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Biochemistry

測定と酸素消費量全体の解釈飛ぶ頭セグメント

doi: 10.3791/58601 Published: January 7, 2019

Summary

代謝率の変化を測定は、様々 な疾患や老化の進行を理解するための中心です。ここより密接に生理学的状態に似ており、ミトコンドリア活性を変更する新薬を明らかに役立つ可能性があります頭全体の酸素消費を測定する手法を提案する.

Abstract

規制の代謝活性は細胞の正常な機能に不可欠です。確かに、代謝活性の変化は、がん、糖尿病、神経変性疾患、いくつかの名前に高齢化の進行とリンクされて因果関係。例えば、ミトコンドリア活性、細胞の代謝の原動力の変更は、このような多くの病気で特徴づけられています。一般的に、ミトコンドリアの酸素消費量は、ミトコンドリアの活動の信頼性の高い読み出しを考えられていたし、これらの研究のいくつかの測定に基づいていた分離ミトコンドリアや細胞。ただし、このような状況では、全体の組織の複雑さを表さない場合があります。最近、全く孤立したフライのヘッドからの酸素消費速度の動的測定を可能にする手法を開発しました。このメソッドを活用し、若者高齢者ハエから頭全体のセグメントの酸素消費率が低いを録画させていただきました。第二に、リジンの脱アセチル化酵素阻害剤急速に頭全体の酸素消費量が変わることを発見しました。私たちの新しい技術したがって、代謝率に影響を与える可能性がありますさまざまな薬の発見の新しいプロパティに役立つ可能性があります。さらに、本手法は、生理的状態により近い実験のセットアップの代謝的動態の理解を与える可能性があります。

Introduction

規制の代謝活性は、細胞の生存と組織の健全な機能に不可欠です。規制緩和の代謝活性は、発症と様々 な病気の1の進行にリンクするよう広く示されています。たとえば、低い代謝活性はアルツハイマー病などの神経変性疾患における前述および年齢関連の記憶減損2,3。さらに、ミトコンドリア機能障害は老化プロセス4,5に作因的に関与すると考えられています。その一方で、ミトコンドリアと代謝率はがん細胞で6ミトコンドリアの阻害剤の使用削減し腫瘍7記述されていた。

代謝活動の 1 つの読み出しは、ミトコンドリアの酸素消費量 (OCR) です。興味深いことに、読み出しのこのタイプは、主に分離ミトコンドリアから取得またはセル、このように文献に記載されているかの大半は、生理学的状態に似ていない読み出しに主に基づいています。ただし、この手法にいくつかの欠点があります。まず、ミトコンドリアの分離のプロトコルは可能性のある若い古い組織9から分離されたミトコンドリアを比較するとき関連したアーチファクトがあります整合性8にそのに損傷を与えます。さらに、分離プロセスが長く、ミトコンドリア機能9,10,11を規制関連タンパク質修飾の失われる可能性があります。さらに、分離ミトコンドリアは一貫して全体の組織代謝率12,13を表してないことが示されています。このような細胞の生物学的複雑さと見なすことが、「全体はその部品合計より大きい'、すなわち、ミトコンドリアが分離したときの代謝率と比較して複雑な細胞内代謝率の異なるを表示ことがあります。

一方、細胞分離ミトコンドリアよりもより良い OCR 読み出しを提供するかもしれない、全体組織のコンテキストでセルに通信が失われます。たとえば、脳の神経細胞の代謝活動は近隣のグリア細胞14の代謝活性に大きく依存。など、全組織または全有機体に OCR を調査する新しい技術を確立する発症と様々 な疾患の進行をより洞察力があるかもしれない。

最近では、これらの問題に対処し、全体の組織、セグメント、または生物から OCR の測定を有効にする新しい手法が浮上しています。例えば、最近の作品は計15グリセリン繊維アプローチを用いたカブトムシ飛翔筋から酸素測定を報告しました。マイクロ呼吸の新しいマシンは、膵ランゲルハンス島16,17の OCR の測定を許可します。その結果、全体のワーム18およびシマウマの魚19から OCR の測定が実現が報告されています。ただし、OCR 変化のコンテキストで様々 な薬をテストするための挑戦を提起する消化のバリアの存在かもしれない。興味深いことに、ネビルと同僚による最近のレポートは、ウェル プレート20,21単一ショウジョウバエ幼虫の脳を測定するための新しい手法を示しています。

この研究では、全体の生活と非携帯ショウジョウバエ22全体 OCR の測定を有効にする同様のセットアップを使いました。この手法は、消化器系バリア13,22を通過することがなく、セグメント全体の代謝活性の各種薬剤の影響を測定する際に 2 番目の利点を提供しています。たとえば、以前に直接噴射リジン脱アセチル化酵素阻害剤 (KDACi) の薬を信じて改善記憶形成23の結果、脳内エピジェネティックな機構を変更するを実証しました。しかし、私たちの新しい技術を使用して、我々 は貢献の要因は神経活動のそれ自体である、OCR の急速な増加で起因した KDAC 阻害発見。我々 のプロトコルは、頭全体のコンテキストで OCR に様々 な薬があり、遺伝子操作、または生理的状態 (病気、高齢化) の影響を評価するために簡単で、新規メソッドを提供します。

Protocol

1. 楽器の準備

注: この実験私たちには、「膵島プレート」とタツノオトシゴ XF24 デバイスを使用していますいます。技術の操作は、測定室に物質を加える混合待機していると測定と同様、可能性の別のサイクルを使用します。

  1. 所望の温度に到達し、安定する十分な時間があるように、実験開始前によくマシンをオンにします。
  2. ソフトウェアの設定 (管理モード)、カートリッジ校正の長さを選択 (ここでは、20 分が選ばれました)、所望の温度。
    注: ミトコンドリアや哺乳類の組織の測定は通常行ったうち 37 ° C,フライのヘッド周囲の温度は 25 ° C が 31 ° C での測定結果が公開されました。これは室温でデバイスの最低設定温度 31 ° C を使いました。25 の ° C の下の温度に達するに最近公開された2111 ° C、寒い部屋でマシンを配置すること。
  3. ソフトウェアで、次のプロトコルを使用して、: 3 分-2 分待っている – 2 分測定を混合します。実験の設計によって選択した測定手順の後ポート A D から注入ステップを追加します。
    1. 品質チェック、および基底の OCR の定量は、ポート A経由で最初の薬物を注入する前に、少なくとも 3 つの計測サイクルを待つプロトコルの詳細なタイムラインを参照してください参照ベッカー13.

2. カートリッジの準備

  1. テスト前に、1 日 (または少なくとも 4 h) 中古カートリッジを調整します。各ウェルに Calibrant (pH 7.4) の 1.0 mL を追加し、CO2の一晩またはを 72 h 蒸発防止のため、パラフィルムでカートリッジの場合は 24 時間以上いる水和されている 37 ° C でプレートとストアの上にセンサー カートリッジを置きます。
  2. 実験薬、実験開始前によく溶解 (2.5% ブドウ糖 + 新鮮な媒体) の中でことを確認します。
  3. 測定し、薬剤注入時の pH の相違を避けるために所望の温度で車両の pH に薬液の pH を調整します。
  4. その割り当てられたワイドボアインジェクターに薬液をピペットで移しなさい。たとえば、ポート A の 77 μ L を使用、1:10 を達成するために 770 μ L 溶液およびその後 85 μ L ポート B の希釈
  5. マシンにカートリッジをロードし、校正を開始します。

3. プレート準備

注: 2 人が板を同時に準備することを強くお勧めします。2 人あたり 1 つのプレートの準備の期間があります 45 〜 60 分。

  1. 調整、作りたてメディア + 1 と目的の pH に 2.5% ブドウ糖は温度の変化 N 塩酸を確認 pH は影響は受けません。
  2. アイス ボックスを準備し、氷の上に金属板を配置します。
  3. アイレット プレート (24 ウェル プレート) パッケージを開くと、メディアでペトリ皿 (92 mm × 16 mm) でネットを浸します。
  4. インサーター (井戸にネットをしっかりと配置する小さな楽器) の 1 つを集めるし、顕微鏡の横に立つインサーターがあります。インサーターに接続されているネット メディアの小滴を追加します。
  5. (1 週間または 4 週間の古いカントンの男性はここで使用された) のハエをハエ冷たい金属プレート上に配置することによって麻酔します。
  6. 鉗子を使用すると、ハエの腹部をつかむし、顕微鏡下でペトリ皿でメディアに没頭します。
  7. 鉗子の 2 番目のペアを使用すると、ハエの頭を慎重に取り外します。インサーターに接続されているネットの真ん中に配置し、頭がメディアに没頭していることを確認します。
  8. ネット上でそれらの 16 があるときは、頭を中心に。井戸でそれらを配置しながら頭の損失を防ぐためにヘッドを中心とする前に余分な液体を削除します。
    注: この番号メソッドの確立中にプレート準備の妥当な時間内で十分な安定したデータを与えた 16 飛ぶヘッドが使用されました。
  9. インサーターを使用すると、よくネットを配置します。頭がネットの下で閉じ込められていることを確認します。ゆっくりと 700 μ メディア + 2.5% ブドウ糖 (図 1) を追加します。井戸のごとにプロセスを繰り返します。
    注: 20 井飛ぶヘッド サンプル、プレートごとのバック グラウンド補正の 4 空井戸が推奨されます。空井戸がバッファー + 2.5% ブドウ糖の 700 μ L とネットにはも含まれていることを確認します。
  10. 気泡、ネット経由で顕微鏡下の井戸を確認します。優しく上下に 1 mL ピペットを使用して任意の気泡を除去ピペットで移しなさい。信頼性の高い OCR 読み取り中心頭を維持します。
  11. マシン プレートを追加し、測定を開始します。

4. OCR 測定結果の解析

  1. プロトコルの最後に、カートリッジを取り外します。
  2. 品質チェックとしてポート詰め物で表示されている残り物を観察します。頭などによるタンパク質の抽出に使用をしない場合、カートリッジとプレート (オプション 1) を破棄 (オプション 2 を参照してください)。
  3. スプレッドシート ファイルを抽出し、品質チェックそれぞれ酸素および pH のレベルのためによく。背景の井戸が OCR を示さない酸素レベルが安定していることを確認します。
    1. データ分析、それぞれのソフトウェアで選択できるいくつかのアルゴリズムを使用します。酸素の範囲レベル (= サブ測定) 最初と最後の目盛の間、全体の測定の間に場合は OCR 値2用 AKOS アルゴリズムが 2 つの試料間で類似と最後のタイマー刻みの酸素レベルが 95 (より低いmmHg) (ヘッドの OCR は、著しく低いこの酸素レベル)、(図 2)。
    2. いくつかの条件は急速な OCR を生成するサンプルになります、1stチック中に、最後のタイマー刻み (無酸素) (図 3 a)、低酸素レベルを表示ことがあります。このようなシナリオでは、固定のアルゴリズムなどの代替法を使用します。無酸素、OCR は、ソリューションにおける酸素の低レベルのため大幅に削減します。など、AKOS アルゴリズムは、誤った測定値を得られます。
      注: 新しいマシンは、固定アルゴリズムを欠いています。したがって、総酸素濃度を抽出し、最初の時間あたりの 3-5 タイマー刻み (図 3) をプロットすることが好ましい。

5. (オプション 2) 頭セグメントの生化学的解析

  1. 生化学測定する(代謝産物、プロテオーム等)頭セグメントのプロパティ; 要件に実行時間を調整します。ただし、いつでもプロトコルを中止し、プレートを除去することが可能です。
  2. プレートを取り外したら、ネットに穴をあける、フロートに頭を解放削除非シャープ鉗子を使用します。
  3. カットと 1 mL ピペットを使用してヒントし、頭をバイアルに転送します。
  4. 迅速にバッファーを破棄し、液体窒素で凍結するヘッド。将来の分析用-80 ° c ヘッドを格納します。

Representative Results

高品質 OCR 測定を記録する機能はネット (図 1) の真ん中に頭を中心に依存しています。これは、センサーが大きい新しい XFe24 マシンと比較してかなり小さい酸素センサーのスポットのある XF24 マシンにとって重要です。以前に、センタリング頭は若いハエ13で少なくとも 20 の連続測定のための着実な OCR を表示します。

マシンを使用しての 1 つの重要な側面は、正しい分析を適用することです。実験中の酸素のレベルをチェックすることをお勧めします。各 2 分計測は 10 サブ測定 (タイマー刻み) に細分されます。16 健康な頭部とよく通常 140 170 (mmHg) を最初のダニのための酸素分圧 (pO2) が表示されます。最初の例では、(図 2 aおよび2 b) 中年の飛ぶヘッド対ヤングを比較しました。観測差が小さい酸素レベル ドロップ早く、中年の頭の中に、(図 2 a)。また、酸素レベルの範囲は最後の目盛りの間に 120 に最初の目盛りの中に 165 を使用して、条件間に似ています。このような場合、AKOS アルゴリズムを使用して、自動的に OCR (pmol/分)2、確実に若者中年頭 (図 2 b) 間酸素のレベル低下を反映したものを生成することをお勧めします。注記のうち、コンピューターによって解析プログラムは AKOS アルゴリズムを自動的に選択します。

しかし、我々 の観察に基づきは誤解を与える可能性があります AKOS アルゴリズムを使用して自動的にいなければ反対が正しい OCR の結果します。このような遺物は、無酸素症13,22に達する高度のかかるサンプルの条件で生成できます。たとえば、酪 (SB)、KDAC 阻害剤の添加は一過性 (図 3 a) の酸素のレベルのダイナミクスを変更します。一方、車両のコントロールは、最初と最後のタイマー刻みの間に酸素の安定したレベルを表示、SB 追加するこれらのタイマー刻み (図 3 a) での酸素のレベルのかなり過渡及び定常ドロップされます。それ自体で SB はどこないヘッドが追加されます (データは示されていない)、バック グラウンド井戸の中の酸素のレベルを変更しません。データでは、SB が酸素消費量を増加するという概念をサポートしています。最初のダニのコレクションが遅延 (12 秒最初の目盛りが測定の段階で記録されるまで)、最初のデータ ポイントは、既に低い SB 扱われる井戸。したがって、酸素消費量この HDAC 阻害剤の添加で初期の変化をキャプチャすることは困難です。さらに、最後のタイマー刻みのコレクションによって示されているように扱われます SB 試料中の酸素のレベルは既に低レベル (無酸素症) に縮小されます。講習で頭は最後のタイマー刻み (図 3 a) で、酸素消費速度が低下します。AKOS 計算すべてのダニを考慮し、無酸素状態を無視する、それは誤解を招く OCR を生成します。確かに、正規化 AKOS に基づいて OCR のレベルを少し変更ポート、(Veh/SB) (図 3 b) の注入 (破線)。

酸素レベルの変更 (図 3 a) をサポートしていないポート A の注入の前後に OCR の非常に同じようなレベルを明らかに、AKOS プレ噴射計測する OCR のレベルを正規化します。このような状況の下でもっと密接にモデル/似たレベルの変更は OCR と酸素固定アルゴリズム (図 3) を推奨します。その結果、固定方式は測定明らかに増加の OCR 処理する (図 3) と SB を正規化します。

新しいマシンの欠点修正アルゴリズムの不在であります。したがって、高消費サンプル/トリートメントが使用されている実験において OCR 測定を手動で計算をお勧めし、測定ごとに 3-5 ダニ最初の時間当たりレベルの酸素の減少を計算します。

Figure 1
図 1.男性のハエの 16 週齢 1 頭を含む井戸の例。頭が網下に中央揃えとメディアに浮かぶです。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2.1 週間の古い飛ぶヘッド (ヤング) の OCR 測定比較の代表的な例と 4 週間の古い飛ぶヘッド (中年).(3 つの独立した測定; の A) の酸素のレベルが表示されます。各 2 分計測は 10 サブ測定 (タイマー刻み) に細分されます。(B) (A) の定量化。最初と最後のタイマー刻みのレベルは、中年サンプルのレベルが若干低いが、似ています。酸素濃度の低下の斜面の定量化は、OCR のレベルを生成する使用されます。前述の22と中間の老化させたハエの OCR は 10-15% 若いハエよりも高いです。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3.若い飛ぶヘッドで酪 (SB) による OCR の変化の例です。(A) 酸素濃度を 15 mm SB 添加 7 測定から記録しました。破線は、ポート A から薬物 (または車両) の注入をマークします。注記のうち、1 と 10 刻みの酸素のレベルが制御グループ (青) で安定したままこれらのダニにおける酸素のレベルは一過性 (六つの測定次の注入) SB 処理サンプル (オレンジ) の減少します。また、酸素濃度の低下は、SB 処理サンプルの最後のタイマー刻みの間に大幅削減されます。N = 3 グループ (B) [左] 非正規化 OCR レベルあたりは、AKOS アルゴリズムから計算されます。計算正しくレベルを示しますない似たような OCR のポート ポート A. (C) [左] '固定' アルゴリズム計算 (を) 示す正規化 OCR の注入前に測定する OCR の A. [右] 正規化で SB の注入の前後に.ここでは、OCR が密接に SB 治療時にヘッドの酸素使用量の一時的な増加を表します[右]A. 誤差範囲のポートの注入前に測定する OCR の正常化は、すべてのグラフで S.E.M. を示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Discussion

我々 の新しい技術では、高齢化における代謝変動と全く飛ぶヘッド セグメント22のコンテキストで病研究への新しいアプローチを提供しています。メソッドは、酸素消費量に KDAC 酪酸の影響を研究するも適して ことができます。実証してきた、リジン deacetlyase 阻害剤 (hdacs をした/KDACs) OCR 変更あります。基本的に、このような阻害剤のターゲットが (これらの阻害剤では、クラス III 脱アセチル化酵素、サーチュインは影響しない) ミトコンドリアでローカライズされていない通常24、そのような薬だけでテストすることができる、少なくとも組織レベル。確かに、様々 な薬は消化器系によって可能な不活性化処理/変更/が入り込んで、脳に直接注入されます。など、私たちの技術にどのようにこのような薬剤の影響で直接新しい見識に頭のセグメントを提供しています。

いくつかの重要な手順があります。まず、前述のプロトコルでは、強くお勧めしますプレートの準備の手の 2 つのペアで 1 時間未満プレートを準備します。私たちの経験から OCR 測定の安定性と品質が良いときにタイムリーに準備です。あまりにも時間がかかり、安定した OCR の短い期間だけでなく、低 OCR がかかる井戸の発生が増加しています。第二に、品質チェックを実施し、様々 なサンプル間の実験条件が類似 (pH、酸素レベル) することが重要です。最後に、重要なステップは、サンプルの分析が正しいアルゴリズムを選んでいます。実証してきた、既定 AKOS アルゴリズムは消費率が高い13酸素サンプルで誤解を招くと時々 反対の計算をもたらした。我々 したがって酸素レベルの raw データをチェックし、結果の OCR を比較することの重要性を強調します。

現在、この方法ではいくつかの制限があります。常温でマシン加熱 31 ° C まで (これは最小限の温度測定中に室温で、)、飛ぶヘッド25の応力状態を表す場合があります。これはしかし、25 ° C での測定を可能にする低温室内でマシンを配置することによって克服できると、それゆえフライのヘッドに熱ストレスなし。最近の報告書は、11 ° c、25 ° C21で飛ぶの OCR 記録ができ、マシンを配置することを実証しています。それにもかかわらず、部屋の温度でフライのヘッド分離を実行します。さらに、温度の変動は、pH 変化への挑戦したがって強くお勧め同様の実験のセットアップを使用して OCR の生理学的条件/薬剤の影響をテストします。さらに、非ミトコンドリア依存性のメカニズムによる酸素消費量の貢献されていない確立された26。飛ぶヘッドで効率的なさまざまな呼吸阻害剤を使用すると、このような非ミトコンドリアの酸素消費率を確立することが可能なります。

それは注目に値する様々 な哺乳類の病気はエネルギー代謝の変化によって特徴付けられます。中でも、がんなど再配線、いずれかの還元的代謝の代謝やアルツハイマー病などによって特徴付けられる病気。興味深いことに、KDAC 阻害剤はアルツハイマー病および癌治療27に使用されます。どの KDAC によって阻害剤治療の側面を達成している正確なメカニズムは不明私たちの技術からデータはこのような阻害剤が代謝を調節する新規の概念をサポートしています。

要約すると、このメソッドは貴重な体内料金全体の酸素消費量を測定し、正確に分離ミトコンドリア プロトコル12で見落とされることがあります一般的な代謝に対する薬剤の効果が表示されます。など、従来の技術ではなくこのメソッドから得られた結果は、KDAC の治療に加齢に伴う代謝の硬直化の知見を関与しています。追加の作業を最適化する必要がある実験条件飛ぶヘッド、私たちの技術と適切な分析の組み合わせは全体の生体組織のコンテキストでミトコンドリアの活動のさらなる解明につながる可能性があります。

Disclosures

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

Acknowledgments

アンドレアス囲ま、カーラ マーグリスと広範な実験的なサポートのため、チームに感謝します原稿の彼女のコメントありがとうケイトリン Ondracek。我々 はこの手法の初期の段階を確立するのに私たちを支援のためソフィア Vikstrom を感謝したいです。我々 はまた、彼女の技術的な助けを可能性があります Sanderhoff を感謝します。LB はドイツ連邦教育省と研究 (Infrafrontier グラント 01KX1012) によって資金を供給します。SP は、アクサ研究基金研究員親睦と NSFC (許可番号 81870900) によって資金を供給されました。AVV は、QBM によって資金を供給します。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glucose Sigma-Aldrich G8644 D-(+)-Glucose solution 100 g/L in H2O, sterile-filtered
XF assay Medium Agilent 103575-100 Seahorse XF DMEM Medium, pH 7.4
Sodium butyrate Merck 817500 Dissolved in XF assay buffer
Seahorse XF24/e24 analyzer Agilent
XF24/e24 Extracellular Assay Kit Agilent 100850-001 Cartridge
XF24/e24 Islet Capture Microplates Agilent 101122-100 Plate
Seahorse Capture Screen Insert Tool Agilent 101135-10 Insertor
Petri dish Sarstedt 821,472 Petri dish 92 x 16 mm

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References

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Dietz, L. J., Venkatasubramani, A. V., Müller-Eigner, A., Hrabe de Angelis, M., Imhof, A., Becker, L., Peleg, S. Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments. J. Vis. Exp. (143), e58601, doi:10.3791/58601 (2019).More

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