Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

قياس وتفسير معدلات استهلاك الأوكسجين كلياً يطير رئيس قطاعات

doi: 10.3791/58601 Published: January 7, 2019

Summary

قياس التغيرات في معدلات التمثيل الغذائي أمرا أساسيا لفهم تطور مختلف الأمراض والشيخوخة. نقدم هنا، تقنية جديدة لقياس استهلاك الأوكسجين الرأس كله أوثق تشبه الحالة الفسيولوجية ويمكن أن تساعد في الكشف عن أدوية جديدة تعديل النشاط المتقدرية.

Abstract

ينظم النشاط الأيضي ضروري للسير العادي للخلايا الحية. في الواقع، غيرت النشاط الأيضي يرتبط ارتباطاً سببياً مع تطور السرطان والسكري، ونيوروديجينيريشن، والشيخوخة سبيل المثال لا الحصر. على سبيل المثال، تتسم التغيرات في النشاط الميتوكوندريا، وقوة الأيضية للخلية، في كثير من هذه الأمراض. عموما، تعتبر معدلات استهلاك الأكسجين الميتوكوندريا قراءات موثوق بها من النشاط mitochondrial والقياسات في بعض هذه الدراسات تستند إلى الميتوكوندريا المعزولة أو الخلايا. بيد هذه الشروط قد لا تمثل الطابع المعقد للأنسجة كاملة. في الآونة الأخيرة، قمنا بتطوير أسلوب رواية التي تمكن من قياس دينامية لمعدلات استهلاك الأوكسجين من رؤساء يطير معزولة كلياً. باستخدام هذا الأسلوب، سجلنا أدنى معدلات استهلاك الأوكسجين الجزء الرأس كله في الشباب مقابل عمر الذباب. ثانيا، لقد اكتشفنا أن مثبطات deacetylase يسين تغيير سرعة استهلاك الأكسجين في الرأس كله. ولذلك قد تساعد لدينا تقنية مبتكرة في الكشف عن خصائص جديدة من المخدرات المختلفة، مما قد يؤثر على معدلات التمثيل الغذائي. وعلاوة على ذلك، قد تعطي طريقة لدينا فهم أفضل للسلوك الأيضي في إعداد تجريبية التي تشبه أكثر الدول الفسيولوجية.

Introduction

ينظم النشاط الأيضي ضروري لبقاء الخلايا ووظيفة صحية للأنسجة. لقد ثبت النشاط الأيضي الضوابط على نطاق واسع أن تكون مرتبطة بظهور وتطور مختلف العلل1. على سبيل المثال، انخفاض النشاط الأيضي وصفت سابقا في أمراض الأعصاب مثل الزهايمر وضعف الذاكرة المرتبط بالعمر2،3. وعلاوة على ذلك، يعتقد خلل mitochondrial أن تشارك سببياً في4،5عملية الشيخوخة. من ناحية أخرى، وصفت أعلى معدلات mitochondrial والايض في سرطان خلايا6، حيث انخفض استخدام مثبطات الميتوكوندريا توموريجينيسيس7.

قراءات واحدة من النشاط الأيضي هو معدل استهلاك الأوكسجين (OCR) الميتوكوندريا. من المثير للاهتمام، أساسا هو الحصول على هذا النوع من قراءات من الميتوكوندريا المعزولة أو الخلايا، وبالتالي معظم ما يرد في الأدب يعتمد أساسا على قراءات التي لا تشبه الحالة الفسيولوجية. ومع ذلك، هناك عدة عيوب لهذا الأسلوب. أولاً، بروتوكول العزلة المتقدرية يحتمل أن يمكن أن تلحق الضرر سلامة8، الذي قد يكون الحرفية ذات صلة عند مقارنة الميتوكوندريا المعزولة من الشباب مقابل الأنسجة القديمة9. وعلاوة على ذلك، عملية عزل طويلة وقد يؤدي فقدان التعديلات بوستترانسلاشونال البروتين ذات الصلة التي تنظم الوظيفة المتقدرية9،،من1011. وعلاوة على ذلك، فقد ثبت أن الميتوكوندريا معزولة لا تمثل دائماً الأنسجة كلها معدلات التمثيل الغذائي12،13. ويمكن اعتبار مثل هذا التعقيد البيولوجية الخلوية، 'الجامع أكبر من مجموع أجزائه'، أي الميتوكوندريا قد عرض معدلات ايضية مختلفة داخل خلية معقدة بالمقارنة مع معدل الأيض عند معزولة.

في حين قد عرض الخلايا قراءات التعرف الضوئي على الحروف أفضل من الميتوكوندريا المعزولة، قد تضيع خلية إلى خلية الاتصال في السياق من الأنسجة كاملة. على سبيل المثال، النشاط الأيضي للخلايا العصبية في الدماغ، وتعتمد اعتماداً كبيرا على النشاط الأيضي ل الخلايا الدبقية المجاورة14. على هذا النحو، قد وضع تقنيات جديدة للتحقيق التعرف الضوئي على الحروف في الأنسجة كاملة أو الكائنات الحية كلها تثبت أكثر الثاقبة لظهور وتطور مختلف الاضطرابات.

في الآونة الأخيرة، ظهرت تقنيات جديدة معالجة هذه القضايا، وتمكين قياس التعرف الضوئي على الحروف من الأنسجة كاملة أو الجزء المتعلق بالكائنات الحية. على سبيل المثال، ذكرت عمل الأخيرة بقياس الأوكسجين من العضلات رحلة خنفساء باستخدام نهج ألياف بيرميبيليزيد مع ريسبيروميتير15. آلات جديدة للدقيقة-ريسبيروميتري تسمح بقياس التعرف الضوئي على الحروف من جزيرات البنكرياس16،17. ونتيجة لذلك، أفيد أن هذه التكنولوجيا يمكن قياس التعرف الضوئي على الحروف من كل الديدان18 وسمك الزرد19. ومع ذلك، وجود حاجز الجهاز الهضمي قد يشكل تحديا لاختبار المخدرات المختلفة في سياق التعديلات التعرف الضوئي على الحروف. من المثير للاهتمام، أظهرت التقارير الأخيرة من نيفيل والزملاء تقنية جديدة لقياس الدماغ يرقة المورفولوجية واحد مع لوحة جيدا20،21.

في هذه الدراسة، وقد استخدمنا إعداد مماثلة لتمكين قياس كامل التعرف الضوئي على الحروف من أسرة معيشية وغير النقالة المورفولوجية22. ويوفر هذا الأسلوب أيضا ميزة ثانوية في قياس أثر المخدرات المختلفة على النشاط الأيضي في شريحة كاملة، دون الحاجة إلى المرور عبر الحاجز الهضمي13،22. على سبيل المثال، أنه اتضح سابقا أن المباشرة حقن المانع deacetylase يسين (قدسي)، يعتقد أن دواء لتغيير إليه جينية في الدماغ، أدى تشكيل ذكريات تحسين23. ومع ذلك، باستخدام تقنية الرواية لدينا، اكتشفنا أن تثبيط كدك أدى إلى زيادة سريعة للتعرف الضوئي على الحروف، التي قد تكون عاملاً مساهما بنفسها في نشاط الخلايا العصبية. لدينا بروتوكول يوفر طريقة بسيطة ومبتكرة لتقييم تأثير مختلف العقاقير، والتلاعب بالجينات، أو الدول الفسيولوجية (المرض والشيخوخة) على التعرف الضوئي على الحروف في سياق الرأس كله.

Protocol

1-أداة إعداد

ملاحظة: لهذه التجربة، فقد استخدمنا جهاز XF24 فرس البحر مع "لوحات جزيرة ليلى". يستخدم عملية تقنية دورات مختلفة لخلط، في انتظار والقياسات، فضلا عن إمكانية إضافة المواد إلى حجرة القياس.

  1. قم بتشغيل الجهاز جيدا قبل البدء التجربة حتى يكون هناك وقت كاف للوصول إلى درجة الحرارة المطلوبة وتبقى مستقرة.
  2. في إعداد البرنامج (وضع الإدارة)، اختر طول معايرة خرطوشة (هنا، تم اختيار 20 دقيقة) ودرجة الحرارة المطلوبة.
    ملاحظة: بينما الميتوكوندريا أو قياسات أنسجة الثدييات ويجري عادة خارجاً على 37 درجة مئوية، تطير الرأس المحيطة درجة الحرارة 25 درجة مئوية ولكن يتم نشر نتائج القياسات في 31 درجة مئوية. كنا 31 درجة مئوية لأن هذا هو أدنى درجة حرارة الإعداد للجهاز في درجة حرارة الغرفة. للوصول إلى درجات الحرارة 25 درجة مئوية أو أقل، ضع الجهاز في غرفة باردة أو في 11 درجة مئوية كما نشرت مؤخرا21.
  3. في البرنامج، استخدم البروتوكول التالي: 3 دقيقة خلط – 2 دقيقة انتظار – قياس 2 دقيقة. استناداً إلى تصميم تجريبي، إضافة خطوات الحقن من منافذ أ-د بعد خطوة قياس الذي تم اختياره.
    1. لفحص الجودة، وتصميم القاعدية التعرف الضوئي على الحروف، انتظر على الأقل ثلاث دورات القياس قبل حقن المخدرات الأول عبر منفذ أ لوضع جدول زمني مفصل للبروتوكول، الرجاء راجع مرجع بيكر et al. 13 .

2. إعداد خرطوشة

  1. قبل معايرة الخرطوشة في يوم (أو على الأقل 4 ح) قبل الاختبار. إضافة مل 1.0 من كاليبرانت (الرقم الهيدروجيني 7.4) لكل بئر ومكان خرطوشة استشعار على رأس لوحة ومخزن في 37 درجة مئوية دون CO2 لبين عشية وضحاها، أو تصل إلى 72 حاء منع تبخر خرطوشة مع بارافيلم إذا كان هو يجري رطب لأكثر من 24 ساعة.
  2. التأكد من أن هذه العقاقير التجريبية تذاب جيدا في الأجل المتوسط (متوسطة جديدة + الجلوكوز 2.5%) قبل البدء التجربة.
  3. قياس وضبط درجة حموضة حل المخدرات الرقم الهيدروجيني للسيارة في درجة الحرارة المطلوبة لتفادي أي اختلاف درجة الحموضة خلال تعاطي المخدرات بالحقن.
  4. بيبيت الحل المخدرات بالحقن تخصيص المنفذ. على سبيل المثال، استخدم ميكروليتر 77 لمنفذ أ لتحقيق 01:10 إضعاف في حل ميكروليتر 770 وفي وقت لاحق 85 ميكروليتر لمنفذ ب
  5. تحميل الخرطوشة في الجهاز وبدء المعايرة.

3-لوحة الإعداد

ملاحظة: من المستحسن أن شخصين بإعداد اللوحة في وقت واحد. قد تتطلب مدة إعداد لوحة واحدة لكل شخص اثنين ~ 45-60 دقيقة.

  1. ضبط الطازجة في وسائل الإعلام + الجلوكوز 2.5% على درجة الحموضة المطلوبة مع 1 N HCl. يجب التأكد من أن درجة الحموضة لا يتأثر بالتغيرات في درجة الحرارة.
  2. إعداد شكل مربع جليد ووضع لوحة معدنية على الجليد.
  3. فتح الحزمة لوحة (لوحة 24-جيدا) جزيرة ليلى وتزج الشباك في طبق بتري (92 مم × 16 مم) مع وسائل الإعلام.
  4. جمع أحد صافي مع الواضع (أداة صغيرة يضع الصافية بشدة في البئر) والواضع الوقوف بجوار المجهر. إضافة قطره صغيرة من وسائل الإعلام إلى صافي يعلق إلى الواضع.
  5. تخدير الذباب (أسبوع واحد أو 4 أسابيع القديمة كانتون الذكور واستخدمت هنا) عن طريق وضع الذباب على اللوحة المعدنية المثلج.
  6. استخدام الملقط، الاستيلاء على البطن من ذبابة وتزج أنه في وسائط الإعلام في طبق بتري تحت المجهر.
  7. استخدام زوج ثاني من الملقط، بلطف قم بإزالة رأس ذبابة. وضعه في وسط صافي يعلق إلى الواضع والتحقق من أن الرأس هو منغمسين في وسائل الإعلام.
  8. مركز رئيسي عندما تكون هناك 16 منها على شبكة الإنترنت. إزالة السائل زائدة قبل التوسيط رؤساء للحيلولة دون فقدان رؤساء حين وضعها في البئر.
    ملاحظة: استخدمت 16 رؤساء يطير هذا الرقم يعطي بيانات كافية ومستقرة خلال فترة زمنية معقولة لإعداد لوحة أثناء إنشاء الأسلوب.
  9. استخدام الواضع، مكان الصافي في البئر. ضمان أن الرؤساء محاصرون تحت الشبكة. أضف ببطء ميكروليتر 700 من وسائل الإعلام + 2.5% جلوكوز (الشكل 1). كرر هذه العملية لكل من الآبار.
    ملاحظة: 20 بئرا ليطير رئيس عينات ويوصي 4 آبار فارغة للمعايرة الخلفية للوحة الواحدة. تأكد من أن الآبار فارغة تحتوي أيضا على شبكة مع 700 ميكروليتر من المخزن المؤقت + الجلوكوز 2.5%.
  10. تحقق من الآبار لفقاعات الهواء تحت الشباك عن طريق المجهر. بيبيت بلطف صعودا ونزولاً باستخدام بيبيت 1 مل لإزالة أي فقاعات. يبقى رؤساء توسيط للتعرف الضوئي على الحروف موثوق بها قراءة.
  11. إضافة اللوحة إلى الجهاز وبدء القياس.

4-تحليل القياسات التعرف الضوئي على الحروف

  1. في نهاية البروتوكول، إزالة الكارتريدج.
  2. كما تحقق جودة، مراقبة أي بقايا مرئية في حشوات المنفذ. تجاهل خرطوشة ولوحة (الخيار 1) إذا لم تستخدم لاستخراج البروتين، مثلاً، الرؤساء (انظر الخيار 2).
  3. استخراج ملفات جداول البيانات والتحقق من جودة كل جيدا لمستويات الأوكسجين ودرجة الحموضة. تأكد من أن الآبار الخلفية إظهار لا التعرف الضوئي على الحروف، وأن مستويات الأكسجين غير مستقرة.
    1. استخدام خوارزمية لتحليل البيانات، ويمكن اختيار بعض منها في البرامج الخاصة بكل منها. استخدام خوارزمية أكوس للتعرف الضوئي على الحروف قيم2 إذا كانت المستويات مجموعة الأوكسجين أثناء قياس كامل، بين القراد الأول والأخير (= القياس الفرعية) متشابهة بين اثنين من العينات البيولوجية ومستويات الأوكسجين القراد الماضي ليست أقل من 95 ( مم زئبق) (التعرف الضوئي على الحروف الرؤساء أدنى بشكل ملحوظ على هذا الصعيد الأكسجين)، (الشكل 2).
    2. بعض الظروف سوف يسبب العينة لتوليد سرعة التعرف الضوئي على الحروف، وقد عرض انخفاض مستويات الأوكسجين أثناء القرادش 1 و/أو في الماضي القراد (أكسجين) (الشكل 3A). في هذا سيناريو، استخدام أسلوب قياس بديلة مثل خوارزمية ثابتة. في أكسجين، التعرف الضوئي على الحروف هو تقلص إلى حد كبير بسبب انخفاض مستويات الأوكسجين في الحل. على هذا النحو، خوارزمية أكوس تعطي قراءات مضللة.
      ملاحظة: الجهاز أحدث يفتقر إلى الخوارزمية ثابتة. ولذلك يفضل لاستخراج مستويات الأوكسجين الكلي والأرض معدل كل الوقت للأول 3-5 القراد (الشكل 3).

5-(الخيار 2) تحليل الكيمياء الحيوية الجزء الرأس

  1. لقياس في الكيمياء الحيوية (نواتج الأيض، البروتين، إلخ) خصائص لمقطع الرأس، ضبط وقت التشغيل للطلب؛ ومع ذلك، من الممكن لإحباط البروتوكول في أي وقت، وإزالة اللوحة.
  2. حالما تتم إزالة اللوحة، استخدم الملقط غير شحذ لجعل ثقب في الشباك وإزالته ثم الإفراج عن الرؤساء لتعويم.
  3. استخدام بيبيت 1 مل مع قطع نصيحة ونقل الرؤساء لقنينة.
  4. بسرعة تجاهل المخزن المؤقت والأداة الإضافية-تجميد رؤوس في نيتروجين سائل. تخزين الرؤساء في-80 درجة مئوية للتحليل في المستقبل.

Representative Results

وتعتمد القدرة على تسجيل عالية الجودة قياس التعرف الضوئي على الحروف على توسيط الرأس في وسط الشبكة (الشكل 1). هذا أمر مهم لالة XF24، التي لديها جهاز استشعار الأوكسجين صغيرة بدلاً من بقعة مقارنة بالجهاز XFe24 الأحدث الذي جهاز استشعار أكبر. كما سبق عرضها، وتركز عرض الرؤساء مطرد التعرف الضوئي على الحروف لقياسات متتالية على الأقل 20 في الذباب الشباب13.

أحد الجوانب البالغة الأهمية في استخدام الآلات لتطبيق التحليل الصحيح. من المستحسن للتحقق من مستويات الأوكسجين أثناء التجارب. وينقسم القياس 2 دقيقة كل القياسات الفرعية 10 (القراد). وعادة ما يعرض جيدا مع رؤساء صحية 16 ضغط جزئي الأوكسجين (ص2) من 140-170 (ملم زئبق) للقراد أول. في المثال الأول، قارنا الشباب مقابل رؤساء يطير منتصف العمر (الشكل 2 ألف و 2 باء). رغم انخفاض مستويات الأوكسجين أسرع في رؤساء الكهول، الفرق الملاحظ الصغيرة (الشكل 2A). وعلاوة على ذلك، مجموعة مستويات الأوكسجين مماثلة بين الشروط، مع 165 خلال القراد الأولى إلى 120 خلال القراد الأخير. وفي هذه حالة، فمن الأفضل لاستخدام خوارزمية أكوس لتوليد تلقائياً التعرف الضوئي على الحروف (pmol/دقيقة)2، مما يعكس انخفاض مستوى الأكسجين بين الشباب مقابل رؤساء منتصف العمر (الشكل 2) موثوق بها. من المذكرة، يختار البرنامج التحليل من خلال الجهاز تلقائياً خوارزمية أكوس.

ومع ذلك، استناداً إلى ملاحظاتنا، تلقائياً باستخدام خوارزمية أكوس قد تعطي مضللة، أن لم يكن عكس النتائج للتعرف الضوئي على الحروف الصحيحة. يمكن إنشاء مثل هذه التحف في ظروف من عينة مضيعة للغاية الذي يصل إلى أكسجين13،22. على سبيل المثال، تغيير إضافة الصوديوم butyrate (SB)، مثبط كدك، عابر ديناميات مستويات الأوكسجين (الشكل 3A). حين عرض عناصر التحكم المركبة مستويات ثابتة من الأكسجين أثناء القراد الأولى والأخيرة، أسباب إضافة SB انخفاضا كبيرا وعابر لمستويات الأوكسجين في هذه القراد (الشكل 3A). SB بحد ذاتها لا تغير مستويات الأوكسجين في الآبار الخلفية، حيث يتم إضافة لا رؤساء (البيانات لا تظهر). البيانات يدعم فكرة أن بينالي الشارقة يزيد استهلاك الأوكسجين. كما تأخر جمع التجزئة الأول (12 ثانية حتى يتم تسجيل القراد الأولى في مرحلة قياس) نقطة البيانات الأولى بالفعل أقل الآبار SB معاملة. ولذلك، من الصعب التقاط التغييرات المبكرة في استهلاك الأوكسجين بعد إضافة هذا المانع هداك. وعلاوة على ذلك، تنخفض مستويات الأوكسجين في عينات SB تعامل إلى مستويات منخفضة بالفعل (أكسجين) كما هو مبين بجمع القراد الأخير. في أكسجين، تبطئ الرؤساء استهلاكها الأكسجين في الماضي القراد (الشكل 3A). نظراً لأن حساب أكوس يأخذ في الاعتبار جميع القراد ويتجاهل حالة وصول، فإنه ينشئ التعرف الضوئي على الحروف مضللة. في الواقع، أكوس غير تطبيع استناداً إلى إظهار مستويات التعرف الضوئي على الحروف تغيير طفيف حقن منفذ (فيه/SB) (الشكل 3B) (خط متقطع).

تطبيع مستويات التعرف الضوئي على الحروف بقياس ما قبل الحقن استناداً أكوس يكشف عن مستويات مشابهة جداً للتعرف الضوئي على الحروف قبل وبعد حقن المنفذ A، التي لا تدعم التغييرات مستوى الأوكسجين (الشكل 3A). وفي ظل هذه الظروف، يوصي الخوارزمية الثابتة، التي النماذج أوثق/تشبه التغييرات على مستوى التعرف الضوئي على الحروف والأكسجين (الشكل 3). ونتيجة لذلك، خوارزمية ثابتة على أساس تطبيع يكشف القياس زيادة التعرف الضوئي على الحروف عند معاملة SB (الشكل 3).

عيب مع الجهاز الجديد هو عدم وجود خوارزمية ثابتة. ولذلك، في التجارب التي يستخدم فيها عاليا تستهلك عينة/العلاج، يوصي بحساب القياسات OCR يدوياً، وحساب النقص في الأوكسجين مستوى كل الوقت للمرة الأولى القراد 3-5 في كل قياس.

Figure 1
الشكل 1 . مثال للبئر الذي يحتوي على 16 من رؤساء الذباب الذكور البالغ من العمر واحدة في الأسبوع- الرؤساء يتم توسيط أدناه صافي والعائمة في وسائل الإعلام. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 . مثال ممثل للتعرف الضوئي على الحروف القياس المقارنة بين رؤساء يطير البالغ من العمر واحدة في الأسبوع (الشباب) ورؤساء يطير العمر أربعة الأسبوع (منتصف العمر)- (أ) مستويات الأوكسجين يتم إظهارها لثلاثة مقاييس منفصلة؛ وينقسم القياس 2 دقيقة كل القياسات الفرعية العشرة (القراد). (ب) تحديد كمي (A). مستويات القراد الأولى والأخيرة مماثلة، على الرغم من أن مستويات العينة منتصف العمر أقل بشكل طفيف. يتم استخدام إجراء تقييم كمي لمنحدر الانخفاض في مستويات الأكسجين لتوليد مستويات التعرف الضوئي على الحروف. كما هو موضح سابقا22، هو التعرف الضوئي على الحروف الأوسط الذباب الذين تتراوح أعمارهم بين 10-15% أعلى من الذباب الشباب. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 . مثال على تغيير OCR بالصوديوم butyrate (SB) في رؤساء يطير الشباب- (A) سجلت مستويات الأوكسجين من قياسات سبعة بعد إضافة 15 ملم س. ب. خط متقطع يمثل الحقن المخدرات (أو مركبة) من ألف منفذ من المذكرة، بينما تظل مستقرة في السيطرة على المجموعة (أزرق)، مستويات الأوكسجين القراد 1 و 10 مستويات الأوكسجين خلال هذه القراد عابر (القياسات الستة بعد الحقن) خفضت في عينات SB تعامل (برتقالي). وبالإضافة إلى ذلك، انخفاض مستويات الأوكسجين تقل كثيرا خلال القراد الماضي SB تعامل العينات. N = 3 من كل المستويات [اليسار] عدم تطبيع التعرف الضوئي على الحروف المجموعة (ب) تحسب من خوارزمية أكوس. الحساب بشكل غير صحيح يظهر مستويات مماثلة للتعرف الضوئي على الحروف قبل وبعد حقن SB بالميناء (أ) [الحق] تطبيع OCR إلى القياس قبل حقن أ (ج) [اليسار] منفذ 'ثابتة' حساب خوارزمية (أ) إظهار التعرف الضوئي على الحروف غير تطبيع . هنا، يمثل OCR عن كثب زيادة عابرة في استخدام الأوكسجين الرؤساء على المعاملة بينالي الشارقة؛ [الحق] التطبيع للتعرف الضوئي على الحروف إلى القياس قبل حقن منفذ أشرطة الخطأ ألف تشير إلى S.E.M. في جميع الرسوم البيانية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

لدينا أسلوب جديد يقدم نهجاً جديداً لدراسة التغيرات الاستقلابية في الشيخوخة والمرض في إطار قطاعات الرأس كله يطير22. أيضا يمكن أن تكون مناسبة الأسلوب دراسة أثر butyrate الصوديوم كدك على استهلاك الأوكسجين. وكما أظهرنا، يسين دياسيتلياسي مثبطات (هداكس/كداكس) يسفر عن تغييرات التعرف الضوئي على الحروف. أساسا، كما عادة لا يتم ترجمة أهداف هذه الموانع في الميتوكوندريا (لا تؤثر هذه مثبطات ديسيتيلاسيس "الدرجة الثالثة"، سيرتوينس)24، يمكن أن يكون اختبار هذه العقاقير فقط على على الأقل مستوى الأنسجة. وفي الواقع، يتم حقن المخدرات المختلفة مباشرة إلى الدماغ، وبالتالي تجاوز الممكن تجهيز/تعديل/المنظمة بالجهاز الهضمي. على هذا النحو، يقدم لنا تقنية الرواية نظرة ثاقبة كيف تلك العقاقير مباشرة أثر الجزء الرئيسي.

وهناك العديد من الخطوات الحاسمة. أولاً، وكما ورد في البروتوكول، نوصي بشدة إعداد لوحة تحت ساعة واحدة، مع اثنين من أزواج من أيدي إعداد اللوحة. من خلال تجربتنا، على جودة واستقرار القياسات التعرف الضوئي على الحروف أفضل عند إعدادها في الوقت مناسب. عندما تأخذ وقتاً طويلاً، هو تزايد حدوث انخفاض الآبار المستهلكة التعرف الضوئي على الحروف، فضلا عن تقصير مدة مستقرة التعرف الضوئي على الحروف. وثانيا، من المهم إجراء فحص جودة وضمان ظروف تجريبية بين العينات المختلفة مماثلة (درجة الحموضة، مستويات الأوكسجين). وأخيراً، خطوة حاسمة في اختيار الخوارزمية الصحيح لتحليل العينات. وكما أظهرنا، الخوارزمية الافتراضية أكوس أسفرت عن عملية حسابية مضللة وأحيانا متعارضة في العينات التي تستهلك الأوكسجين في ارتفاع معدلات13. ولذلك نؤكد على أهمية التحقق من البيانات الخام لمستويات الأوكسجين ومقارنة OCR الناتجة عن ذلك.

حاليا، هناك العديد من القيود مع هذا الأسلوب. في درجة حرارة الغرفة، الجهاز مع ارتفاع درجات الحرارة تصل إلى 31 درجة مئوية (هذا هو قياس درجة الحرارة الدنيا في حين أن الجهاز في درجة حرارة الغرفة)، والتي قد تمثل حالة إجهاد ل يطير رؤساء25. وهذا يمكن التغلب عليها إلا عن طريق وضع الإله في غرفة باردة، مما سيمكن القياسات عند 25 درجة مئوية ومن ثم دون إجهاد حرارة ممكنة إلى الرؤساء يطير. أظهر تقرير صدر مؤخرا وضع الجهاز في 11 درجة مئوية، وبالتالي تمكين تسجيل التعرف الضوئي على الحروف من الذباب في21من 25 درجة مئوية. ومع ذلك، ينبغي القيام بفصل رأسه يطير في درجة حرارة الغرفة. وعلاوة على ذلك، تقلبات درجة الحرارة تجعل من التحدي لمراقبة التغييرات الأس الهيدروجيني ولذلك ينصح باختبار أثر الظروف الفسيولوجية/المخدرات في التعرف الضوئي على الحروف باستخدام الأجهزة تجريبية مماثلة. وبالإضافة إلى ذلك، لم يكن مساهمة استهلاك الأوكسجين بالآليات غير-الميتوكوندريا-مستقلة بعد المنشأة26. باستخدام مختلف مثبطات الجهاز التنفسي التي تتسم بالكفاءة في رؤساء يطير، سيكون من الممكن وضع معدلات استهلاك الأوكسجين غير المتقدرية هذه.

جدير بالذكر أن مختلف العلل الثدييات تتميز بالتعديلات في استقلاب الطاقة. فيما بينها، هي الأمراض التي تتميز بها أما خفض التمثيل الغذائي مثل مرض الزهايمر أو الأيضية الأسلاك مثل السرطان. من المثير للاهتمام، ومثبطات كدك تستخدم ل علاج مرض الزهايمر والسرطان27. بينما آليات دقيقة من كدك التي مثبطات هي تحقيق الجانب العلاجي لا تزال غير واضحة، يدعم البيانات من تقنية لدينا فكرة الرواية أن هذه الموانع قد تعدل الأيض.

باختصار، هذا الأسلوب قيمة لقياس استهلاك الأوكسجين عموما معدلات في فيفو وأكثر دقة عرض تأثيرات المخدرات على التمثيل الغذائي العام، التي قد أغفلت في الميتوكوندريا المعزولة البروتوكولات12. على سبيل المثال، النتائج التي تم الحصول عليها من هذا الأسلوب، بدلاً من الأساليب السابقة، تورطت رؤى الرواية لعدم المرونة الأيضية المرتبطة بالعمر عند معاملة كدك. بينما عمل إضافي ضروري لتحسين ظروف تجريبية ليطير رؤساء، الجمع بين تقنية وتحليل مناسب قد يؤدي إلى المزيد من الإيضاح النشاط المتقدرية في سياق الأنسجة الحية كلها.

Disclosures

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

Acknowledgments

ونحن نشكر Ladurner أندرياس، كارلا مارجوليس وفرقهم لدعم تجريبية واسعة النطاق. ونشكر أوندراسيك كيتلين لتعليقاتها على المخطوطة. نود أن نشكر فيكستروم صوفيا لمساعدتنا في تحديد المراحل الأولى لهذه التقنية. ونشكر أيضا "قد سانديرهوف" للها المساعدة التقنية. وتمول رطل الوزارة الألمانية الاتحادية للتعليم والبحوث (منحة إينفرافرونتير 01KX1012). س مولت زمالة "أكسا صندوق أبحاث" ما بعد الدكتوراه وتشرف (رقم المنحة 81870900). وتمول AVV قبم.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glucose Sigma-Aldrich G8644 D-(+)-Glucose solution 100 g/L in H2O, sterile-filtered
XF assay Medium Agilent 103575-100 Seahorse XF DMEM Medium, pH 7.4
Sodium butyrate Merck 817500 Dissolved in XF assay buffer
Seahorse XF24/e24 analyzer Agilent
XF24/e24 Extracellular Assay Kit Agilent 100850-001 Cartridge
XF24/e24 Islet Capture Microplates Agilent 101122-100 Plate
Seahorse Capture Screen Insert Tool Agilent 101135-10 Insertor
Petri dish Sarstedt 821,472 Petri dish 92 x 16 mm

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wallace, D. C. Mitochondrial diseases in man and mouse. 283, (5407), Science. New York, N.Y. 1482-1488 (1999).
  2. Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Analytical chemistry. 81, (16), 6868-6878 (2009).
  3. Cunnane, S., et al. Brain fuel metabolism, aging, and Alzheimer's disease. Nutrition. 27, (1), Burbank, Los Angeles County, Calif. 3-20 (2011).
  4. Wang, Y., Hekimi, S. Mitochondrial dysfunction and longevity in animals: Untangling the knot. 350, (6265), Science. New York, N.Y. 1204-1207 (2015).
  5. Wallace, D. C., Fan, W., Procaccio, V. Mitochondrial energetics and therapeutics. Annual review of pathology. 5, 297-348 (2010).
  6. Zhang, X., et al. Induction of mitochondrial dysfunction as a strategy for targeting tumour cells in metabolically compromised microenvironments. Nature communications. 5, 3295 (2014).
  7. Wheaton, W. W., et al. Metformin inhibits mitochondrial complex I of cancer cells to reduce tumorigenesis. eLife. 3, e02242 (2014).
  8. Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods. PloS one. 6, (3), e18317 (2011).
  9. Baker, D. J., Peleg, S. Biphasic Modeling of Mitochondrial Metabolism Dysregulation during Aging. Trends in biochemical sciences. 42, (9), 702-711 (2017).
  10. Zhao, S., et al. Regulation of cellular metabolism by protein lysine acetylation. 327, (5968), Science. New York, N.Y. 1000-1004 (2010).
  11. Baeza, J., Smallegan, M. J., Denu, J. M. Mechanisms and Dynamics of Protein Acetylation in Mitochondria. Trends in biochemical sciences. 41, (3), 231-244 (2016).
  12. Picard, M., et al. Mitochondrial functional impairment with aging is exaggerated in isolated mitochondria compared to permeabilized myofibers. Aging cell. 9, (6), 1032-1046 (2010).
  13. Becker, L., Nogueira, M. S., Klima, C., de Angelis, M. H., Peleg, S. Rapid and transient oxygen consumption increase following acute HDAC/KDAC inhibition in Drosophila tissue. Scientific reports. 8, (1), 4199 (2018).
  14. Volkenhoff, A., et al. Glial Glycolysis Is Essential for Neuronal Survival in Drosophila. Cell metabolism. 22, (3), 437-447 (2015).
  15. Newell, C. Physiological Entomology. 41, 96-102 (2016).
  16. Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PloS one. 6, (7), e21746 (2011).
  17. Wikstrom, J. D., et al. A novel high-throughput assay for islet respiration reveals uncoupling of rodent and human islets. PloS one. 7, (5), e33023 (2012).
  18. Koopman, M., et al. A screening-based platform for the assessment of cellular respiration in Caenorhabditis elegans. Nature. 11, (10), 1798-1816 (2016).
  19. Kumar, M. G., et al. Altered Glycolysis and Mitochondrial Respiration in a Zebrafish Model of Dravet Syndrome. eNeuro. 3, (2), (2016).
  20. Neville, K. E., et al. A novel ex vivo method for measuring whole brain metabolism in model systems. Journal of neuroscience. 296, 32-43 (2018).
  21. Neville, K. E., et al. Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains. Journal of visualized experiments: JoVE. (138), (2018).
  22. Peleg, S., et al. Life span extension by targeting a link between metabolism and histone acetylation in Drosophila. EMBO reports. 17, (3), 455-469 (2016).
  23. Peleg, S., et al. Altered histone acetylation is associated with age-dependent memory impairment in mice. 328, (5979), Science. New York, N.Y. 753-756 (2010).
  24. Drazic, A., Myklebust, L. M., Ree, R., Arnesen, T. The world of protein acetylation. Biochimica et biophysica acta. 1864, (10), 1372-1401 (2016).
  25. Miquel, J., Lundgren, P. R., Bensch, K. G., Atlan, H. Effects of temperature on the life span, vitality and fine structure of Drosophila melanogaster. Mechanisms of ageing and development. 5, (5), 347-370 (1976).
  26. Banh, R. S., et al. PTP1B controls non-mitochondrial oxygen consumption by regulating RNF213 to promote tumour survival during hypoxia. Nature cell biology. 18, (7), 803-813 (2016).
  27. Falkenberg, K. J., Johnstone, R. W. Histone deacetylases and their inhibitors in cancer, neurological diseases and immune disorders. Nature reviews. Drug discovery. 13, (9), 673-691 (2014).
قياس وتفسير معدلات استهلاك الأوكسجين كلياً يطير رئيس قطاعات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dietz, L. J., Venkatasubramani, A. V., Müller-Eigner, A., Hrabe de Angelis, M., Imhof, A., Becker, L., Peleg, S. Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments. J. Vis. Exp. (143), e58601, doi:10.3791/58601 (2019).More

Dietz, L. J., Venkatasubramani, A. V., Müller-Eigner, A., Hrabe de Angelis, M., Imhof, A., Becker, L., Peleg, S. Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments. J. Vis. Exp. (143), e58601, doi:10.3791/58601 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter