Summary
İnterferon-gamma ELISpot tahlil için eskiden şiling şimdi domuz PBMCs gelişimi bulaşıcı hastalıklar çalışmak için son derece alakalı bu modelde T hücreli yanıt karakterizasyonu sağlar. DNA aşıları intradermal teslimatla ilişkili T hücre yanıtları ölçmek için tahlil başvurdum.
Abstract
Eskiden şiling şimdi domuz tüberküloz, grip, difteri ve viral Hemorajik ateş gibi bulaşıcı hastalıklar için aşıların geliştirilmesi ilgili küçük hayvan modeli olarak önemli bir rol oynamış. Plazmid DNA (pDNA) aşı teslim deri içine eskiden şiling şimdi domuz sağlam humoral yanıt aydınlığa çıkartıyor göstermiştir. Ancak, bu hayvan modeli bağışıklık yanıtı için kullanımı biraz T hücre yanıt-e doğru incelemek için protokoller ve kullanılabilir reaktifler eksikliği nedeniyle geçmişte sınırlı. T hücreleri immunoprophylactic ve immunotherapeutic mekanizmaları çok önemli bir rol oynamaktadır. T hücre yanıt-e doğru anlamak bulaşıcı hastalık ve onkoloji aşı ve accomodating teslim cihazlar gelişimi için çok önemlidir. Burada eskiden şiling şimdi domuz periferik kan mononükleer hücreler (PBMCs) için bir interferon-gamma (IFN-γ) immunospot (ELISpot) enzim bağlı tahlil açıklayın. Tahlil araştırmacılar aşı özgü T hücreli yanıt bu önemli kemirgen modelde karakterize sağlar. Hücrelerin periferik kandan izole tahlil yeteneği immünojenisite bireysel hayvanlarda izlemek için fırsat sağlar.
Introduction
Burada açıklanan protokol interferon-gamma tespiti (IFN-γ) salgılayan hücreler antijen hatırlama Hartley eskiden şiling şimdi pigs--dan hasat periferik kan mononükleer hücre (PBMC) nüfus sonra izin verir. Kinetik ve büyüklükleri antijen spesifik T hücre tepkileri bir grip aşı rejimi kobay olarak karakterize etmek için tahlil başvurdum. Bu protokol önemli ölçüde son derece alakalı bu hayvan modelinde aşı programlarının önceden klinik geliştirme itmek olacaktır inanıyorum.
Aşılar tarafından elde edildi T hücreler enfeksiyöz ajanlar ve diğer hastalıklarla ilişkili immunotherapeutic yollar karşı koruma önemli bir rol oynamaktadır. T hücreleri önemini birden fazla aşı çalışmaları vurgulanmış bulunmaktadır. Bağışıklama yaban gelinciği ve plazmid DNA (pDNA) ile fareler H5 hemagglutinin ve morbidite ve mortalite antikorlar, önemini belirten nötralize yokluğu bir grip virüsü Challenge N1 neuraminidase sağlanan koruma için kodlama T hücre bağışıklık1. Ek olarak güçlü humoral yanıt nötralize T-hücreleri sadece viral izni2 aynı zamanda enfeksiyon respiratuvar sinsityal virüs (RSV) ile koruma için çok önemli bir rol fareler3' te oynamak. İnsanlarda, önceden varolan CD8 + T hücreleri 20094' te Pandemik H1N1 sırasında azalan hastalık şiddeti ile ilişkili bulunmuştur. CD4 + T hücre sayısı ile birlikte belirli sitokin plazma konsantrasyonu RSV-enfekte çocuklar5şiddetinde hastalığı ile ilişkili.
Eskiden şiling şimdi domuz araştırma ve ilaç cilt Sensitizasyonu, beslenme araştırma, işitme sisteminin ve bu eser, bulaşıcı hastalıklar için en uygun çalışmalar gibi çeşitli alanlarda geliştirme için bir laboratuvar model olarak önem kazanmıştır. Tüberküloz ve difteri karşı aşı keşfi için çok önemli. Son zamanlarda eskiden şiling şimdi domuz grip6 ve Ebola7için bir model olarak kullanılır. Ayrıca, insan derisi8fizyolojik benzerlikler sahip, eskiden şiling şimdi domuz dermal ilaç teslim yöntemi için erişilebilir bir küçük hayvan modeli sunar. Bir laboratuar modeli olarak önemini aksine, eskiden şiling şimdi domuz belirli deneyleri ve sondalar bağışıklık yanıtı karakterize etmek için sınırlı9kalır. Önceden klinik ve klinik araştırmada T hücre yanıt numaralandırmak için rutin olarak kullanılan IFN γ enzim bağlı immunospot (ELISpot-tahlil) gibi temel hücresel deneyleri mevcut olmamıştır.
İlk katı fazlı enzim bağlı immunospot deneyleri belirli antikor salgılayan hücreler farklı B hücre-nüfus10,11sayısını belirlemek için kullanılmıştır. Sitokinler Il-1, IL-2, dahil olmak üzere salgılayan hücreleri tespit etmek için gelişmiş bir biçimi Il-4, IL-5, IL-6, IL-10, GM-CSF, TNF-alfa, TNF-beta, granzyme B ve IFN γ. ELISpot tahlil yüksek hassasiyet sahiptir; potansiyel olarak her sitokin üreten hücre tespit edilebilir. Algılama ELISpot deneyleri için limit 100.000 PBMCs12başına 10 lekeler daha düşük olduğu bildirilmiştir. Bir kobay IFN γ spesifik antikor çift kullanılabilir13yeni yapıldı ve bu alandaki bu eksikliği gidermek için fırsat açtı.
IFN γ edinilmiş bağışıklık yanıtındaki bir önemli efektör molekül olarak kabul edilir; üretilen ve etkinleştirme üzerine CD4 ve CD8 T hücreleri tarafından salgılanan. IFN γ sahip geniş bir aralığı biyolojik fonksiyonları makrofajlar aktivasyonu ve MHC kompleksi kadar düzenlenmesi gibi bir virüs enfeksiyonu (MHC) bir bağışıklık yanıtı bağlamında ben ve MHCII ifade. Bu da B-hücre farklılaşması teşvik, T-helper-2 hücre büyümesini engeller ve doğal katil hücreler etkinleştirir. IFN γ virüslü somatik hücreler ve MHC molekülleri upregulates ifade viral çoğaltma engeller. Böylece, IFN γ üretimi bir aşı veya patojen T hücre yanıtı kalitesi çok önemli bir göstergesidir.
Burada sunulan IFN γ ELISpot önemli bir yönünü splenocytes yerine PBMCs13kullanımıdır. Splenocytes topluluğu dalak hasat önce hayvan euthanization gerektirir, ancak PBMCs olmayan terminal toplanan kan örneği, işleme tarafından elde edilebilir. PBMCs kullanımı IFN γ T hücreli yanıt üzerinde bir süre ve T-hücre yanıtları asal artışı rejimleri14gibi etkilerinin izlenmesi için sağlar.
Eskiden şiling şimdi domuz hayvan bir model olarak kullanmakta olan araştırmacılar için bilimsel veri onlar elde edebilirsiniz IFN γ ELISpot yöntemi genişletecek. Onun durumu şimdi hangi hücresel yanıt incelenmesi için reaktif kullanılabilirlik nedeniyle daha önce seçilmiş hedef hastalık için daha az alakalı hayvan modelleri ile çalışmalar yapmak için zorunluluk azaltabilir. Dalak veya lenf düğümleri değil, PBMCs kullanımına terminal deneyler ve bireysel hayvanların sürekli izlenmesi için izin verir.
Aşağıda bir IFN γ hücresel yanıt olarak eskiden şiling şimdi pigs pDNA aşı tespiti katılan adımlar ayrıntılı bir açıklamasını sağlar. Biz belirli bir teslimat prosedürü anahat ve kan örnekleme, kan işleme, PBMC hasat, tahlil yordam ve veri analizi kapsayan genel ELISpot tahlil açıklayın. ELISpot testin bir şematik resim 1' de tasvir edilir.
Resim 1 : Eskiden şiling şimdi domuz ELISpot Protokolü şematik bakış. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Protocol
Tüm yöntem tanımlamak burada hayvan bakım ve kullanım Komitesi (ACUC), Acculab tarafından onaylanmıştır.
Not: Protokol potansiyel tehlikeli madde kullanımını gerektirir. Lütfen üreticinin MSDS için bakın ve uygun kişisel donanımları (PPE) prosedür boyunca.
1. eskiden şiling şimdi domuz bağışıklama sitesinin, intradermal Mantoux-enjeksiyon ve CELLECTRA-3P-EP-yordam hazırlık
-
Eskiden şiling şimdi domuz tedavi ücreti hazırlanması.
- Eskiden şiling şimdi domuz bir indüksiyon odasında koyun ve %5 uyuşturan Isoflurane buharı.
- Hayvan odasından çıkarın ve anestezi prosedürü boyunca korumak için % 2 Isoflurane buharı sağlayan pozisyonda burun konisi yerleştirin.
- Karın kanatta yaklaşık2 4 cm alan tıraş.
- Etanol-bez ile traş alanı dezenfekte.
-
Enjeksiyon pDNA formülasyonu ve Elektroporasyon yordam.
- Bir insülin şırınga 100 µl formülasyonu dermise Mantoux tekniği ile enjekte etmek için kullanın. İğne eklenir hayvanın vücut ile 10 derecelik bir açıyla yukarı eğim.
- İğne kaldırmak ve hemen CELLECTRA® - 3 P elektrot dizi enjeksiyon histaminin eklerseniz ve elektrik alanı.
- Hayvan anesteziden kaldırmak ve kendi kurtarma izlemek.
2. Sigara-terminal bleed
-
Juguler ven koleksiyonundan kan anaesthetized eskiden şiling şimdi domuz.
- Eskiden şiling şimdi domuz bir indüksiyon odasında yerleştirin ve 1.1.1 içinde açıklandığı gibi hayvan uyuşturan
- 3 ml 27G 1/2 inç iğne ile kullanarak, juguler ven anaesthetized hayvan noktalamak ve 3 ml kan toplamak.
- Hemen kan K2EDTA kan toplama tüp içine aktarmak, tüp birkaç kez kan Anti-koagulant ve buz üzerinde yer ile karıştırmak için ters çevir.
Not: kaçınma, kan pıhtılaşması kan örneği başarılı aşağı akım işlenmesi için önemlidir. - Hayvan kurtarma izlemek.
3. kan örnek işleme
-
Tam kan yoğunluğu-gradient Santrifüjü tarafından PBMCs, ayrılık
- Kan Hank'in dengeli tuz çözüm (HBSS ile) 1:1 oranında seyreltin.
Not: tüm bundan böyle iş kirlenmesini önlemek için aseptik teknik uygulama bir Biyogüvenlik dolapta yapılmalıdır. - Katman kan yavaş yavaş üzerinden 4.5 ml Ficoll-Paque Plus 15 ml konik tüp içinde seyreltilmiş. Arabirim rahatsızlık kaçının. Not: uygun ayırma emin olmak için Ficoll-Paque oda sıcaklığında olmalıdır.
- Tüpler, 30 dk için 800 rcf fren ile kapalı santrifüj kapasitesi.
Not: alternatif, SepMate™ tüpler (STEMCELL teknolojileri) PBMC-ayrılması için kullanılabilir. Kan HBSS seyreltilmiş 15 ml SepMate tüp ile 3,5 ml dolu eklenen Ficoll-Paque Plus ve 1200 rcf 10 dk (frene) adlı centrifuged. Bu zaman kazandıran degrade Santrifüjü teknik eşit canlılığı, hücre-verim ve nokta-oluşumu ile sonuçlanır. - Hasat Buffy-Coat katman ve R10 ortamda seyreltik (% 10 (v/v) ısı-devre dışı FBS ve % 1 (v/v) kalem/Strep RPMI1640 orta) toplam hacmiyle 15 ml.
- Pelet hücreleri tarafından 5 min için 450 rcf adlı centrifuging.
- Hücreleri iki kez R10 orta ile yıkayın.
- 1 ml R10 hücrelerde yeniden askıya alma ve hücre-süspansiyon 70 µm hücre-süzgeç aracılığıyla yeni bir tüp geçirin.
- Hücreleri saymak ve Trypan-mavi boyama canlı hücre sayısı belirler.
- R10 orta ve 1 x 10 bir konsantrasyon içeren hücreleri seyreltik ^ ml başına 6 canlı hücre.
- Kan Hank'in dengeli tuz çözüm (HBSS ile) 1:1 oranında seyreltin.
4. ELISpot-tabaklar ve hücre-stimülasyon hazırlanması
-
PBMCs tohumlama önce bir 96-şey ELISpot PVDF-membran plaka ceket ve blok kuyu.
- Plakalar için 60 saniye önceden işlenmiş olmalıdır. Etanol ön arıtma daha az belirsiz nokta-oluşumu ve geliştirilmiş tanımıyla lekeler neden olur.
: Dikkat tam membran 15 µl %35 ile temas geliyor emin olmak için ekstra bakım etanol. - 60 saniye sonra 150 µl 1 x PBS iyi ücret ekleyin ve sonra plakaları ters çevirme wells boş.
Not: Etanol öncesi çok zamana duyarlı tedavisidir. İyi-membran 60 sn membranlar yordamı aşağıdaki adımları sırasında kurumasına gerekir daha uzun kuluçkaya değil. - Üç kez 250 µl 1 x PBS ile plakalar iyi yıkayın.
- 100 µl/kuyu ile 5 µg/ml yakalama Anti-eskiden şiling şimdi domuz IFN γ antikor V-E4 PBS kat.
- Kaplamalar, en az 12 için kuluçkaya gönderilen 4° C'de
- Üç kez 250 µl/iyi PBS ekleyerek tabakları yıka.
- 200 µl/iyi engelleme arabellek (% 10 (w/v) sükroz ve %2 (w/v) BSA PBS) ekleyin ve oda sıcaklığında 2 saat kuluçkaya.
- 250 µl/iyi PBS ile plakalar üç kez yıkayın.
- Plakalar için 60 saniye önceden işlenmiş olmalıdır. Etanol ön arıtma daha az belirsiz nokta-oluşumu ve geliştirilmiş tanımıyla lekeler neden olur.
-
Antijen spesifik peptidler, pozitif ve negatif kontrolleri ile plaka PBMCs.
- R10 Protein-peptid havuzunda istenilen son peptid konsantrasyonu sulandırmak.
- Örnek PBMCs triplicates içinde tahlil.
Not: uyarıcı ile orta ELISpot plakaları önce ekleyin ve PBMC süspansiyon ikinci ekleyin. - Peptid-R10 orta 50 µl belirtilen wells için ekleyin.
- Negatif kontrol için 50 µl boş peptit formülasyonun R10 içinde belirtilen kuyu ekleyin.
- Pozitif kontrolü için 5 µg/ml Concanavalin A (ConA) R10 ortamda belirtilen kuyu ekleyin.
- PBMC hücre-süspansiyon, 100 µl bütün wells için Ekle
- 37 ° c 18 oksijen %5 CO2 atmosferinin levha kuluçkaya gönderilen.
Not: Yer ELISpot bile bir yüzey/raf kuluçka tabaklar ve tabakları herhangi bir rahatsızlık kuluçka süresi sırasında kaçının.
5. Interferon-gamma olumlu noktalar tespiti
-
Kuluçka algılama antikor ve plaka geliştirme ile.
Not: Bu bölümdeki tüm adımları için hiçbir aseptik teknik gereklidir.- Plakalar kuluçka dikkatli bir şekilde çıkarın ve güvenli bir şekilde wells boş. Plakalar için üç kez 250 µl/iyi PBS ekleyerek yıkayın.
- N-G3 seyreltilmiş 2 µg/ml biotinylated algılama Anti-eskiden şiling şimdi domuz IFN γ antikor 100 µl/kuyu engelleme arabellekte ekleyin.
Not: arka plan azaltmak için filtre (22 µm) antikor çözüm. - Algılama antikor 2 ile kuluçkaya gönderilen oda sıcaklığında.
- Üç kez 250 µl/iyi PBS ekleyerek süpernatant ve yıkama tabak atmak.
- Alkalen fosfataz (ALP) 100 µl/kuyu eklemek-Konjüge streptavidin engelleme arabellekte seyreltilmiş.
Not: arka plan azaltmak için filtre (22 µm) çözüm. - ALP-Streptavidin eşlenik ile Oda sıcaklığında 1 saat için kuluçkaya.
- ALP-Streptavidin çözüm atmak ve iki kez 250 µl/iyi PBS ekleyerek tabak yıkama ve plaka ters çevirme ve karşı temiz kağıt havlu kurutma tarafından aşırı PBS kaldırın.
- Bir kez 250 µl/iyi ultrasaf DI su ekleyerek tabak yıkama ve plaka ters çevirme ve karşı temiz kağıt havlu kurutma tarafından aşırı su kaldırın.
- BCIP/NBT (dikkat) substrat çözeltisi 100 µl her kuyunun içine ekleyin. Dikkat: BCIP/NBT son derece yanıcı ve toksik yuttu, deri ile temas veya inhale. Kullanmadan önce MSDS için başvurun.
- Işıktan korunan oda sıcaklığında 20 dk için kuluçkaya.
- Plaka 4 kez deiyonize su ile durulayın. Plaka ters çevir ve aşırı su kaldırmak için dokunun.
- ELISpot plakaları altındaki plastik drenaj çıkarın ve kuru plakalara sağlar.
- Noktalar el ile veya otomatik bir ELISpot okuyucu, örneğin CTL Immunospot S6 plaka okuyucu kullanarak ölçmek.
Representative Results
Burada sunulan sonuçları beklenen sonuçlar çok önemli adımlar önemini vurgulayan ve açıklanan en iyi duruma getirmeleri yararları onaylayan bu Protokolü'nün kullanılmasına takip için bir referans olarak hizmet.
Yoğunluğu-gradient Santrifüjü sonra protokol, 3.1. adımında açıklandığı gibi kırmızı viskoz sıvı tüpün dibinde kırmızı kan hücreleri çoğunu içerir. Şekil 2' de gösterildiği gibiA, kırmızı kan hücreleri üzerinde yoğunluk Orta tabakası var. Açık ya da sarı plazma üst tabakası ve yoğunluğu arasında degrade beyaz kan hücreleri ve trombosit çoğunu içeren beyaz veya açık kahverengi buffy kat tabaka ortamıdır. Eksik ayrılık kırmızı kan hücreleri yoğunluğu-gradient orta üst varlığı olarak tezahür. Şekil 2A plazmada kırmızı coloration en büyük olasılıkla hemoliz nedeniyle, bu kan örneğini toplama tüp 1,5 saat işlenmeden önce saklanan gibidir. Resim 2 B gösterir degrade önce (solda) ve sonra (sağda) aralıklarla PBMC yalıtım cihazın. Kan toplama ve plazma renklendirme sonra sarı kan örneği Şekil 2B en az gecikme ile işlendi.
Membranlar etanol ile ön ıslatma etkisi (adım 4.1 Protokolü'nün bakın) nokta-geliştirme Şekil 3' te gösterilen. Önceden arıtılmış kuyu noktalar geliştirilmiş tanımını görüntülemek ve orta/DMSO negatif kontrol Wells (Şekil 3A) noktaların sayısını bir azalma. İşlenmiş eskiden şiling şimdi domuz PBMCs tipik canlılığı % 90 civarında değişmektedir ve düzenli 15 mL tüpler ve PBMC-yalıtım aygıtlar (Şekil 3B) için benzer. Verim 3 mL kan örneği geçerli hücre genellikle 3 x 106 ve 5 x 106arasında değişmektedir.
Hayvanlar plazmid DNA H1N1 grip suşu nükleoprotein (NP) kodlama ile aşı A/PuertoRico8. Şekil 4 gösterir numaralandırma sunulan T-hücre IFN γ tepkilerin olarak yer şekillendirme bir aşı rejimi süresince oluşturulan birimleri (SFU). ELISpot tahlil PBMCs ile aşı olmayan hayvanlardan ihmal edilebilir nokta sayıları (tx) sonuçlarında hasat. On dört gün sonra ilk aşılama (BA), 970 IFN γ noktalar milyon PBMCs başına ortalama immünojenik stimülasyon sonra saydı. Yedi gün sonra ikinci aşılama (artırma), T-hücre yanıt karşı tüm üç havuzları, 5020 IFN γ SFUs/106 PBMCs. ortalama kırk altı gün sonra ikinci aşılama (bellek), bir ortalama toplam-in 6310 IFN γ SFUs/10 ulaşan genişletildi 6 PBMCs periferik kan sayıldı.
ŞEKİL LEGENDS:
Resim 2 : Katmanların yoğunluğu-gradient Santrifüjü sonra temsilcisi görüntüler. (A)kan örnek önce (sol) ve sonra (sağda) aralıklarla düzenli tüpler. (B) kan örnek önce (sol) ve sonra (sağda) aralıklarla PBMC yalıtım cihazlarda. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : En iyi duruma getirme Protokolü'nün. (A)tipik görünümü protokole göre geliştirilen IFN γ olumlu noktalar bir ELISpot tahlil plaka iyi. Örnek onaylatılacak wells gösterilir etanol ile ön arıtma sonra (sağda) veya ön arıtma (solda) olmadan. Hücreleri inkübe ya da no-uyarıcı denetimi, olarak DMSO (üst) ile bir gecede antijen eşlemeli peptidler (orta) veya mitojenle ConA (altta). Aynı bireysel hayvandan kökenli PBMCs. Wells bir otomatik plaka-tarayıcı kullanarak görüntüsü. (B) farklı yoğunluk gradient tüpler işlenmiş hücrelerde karşılaştırılması. 3 mL kan örnekleri 3 bireysel eskiden şiling şimdi pigs toplanan. her örneğinin 1,5 mL işleme düzenli tüpler (yoğunluk gradient orta) ya da PBMC-yalıtım aygıtları kullanarak. Canlılık (sol, % ± SEM) ve (doğru x 106 ± SEM) canlı hücre sayısı sayım sistemi ve trypan-mavi dışlama tahlil otomatik bir hücre kullanılarak belirlenmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Sağlam hücresel bağışıklık yanıtı bir aşı rejimi boyunca tespiti. 1 ile 15 gün üzerinde grip A nükleoprotein (NP) kodlama pDNA 30 µg intra dermally karın kanat Hartley kobay hemen ardından cilt-Elektroporasyon tarafından teslim edildi. IFN γ ELISpot yanıt 14 gün sonra ilk aşılama (BA) ve 7 gün (destek) ve 46 gün (bellek) sonra ikinci bağışıklama ölçüldü. Demek SFUs + SEM 5 tedavi eskiden şiling şimdi pigs ve 2 tedavi edilmezse eskiden şiling şimdi pigs (tx) için çizildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Discussion
Eskiden şiling şimdi domuz aşı ve intradermal teslim stratejileri önceden klinik gelişimi için değerli bir hayvan modelidir. Yukarıdaki Protokolü antijen spesifik T hücre yanıt son derece alakalı bu modelde ölçmek için metodoloji açıklar. Tahlil Periferik T-hücreleri üreten Interferon-Gamma stimülasyon ile antijen spesifik peptidler üzerine açık bir sabit listesi sağlar. Bağışıklık yanıtının kinetik terminal kan örnekleme tarafından izlenebilir.
Biz iletişim kuralı en iyi duruma getirilmiş ve bu tahlil kullanarak en iyi sonuçları elde etmek için kritik yönleri tespit. Örneğin, koleksiyon tüp kan pıhtısı oluşumu suboptimal PBMC kurtarma ve canlılığı sonuçlanır. Eskiden şiling şimdi domuz kanı çok hızlı bir şekilde18pıhtılaşır. Kan alımı hızlı bir şekilde gerçekleştirmek çok önemlidir. Au-Birck ve ark. teknikleri eskiden şiling şimdi domuz modeli16kanadığı için kapsamlı bir rehber sağlar. Kan toplama genel anestezi gerektirdiğinden, bu geçerli standart işletim prosedürleri yordamı19bu yönünü gözden geçirmek için tavsiye edilir. Yeterince anaesthetized eskiden şiling şimdi pigs kendi ayak tırnaklarını veya onların kulaklarını i gözü kapalı ve onların bıyık kulak pinching sonra ileri hareket ettirerek arasında onların ayakları ya da konser doku kısa bir tutam sonra hareket ettirerek tepki olacaktır. İyice haddeleme veya tüp birkaç kez ters çevirme tarafından hemen transfer kan antikoagülan ve karışımı bir boru içine bu iletişim kuralı gerekli bir adımdır. Burada açıklanan protokol için EDTA-borular kullanıldı ve diğer antikoagülanlar test edildi. EDTA hipertonik, numune hacmi-meli var olmak kullanılmış için tüpler ideal yarısından fazlası dolu ve bu nedenle uygun tüp boyutu doldurulması gerektiğini lütfen unutmayınız.
Doğru gerçekleştirilen, yoğunluk gradient Santrifüjü sürekli temiz PBMC hazırlanmasında oluşur. Yoğunluk gradient Orta oda sıcaklığında Santrifüjü önce degrade katman olması gerekir ve frenler normal tüpler kullanırken santrifüj durdurmak için kullanılmamalıdır. PBMC işleme pratiklik açısından önemli bir gelişme PBMC yalıtım aygıtlarla yoğunluğu degrade Santrifüjü oluşuyordu. Bu Santrifüjü zaman bir azalma sağlar. Yoğunluk gradient Santrifüjü PBMC yalıtım cihazlarda ve benzer canlılığı düzenli tüpler sonuçları, canlı hücre işlenmiş PBMCs ve spot oluşumu sayar. Bağımsız ayrılması için kullanılan tüp tip buffy kat hasattan hemen uygulamalısınız. Uzun bir zaman aralığı içinde yoğunluk gradient orta ile temas için PBMCs sitotoksik.
Doğru uygun PBMCs sayma tahlil-plaka wells hücrelere tohum sürekli olarak eşit sayıda için önemlidir. Canlı/ölü ayrımcılık bazı yöntemi uygulanmalıdır. Bizim laboratuarımızda trypan-mavi dışlama tahlil ve otomatik bir hücre sayaç kullanın.
Keskin kenarlı ve yüksek kontrastlı noktalar tanımlanan spot kalitesi geliştirilmiş doğruluk ve tutarlı spot sayma, özellikle otomatik sayım sistemi kullanılarak neden olur. Üreticinin önerilerini doğrultusunda, biz arka plan noktaların sayısını azaltmak ve noktalar tanımını geliştirmek için önemli bir adım olmasını ELISpot plakaların etanol öncesi tedavileri gözlenen. ELISpot tahlil-tabaklar Protokolü'nün sonunda görüntü plaka okuyucu kullanımı önerilir. Her şey orijinal görüntüleri kolayca ve verimli bir şekilde elde edilen depolanan ve. Dijital görüntüler de tarafsız analiz ve spot tek tek işleçleri tarafından elle sayıma göre sayım için izin bir görüntü analiz yazılımı kullanarak.
Burada açıklanan tahlil gelişmesi için mutlak bir gereklilik uygun bir anti-eskiden şiling şimdi domuz Interferon-gamma antikor çifti nesil oldu. Fare monoklonal antikorlar V-E4 ve N-G3 Hibridoma-tekniği ile B-hücre klonlar üzerinden kobay rekombinant interferon gama20ile aşı fareler tarafından geliştirilmiştir. V-E4, Igg1 izotip olan ve Igg2a olan N-G3 rekombinant ve yerel antijen için her ikisi de bağlamak için raporlanır. Alçak arka plan sinyal bir sandviç-ELISA biçimde koruyarak yüksek hassasiyet rekombinant ve yerli protein için algılama antikor sonuçlandı olarak V-E4 yakalama antikor ve biotinylated N-G3 atama. Her iki antikorlar Dr. Hubert Schaefer, co-yazar, bu yayının laboratuvar tarafından liderliğindeki bir üretim anlaşması yoluyla bilimsel topluluk için kullanılabilir. İstekleri Schaefer'ın lab tarafından alınan ve daha sonra bir ticari ortağı tarafından üretilmiştir.
İnterferon-gamma normal arabellekleri veya medya21' kararsız olduğu bildirilmiştir. Schaefer vd.20 kullanarak IFN-y, biyolojik işlevselliğinde antikorları V-E4 ve N-G3 kullanan bir ELISA biçimi kaybetmişti bozulmuş zaman iyileşme oranı, sadece ılımlı bir düşüş bildirdi. Ancak, artan yaşam peptid uyarılması PBMCs 18 h üzerinden kuluçka süresi dikkatle test edilmelidir.
PBMCs kullanmanın avantajları tartışıldı. Ancak, burada açıklanan tahlil sadece T-hücreleri çevre dolaşan antijen spesifik yanıt yansıtır. Doku sızmak T-hücreleri veya dalak ve lenf bezleri, lenf organları dan izole hücreler farklı özellikler22,23,24sergileyebilirler. Hücresel yanıt hiçbir önemli farklılıklar PBMCs noktalardan interferon-gamma ve splenocytes aynı pNP grip aşısı14ile aşı eskiden şiling şimdi pigs üzerinden karşılaştırılması üzerine tespit edildi.
Bu protokol için bir intradermal aşı prosedür açıklanan. Kimliği bağışıklama için bir asıl gerekçe dendritik hücreler içinde cilt25mevcut yüksek yoğunluklu hedef alıyor. Biz ve diğerleri bu hücreler özellikle teslim yöntemi26, formülasyon27veya uyuşturucu-tasarım28adapte tarafından hedeflenebilir olduğunu göstermiştir. Aktif profesyonel antijen sunan hücreler bir drenaj lenf nodu göç ve edinilmiş bağışıklık sistemi29,30,31,32etkinleştirin. Dendritik hücreler gerekli antijen sunumu hücre-üretken hücresel bağışıklık yanıtı priming için türü vardır.
Hayvanlar plazmid DNA grip H1N1 nükleoprotein kodlama ile aşı bu çalışma için A/PuertoRico/8 süzün. Bu pDNA aşı (pNP) çoğalmasıyla birlikte cilt teslimini antijen spesifik humoral yanıt eskiden şiling şimdi pigs33, yaban gelinciği ve insan dışı primatlar (NHPs)1,34temin göstermişti. Ayrıca, bu aşı farelerde sağlam T hücreli yanıt-e doğru teslim CD4 ve CD8 T-hücreleri belirli epitopları için bu hücre popülasyonlarının temsil eden peptidler ile uyararak atfedilen olabilir epidermis35içine sonra elde edildi. PNP aşı da tavşan ve kobay humoral yanıt yanı sıra fareler36hücresel ve humoral yanıt nesil tarafından gösterildiği gibi mukozal doğumdan sonra immünojenik. Son olarak, bizim grup tavşan yanıtlarında IFN-γT-hücre üretimi içi kas teslim (yayınlanmamış veri) sonra göstermek başardı.
Şu anda, eskiden şiling şimdi domuz ELISpot gözlenen Interferon-gamma sıralarda bir CD4 + ya da CD8 + T-hücre alt ayrılamıyor. Tasarım ve geliştirme bağışıklık tedaviler cilt hedefleme için özellikle, gözlenen interferon-gamma spot Frekanslar bir özel alt küme genişlemesi veya her ikisi için dengeli bir yanıt neden olup olmadığını belirlemek çok yararlı olacaktır çapraz-sunum tetiklemek için aşı etkinliğini değerlendirmek. Bu sınırlama negatif tarafından üstesinden cep-sıralama CD4 ve CD8 hücreleri plaka üzerinde veya MHC sınıf II (için CD4 yanıt) veya MHC sınıf kimliği tarafından tohumlama önce ben (CD8 yanıt için) sınırlı epitopları.
Burada açıklanan Interferon-gamma ELISpot tahlil eskiden şiling şimdi domuz PBMCs kullanarak hücresel eskiden şiling şimdi domuz laboratuvar modeli yanıt-e doğru seyri değerlendirmek gerek giderir. Bu aşıların geliştirilmesi rafine ve teslimat protokolleri deri. Biz bu hastalıklar TB37, Ebola38, HSV39ve diğerleri gibi önemli T-hücre bileşenleri ile çalışmak için bu ilgili hayvan modeli istihdam için sağlar inanıyoruz. Daha az alakalı hayvan modelleri kullanımını azaltır.
Disclosures
Yazarlar Inovio ilaç Katherine Schultheis, Holly M. Pugh, Bryan S. Yung, Janet Oh, Holly M. Pugh, Jacklyn Nguyen, Laurent Humeau, Kate E. Broderick ve Trevor R.F. Smithare çalışanları ve bu nedenle ücret ve yan haklar, mülkiyet-in dahil olmak üzere Stok ve şirketten hisse senedi opsiyonu.
Acknowledgments
Inovio Eczacılık R & D bölümü teknik yardım için üyeleri ve mükemmellik yetiştirme hizmeti Acculab personel teşekkür etmek istiyorum. Özellikle Alysha Vu ve Joe Agnes el yazması proofreading için teşekkür etmek istiyorum. Bu eser kamu, ticari veya değil, kar amacı gütmeyen sektörlerde finansmanı kuruluşları belirli herhangi bir hibe tarafından finanse edildi değil.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cellectra-3P | Inovio Pharmaceuticals | ID-Electroporatio device/ non-commercial, R&D-only | |
| K2EDTA blood collection tube | BD | 367844 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Gibco | 14175-079 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthacre | 17144003 | density gradient medium |
| SepMate tube | STEMCELL Technologies | 85415 | PBMC-isolation device |
| RPMI | Thermo Fisher | 11875-135 | |
| heat-deactivated FBS | VWR | 97068-085 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| β-Mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
| 96-well ELISpot PVDF-membrane | Millipore | MSIPS4W10 | ELISpot assay plate |
| Ethanol | Sigma | 459844-1L | |
| UPDI | Invitrogen | 10977-015 | Ultra-Pure DI water |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
| 10x PBS | HyClone | SH30378.03 | |
| Concanavalin A (ConA) | Sigma | C5275-5MG | |
| alkaline phosphatase (ALP)-conjugated streptavidin | R&D Systems Inc. | SEL002 | |
| BCIP/NBT | R&D Systems Inc. | SEL002 | |
| capture anti-guinea pig IFN-γ antibody V-E4 | GenScript | Order #:U5472CE080-3 | LOT # A217071153 |
| biotinylated detection anti-guinea pig IFN-γ antibody N-G3 | GenScript | Order #:U5472CE080-1 | LOT # A21700598 |
| CTL S6 Micro Analyzer | ImmunoSpot | #S6MIC12 | automated ELISpot plate reader |
| Vi-CELL XR | Beckman-Coulter | 731050 | automated cell counter |
| ImmunoSpot 5.1 | ImmunoSpot | assay analysis software | |
| ESCO Class II Type A2 | ESCO | Biosafety cabinet | |
| Falcon cell strainer | Corning, Inc. | VWR cat# 21008-952 | |
| Exel Comfort Point Insulin syringe | MedLab Supply | 26028 | |
| Rotanta 460R | Hettich | centrifuge | |
| Vi-CELL XR Quad Pak Reagent Kit | Beckman Coulter | 383722 | |
| Incu Safe | Panasonic-Healthcare | incubator | |
| 22 µm Filter | ThermoScientific | VWR act# 597-4520 | 22 µm Filter |
| KimWipes | Kimberly-Clark Professional | VWR cat# 21903-005 | paper towels |
References
- Laddy, D. J., et al. Heterosubtypic protection against pathogenic human and avian influenza viruses via in vivo electroporation of synthetic consensus DNA antigens. PloS One. 3 (6), 2517 (2008).
- Lee, J. Y., Chang, J. Recombinant baculovirus-based vaccine expressing M2 protein induces protective CD8+ T-cell immunity against respiratory syncytial virus infection. Journal of Microbiology. 55 (11), 900-908 (2017).
- Kinnear, E., et al. Airway T cells protect against RSV infection in the absence of antibody. Mucosal Immunology. , (2017).
- Sridhar, S., et al. Cellular immune correlates of protection against symptomatic pandemic influenza. Nature Medicine. 19 (10), 1305-1312 (2013).
- Brand, H. K., et al. CD4+ T-cell counts and interleukin-8 and CCL-5 plasma concentrations discriminate disease severity in children with RSV infection. Pediatric Research. 73 (2), 187-193 (2013).
- Bouvier, N. M. Animal models for influenza virus transmission studies: a historical perspective. Current Opinion in Virology. 13, 101-108 (2015).
- St Claire, M. C., Ragland, D. R., Bollinger, L., Jahrling, P. B. Animal Models of Ebolavirus Infection. Comparative Medicine. 67 (3), 253-262 (2017).
- Todo, H. Transdermal Permeation of Drugs in Various Animal Species. Pharmaceutics. 9 (3), 33 (2017).
- Schafer, H., Burger, R. Tools for cellular immunology and vaccine research the in the guinea pig: monoclonal antibodies to cell surface antigens and cell lines. Vaccine. 30 (40), 5804-5811 (2012).
- Czerkinsky, C. C., Nilsson, L. A., Nygren, H., Ouchterlony, O., Tarkowski, A. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 109-121 (1983).
- Sedgwick, J. D., Holt, P. G. A solid-phase immunoenzymatic technique for the enumeration of specific antibody-secreting cells. Journal of Immunological Methods. 57 (1-3), 301-309 (1983).
- Moodie, Z., et al. Response definition criteria for ELISPOT assays revisited. Cancer Immunology, Immunotherapy. 59 (10), 1489-1501 (2010).
- Gillis, P. A., et al. Development of a novel, guinea pig-specific IFN-gamma ELISPOT assay and characterization of guinea pig cytomegalovirus GP83-specific cellular immune responses following immunization with a modified vaccinia virus Ankara (MVA)-vectored GP83 vaccine. Vaccine. 32 (31), 3963-3970 (2014).
- Schultheis, K., et al. Characterization of guinea pig T cell responses elicited after EP-assisted delivery of DNA vaccines to the skin. Vaccine. 35 (1), 61-70 (2017).
- Mantoux Tuberculin Skin Test DVD Facilitator Guide - CDC (Part One). , Available from: https://www.cdc.gov/tb/education/Mantoux/images/mantoux.pdf (2013).
- Birck, M. M., Tveden-Nyborg, P., Lindblad, M. M., Lykkesfeldt, J. Non-Terminal Blood Sampling Techniques in Guinea Pigs. Journal of Visualized Experiments. (92), e51982 (2014).
- Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. 111, 1-3 (2014).
- Lewis, J. H. Comparative hematology: studies on guinea-pigs (Cavia porcellus). Comparative Biochemistry and Physiology: Comparative Physiology. 102 (3), 507-512 (1992).
- Flecknell, P. Laboratory Animal Anaesthesia (Fourth Edition). Flecknell, P. , Academic Press. 77-108 (2016).
- Schaefer, H., Kliem, G., Kropp, B., Burger, R. Monoclonal antibodies to guinea pig interferon-gamma: tools for cytokine detection and neutralization. Journal of Immunological Methods. 328 (1-2), 106-117 (2007).
- Lipiainen, T., et al. Formulation and stability of cytokine therapeutics. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (2), 307-326 (2015).
- Wang, X. Z., et al. Virus-Specific CD8 T Cells in Peripheral Tissues Are More Resistant to Apoptosis Than Those in Lymphoid Organs. Immunity. 18 (5), 631-642 (2003).
- Veron, P., et al. Deep Sequencing of T Cell Receptor in Peripheral Blood and Muscle from Adeno-Associated Virus Vector-Injected Subjects Reveals Differences in T Cell Clonality Between the Two Compartments. Molecular Therapy. 23, 210 (2015).
- Sckisel, G. D., et al. Differential phenotypes of memory CD4 and CD8 T cells in the spleen and peripheral tissues following immunostimulatory therapy. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 5 (1), 33 (2017).
- Yanofsky, V. R., Mitsui, H., Felsen, D., Carucci, J. A. Understanding Dendritic Cells and Their Role in Cutaneous Carcinoma and Cancer Immunotherapy. Clinical and Developmental Immunology. 2013, 624123 (2013).
- Amante, D. H., et al. Direct Transfection of Dendritic Cells in the Epidermis After Plasmid Delivery Enhanced by Surface Electroporation. Human Gene Therapy Methods. 25 (6), 315-316 (2014).
- Mahe, B., et al. Nanoparticle-based targeting of vaccine compounds to skin antigen-presenting cells by hair follicles and their transport in mice. Journal of Investigative Dermatology. 129 (5), 1156-1164 (2009).
- Vandermeulen, G., et al. Skin-specific promoters for genetic immunisation by DNA electroporation. Vaccine. 27 (32), 4272-4277 (2009).
- Brave, A., Nystrom, S., Roos, A. K., Applequist, S. E. Plasmid DNA vaccination using skin electroporation promotes poly-functional CD4 T-cell responses. Immunology and Cell Biology. 89 (3), 492-496 (2011).
- Romani, N., et al. Targeting skin dendritic cells to improve intradermal vaccination. Current Topics in Microbiology and Immunology. 351, 113-138 (2012).
- Smith, T. R., et al. DNA vaccination strategy targets epidermal dendritic cells, initiating their migration and induction of a host immune response. Molecular Therapy Methods & Clinical Development. 1, 14054 (2014).
- Teunissen, M. B., Haniffa, M., Collin, M. P. Insight into the immunobiology of human skin and functional specialization of skin dendritic cell subsets to innovate intradermal vaccination design. Current Topics in Microbiology and Immunology. 351, 25-76 (2012).
- Lin, F., et al. A novel prototype device for electroporation-enhanced DNA vaccine delivery simultaneously to both skin and muscle. Vaccine. 29 (39), 6771-6780 (2011).
- Laddy, D. J., et al. Electroporation of synthetic DNA antigens offers protection in nonhuman primates challenged with highly pathogenic avian influenza virus. Journal of Virology. 83 (9), 4624-4630 (2009).
- Lin, F., et al. Optimization of Electroporation-Enhanced Intradermal Delivery of DNA Vaccine Using a Minimally Invasive Surface Device. Human Gene Therapy Methods. 23 (3), 157-168 (2012).
- Kichaev, G., et al. Electroporation mediated DNA vaccination directly to a mucosal surface results in improved immune responses. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 9 (10), 2041-2048 (2013).
- Klunner, T., Bartels, T., Vordermeier, M., Burger, R., Schafer, H. Immune reactions of CD4- and CD8-positive T cell subpopulations in spleen and lymph nodes of guinea pigs after vaccination with Bacillus Calmette Guerin. Vaccine. 19 (15-16), 1968-1977 (2001).
- Shedlock, D. J., et al. Induction of Broad Cytotoxic T Cells by Protective DNA Vaccination Against Marburg and Ebola. Molecular Therapy. 21 (7), 1432-1444 (2013).
- Hensel, M. T., et al. Prophylactic Herpes Simplex Virus 2 (HSV-2) Vaccines Adjuvanted with Stable Emulsion and Toll-Like Receptor 9 Agonist Induce a Robust HSV-2-Specific Cell-Mediated Immune Response, Protect against Symptomatic Disease, and Reduce the Latent Viral Reservoir. Journal of Virology. 91 (9), 02257 (2017).
