Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

מבנה תמיסת Cerulean חלבון פלואורסצנטי באמצעות MeshAndCollect

doi: 10.3791/58594 Published: March 19, 2019
* These authors contributed equally

Summary

אנו מציגים את השימוש בפרוטוקול MeshAndCollect כדי לקבל ערכת נתונים עקיפה מוחלטת, לשימוש בקביעת מבנה עוקבות, המורכב עקיפה חלקי ערכות נתונים שנאספו מקריסטלים קטנים רבים של החלבון הניאון Cerulean.

Abstract

קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן היא הטכניקה העיקריים הנדרשים להשגת המידע ברזולוציה גבוהה בדבר מבנה תלת-ממדי ביולוגיות. עד לאחרונה, דרישה גדולה כבר הזמינות של גדול יחסית, ובכן diffracting קריסטלים, לעתים קרובות מאתגרת כדי להשיג. עם זאת, הופעתו של טורי קריסטלוגרפיה, רנסנס בשיטות איסוף נתונים מרובת קריסטל דעונ הזמינות של גבישים גדולים כבר לא צריך להיות גורם מגביל. כאן, אנחנו מנת להמחיש את השימוש בפרוטוקול MeshAndCollect אוטומטיות, אשר קודם מזהה את העמדות של קריסטלים קטנים רבים רכוב על בעל מדגם זהה, ואז מפנה את האוסף של הקריסטלים של סדרה של ערכות נתונים חלקיים עקיפה מיזוג עוקבות, שימוש בקביעת מבנה. ניתן להחיל MeshAndCollect לכל סוג של מיקרו קריסטלים, גם אם חלש diffracting. לדוגמה, אנו מציגים כאן את השימוש בטכניקה לפתור את מבנה הגביש Cerulean החלבון הניאון ציאן (CFP).

Introduction

קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן macromolecular (MX) היא, עד כה, השיטה הנפוצה ביותר להשגת תובנה ברזולוציה אטומית לתוך מבנים תלת מימדיים ביולוגיות. אולם, צוואר הבקבוק העיקרי הוא הדרישה גבישים גדולים יחסית, diffracting טוב.

לעיתים קרובות, ובמיוחד בעת התגבשות קרום חלבונים, יכולה להיות מושגת רק קטן מאוד גבישים של מיקרונים אחדים בממד הגדול. ניזקי קרינה מגבלת אפקטים שברזולוציה של נתונים עקיפה מוחלטת לקבוע כי ניתן לאסוף מ קריסטל מיקרו יחידה2, ולעתים קרובות מאוד, יש צורך לשפר את האות לרעש יחס, ומכאן ערכת נתונים ברזולוציה, על-ידי מיזוג מספר ערכות נתונים חלקיים עקיפה מקריסטלים שונה, אך איזומורפיים. התוספת צפיפות השטף של קרני רנטגן ב מקורות synchrotron ובמקומות אחרים (למשל צילום רנטגן אלקטרונים חופשיים לייזרים (X-FELs)), אומר כי ניתן לאסוף ערכות נתונים שימושי עקיפה חלקית מקריסטלים אפילו קטן מאוד של הביולוגיה מקרומולקולות. זה, בתורו, הוביל פיתוח טכניקות חדשות לאוסף, מיזוג של ערכות נתונים חלקיים עקיפה שנאסף קריסטלים שונים רבים כדי ליצור ערכת נתונים מלאה לפתרון מבנה. טכניקות אלה מכונים בדרך כלל קריסטלוגרפיה טורי (SX)3,4,5,6,7,8. דוגמה ומופת של SX הוא השימוש של מזרק התקנים להציג זרם צר של slurry קריסטל לתוך4,53,קרן רנטגן. תבנית עקיפה מתועד בכל פעם גביש נחשף לקרינת רנטגן מובילים לאוסף, של אלפים רבים של גבישים בודדים, 'עדיין' עקיפה תמונות, מידע אשר ואז יאוחד להפיק ערכת נתונים מלאה. אולם, נחיתות ניכרת של סוג זה של איסוף נתונים טורית היא כי העיבוד של תמונות סטילס יכול להיות בעייתי. איכות נתונים משופרת במידה ניכרת אם ניתן לסובב קריסטלים ו/או מספר תמונות דיפרקציה נאספים מן הגביש אותו במהלך הניסויים קריסטלוגרפיה טורית6.

MeshAndCollect1 פותחה עם המטרה של שילוב SX עם איסוף נתונים סיבוב MX 'תקן' ו מאפשר, באופן אוטומטי, ניסויים לאיסוף ערכות נתונים חלקיים עקיפה מהגבישים הרבים של אותו יעד macromolecular רכוב על בעלי מדגם זהה או שונה. ערכת נתונים עקיפה מוחלטת ואז מתקבל על-ידי מיזוג isomorphous ביותר של ערכות נתונים חלקיים שנאספו. MeshAndCollect הוא תואם עם כל הפרעות לקרן החלקיקים רנטגן סינכרוטרון המדינה-of-the-art עבור MX (אידיאלי המכשיר מתקן הכניסה עם קטן יחסית (מיקרומטר 20 או פחות) לשגר גודל במיקום לדוגמה). בנוסף ההידור של ערכות נתונים מלאה מתוך סדרה של גבישים קטנים, diffracting היטב, השיטה מתאימה מאוד גם את ההערכה הראשונית ניסיוני של איכות עקיפה של מיקרו קריסטלים ועל העיבוד של דגימות אטום, למשל, ב meso גדל microcrystals של חלבוני ממברנה9.

ההתחלה של ניסוי MeshAndCollect העמדות, בשני מימדים, מכל סוג של הגביש רבים הכלולים בעל מדגם יחיד נקבעים באמצעות סריקת רנטגן במינון נמוך. תמונות דיפרקציה שנאספו במהלך סריקה זו מנותחים באופן אוטומטי על-ידי התוכנית DOZOR1, הממיין את העמדות של הקריסטלים את המחזיק לדוגמה לפי כוחם עקיפה בהתאמה. משרות עבור האוסף של ערכות נתונים חלקיים מוקצים באופן אוטומטי בהתבסס על ניתוק הכוח עקיפה ו, בשלב האחרון, פלחי קטן של עקיפה נתונים, בדרך כלל ±5 מעלות של סיבוב, נאספים כל מיקום שבחרת. הניסיון הוכיח כי טווח סיבוב זה מספק כמות מספקת של השתקפויות לכל קריסטל עבור ערכת הנתונים חלקיים דרוג מטרות, בזמן בו זמנית, הפחתת בעיות המרכוז קריסטל אפשרי, הזדמנות לחשוף מספר גבישים תמיכה צפוף במיוחד1. הפרוסות נתוני דיפרקציה בודדים (ערכות נתונים חלקיים) הם מכן מעובד גם באופן ידני או באמצעות עיבוד נתונים אוטומטי קווי. צינורות10,11,12,13. מכשור לקביעת קשיות ומבנה במורד הזרם זה אז צורך למצוא את השילוב הטוב ביותר של ערכות נתונים חלקיים להיות ממוזג14,15,16 לאחר מכן ערכת הנתונים מלאה וכתוצאה מכך יכולים להיות מטופלים באופן זהה בתור אחד שמקורם גביש יחיד הניסוי.

כדוגמה של MeshAndCollect בפועל, אנו מציגים כאן את הפתרון של מבנה הגביש Cerulean החלבון הניאון ציאן (CFP), באמצעות ערכת נתונים עקיפה בנוי משילוב של חלקי ערכות נתונים שנאספו מתוך סדרה של microcrystals רכוב על התמיכה מדגם זהה. Cerulean מהונדס מ ירוק ניאון חלבון (GFP) מן המדוזה ויקטוריה Aequorea17, אשר כרומופור פלורסנט נוצר autocatalytically מ cyclisation של שלוש רצופות חומצת אמינו שאריות. Cerulean המתקבל GFP על ידי מוטציה משקעי הראשון והשני על כרומופור, סרין טירוזין, תראונין (S65T), טריפטופן (Y66W) בהתאמה והתאמת הסביבה כרומופור עם עוד מוטציות (Y145A, N146I, H148D, M153T ו V163A) כדי לייצר רמת קרינה פלואורסצנטית משמעותי, ובכל זאת שיוצרת של QY = 0.4918,19,20. מאפייני פלורסנט שיוצרת Cerulean הוצעו יקושרו dynamics חלבונים מורכבים המערבים ייצוב לא מושלם של אחד עשר β-גדילי ה חלבון21 , הלינה של שני כרומופור שונים isomers בהתאם ה pH והקרנה התנאים22. בחרנו לעבוד עם Cerulean כמו חלבון דגם המדגימה את השימוש בפרוטוקול MeshAndCollect בשל כוונון גודל הקריסטל בהתאם התגבשויות קלות יחסית. מבנה Cerulean הוא דומה מאוד כי החלבון האב שלה GFP, כמו זה היוו של חבית β יצרו של 11 β-גדילי המקיפים של סליל α, הנושאת את כרומופור.

Protocol

1. ביטוי ולטיהור Cerulean

הערה: זו מבוססת על הפרוטוקול בהוצאת Lelimousin. et al. 21

  1. אקספרס שלו מתויג Cerulean ב- Escherichia coli בתאי BL21 גדל ב- 37 מעלות צלזיוס ב 4 ליטרים של אוטומטי inducible בינוני23 עד OD600= 1 ולאחר מכן דגירה בין לילה ב-27 º C
  2. לקצור תאי חיידקים ב 5,000 x g ואת lyse תאים באמצעות sonication (40%, 5 דקות, 10 s דופק, השהה s 10) ב- 200 מ ל מאגר של 20 מ מ טריס pH 8.0, 500 מ מ NaCl ו- 1 x EDTA נטול מעכבי פרוטאז.
  3. לטעון את תגובת שיקוע על עמודה לו מלכודת Ni-נ, elute Cerulean עם 100 מ מ imidazole ב מאגר באותם התנאים.
  4. בריכת השברים בצבע צהוב בהיר. החלבון הוא מהותי בצבע, ולכן שברים Cerulean המכילים הן בקלות ניתן להבחנה.
  5. לטהר את החלבון (4 מ ל) על עמודת S75 ב- 20 מ מ טריס pH 8.0.
  6. בריכה שברים צהוב בהיר ולרכז את הפתרון חלבון 15 מ"ג/מ"ל.

2. התגבשות

  1. השתמש הירידה תלוי vapor דיפוזיה טכניקה24 -20 ° C בצלחות Linbro. למלא את הבארות 1 מ"ל של פתרון precipitant בהיקף של 100 מ מ HEPES ב- pH 6.75, 12% PEG8000 ל- 100 מ מ MgCl2- עבור הטיפות לתלייה, מיקס 1 µL של חלבון מרוכז 15 מ"ג/מ"ל עם µL 1 של פתרון precipitant. קריסטלים אמור להופיע ב- 24 שעות ביממה.
  2. קציר הקריסטלים שהושג ולהעביר שאותם µL 100 של חיץ זריעה מורכבת 0.1 M HEPES pH 6.75, 22% פג 8000.
  3. לטחון את הקריסטלים עם מטחנה רקמות 0.1 מ"ל ו לדלל ב זריעה מאגר (יחס 1: 100).
  4. לעכל aliquot של חלבון מניות הפתרון (15 מ"ג/מ"ל) עם טריפסין (0.5 mg/mL במאגר אותו) עבור h 1 (1:10 (v/v)).
  5. מערבבים את הפתרון חלבון מתעכל עם 10% של זרע המכיל מאגר (v/v).
  6. לגדל גבישים (10 * 10 * 20 מיקרומטר3) ב- 0.1 M HEPES pH 7, 14% יתד 8000, 0.1 MgCl2 ב- 1-1.5 μL תלוי טיפות בשיטת דיפוזיה אדי.

3. קריסטל הרכבה

  1. השתמש לולאה מתאים, למשל, רשת לולאה 700 חורים מרובעים של 25 מיקרומטר רכוב על בעל מדגם סטנדרטית השדרה25. העברת קריסטלים מהמסירה התגבשות (שלב 2.6) לתוך µL 1 של פתרון cryoprotectant (הפתרון טוב precipitant מעורבב עם גליצרול (20% v/v הסופי)).
  2. הר של slurry קריסטל החלבון לתוך לולאה רשת על-ידי הזזת הלולאה תחת הקריסטלים והרמה אותם מתוך הירידה. אידיאלי הקריסטלים צריך להיות בטווח גודל של 5 מיקרומטר – 30 מיקרומטר בממד מקסימלית עם אין חפיפה בין הגבישים רכוב בתוך המעגל.
  3. לפתיל את הנוזל העודף על-ידי נגיעה ההר במהירות עם נייר סינון. משקעים הקריסטלים כך הם יושבים במישור של הלולאה מוקף מעט נוזל בכמות גדולה ככל האפשר.
  4. טיבלו את ההר unipuck מלא חנקן נוזלי. לאחסן הדיסקית ב- 100 אלף דולר למכולה מתאימים עד קרן זמן זמין.

4. מנותק הכנת הניסוי סינכרוטרון

הערה: בקשת סינכרוטרון קרן זמן מוקדם ככל האפשר, עקוב אחר ההנחיות באינטרנט עבור סוגי גישה זמינה ועל כיצד להגיש בקשה סינכרוטרון נתון. ניתן למצוא את ההנחיות ESRF-http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Applying. אם חבר של ESRF בלוק הקצאת קבוצה (שקית), יישום עבור כל פרוייקט ספציפי אינה נחוצה. במקרה זה ניסויים צריך גישה אחראית התיק שלהם לגבי התזמון של קרן זמן.

  1. לאחר ההצעה מתקבלת וקיבל הזמנה עבור הניסוי, שיהיה כל המשתתפים להשלים הדרכות בנושאי בטיחות. מלאו את "A-" (דרך הפורטל משתמש ESRF, http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Preparing/new-a-form) עם המידע הבטיחות הנדרשים על הדגימות. צור קשר עם איש הקשר המקומי כדי לדון את הניסוי. ברגע שלך-הטופס זה נאספו ואומתו זה ייתן לך את הניסוי מספר ואת הסיסמה.
  2. להתחבר ISPyB מורחבים26 (http://www.esrf.fr/) ובחר MX.
  3. להיכנס למערכת באמצעות מספר הניסוי ואת הסיסמה מהטופס A.
  4. בחר משלוח | הוסף חדש , מלאו הפרטים הנדרשים.
  5. בחר חבילה להוסיף ולמלא את הנתונים הרלוונטיים. בחר להוסיף מיכל, לבחור unipuck ומלא את המידע הנדרש, כולל את העמדות של בעלי לדוגמה הדיסקוס.

5. טעינה של המדגם על גבי הפרעות לקרן החלקיקים

  1. ב. האץ ', ניסיוני לטעון את הדיסקית לתוך המחליף מדגם (SC) דיואר ורשום את מיקומו.
  2. משתלבים הבקתה ניסיוני והזן את האץ שליטה.
  3. התחבר עם ISPyB (https://esrf.fr/). בחר להכין ניסוי, למצוא את המשלוח, בחר הבא ולציין את הפרעות לקרן החלקיקים ואת המיקום הדיסקית ב SC.
  4. היכנס לתוך הפרעות לקרן החלקיקים בקרת התוכנה, כאן27,MXCuBE228 עם מספר ניסיוני ואת הסיסמה שסופקה על A-הטופס.
    1. לחץ על סינכרון כדי לסנכרן את תוכנת שליטה הפרעות לקרן החלקיקים עם מסד הנתונים ISPyB.
  5. השתמש בתוכנת שליטה של הפרעות לקרן החלקיקים, כדי לטעון את בעל מדגם על גבי מד זווית. MXCuBE2, עמדה באזור מחלף מדגם קליק ימני ובחר דוגמת הר.
  6. תוך ניצול של MK3 קאפה מיני מד זווית29 מותקן לכל היותר beamlines ESRF MX, השימוש של MXCuBE2 'חזותי יישור מחדש' זרימת העבודה30 כדי ליישר את המטוס של בעל מדגם עם ציר הסיבוב של מד זווית.
    1. בחר בלחצן מרכז , מרכז מכן 3 לחץ על האמצע לקצה קצהו של הלולאה. שמור את המיקום ממורכזת על-ידי בחירה לשמור.
    2. לחץ שוב על לחצן ' מרכז , מרכז מכן 3 לחץ אמצע תחילת הגזע של הלולאה. שמור במיקום השני גם כן על ידי לחיצה על שמור.
    3. בחר באחד המיקומים ממורכז שנשמרו על-ידי לחיצה על זה.
    4. תחת מתקדם, להוסיף את זרימת העבודה חזותיים ולהתפכחות לתור אוסף נתונים MxCuBE2.
    5. להפעיל את זרימת העבודה על ידי לחיצה על לאסוף את התור.
    6. לאחר שזרימת העבודה מיישר את המטוס של בעל מדגם עם ציר הסיבוב של מד זווית, מרכז בעל מדגם שוב, הפעם איפשהו באמצע רשת השינוי.
  7. אוריינט בעל מדגם כך הפנים של רשת השינוי הוא בניצב לכיוון קרן רנטגן על-ידי סיבוב הציר אומגה באמצעות MXCuBE2.
  8. MXCuBE2, בחר את גודל קרן הנדרש עבור סריקה של המחזיק לדוגמה (רק עבור beamlines עם גודל הקרן משתנה).
    1. לחץ על התפריט בתוכנה שליטה הפרעות לקרן החלקיקים צמצם הנפתח ובחר של ערך, למשל, 10 מיקרומטר.
  9. הגדר רשת סריקת רשת.
    1. לחץ על סמל הכלי רשת שינוי ב- MXCuBE2. יופיע חלון הכלי רשת שינוי.
    2. בתצוגה מדגם של MXCuBE2, צייר את הרשת על-ידי לחיצה על השמאלי וגרירת העכבר מעל האזור המכיל קריסטלים על המחזיק לדוגמה.
    3. כדי להציל רשת השינוי ללחוץ על כפתור פלוס בחלון כלי רשת (רשת הופך ירוק).

6. מכינים ובצע את זרימת העבודה MeshAndCollect

  1. בתחום ברזולוציה של MXCuBE2, הזן את הרזולוציה (dדקות)-איזה עקיפה התמונות צריך להיות שנאספו, למשל, כאן 1.8 Å.
  2. בחר MeshAndCollect בכרטיסיה אוסף נתונים מתקדם , להוסיף את התור ולחץ לאסוף התור.
  3. בחלון פרמטר אשר מופיעה, השתמש בפרמטרים מחדל התלויים הפרעות לקרן החלקיקים. בניסוי המתוארים כאן ברירות מחדל הפרמטרים הם 0.037 זמן החשיפה s לכל נקודת סריקת רשת שינוי, שידור 100% (המוביל במקרה זה עונה 4 פרק 1011 ph/s), תנודה 1 ° לשורה סריקת רשת.
  4. לחץ על Continue. מפעיל הסריקה עם רשת שינוי, תמונות דיפרקציה שנאסף בכל נקודה ברשת ניתח, מדורגת לפי חוזק עקיפה עם התוכנה DOZOR1. תהליך זה פועל ברקע.
  5. לאחר הניתוח DOZOR נוצרת מפה חום ולא הסדר עבור אוספי נתונים חלקיים עוקבות מוקצה באופן אוטומטי בהתבסס על כוחו עקיפה (ראה איור 1).
    הערה: התוצאות של שלב זה ניתן גם לבדוק ISPyB. עבור האוסף של ערכות נתונים חלקיים שכרטיסיה חדשה עם הגדרות יצוץ בתוכנה שליטה הפרעות לקרן החלקיקים, בחר ערכים מתאימים עבור טווח סיבוב (קרי, 0.1 º), מספר תמונות (קרי, 100), זמן החשיפה, רזולוציה, שידור, קרן הפוך וכו באופן אידיאלי המנה עבור כל טריז להיות שנאספו צריך להיות מתחת לגבול Garman (30 MGy). הזמן המשוער חשיפה לכל תמונה הוא 0.037 s כדי 0.1 s בתנאי הניסוי המתואר.
  6. לחץ על המשך כדי לשגר את אוספי נתונים חלקיים.

7. עיבוד נתונים

הערה: ערכות הנתונים חלקיים משולבים עם תוכנית מתאימה (XDS10). בשביל זה תסריט פיתון ישמש מזהה כל ערכת נתונים בודדות, משלב זה ומוודא כי יצירת האינדקסים בין קבוצות נתונים חלקיים שונים הוא עקבי.

  1. פתח את התיקיה המכילה את התמונות: /data/visitor/mxXXXX/beamline_name/date/RAW_DATA/Cerulean.
  2. צור עותק בטיחות של תיקיית משנה תהליך זה יכול להימצא בתיקיה שבה נאספים ערכות הנתונים חלקיים.
    1. הטרמינל לינוקס, להשתמש את הפקודה cp – r תהליך process_backup.
  3. נווט אל התיקיה התהליך ולהפעיל את התסריט עיבוד.
    1. על הטרמינל Linux, הקלד את הפקודה cd תהליך , והקישו על enter.
    2. סוג procMultiCrystalData והקישו על enter.
      הערה: קובץ ה-script יבקש קבוצת מרחב והזן התא בפרמטרים (מידע זה הוא אופציונלי), אלה בהתאם להוראות. לאחר אישור המשתמש האחרון, ה-script יפעל באופן אוטומטי.

8. מיזוג של ערכות נתונים

הערה: לאחר כל ערכות נתונים חלקיים משולבים השילוב הטוב ביותר של אותם ימוזגו כדי לייצר את ערכת הנתונים הסופי לשימוש מכשור לקביעת קשיות ומבנה ועידון. מטרות שונות של תהליך מיזוג זה ניתן להשיג השלמות המלאה (מומלץ מאוד), ריבוי גבוה או הנתונים הסטטיסטיים הנתונים הטוב ביותר (גבוהה < I/σ(I) >, R נמוכה-גורמים, וכדומה). האחרון יכול להיות לפעמים על חשבון לשלמות ו/או ריבוי אז יש לבחור באפשרות זו בזהירות.

  1. מיזוג ערכות הנתונים חלקית באמצעות תוכנית ccCluster14. היא משתמשת ניתוח האשכולות היררכי (HCA) כדי לקבוע צירופים אפשריים של ערכות נתונים חלקיים isomorphous ().
    1. הקלד ccCluster מסוף Unix כדי לפתוח את ממשק המשתמש הגרפי (GUI).
      הערה: ב- ccCluster GUI dendrogram מצויר. זה נותן הצעה לאיזה ערכות נתונים חלקיים ייתכן בצורה הטובה ביותר למזג בהתבסס על איזומורפיזם ביניהם.
    2. לחץ על הצומת המתאים לערך של 0.4 בציר האנכי. באופן כללי, ערכים גבוהים יותר יכלול נתונים חלקיים יותר ערכות אבל עלול להחמיר מיזוג נתונים סטטיסטיים כמו ערכות נתונים חלקיים יהיה פחות isomorphous.
    3. לחץ על מיזוג נתונים. האשכול שנבחרה יעובדו ברקע, הנתונים הסטטיסטיים מיזוג מוערך יופיע בכרטיסיה חדשה ב- GUI. ניתן לחזור על שלב זה עבור צירופים שונים של ערכות נתונים. עבור שילוב טוב של ערכות נתונים חלקית שלמות התרגום צריך להיות ל 100 אחוז, < I/σ(I) > ערכים גבוהים (10 ומעלה במעטפת ברזולוציה הנמוכה ביותר) הערכים31 R-לי נמוך (כ-5% במעטפת ברזולוציה נמוכה).
  2. עבור כל שילוב שבחרת להשתמש בתסריט קלט שנוצר כדי למזג חלקי ערכות הנתונים שנבחרו לתוך קובץ בודד mtz (קרי, טעם32).
  3. בהחלט קנה מידה, למזג את הנתונים העוצמה בקובץ זה באמצעות תוכנית שינוי קנה המידה (קרי, תכלית32) ולהשתמש, כמו עם קובץ שמקורם אוסף נתונים יחיד קריסטל, הפלט בהדרגה עוקבות והפתרון מבנה33 .

Representative Results

MeshAndCollect, כפי מיושם ב- MXCuBE2 (ראה איור 1A), שימש עבור האוסף של ערכות נתונים חלקיים עקיפה מקריסטלים קטנים של Cerulean ממוקם על בעל מדגם זהה שבו זיהוי חזותי של גבישים היה קשה. למסך בעל מדגם, ציירנו רשת מעל למרכז meshloop (ראה איור 1B) מבוסס על DOZOR הציון חום מפה עקיפה חלקית 85 (ראה דמויות 1C, ד 1), ערכות נתונים שנאספו באופן אוטומטי. אלה היו משולבים בנפרד ולאחר מכן התמזגה (ראה לעיל) כדי ליצור ערכת נתונים עם השלמות 99.8% ב- dדקות = 1.7Å (ראה טבלה 1). חצי-set קורלציה (1/2CC)34 במעטפת ברזולוציה הגבוהה ביותר היה 60% (= 4.7). כצפוי, מבנה הגביש של Cerulean יכולות אבר המין הגברי להיפתר ע י החלפת מולקולרית33 באמצעות ערכת הנתונים נוצר. לאחר עידון, השגנו על Rעובד של 22.8%, של Rחינם של 25.4%. הסופרפוזיציה עם המבנה נקבע בעבר (PDB כניסה 2WSO21) מראה של rmsd העולמי על עמדותα C 0.1 Å.

סטטיסטיקה של ערכת הנתונים הממוזגים
קיבוץ באשכולות הסף 0.35
מספר datasets חלקית 25
חבורת סימטריות מרחבית P212121
תא יחידה (a, b, c) 50.98, 62.76, 69.50
רזולוציה בטווח 46.58-1.70 (1.73-1.70)
Rmerge (כל אני + ואני -) 0.133 (0.743)
Rmeas (כל אני + & אני?) 0.142 (0.813)
Rpim (כל אני + & אני?) 0.047 (0.318)
תצפיות סה כ/ייחודי 220693/25129
Mean((I)/sd(I)) 13.8 (4.7)
המתאם חצי-set Mn(I) CC(1/2) 0.994 (0.602)
השלמות 99.8 (99.5)
ריבוי 8.8 (6.5)
R הסופיcryst 22.8
סופי Rחינם 25.4

טבלה 1: סטטיסטיקה של ערכת הנתונים הממוזגים המציין את האיכות הגבוהה של הנתונים שנאספו.

Figure 1
איור 1: שימוש MeshAndCollect כדי לאסוף סדרה של ערכות נתונים חלקיים מתוך סדרה של גבישים קטנים הכלול בעל מדגם זהה. A)-ממשק המשתמש של MXCuBE2. האליפסה ירוק מעל לשדה הצופה על ציר מצביע הכלי רשת. B) עם זה ברשת מצויר על גבי התמונה של בעל מדגם בשטח תמונת החיים. ג) חום מפת התוצאות DOZOR. ד) דוגמה של תמונת עקיפה. ה) Dendrogram לאחר ניתוח האשכולות הירארכי. ערכות נתונים באדום שימשו לצורך מיזוג. F) מבנה הכוללת של Cerulean. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

ההצלחה של ניסוי MX בדרך כלל תלוי קיומו של גדול יחסית, ובכן diffracting קריסטלים. עבור פרוייקטים שבו נכשל אופטימיזציה ממקלחות קריסטל קטנים כדי גבישים גדולים יותר, MeshAndCollect מספק אפשרות להשיג dataset עקיפה מוחלטת עבור מבנה הפתרון באמצעות השילוב של isomorphous ערכות נתונים חלקיים שנאספו מתוך סדרה של גבישים קטנים. השיטה זו תואמת ל- beamlines סינכרוטרון עבור MX, אידיאלי עם זרימה גבוהה פוטון, קוטר הקורה קטן, מצוידים עם מכשיר diffractometer משוכללת גלאי במהירות readout. על כך תחנת הקצה, החלק אוסף נתונים של ניסוי כזה יקח 20 דקות, בהתאם את מספר ערכות נתונים חלקיים להיות שנאספו ואת המספר של קריסטל המכילות מחזיקי הדגימה כדי להיות מנותח.

תנאי מוקדם חשוב ביותר להצלחת ניסוי MeshAndCollect היא קיומם של מספר מספיק (לפחות 50, 100 אידיאלי) של diffracting עמדות על המחזיק לדוגמה. מניסיון, הגודל המינימלי של הקריסטלים כדי להיות מנותח צריך להיות כ-5 µm בממד הקטן ביותר. השיטה היא תואם עם כל סוג של תקן תואמת קירור-הקפאה לטעום מחזיקי עם התוצאות הטובות ביותר להיות מושגת באמצעות רשת שינוי טעינות נוקשה ובלתי ישרים.

-ESRF, MeshAndCollect מיושם באופן ידידותי למשתמש Passerelle (http://isencia.be/passerelle-edm-en) זרימת העבודה30 זמין מתוך התוכנה בקרת הפרעות לקרן החלקיקים MXCuBE2. היתרון העיקרי של MeshAndCollect לעומת שיטות אחרות-SX הוא כי ניתן לעבד את הנתונים שנאספו על ידי תוכנות סטנדרטיות, אוטומטית צינורות משמש גביש יחיד MX.

כפי בדוגמה שלנו, MeshAndCollect קל מאוד ליישם ומוביל אל סדרה של ערכות נתונים חלקיים עקיפה, שנאסף בדרך כלל גבישים קטנים, אשר ניתן למזג להפיק ערכת נתונים מלאה לשימוש בפתרון המבנה. יתרה מכך, MeshAndCollect יש את היכולת לפתוח את החלל דגימה לקריסטלוגרפיה חלבון כפי שהיא מספקת דרך לאיסוף נתונים שמיש מניסויים התגבשות איפה השלב האחרון אופטימיזציה, הייצור של גבישים גדולים, לא מוצלח.

לאור ההתפתחויות הנוכחית כלפי מקורות רנטגן בהיר יותר (למשל, פרוייקט/ESRF מקור מאוד מבריק (EBS)35) זה הנראה לעין עקב נזק קרינה מוגברת, הסוג של איסוף נתונים מרובת קריסטל הקל על ידי MeshAndCollect יהפכו השיטה הרגילה של איסוף נתונים, ולא חריג – כפי שקורה כיום - על-מבוססות סינכרוטרון beamlines MX.

Disclosures

המחברים אין לחשוף

Acknowledgments

אנו מודים על ESRF למתן קרן זמן באמצעות תוכנית מחקר שבאתר שלה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Beamline ESRF ID 23-1
Concentrators: Amicon Ultra-4 Ultracel -30K Merck Millipore UFC803024
Crystallization plates XDXm with sealant Hampton Research HR3-306
EDTA- free protease inhibitors Roche 4,693,159,001
Escherichia coli BL21 (DE3) Life Technologies Thermo Fisher Scientific C600003
glycerol VWR Chemicals Prolabo 14388.29T
HEPES Euromedex 10-110-C
His-trap HP GE healthcare 17-5247-01
imidazole Sigma-Aldrich 56750-500G
MgCl2 Sigma-Aldrich 13452-1KG
MicroMeshes 700/25 MiTeGen SKU: M3-L18SP-25L
NaCl Fisher Chemical S/3160/60
PEG8000 Sigma-Aldrich P5413-500G
Sonicator vibra cell 75/15 SONICS
Superdex 75 10/300 -GL GE healthcare 17-5174-01
Tris base Euromedex 26-128-3094-B
Trypsin Sigma-Aldrich T9201-1G
Unipuck Molecular Dimensions MD7-601
Name Company Catalog Number Comments
Programs
ISPyB ESRF Solange Delagenière, Patrice Brenchereau, Ludovic Launer, Alun W. Ashton, Ricardo Leal, Stéphanie Veyrier, José Gabadinho, Elspeth J. Gordon, Samuel D. Jones, Karl Erik Levik, Seán M. McSweeney, Stéphanie Monaco, Max Nanao, Darren Spruce, Olof Svensson, Martin A. Walsh, Gordon A. Leonard; ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography, Bioinformatics, Volume 27, Issue 22, 15 November 2011, Pages 3186–3192, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btr535 local development
aimless MRC Laboratory of Molecular Biology Evans, P.R., Murshudov, G.N. How good are my data and what is the resolution? Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69 (7), 1204–1214, doi: 10.1107/S0907444913000061 (2013).
ccCluster ESRF Santoni, G., Zander, U., Mueller-Dieckmann, C., Leonard, G., Popov, A. Hierarchical clustering for multiple-crystal macromolecular crystallography experiments: the ccCluster program. Journal of Applied Crystallography. 50 (6), 1844–1851, doi: 10.1107/S1600576717015229 (2017). local development
DOZOR ESRF Bourenkov and Popov, unpublished local development
MeshAndCollect workflow ESRF Zander, U. et al. MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (11), 2328–2343, doi: 10.1107/S1399004715017927 (2015). local development
MXCuBE2 ESRF Gabadinho, J. et al. MxCuBE: a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700–707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010). De Santis, D., Leonard, G. Notiziario Neutroni e Luce di Sincrotrone,Consiglio Nazionale delle Ricerche. (19), 24–226 (2014). local development
XDS Max-Planck-Institut für Medizinische Forschung Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125–132, doi: 10.1107/S0907444909047337 (2010)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zander, U., et al. MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71, (11), 2328-2343 (2015).
  2. Henderson, R. Cryo-Protection of Protein Crystals against Radiation Damage in Electron and X-Ray Diffraction. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 241, (1300), 6-8 (1990).
  3. Chapman, H. N., et al. Femtosecond X-ray protein nanocrystallography. Nature. 470, (7332), 73-77 (2011).
  4. Schlichting, I. Serial femtosecond crystallography: the first five years. IUCrJ. 2, (2), 246-255 (2015).
  5. Stellato, F., et al. Room-temperature macromolecular serial crystallography using synchrotron radiation. IUCrJ. 1, (4), 204-212 (2014).
  6. Gati, C., et al. Serial crystallography on in vivo grown microcrystals using synchrotron radiation. IUCrJ. 1, (2), 87-94 (2014).
  7. Coquelle, N., et al. Raster-scanning serial protein crystallography using micro- and nano-focused synchrotron beams. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71, (5), 1184-1196 (2015).
  8. Diederichs, K., Wang, M. Serial Synchrotron X-Ray Crystallography (SSX). Protein Crystallography. 1607, 239-272 (2017).
  9. Borshchevskiy, V. I., Round, E. S., Popov, A. N., Büldt, G., Gordeliy, V. I. X-ray-Radiation-Induced Changes in Bacteriorhodopsin Structure. Journal of Molecular Biology. 409, (5), 813-825 (2011).
  10. Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66, (2), 125-132 (2010).
  11. Winter, G., et al. DIALS implementation and evaluation of a new integration package. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 74, (2), 85-97 (2018).
  12. Winter, G. xia2: an expert system for macromolecular crystallography data reduction. Journal of Applied Crystallography. 43, (1), 186-190 (2010).
  13. Monaco, S., et al. Automatic processing of macromolecular crystallography X-ray diffraction data at the ESRF. Journal of Applied Crystallography. 46, (3), 804-810 (2013).
  14. Santoni, G., Zander, U., Mueller-Dieckmann, C., Leonard, G., Popov, A. Hierarchical clustering for multiple-crystal macromolecular crystallography experiments: the ccCluster program. Journal of Applied Crystallography. 50, (6), 1844-1851 (2017).
  15. Zander, U., et al. Merging of synchrotron serial crystallographic data by a genetic algorithm. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 72, (9), 1026-1035 (2016).
  16. Foadi, J., et al. Clustering procedures for the optimal selection of data sets from multiple crystals in macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69, (8), 1617-1632 (2013).
  17. Tsien, R. Y. The Green Fluorescent Protein. Annual Review of Biochemistry. 67, (1), 509-544 (1998).
  18. Heim, R., Prasher, D., Tsien, R. Y. Wavelength mutations and posttranslational autoxidation of green fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 91, (26), 12501-12504 (1994).
  19. Cubitt, A. B., Woollenweber, L. A., Heim, R. Chapter 2: Understanding Structure-Function Relationships in the Aequorea victoria Green Fluorescent Protein. Methods in Cell Biology. 58, 19-30 (1998).
  20. Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. An improved cyan fluorescent protein variant useful for FRET. Nature Biotechnology. 22, (4), 445-449 (2004).
  21. Lelimousin, M., et al. Intrinsic Dynamics in ECFP and Cerulean Control Fluorescence Quantum Yield. Biochemistry. 48, (42), 10038-10046 (2009).
  22. Gotthard, G., von Stetten, D., Clavel, D., Noirclerc-Savoye, M., Royant, A. Chromophore Isomer Stabilization Is Critical to the Efficient Fluorescence of Cyan Fluorescent Proteins. Biochemistry. 56, (49), 6418-6422 (2017).
  23. Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expression and Purification. 41, (1), 207-234 (2005).
  24. Rhodes, G. Crystallography made crystal clear: a guide for users of macromolecular models. Elsevier/Academic Press. Amsterdam; Boston. (2006).
  25. Cipriani, F., et al. Automation of sample mounting for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 62, (10), 1251-1259 (2006).
  26. Delageniere, S., et al. ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography. Bioinformatics. 27, (22), 3186-3192 (2011).
  27. Gabadinho, J., et al. MxCuBE a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17, (5), 700-707 (2010).
  28. De Santis, D., Leonard, G. Notiziario Neutroni e Luce di Sincrotrone. Consiglio Nazionale delle Ricerche. (2014).
  29. Brockhauser, S., Ravelli, R. B. G., McCarthy, A. A. The use of a mini-κ goniometer head in macromolecular crystallography diffraction experiments. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69, (7), 1241-1251 (2013).
  30. Brockhauser, S., et al. The use of workflows in the design and implementation of complex experiments in macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68, (8), 975-984 (2012).
  31. Diederichs, K., Karplus, P. A. Improved R-factors for diffraction data analysis in macromolecular crystallography. Nature Structural Biology. 4, 269 (1997).
  32. Evans, P. R., Murshudov, G. N. How good are my data and what is the resolution? Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69, (7), 1204-1214 (2013).
  33. Taylor, G. L. Introduction to phasing. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66, (4), 325-338 (2010).
  34. Karplus, P. A., Diederichs, K. Linking Crystallographic Model and Data Quality. Science. 336, (6084), 1030-1033 (2012).
  35. Dimper, R., Reichert, H., Raimondi, P., Ortiz, L. S., Sette, F., Susini, J. ESRF upgrade programme phase II (2015 - 2022). The orange book. (2015).
מבנה תמיסת Cerulean חלבון פלואורסצנטי באמצעות MeshAndCollect
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hutin, S., Santoni, G., Zander, U., Foos, N., Aumonier, S., Gotthard, G., Royant, A., Mueller-Dieckmann, C., Leonard, G. Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect. J. Vis. Exp. (145), e58594, doi:10.3791/58594 (2019).More

Hutin, S., Santoni, G., Zander, U., Foos, N., Aumonier, S., Gotthard, G., Royant, A., Mueller-Dieckmann, C., Leonard, G. Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect. J. Vis. Exp. (145), e58594, doi:10.3791/58594 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter