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Biochemistry

Struktur-Lösung von den fluoreszierenden Proteins Himmelblau mit MeshAndCollect

doi: 10.3791/58594 Published: March 19, 2019
* These authors contributed equally

Summary

Wir präsentieren Ihnen die Verwendung des MeshAndCollect-Protokolls auf einen vollständige Beugung-Datensatz für den Einsatz in nachfolgenden Strukturbestimmung, bestehend aus teilweise Beugung Datensätze gesammelt aus vielen kleinen Kristallen des fluoreszierenden Proteins Cerulean beziehen.

Abstract

Röntgen-Kristallographie ist die große Technik verwendet, um hohe Auflösung über die 3-dimensionale Strukturen von biologischen Makromolekülen informieren. Bis vor kurzem wurde eine wesentliche Voraussetzung der Verfügbarkeit von relativ großen, gut Interferenzgitters Kristalle, die oft schwierig zu erhalten sind. Jedoch das Aufkommen von seriellen Kristallographie und eine Renaissance in Multi-Kristall Methoden der Datenerhebung hat dazu geführt, dass die Verfügbarkeit von großen Kristallen nicht mehr ein limitierender Faktor sein muss. Hier zeigen wir den Einsatz der automatisierten MeshAndCollect Protokoll, das identifiziert zunächst der Positionen der viele kleine Kristalle, die auf dem gleichen Probenhalter montiert und weist dann die Sammlung von den Kristallen eine Reihe von teilweise Beugung Datensätze für anschließende Zusammenführen und Einsatz in der Strukturaufklärung. MeshAndCollect kann auf jede Art von Mikro-Kristalle angewendet werden, auch wenn schwach Interferenzgitters. Als Beispiel stellen wir hier die Nutzung der Technik, die Kristallstruktur des Cyan fluoreszierenden Proteins (GFP) Himmelblau zu lösen.

Introduction

Makromolekularen Röntgen-Kristallographie (MX) ist bei weitem die am häufigsten verwendete Methode zur atomarer Auflösung Einblick in die dreidimensionalen Strukturen von biologischen Makromolekülen. Eine große Engpässe ist jedoch die Voraussetzung für relativ große, gut Interferenzgitters Kristalle.

Oft, und besonders wenn Membranproteine kristallisieren, nur sehr kleine Kristalle von wenigen Mikrometern die größte Abmessung erzielt werden. Strahlenschäden, die Effekte begrenzen die Auflösung für eine vollständige Beugung Daten festlegen, die von einem einzigen micro Crystal2, und sehr oft gesammelt werden kann, ist es notwendig, das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern und somit Daten stellen Sie Auflösung, durch die Zusammenlegung mehrerer partielle Beugung Datensätze aus verschiedenen, aber isomorph Kristalle. Der Anstieg der Flussdichte von Röntgenstrahlen am Synchrotron Quellen und an anderer Stelle (z. B. Röntgen-freie-Elektronen-Laser (X-FELs)), haben dazu geführt, dass selbst sehr kleine Kristalle von biologischen nützlich teilweise Beugung Datensätze abgeholt werden können Makromoleküle. Dies wiederum führte zur Entwicklung neuer Techniken für die Sammlung und Zusammenführung der Datensätze teilweise Beugung aus vielen verschiedenen Kristalle gesammelt, um einen vollständigen Datensatz Struktur Lösung zu produzieren. Solche Techniken sind gemeinhin als serielle Kristallographie (SX)3,4,5,6,7,8. Ein prototypisches Beispiel für SX ist die Verwendung des Injektor-Geräte, einen schmalen Bach eine Kristall-Gülle in die x-ray Strahl3,4,5einzuführen. Ein Beugungsmuster wird aufgezeichnet, jedes Mal, wenn ein Kristall ausgesetzt wird Röntgenstrahlung führt zu der Sammlung aus vielen tausend einzelne Kristalle, "still" Beugung Bilder, Informationen, die dann zusammengeführt werden, um einen vollständigen Satz von Daten zu produzieren. Ein erheblicher Nachteil dieser Art von seriellen Datenerfassung ist jedoch, dass die Verarbeitung von Standbildern kann problematisch sein. Die Datenqualität wird deutlich verbessert, wenn Kristalle sind drehbar und/oder mehrere Beugung Bilder sind aus dem gleichen Crystal während serielle Kristallographie Experimente6gesammelt.

MeshAndCollect1 wurde entwickelt mit dem Ziel, SX mit "standard" MX-Drehung-Datensammlung zu kombinieren und ermöglicht es, auf automatische Weise, Experimentatoren, teilweise Beugung von Datensätzen aus zahlreichen Kristallen des gleichen makromolekulare Targets zu sammeln auf die gleiche oder verschiedene Probenhalter montiert. Ein vollständige Beugung-Datensatz ergibt sich dann durch die Zusammenlegung der meisten isomorphous der teilweisen Datensätze gesammelt. MeshAndCollect ist kompatibel mit jeder State-of-the-Art-Synchrotron Röntgenstrahl Strahlrohr für MX (im Idealfall eine Einfügung Gerät Anlage mit einem relativ kleinen (20 µm oder weniger) breite Größe an der Probenposition). Neben der Zusammenstellung der vollständige Datensätze aus einer Reihe von kleinen, gut diffracting Kristalle eignet sich die Methode auch sehr für die experimentelle Erstprüfung der Beugung Qualität der Mikro-Kristalle und für die Verarbeitung von opaken Proben, z. B. in Meso Mikrokristalle Membran Proteine9gewachsen.

Zu Beginn eines MeshAndCollect Experimentes sind die Positionen, in zwei Dimensionen der einzelnen der vielen Kristall in einem einzigen Probenhalter enthaltenen bestimmt mit einer niedrigen Dosis Röntgen-Scan. Die Beugung Bilder gesammelt während dieser Scan werden automatisch vom Programm DOZOR1, analysiert die Positionen der Kristalle auf der Probenhalter nach ihren jeweiligen Beugung Stärke sortiert. Positionen für die Sammlung von teilweise Datensätzen basierend auf eine Beugung Stärke Abschaltung automatisch zugeordnet sind, und im letzten Schritt, kleine Keile Beugung Daten, in der Regel ±5 ° Drehung, von jeder gewählten Position gesammelt werden. Erfahrung hat gezeigt, dass diese Drehbereich eine ausreichende Menge an Reflexionen pro Kristall für partielle Dataset Skalierung Zwecke, während gleichzeitig die Reduzierung möglich Kristall Zentrierung Themen und die Möglichkeit bietet des Aussetzens mehrere Kristalle in einer besonders überfüllt Unterstützung1. Die einzelnen Beugung Daten Keile (teilweise Datensätze) sind dann entweder manuell bearbeitet oder10,11,12,13Rohrleitungen mit Hilfe automatischer Datenverarbeitung. Für nachgeschaltete Strukturaufklärung ist es dann notwendig ist, finden die beste Kombination von teilweise Datensätzen zu zusammengeführten14,15,16 , nach denen die Ergebnismenge der kompletten Daten auf die gleiche Weise behandelt werden können wie man aus einem einzigen Kristall zu experimentieren.

Als ein Beispiel für MeshAndCollect in der Praxis stellen wir hier die Lösung der Kristallstruktur von Cyan fluoreszierenden Proteins (GFP)-Himmelblau, mit einer Beugung Datensatz konstruiert aus der Kombination von teilweise gesammelt aus einer Reihe von Datensätzen Mikrokristalle montiert auf die gleiche Probe-Unterstützung. Coelinblau wurde von Green Fluorescent Protein (GFP) aus der Qualle Aequorea Victoria17, entwickelt, deren Fluoreszenz Chromophor ab aus die Cyclisierung von drei aufeinander folgenden Aminosäurereste gebildet wird. Himmelblau ergibt sich aus GFP durch die ersten und zweiten Rückstände der Chromophor, ein Serin und ein Tyrosin, Threonin (S65T) und Tryptophan (Y66W) bzw. mutiert und Anpassung der Chromophor Umgebung mit weiteren Mutationen (Y145A, N146I, H148D, M153T und V163A), eine bedeutende, suboptimale Fluoreszenz Niveau von QY produzieren = 0,4918,19,20. Die suboptimalen fluoreszierenden Eigenschaften der Cerulean sind vorgeschlagen worden, um komplexe Proteindynamik unter Einbeziehung der unvollkommenen Stabilisierung eines der elf β-Stränge der Protein-21 und die Unterbringung von zwei unterschiedlichen Chromophor verknüpft werden Je nach pH-Wert und Bestrahlung Bedingungen22Isomere. Wir entschieden uns für die Arbeit mit Himmelblau als Modell Protein veranschaulicht die Verwendung des MeshAndCollect-Protokolls aufgrund der relativ einfachen Tuning Kristallgröße abhängig von der Kristallisation. Die Struktur der Cerulean ist sehr ähnlich der von seinen Eltern Protein GFP, da es von besteht ein β-Fass gebildet von elf β-Stränge rund um eine α-Helix, die den Chromophor trägt.

Protocol

1. Ausdruck und Reinigung von Himmelblau

Hinweis: Dies basiert auf dem Protokoll von Lelimousin Et Al. veröffentlicht 21

  1. Express sein-tagged Cerulean in Escherichia coli BL21 Zellen gewachsen bei 37 ° C in 4 L Auto induzierbaren mittlere23 bis OD600= 1 und dann über Nacht bei 27 ° c inkubieren
  2. Die Bakterienzellen bei 5.000 X g zu ernten und lyse der Zellen über Beschallung (40 %, 5 min, 10 s Puls, 10 s Pause) in 200 mL Puffer bestehend aus 20 mM Tris pH 8,0, 500 mM NaCl und 1 x EDTA-freie Protease-Inhibitoren.
  3. Laden des Überstands auf eine seiner Falle Ni-NTA-Spalte und eluieren Himmelblau mit 100 mM Imidazol in den gleichen Pufferbedingungen.
  4. Die helle gelbe farbige Brüche zu bündeln. Das Protein ist intrinsisch eingefärbt, damit die Himmelblau-haltige Fraktionen sind leicht zu unterscheiden.
  5. Reinigen Sie das Protein (4 mL) auf eine S75 Spalte 20 mM Tris pH 8.0.
  6. Bündeln Sie die leuchtenden gelben Fraktionen und konzentrieren Sie die Proteinlösung bis 15 mg/mL.

2. Kristallisation

  1. Verwenden Sie die hängenden Tropfen Dampf Diffusion Technik24 bei 20 ° C in Linbro Platten. Füllen Sie die Brunnen mit 1 mL einer Fällungsmittel Lösung bestehend aus 100 mM HEPES bei pH 6.75, 12 % PEG8000 und 100 mM MgCl2. Für die hängenden Tropfen konzentrierte Mischung 1 µL Protein bis 15 mg/mL mit 1 µL des Fällungsmittels Lösung. Kristalle werden in 24 h angezeigt.
  2. Die Kristalle erhalten und den Transfer zu 100 µL der Aussaat Puffer bestehend aus 0,1 M HEPES pH 6.75, 22 % PEG 8000 zu ernten.
  3. Die Kristalle mit einer 0,1 mL Gewebe Mühle mahlen und verdünnen in Aussaat Puffer (Verhältnis 1: 100).
  4. Ein Aliquot der Protein-Stammlösung (15 mg/mL) mit Trypsin (0,5 mg/mL in den gleichen Puffer) für 1 h (01:10 (V/V)) zu verdauen.
  5. Mischen Sie die verdauten Proteinlösung mit 10 % der Samen-haltigen Puffer (V/V).
  6. Kristalle wachsen (10 * 10 * 20 µm3) in 0,1 M HEPES pH 7, 14 % PEG 8000, 0,1 MgCl2 in 1-1,5 μL hängenden Tropfen mit der Dampf-Diffusion-Methode.

3. Crystal Montage

  1. Verwenden Sie eine passende Schleife, z. B. ein Netz 700 Quadratmeter Schlupflöcher von 25 µm auf eine Wirbelsäule Standardprobe Halter25montiert. Übertragen Sie Kristalle aus dem Drop-Kristallisation (Schritt 2.6) in 1 µL Kryoprotektivum Lösung (die auch Fällungsmittel gemischt mit Glycerin (20 % V/V final)).
  2. Montieren Sie Protein Crystal Gülle auf ein Mesh-Schleife durch Verschieben der Schleife unter den Kristallen und heben sie aus der Drop. Idealerweise sollte die Kristalle in der Größenordnung von 5 µm – 30 µm in Maximalgröße ohne Überschneidungen zwischen Kristalle montiert auf dem Laufenden sein.
  3. Docht aus überschüssige Flüssigkeit durch Berühren der Halterung schnell mit Filterpapier. Sediment die Kristalle so, dass sie in der Ebene der Schleife umgeben von möglichst wenig Masse Flüssigkeit wie möglich sitzen.
  4. Tauchen Sie die Halterung in eine Unipuck voller flüssigem Stickstoff. Speichern Sie den Puck bei 100 K in einem geeigneten Behälter bis Strahlzeit verfügbar ist.

(4) Offline Vorbereitung des Synchrotron-Experiments

Hinweis: Beantragen Sie Synchrotron Strahlzeit so früh wie möglich und die Online-Richtlinien für verfügbaren Zugriffstypen und wie Sie einen Antrag für einen bestimmten Synchrotron. Die ESRF-Richtlinien finden Sie auf http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Applying. Wenn ein Mitglied eine ESRF Block Zuweisung Gruppe (BAG), ist eine Anmeldung für jedes spezifische Projekt nicht erforderlich. In diesem Fall sollten die Experimentatoren ihre Tasche verantwortlich, die über die Terminierung der Strahlzeit nähern.

  1. Nachdem der Vorschlag angenommen und eine Einladung für das Experiment erhielt, haben Sie alle Teilnehmer Sicherheitsausbildung absolvieren. Füllen Sie die "A-Form" (über die ESRF User Portal, http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Preparing/new-a-form) mit den erforderlichen Sicherheitsinformationen über die Proben. Wenden Sie sich an die Ansprechpartner vor Ort um das Experiment zu besprechen. Sobald Ihr A-Form eingereicht und bestätigt wird geben es Ihnen die Experimentnummer und das Passwort.
  2. Verbinden Sie mit erweiterten ISPyB26 (http://www.esrf.fr/) und wählen Sie MX.
  3. Melden Sie sich mit dem Experimentnummer und das Passwort aus der A-Form.
  4. Wählen Sie Sendung | Neu hinzufügen und geben Sie die angeforderten Informationen.
  5. Wählen Sie Hinzufügen Parzelle und füllen Sie die relevanten Daten. Wählen Sie Container hinzufügen, wählen Sie eine Unipuck und füllen Sie die Informationen, die erforderlich ist, einschließlich der Positionen der Probenhalter in den Puck.

5. Laden des Beispiels auf einem Strahlrohr

  1. Im experimentellen Stall, laden Sie den Puck in die Probenwechsler (SC) Dewar und beachten Sie seine Position.
  2. Verriegeln Sie die experimentelle Kabine und geben Sie die Steuerelement-Stall.
  3. Melden Sie sich bei der ISPyB (https://esrf.fr/). Wählen Sie Experiment vorbereiten, finden Sie die Sendung zu, wählen Sie nächste und geben Sie das Strahlrohr und der Puck-Position in der SC.
  4. Melden Sie sich in das Strahlrohr Steuersoftware hier MXCuBE227,28 mit der experimentellen Nummer und das Passwort auf die A-Form zur Verfügung gestellt.
    1. Drücken Sie Sync , die Strahlrohr Steuerungssoftware mit der ISPyB-Datenbank zu synchronisieren.
  5. Verwenden der Steuerungssoftware Strahlrohr der Probenhalter auf das Goniometer. MXCuBE2 eine Position im Bereich Beispiel Wechsler einen Rechtsklick und wählen Sie Mount Probe.
  6. Unter Ausnutzung der MK3 Mini-Kappa Goniometer29 installiert am meisten von der ESRF MX Beamlines können MXCuBE2s "visuellen Neuausrichtung" Workflow30 das Flugzeug von der Probenhalter mit der Drehachse des Goniometers ausrichten.
    1. Wählen Sie die mittlere Taste, dann 3-Klick-Zentrum in der Mitte der Kante der Spitze der Schleife. Speichern Sie die zentrierte Position durch Auswahl Speichern.
    2. Klicken Sie erneut auf die mittlere Taste, dann 3-Klicken Sie auf Mitte der Mitte des Beginns des Stammes der Schleife. Speichern Sie die zweite Position sowie durch Klicken auf Speichern.
    3. Wählen Sie eines der gespeicherten zentrierten Positionen indem Sie darauf klicken.
    4. Fügen Sie unter AdvancedWorkflow visuelle Neuausrichtung zur MxCuBE2 Daten Sammlung Warteschlange hinzu.
    5. Starten Sie den Workflow durch Anklicken sammeln Warteschlange.
    6. Nachdem der Workflow das Flugzeug von der Probenhalter mit der Drehachse des Goniometers, Zentrum der Probenhalter wieder, dieses mal irgendwo in der Mitte des Netzes richtet.
  7. Der Probenhalter zu orientieren, so dass die Fläche des Netzes senkrecht zur Strahlrichtung Röntgen durch Drehen der Omega Achse mit MXCuBE2.
  8. MXCuBE2 wählen Sie die Strahlgröße für das Scannen von der Probenhalter (nur für Beamlines mit variabler Breite Größe) erforderlich.
    1. Klicken Sie auf das Dropdown-Menü in der Steuerungssoftware Strahlrohr Blende und wählen Sie einen Wert, z. B. 10 µm.
  9. Definieren Sie ein Netz für den Netz-Scan.
    1. Klicken Sie auf das Werkzeugsymbol Netz in MXCuBE2. Das Mesh-Fenster wird angezeigt.
    2. Zeichnen Sie in der Probe-Ansicht des MXCuBE2 das Netz durch Linksklick und ziehen mit der Maus über den Bereich mit Kristallen auf dem Probenhalter.
    3. Das Netz um zu speichern klicken Sie auf die Plus -Taste im Menüfenster "Mesh" (Netz wird grün).

6. vorbereiten und Ausführen der MeshAndCollect-Workflow

  1. Geben Sie im Feld " Auflösung " des MXCuBE2 die Auflösung (dmin) auf die Beugung Bilder gesammelt werden sollten, z. B. hier 1,8 Å.
  2. Wählen Sie MeshAndCollect in der Registerkarte Erweiterte Daten Sammlung, zur Warteschlange fügen Sie hinzu, und klicken Sie auf erfassen die Warteschlange.
  3. Verwenden Sie im Parameterfenster erscheint das Strahlrohr abhängigen Standardparameter. Im Experiment beschriebenen hier Parameter 0.037 s Belichtungszeit pro Scan Gitterpunkt, 100 % Transmission (was in diesem Fall zu 4 x 1011 Ph/s), 1 ° Schwingung pro Scan Gitterlinie sind Standardwerte.
  4. Klicken Sie auf Cweiterhin. Der Netz-Scan läuft und die Beugung Bilder an jedem Gitterpunkt gesammelt werden analysiert und nach Beugung Stärke mit der Software DOZOR1eingestuft. Dieser Prozess läuft im Hintergrund.
  5. Nach der DOZOR-Analyse wird eine Heatmap erzeugt und der Auftrag für nachfolgende partielle Datensammlungen basierend auf Beugung Stärke automatisch zugeordnet ist (siehe Abbildung 1).
    Hinweis: Die Ergebnisse dieser Schritt können auch in ISPyB überprüft werden. Wählen Sie für die Sammlung von teilweise Datensätzen, die eine neue Registerkarte mit den Einstellungen in der Steuerungssoftware Strahlrohr öffnet geeignete Werte für die Anzahl der Bilder (z. B. 100), Belichtungszeit, Auflösung, Drehbereich (d.h. 0,1 °), Übertragung, Inverse Strahl etc. sollte idealerweise die Dosis für jeden Keil gesammelt werden unterhalb der Garman (30 MGy) sein. Die ungefähre Belichtungszeit pro Bild beträgt 0,037 s 0,1 s in den beschriebenen experimentellen Bedingungen.
  6. Klicken Sie auf weiter um die partielle Datensammlungen zu starten.

7. Datenverarbeitung

Hinweis: Die teilweise Datensätze sind mit einem geeigneten Programm (XDS10) integriert. Hierfür wird ein Python-Skript verwendet werden, erkennt jeder einzelne Datensatz, integriert es sich und sorgt dafür, dass zwischen den verschiedenen teilweise Datensätzen Indizierung konsistent ist.

  1. Öffnen Sie den Ordner mit den Bildern: /data/visitor/mxXXXX/beamline_name/date/RAW_DATA/Cerulean.
  2. Machen Sie eine Sicherheitskopie von der Prozess-Unterordner, der im Ordner "" gefunden werden kann, wo die partielle Datensätze gesammelt werden.
    1. Verwenden Sie auf dem Linux-Terminal den Befehl cp-R Prozess Process_backup.
  3. Navigieren Sie in den Prozess-Ordner und starten Sie das verarbeitende Skript.
    1. Auf dem Linux-Terminal geben Sie den Befehl cd-Prozess und drücken Sie die Eingabetaste.
    2. Typ ProcMultiCrystalData und drücken geben Sie.
      Hinweis: Das Skript fragt nach einer Raumgruppe und Zellenparameter (diese Information ist optional), geben Sie diese entsprechend den Anweisungen. Nach einem letzten Bestätigung durch den Benutzer wird das Skript automatisch ausgeführt.

(8) zusammenführen von Datensätzen

Hinweis: Nachdem alle partieller Datensätze integriert sind die beste Kombination von ihnen werden zusammengeführt, um der letzte Datensatz für den Einsatz in Strukturaufklärung und Raffinesse zu produzieren. Verschiedene Ziele dieser Verschmelzungsprozess können vollständige Vollständigkeit (sehr empfehlenswert), hohe Multiplizität oder die besten Daten-Statistik zu erhalten sein (hoher < I/σ(I) >, niedrige R-Faktoren, etc.). Letzteres kann auf Kosten der Vollständigkeit und/oder Vielfalt so dass diese Option mit Bedacht gewählt werden sollten.

  1. Zusammenführen Sie teilweise mit dem Programm CcCluster14Datensätze. Hierarchische Cluster Analyse (HCA) verwendet, um mögliche Kombinationen von isomorphous teilweise Datensätze () zu bestimmen.
    1. Geben Sie CcCluster in das UNIX-Terminal, seine grafische Benutzeroberfläche (GUI) zu öffnen.
      Anmerkung: In der CcCluster-GUI ist ein Dendrogramm gezeichnet. Dies gibt einen Vorschlag, den welche am besten teilweise Datensätze zusammengeführt werden könnte, basierend auf Isomorphismus zwischen ihnen.
    2. Klicken Sie auf einen Knoten, der die einen Wert von etwa 0,4 auf der vertikalen Achse entspricht. Im Allgemeinen werden höhere Werte mehr teilweise Daten enthalten, sondern zu schlechter Statistik zusammenführen führen, da teilweise Datensätze weniger isomorphous werden.
    3. Klicken Sie auf Daten zusammenführen. Der ausgewählte Cluster im Hintergrund verarbeitet werden und die geschätzte verschmelzenden Statistik erscheint in einem neuen Tab in der GUI. Dieser Schritt kann für verschiedene Kombinationen von Datensätzen wiederholt werden. Für eine gute Kombination von teilweise Datensätzen die Vollständigkeit sollte in der Nähe von 100 %, der < I/σ(I) > hohe Werte (10 oder höher in der niedrigsten Auflösung Shell) und die R-Meas31 Werte niedrig (etwa 5 % in der geringen Auflösung Shell).
  2. Verwenden Sie für jede Kombination ausgewählt das generierte Skript Eingang zum teilweisen Datensätze in einer einzigen Mtz-Datei (d. h. sinnlos32) gewählt zusammenführen.
  3. Endgültig zu skalieren Sie und Zusammenführen Sie die Intensitätsdaten in dieser Datei mit einem Skalierungs-Programm (d. h. ziellos32) und als mit einer Datei aus einem Einkristall-Datenerfassung, verwenden Sie die Ausgabe für nachfolgende phasing und Struktur Lösung33 .

Representative Results

MeshAndCollect, wie in MXCuBE2 umgesetzt (siehe Abbildung 1A), wurde verwendet für die Sammlung von teilweise Beugung Datensätzen aus kleinen Kristallen von Cerulean befindet sich auf der gleichen Probenhalter in der visuellen Identifikation der Kristalle schwierig war. Der Probenhalter auf dem Bildschirm, zogen wir ein Raster mittig auf der Meshloop (siehe Abbildung 1 b) und anhand der DOZOR Partitur Hitze zuordnen (siehe Abbildungen 1, 1D) 85 teilweise Beugung Datensätze wurden automatisch gesammelt. Diese wurden individuell integriert dann zusammengeführt (siehe oben) zur Herstellung eines Datensatzes mit 99,8 % Vollständigkeit bei dmin = 1.7Å (siehe Tabelle 1). Hälfte-Set Korrelation (CC1/2)34 in der höchsten Auflösung Shell lag bei 60 % (= 4.7). Wie erwartet, konnte die Kristallstruktur des Cerulean unkompliziert durch molekulare Ersatz33 Verwendung des Datensatzes generiert gelöst werden. Nach Verfeinerung erhielten wir eine Rarbeiten von 22,8 % und eine Rfrei von 25,4 %. Überlagerung mit den zuvor festgelegten Struktur (PDB Eintrag 2WSO21) zeigt eine globale Rmsd Cα Positionen von 0,1 Å.

Statistik der zusammengeführten Datensatz
Clustering-Schwelle 0,35
Anzahl der partiellen datasets 25
Raumgruppe P212121
Elementarzelle (a, b, C) 50.98, 62.76, 69.50
Auflösungsbereich 46,58-1,70 (1,73-1.70)
Rmerge (alle ich + und -) 0.133 (0.743)
Rmeas (alle ich + & ich-) 0,142 (0.813)
Rpim (alle ich + & ich-) 0,047 (0.318)
Beobachtungen insgesamt/unique 220693/25129
Mean((I)/SD(I)) 13,8 (4,7)
MN(I) halb-Satz Korrelation CC(1/2) 0.994 (0.602)
Vollständigkeit 99,8 (99,5)
Multiplizität 8.8 (6.5)
Endgültige RGespinst 22,8
Endgültige Rfrei 25.4

Tabelle 1: Statistiken der zusammengeführten Daten, die die hohe Qualität der Daten gesammelt.

Figure 1
Abbildung 1: mit MeshAndCollect um zu sammeln, eine Reihe von teilweise Datensätze aus einer Reihe von kleinen Kristallen, die in der gleichen Probenhalter enthalten. (A) Benutzeroberfläche des MXCuBE2. Das grüne Oval über das Feld auf der Achse Viewer zeigt die Rasterfunktion. (B) mit ihm wird ein Gitter auf das Bild der Probenhalter im Bildfeld Leben gezeichnet. (C) Heatmap der DOZOR Partituren. (D) Beispiel für eine Beugung Bild. (E) Dendrogramm nach Hierarchische Clusteranalyse. Datensätze in rot wurden für das Zusammenführen verwendet. (F) allgemeine Struktur von Himmelblau. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

Der Erfolg eines MX-Experiments hängt in der Regel die Existenz von relativ großen, gut Interferenzgitters Kristalle. Für Projekte, wo Optimierung von kleinen Kristall Duschen zu größeren Kristallen ausfällt, bietet MeshAndCollect die Möglichkeit, eine vollständige Beugung Dataset für die Struktur-Lösung über die Kombination von isomorphous teilweise Datensätze gesammelt zu erhalten aus einer Reihe von kleinen Kristallen. Die Methode ist kompatibel mit Synchrotron Beamlines für MX, idealerweise mit einem hohen Photon Flux und einer kleinen Strahldurchmesser, ausgestattet mit modernster Diffraktometer und einen Fast-Readout-Detektor. Auf solch eine Endstation dauert der Datenteil Sammlung ein solches Experiment etwa 20 Minuten, je nach der Anzahl der partiellen Datensätze gesammelt werden und die Anzahl der Kristall-haltigen Probenhalter analysiert werden.

Die wichtigste Voraussetzung für den Erfolg eines MeshAndCollect Experimentes ist das Vorhandensein einer ausreichenden Anzahl (mindestens 50, 100 ideal) der Interferenzgitters Positionen auf dem Probenhalter. Aus Erfahrung sollte die minimale Größe der Kristalle zu analysierenden ca. 5 µm in das kleinste Maß. Die Methode ist kompatibel mit jeder Art von standard-Cryo-Kühlung-kompatibel probieren Inhaber mit die besten Ergebnisse erzielt werden, mit mesh-Halterungen, die steif und gerade sind.

Bei der ESRF erfolgt MeshAndCollect in einer benutzerfreundlichen Weise in eine Passerelle (http://isencia.be/passerelle-edm-en) Workflow30 von der MXCuBE2-Strahlrohr-Steuerungs-Software zur Verfügung. Ein wesentlicher Vorteil des MeshAndCollect im Vergleich zu anderen SX-Methoden ist, dass die erhobenen Daten von Standardprogrammen verarbeitet werden können und Rohrleitungen für Einkristall MX automatisiert.

Wie unser Beispiel zeigt, MeshAndCollect ist sehr einfach anzuwenden und führt zu einer Reihe von Datensätzen teilweise Beugung, gesammelt in der Regel aus kleinen Kristallen, die zusammengeführt werden können, um einen vollständigen Datensatz für den Einsatz in Struktur Lösung zu produzieren. Darüber hinaus hat MeshAndCollect das Potenzial, die Probenahme der Proteinkristallographie eröffnen wie es bietet eine Möglichkeit zum Sammeln verwertbare Daten aus Kristallisation Studien wo ist der letzte Optimierungsschritt, die Produktion von großen Kristallen, erfolglos.

Angesichts der aktuellen Entwicklungen in Richtung heller Röntgenquellen (z. B. extrem brillante Quelle (EBS) Projekt/ESRF35) ist es absehbar, dass aufgrund erhöhter Strahlungsschäden, die Art der Multi-Kristall Datenerhebung erleichtert durch MeshAndCollect werden die standard-Methode der Datenerhebung, anstatt eine Ausnahme – wie derzeit der Fall - Synchrotron-basierte MX Beamlines ist.

Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben

Acknowledgments

Wir danken der ESRF für die Bereitstellung von Strahlzeit durch seine eigene Forschungsprogramm.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Beamline ESRF ID 23-1
Concentrators: Amicon Ultra-4 Ultracel -30K Merck Millipore UFC803024
Crystallization plates XDXm with sealant Hampton Research HR3-306
EDTA- free protease inhibitors Roche 4,693,159,001
Escherichia coli BL21 (DE3) Life Technologies Thermo Fisher Scientific C600003
glycerol VWR Chemicals Prolabo 14388.29T
HEPES Euromedex 10-110-C
His-trap HP GE healthcare 17-5247-01
imidazole Sigma-Aldrich 56750-500G
MgCl2 Sigma-Aldrich 13452-1KG
MicroMeshes 700/25 MiTeGen SKU: M3-L18SP-25L
NaCl Fisher Chemical S/3160/60
PEG8000 Sigma-Aldrich P5413-500G
Sonicator vibra cell 75/15 SONICS
Superdex 75 10/300 -GL GE healthcare 17-5174-01
Tris base Euromedex 26-128-3094-B
Trypsin Sigma-Aldrich T9201-1G
Unipuck Molecular Dimensions MD7-601
Name Company Catalog Number Comments
Programs
ISPyB ESRF Solange Delagenière, Patrice Brenchereau, Ludovic Launer, Alun W. Ashton, Ricardo Leal, Stéphanie Veyrier, José Gabadinho, Elspeth J. Gordon, Samuel D. Jones, Karl Erik Levik, Seán M. McSweeney, Stéphanie Monaco, Max Nanao, Darren Spruce, Olof Svensson, Martin A. Walsh, Gordon A. Leonard; ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography, Bioinformatics, Volume 27, Issue 22, 15 November 2011, Pages 3186–3192, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btr535 local development
aimless MRC Laboratory of Molecular Biology Evans, P.R., Murshudov, G.N. How good are my data and what is the resolution? Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69 (7), 1204–1214, doi: 10.1107/S0907444913000061 (2013).
ccCluster ESRF Santoni, G., Zander, U., Mueller-Dieckmann, C., Leonard, G., Popov, A. Hierarchical clustering for multiple-crystal macromolecular crystallography experiments: the ccCluster program. Journal of Applied Crystallography. 50 (6), 1844–1851, doi: 10.1107/S1600576717015229 (2017). local development
DOZOR ESRF Bourenkov and Popov, unpublished local development
MeshAndCollect workflow ESRF Zander, U. et al. MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (11), 2328–2343, doi: 10.1107/S1399004715017927 (2015). local development
MXCuBE2 ESRF Gabadinho, J. et al. MxCuBE: a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700–707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010). De Santis, D., Leonard, G. Notiziario Neutroni e Luce di Sincrotrone,Consiglio Nazionale delle Ricerche. (19), 24–226 (2014). local development
XDS Max-Planck-Institut für Medizinische Forschung Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125–132, doi: 10.1107/S0907444909047337 (2010)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zander, U., et al. MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71, (11), 2328-2343 (2015).
  2. Henderson, R. Cryo-Protection of Protein Crystals against Radiation Damage in Electron and X-Ray Diffraction. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 241, (1300), 6-8 (1990).
  3. Chapman, H. N., et al. Femtosecond X-ray protein nanocrystallography. Nature. 470, (7332), 73-77 (2011).
  4. Schlichting, I. Serial femtosecond crystallography: the first five years. IUCrJ. 2, (2), 246-255 (2015).
  5. Stellato, F., et al. Room-temperature macromolecular serial crystallography using synchrotron radiation. IUCrJ. 1, (4), 204-212 (2014).
  6. Gati, C., et al. Serial crystallography on in vivo grown microcrystals using synchrotron radiation. IUCrJ. 1, (2), 87-94 (2014).
  7. Coquelle, N., et al. Raster-scanning serial protein crystallography using micro- and nano-focused synchrotron beams. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71, (5), 1184-1196 (2015).
  8. Diederichs, K., Wang, M. Serial Synchrotron X-Ray Crystallography (SSX). Protein Crystallography. 1607, 239-272 (2017).
  9. Borshchevskiy, V. I., Round, E. S., Popov, A. N., Büldt, G., Gordeliy, V. I. X-ray-Radiation-Induced Changes in Bacteriorhodopsin Structure. Journal of Molecular Biology. 409, (5), 813-825 (2011).
  10. Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66, (2), 125-132 (2010).
  11. Winter, G., et al. DIALS implementation and evaluation of a new integration package. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 74, (2), 85-97 (2018).
  12. Winter, G. xia2: an expert system for macromolecular crystallography data reduction. Journal of Applied Crystallography. 43, (1), 186-190 (2010).
  13. Monaco, S., et al. Automatic processing of macromolecular crystallography X-ray diffraction data at the ESRF. Journal of Applied Crystallography. 46, (3), 804-810 (2013).
  14. Santoni, G., Zander, U., Mueller-Dieckmann, C., Leonard, G., Popov, A. Hierarchical clustering for multiple-crystal macromolecular crystallography experiments: the ccCluster program. Journal of Applied Crystallography. 50, (6), 1844-1851 (2017).
  15. Zander, U., et al. Merging of synchrotron serial crystallographic data by a genetic algorithm. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 72, (9), 1026-1035 (2016).
  16. Foadi, J., et al. Clustering procedures for the optimal selection of data sets from multiple crystals in macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69, (8), 1617-1632 (2013).
  17. Tsien, R. Y. The Green Fluorescent Protein. Annual Review of Biochemistry. 67, (1), 509-544 (1998).
  18. Heim, R., Prasher, D., Tsien, R. Y. Wavelength mutations and posttranslational autoxidation of green fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 91, (26), 12501-12504 (1994).
  19. Cubitt, A. B., Woollenweber, L. A., Heim, R. Chapter 2: Understanding Structure-Function Relationships in the Aequorea victoria Green Fluorescent Protein. Methods in Cell Biology. 58, 19-30 (1998).
  20. Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. An improved cyan fluorescent protein variant useful for FRET. Nature Biotechnology. 22, (4), 445-449 (2004).
  21. Lelimousin, M., et al. Intrinsic Dynamics in ECFP and Cerulean Control Fluorescence Quantum Yield. Biochemistry. 48, (42), 10038-10046 (2009).
  22. Gotthard, G., von Stetten, D., Clavel, D., Noirclerc-Savoye, M., Royant, A. Chromophore Isomer Stabilization Is Critical to the Efficient Fluorescence of Cyan Fluorescent Proteins. Biochemistry. 56, (49), 6418-6422 (2017).
  23. Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expression and Purification. 41, (1), 207-234 (2005).
  24. Rhodes, G. Crystallography made crystal clear: a guide for users of macromolecular models. Elsevier/Academic Press. Amsterdam; Boston. (2006).
  25. Cipriani, F., et al. Automation of sample mounting for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 62, (10), 1251-1259 (2006).
  26. Delageniere, S., et al. ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography. Bioinformatics. 27, (22), 3186-3192 (2011).
  27. Gabadinho, J., et al. MxCuBE a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17, (5), 700-707 (2010).
  28. De Santis, D., Leonard, G. Notiziario Neutroni e Luce di Sincrotrone. Consiglio Nazionale delle Ricerche. (2014).
  29. Brockhauser, S., Ravelli, R. B. G., McCarthy, A. A. The use of a mini-κ goniometer head in macromolecular crystallography diffraction experiments. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69, (7), 1241-1251 (2013).
  30. Brockhauser, S., et al. The use of workflows in the design and implementation of complex experiments in macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68, (8), 975-984 (2012).
  31. Diederichs, K., Karplus, P. A. Improved R-factors for diffraction data analysis in macromolecular crystallography. Nature Structural Biology. 4, 269 (1997).
  32. Evans, P. R., Murshudov, G. N. How good are my data and what is the resolution? Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69, (7), 1204-1214 (2013).
  33. Taylor, G. L. Introduction to phasing. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66, (4), 325-338 (2010).
  34. Karplus, P. A., Diederichs, K. Linking Crystallographic Model and Data Quality. Science. 336, (6084), 1030-1033 (2012).
  35. Dimper, R., Reichert, H., Raimondi, P., Ortiz, L. S., Sette, F., Susini, J. ESRF upgrade programme phase II (2015 - 2022). The orange book. (2015).
Struktur-Lösung von den fluoreszierenden Proteins Himmelblau mit MeshAndCollect
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Hutin, S., Santoni, G., Zander, U., Foos, N., Aumonier, S., Gotthard, G., Royant, A., Mueller-Dieckmann, C., Leonard, G. Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect. J. Vis. Exp. (145), e58594, doi:10.3791/58594 (2019).More

Hutin, S., Santoni, G., Zander, U., Foos, N., Aumonier, S., Gotthard, G., Royant, A., Mueller-Dieckmann, C., Leonard, G. Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect. J. Vis. Exp. (145), e58594, doi:10.3791/58594 (2019).

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