Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Mäta och tolka syre förbrukning helt flyga Head segment

doi: 10.3791/58601 Published: January 7, 2019

Summary

Mäta förändringar i metabola priser är centrala för förståelsen av progressionen av olika sjukdomar och åldrande. Här presenterar vi en ny teknik för att mäta hela huvudet syreförbrukning som närmare liknar det fysiologiska tillståndet och får stöd i avslöjar nya läkemedel som ändrar mitokondriell aktivitet.

Abstract

Reglerade metabolisk aktivitet är viktigt för normal funktion av levande celler. Faktiskt är förändrade metaboliska aktiviteten causally knutet till utvecklingen av cancer, diabetes, neurodegeneration och åldrande för att nämna några. Till exempel har förändringar i mitokondriell aktivitet, cellens metaboliska kraftpaket, präglats i många sådana sjukdomar. Generellt de syre förbrukning av mitokondrier ansågs en tillförlitlig avläsning av mitokondriell aktivitet och mätningar i några av dessa studier baserades på isolerade mitokondrier eller celler. Sådana villkor får dock inte representera komplexiteten i en hela vävnad. Nyligen, har vi utvecklat en ny metod som möjliggör dynamisk mätning av syre förbrukning från hela isolerade flyga huvuden. Genom att använda denna metod, har vi spelat in lägre syre förbrukning för segmentet hela huvudet i unga kontra åldern flugor. För det andra har vi upptäckt att lysin histondeacetylas hämmare snabbt ändra syreförbrukningen i hela huvudet. Vår ny teknik kan därför hjälpa avslöja nya egenskaper hos olika läkemedel, som kan påverka ämnesomsättning priser. Vår metod kan dessutom ge en bättre förståelse av metabola beteende i ett experiment som mer liknar fysiologiska stater.

Introduction

Reglerade metabolisk aktivitet är viktigt för överlevnaden av celler och friska funktion av en vävnad. Avreglerad metabolisk aktivitet har visats i stor utsträckning kopplas till uppkomsten och utvecklingen av olika maladies1. Lägre metabolisk aktivitet beskrevs exempelvis tidigare neurodegenerativa sjukdomar som Alzheimers och ålder-associerade minne nedskrivningar2,3. Mitokondriell dysfunktion är dessutom tros vara kausalt inblandade i åldrande processen4,5. Däremot, var högre mitokondrie och metabola priser beskrivs i cancer celler6, där användningen av mitokondriell hämmare reduceras tumourigenesis7.

En avläsning av metabolisk aktivitet är syre materialåtgången (OCR) av mitokondrier. Intressant, denna typ av avläsning erhålls huvudsakligen från isolerade mitokondrier eller celler, alltså majoriteten av vad som beskrivs i litteraturen baseras huvudsakligen på en avläsning som inte liknar det fysiologiska tillståndet. Dock finns det flera nackdelar med denna teknik. Det första kan protokollet av den mitokondriella isolering potentiellt skada dess integritet8, vilket kan vara en artefakt som är relevanta när man jämför mitokondrier isolerade från unga jämfört med äldre vävnader9. Dessutom isolering processen är lång och kan resultera i förlust av relevanta protein posttranslationell ändringar som reglerar mitokondriefunktion9,10,11. Det har dessutom visat att isolerade mitokondrierna inte konsekvent företräder hela vävnad ämnesomsättning priser12,13. Sådan cellulära biologisk komplexitet kan ses som, 'helheten är större än summan av dess delar', dvs mitokondrier kan visa olika metabola priser inom en komplex cell jämfört med deras ämnesomsättning när isolerade.

När celler kan erbjuda en bättre OCR-avläsning än isolerade mitokondrier, förloras cell till cell kommunikation inom ramen av en hela vävnad. Exempelvis i hjärnan är den metaboliska aktiviteten av nervceller starkt beroende av den metaboliska aktiviteten av närliggande glialceller14. Som sådan, kan om inrättande av nya tekniker för att undersöka OCR i hela vävnad eller hela organismer bevisa mer insiktsfulla för debut och progression av olika sjukdomar.

Nyligen, nya tekniker har dykt upp för att hantera dessa frågor och möjliggöra mätning av OCR från hela vävnad, segment eller levande organismer. Till exempel rapporterade ett senare arbete syre mätning från en skalbagge flyg muskel med en permeabilized fiber metod med en respirometer15. Nya maskiner för mikro-respiration möjliggör mätning av OCR Langerhanska16,17. Följaktligen har det rapporterats att denna teknik möjliggör mätning av OCR från hela maskar18 och zebrafisk19. Förekomsten av mag barriären kan dock innebära en utmaning för att testa olika droger i samband med OCR förändringar. Intressant, har senaste rapporter av Neville och kollegor visat en ny teknik för att mäta enstaka drosophila larv hjärnan med de väl platta20,21.

I denna studie har vi använt en liknande setup för att möjliggöra mätning av hela OCR från hela levande och icke-mobila Drosophila22. Denna teknik erbjuder också en sekundär fördel i mäta effekterna av olika droger på metabolisk aktivitet i en hel segment, utan att behöva passera genom matsmältningssystemet barriär13,22. Det visades till exempel tidigare som direktinsprutning av lysin histondeacetylas hämmare (KDACi), en drog trodde för att ändra epigenetisk mekanism i hjärnan, resulterade i en förbättrad minnen bildandet23. Men genom att använda vår ny teknik, upptäckte vi att KDAC hämning resulterade i en snabb ökning av OCR, som kan vara en bidragande faktor av sig själv i neuronala aktiviteten. Våra protokoll ger en enkel och ny metod för att bedöma effekterna av olika droger, genetisk manipulation eller fysiologiska påstår (sjukdom, åldrande) på OCR i samband med en hela huvudet.

Protocol

1. instrument förberedelse

Obs: För detta experiment, har vi använt en Sjöhäst XF24 enhet med ”islet plattor”. Driften av tekniken använder olika cykler av blandning, väntar och mätningar samt möjligheten att lägga till ämnen i mätning facket.

  1. Slå på maskinen väl innan experimentet så att det finns tillräcklig tid för att nå önskad temperatur och förbli stabila.
  2. I programvara setup (administrationsläge), välja längden på patronen kalibreringen (här, 20 min valdes) och önskad temperatur.
    Obs: Medan mitokondrier eller däggdjursvävnader mätningar utförs normalt ut vid 37 ° C, flyga huvudet omgivningstemperaturen är 25 ° C men resultaten av mätningar på 31 ° C publiceras. Vi använde 31 ° C eftersom detta är den lägsta temperaturinställningen för enheten vid rumstemperatur. För att nå temperaturer på 25 ° C eller lägre, placera maskinen i ett kallare rum eller vid 11 ° C som nyligen publicerad21.
  3. I programvaran, använder följande protokoll: 3 min blandning – 2 min väntan – 2 min mätning. Beroende på experimentell design, lägga till injektion steg från hamnar A-D efter ett valt mätning steg.
    1. För kvalitetskontroll, och bestämning av basala OCR, vänta minst tre mätning cykler innan du injicerar den första drog via port A. För en detaljerad tidslinje i protokollet, se referens Becker et al. 13 .

2. patron förberedelse

  1. Pre kalibrera kassetten en dag (eller åtminstone 4 h) före testning. Tillsätt 1,0 mL standard (pH 7,4) till varje brunn och Placera sensorn patronen ovanpå plattan och butik vid 37 ° C utan CO2 för över natten eller upp till 72 h. förhindra avdunstning av patronen med parafilm om det är att vara hydratiserade under mer än 24 h.
  2. Se till att de experimentella läkemedel är väl upplöst i mediet (färskt medium + 2,5% glukos) innan experimentet.
  3. Mät och justera pH-värdet i drogen lösningen på pH i fordonet vid önskad temperatur för att undvika eventuella pH skillnaden under injektionsmissbruk.
  4. Pipettera drog lösningen på dess tilldelade injektionsporten. Exempelvis använda 77 μL för port A uppnå en 1:10 spädning i en 770 μL lösning och därefter 85 μL för port B.
  5. Läsa in kassetten i maskinen och påbörja kalibrering.

3. skylt förberedelse

Obs: Det rekommenderas starkt att två personer förbereda plattan samtidigt. Varaktigheten av en platta förberedelse per två personer kan kräva ~ 45-60 minuter.

  1. Justera den nylagade media + 2,5% glukos till önskad pH-värdet med 1 N HCl. Kontrollera att pH inte påverkas av förändringar i temperatur.
  2. Förbereda en ice box och placera en metallplatta på isen.
  3. Öppna holme plattan (24-well plate) paketet och fördjupa näten i en petriskål (92 x 16 mm) med media.
  4. Samla en netto med insertion (ett litet instrument som placerar nätet fast i brunnen) och har den insertion stå upp bredvid mikroskopet. Lägga till en liten droppe av media på nätet som bifogas insertion.
  5. Söva flugor (en vecka eller 4 veckor gamla canton hanar användes här) genom att placera flugorna på iskall metallplattan.
  6. Med pincett, ta tag i buken av en fluga och fördjupa det i media i en petriskål under mikroskopet.
  7. Använder ett par pincett, ta försiktigt bort huvudet av i farten. Placera den i mitten av nätet bifogas insertion och verifierar att huvudet är nedsänkt i media.
  8. Center huvuden när det finns 16 av dem på nätet. Ta bort överflödig vätska innan centrering huvuden för att förhindra förlust av huvuden medan placera dem i brunnen.
    Obs: 16 flyga huvuden användes som detta nummer gav tillräckliga och stabila data inom rimlig tid av plattan förberedelser under metod-establishment.
  9. Använder Insertion, placera nätet i brunnen. Säkerställa att cheferna är instängd under nätet. Tillsätt långsamt 700 μL av media + 2,5% glukos (figur 1). Upprepa processen för varje brunnarna.
    Obs: 20 brunnar i flyga huvud prover och 4 tomma brunnar för bakgrunden kalibrering per platta rekommenderas. Se till att tomma brunnar också innehåller ett nät med 700 μL buffert + 2,5% glukos.
  10. Kontrollera brunnarna för luftbubblor under den nät via mikroskopet. Pipettera försiktigt upp och ner med en 1 mL Pipettera ta bort eventuella bubblor. Hålla huvudet Centrerat för en tillförlitlig OCR läsa.
  11. Lägg plattan på maskinen och starta mätningen.

4. analys av OCR mätningar

  1. Vid slutet av protokollet, ta bort patronen.
  2. Som en kvalitetskontroll, iaktta några synliga rester i port fyllningarna. Kassera patron och plattan (alternativ 1) om cheferna är inte skall användas för protein utvinning, t.ex., (se alternativ 2).
  3. Extrahera kalkylbladsfiler och kvalitetskontroll var bra för syre och pH nivåer. Kontrollera att bakgrunden brunnarna visar inga OCR och att syrehalten är stabila.
    1. Använd en algoritm för dataanalys, av vilka några kan väljas i respektive programvara. Använd den AKOS algoritmen för OCR värden2 om utbudet av syre nivån under hela mätningen, mellan första och sista fästingen (= sub mätning) är lika mellan två biologiska prover och syrehalten i sista fästingar är inte lägre än 95 ( mmHg) (huvuden OCR är markant lägre på detta syrenivå), (figur 2).
    2. Vissa villkor kommer att orsaka provet att generera en snabb OCR och kan visa lägre syrehalter under 1st fästingen och/eller i den sista markeringen (syrebrist) (figur 3A). I ett sådant scenario, Använd en alternativ mätmetod som fasta algoritmen. I anoxia minskas OCR avsevärt på grund av låga halter av syre i lösningen. Som sådan, ger AKOS algoritmen vilseledande avläsningar.
      Obs: Nyare maskinen saknar fast algoritmen. Det är därför att föredra att extrahera totala syrehalten och rita frekvensen per dags för första 3-5 fästingar (figur 3).

5. (alternativ 2) biokemisk analys av huvud-segmentet

  1. Att mäta den biokemiska (metaboliter, proteomet, etc.) egenskaper hos en chef segment, justera körtiden krav; Det är dock möjligt att avbryta protokollet när som helst och ta bort plattan.
  2. När plattan avlägsnas, använda icke-vässat tången gör ett hål i nätet och ta bort det frigjort huvuden att flyta.
  3. Med en 1 mL Pipettera med ett snitt spets och överföra huvuden till en injektionsflaska.
  4. Snabbt kasta bufferten och snapin-frysa huvuden i flytande kväve. Lagra huvuden vid-80 ° C för framtida analys.

Representative Results

Möjligheten att spela in högkvalitativa OCR mätning bygger på centrering huvudet mitt i nätet (figur 1). Detta är viktigt för XF24 maskinen, som har en ganska liten syresensor plats jämfört med nyare XFe24 maskinen där sensorn är större. Som tidigare visad, självcentrerande cheferna visar en stadig OCR för minst 20 på varandra följande mätningar i unga flugor13.

En kritisk aspekt av använder maskinerna är att tillämpa den korrekta analysen. Det rekommenderas att kontrollera syrehalten under experimenten. Varje 2 min mätning är indelad i 10 sub mätningar (fästingar). En brunn med 16 friska huvuden visar oftast en oxygen partialtryck (pO2) 140-170 (mmHg) för den första bocken. I det första exemplet jämförde vi ung vs. medelåldern flyga huvuden (figur 2A och 2B). Samtidigt som syrehalten släpper snabbare i medelålders huvuden, observerade skillnaden är liten (figur 2A). Dessutom är utbudet av syrehalten liknande mellan villkor, med 165 under första fästingen att 120 under den sista markeringen. I sådana fall är det bättre att använda AKOS algoritmen att automatiskt generera den OCR (pmol/min)2, som på ett tillförlitligt sätt speglar den syre nivåerna droppa mellan unga kontra medelåldern huvuden (figur 2B). Notera väljer programmet analys av maskinen automatiskt AKOS algoritmen.

Dock utifrån våra observationer, automatiskt med AKOS algoritm kan ge vilseledande, om inte motsatsen resultat för rätt OCR. Sådana föremål kan genereras i förhållanden av ett mycket tidskrävande urval som når anoxia13,22. Tillsats av natrium butyrate (SB), en hämmare av KDAC, ändrar till exempel normalnivå dynamiken i syrehalten (figur 3A). Fordonets reglage textbild stadig nivåer av syre under den första och sista fästingen, orsakar SB tillägg en betydande och övergående sänkning av syrehalten i dessa fästingar (figur 3A). SB själv ändrar inte syrehalten i bakgrunden brunnar, där inga huvuden läggs (inga data anges). Data stöder uppfattningen att SB ökar syreförbrukningen. Som insamling av första fästing är fördröjd (12 sekunder tills första fästingen registreras i fasen mäta) är den första datapunkten redan lägre i SB behandlas brunnarna. Därför är det svårt att fånga de tidiga förändringarna syreförbrukning efter tillägg av denna HDAC-hämmare. Dessutom reduceras syrehalten i SB behandlade prover till redan låga nivåer (syrebrist) indikerat av insamling av senaste fästingar. Vid syrebrist bromsa huvuden sin syreförbrukning i sista fästingar (figur 3A). Eftersom beräkningen AKOS beaktar alla fästingar och ignorerar ett syrefria tillstånd, genererar det en vilseledande OCR. Faktiskt, den icke-normaliserade AKOS utifrån OCR nivåer Visa lite förändring injektion (streckad linje) av port en (Veh/SB) (figur 3B).

Normalisera OCR nivåer att före injektion mätningen utifrån AKOS avslöjar mycket liknande nivåer av OCR före och efter injektion av port A, som inte stöder de syre förändringarna (figur 3A). Under dessa omständigheter rekommenderas fast algoritm, som mer modeller/liknar de OCR och syre Nivå förändringarna (figur 3 c). Följaktligen normaliserade den fasta algoritm baserat mätning visar en ökad OCR på SB behandling (figur 3 c).

En nackdel med den nya maskinen är avsaknad av fast algoritmen. Därför i experiment där mycket tidskrävande prov behandlingsrum används, rekommenderas att beräkna OCR mätningar manuellt och beräkningen av minskningen av syre nivå per tid för första 3-5 fästingar i varje mätning.

Figure 1
Figur 1 . Ett exempel på en brunn som innehåller 16 en - vecka gamla huvuden av manliga flugor. Cheferna är centrerad nedanför ett netto och flytande i media. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 . Ett representativt exempel på OCR mätning jämförelse mellan en - vecka-gammal flyga huvuden (ung) och fyra - vecka-gammal flyga huvuden (medelålders). (A) syrehalten visas för tre separata mätningar. varje 2 min mätning är indelad i tio sub mätningar (fästingar). (B) en kvantifiering av (A). Den första och sista fästingen är liknande, även om nivåerna av medelålders provet är något lägre. En kvantifiering av lutningen på minskningen av syrehalten används för att generera de OCR-nivåerna. Som tidigare beskrivits22är OCR av mellersta åldern flugor 10% - 15% högre än unga flugor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 . Ett exempel på förändring av OCR av natrium butyrate (SB) i unga flyga huvuden. (A) syrehalten inspelade från sju mätningar efter tillägg av 15 mM SB. Den streckade linjen markerar injektionen av läkemedlet (eller fordon) från port A. Notera, medan syre nivåerna av fästingar 1 och 10 förblir stabila i kontrollgruppen (blå), halterna av syre under dessa fästingar är övergående (sex mätningar efter injektion) minskas i SB behandlade prover (orange). Dessutom är minskningen av syrehalten kraftigt under den senaste fästingen av SB behandlade prover. N = 3 per grupp (B) [vänster] icke-normaliserade OCR nivåer beräknas från AKOS algoritmen. Beräkningen visar felaktigt liknande nivåer av OCR före och efter injektion av SB av port A. [höger] normalisering av OCR till mätningen före injektion av port A. (C) [vänster] 'Fast' algoritm för beräkning av (A) visar den icke-normaliserade OCR . Här, representerar OCR nära den övergående ökningen av syre användning av cheferna vid SB behandling; [Höger] Normalisering av OCR till mätningen före injektion av port A. felstaplarna indikerar S.E.M. i alla grafer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Vår nya teknik erbjuder en ny metod för att studera metaboliska förändringar i åldrande och sjukdom i samband med hela flyga head segment22. Metoden kan också vara lämpade för att studera effekterna av KDAC natrium butyrate på syreförbrukning. Som vi har visat, leda lysin deacetlyase hämmare (HDAC/KDACs) till OCR förändringar. I huvudsak, som målen i sådana hämmare normalt inte är lokaliserade i mitokondrierna (dessa hämmare inte påverkar klass III deacetylases, sirtuiner)24, sådana droger kunde endast testas på en minst vävnad nivå. Ja, olika läkemedel injiceras direkt till hjärnan, sätt kringgå möjligt bearbetning och modifiering/inaktivering av matsmältningssystemet. Vår teknik erbjuder roman inblick i hur sådana droger direkt inverkan segmentet huvud.

I området i närheten finns det flera kritiska steg. Först, som anges i protokollet, rekommenderar vi förbereder en platta under en timme, med två par händer förbereda plattan. Från vår erfarenhet är kvalitet och stabilitet av OCR mätningar bättre när förberedd i god tid. När du tar för lång tid, ökar förekomsten av låga OCR förtärande brunnar samt kortare stabil OCR. Andra, det är viktigt att utföra en kvalitetskontroll och säkerställa att de experimentella förhållandena mellan olika prover är liknande (pH, syrenivåer). Slutligen, ett kritiskt steg är att välja de rätta algoritmen för att analysera proven. Som vi har visat, gav AKOS standardalgoritmen en missvisande och ibland motsatta beräkning i prover som förbrukas syre vid höga13. Därför betonar vi vikten av att kontrollera rådata för syrehalten och jämföra den resulterande OCR.

För närvarande finns det flera begränsningar med denna teknik. Vid rumstemperatur, apparaten värms upp till 31 ° C (detta är minimal mäta temperaturen medan maskinen är vid rumstemperatur), som kan representera ett stress tillstånd för flyga huvuden25. Detta kan dock lösas genom att placera maskinen i ett kallt rum, som kommer att möjliggöra mätningar vid 25 ° C och därmed utan ett möjligt värmestress att flyga huvuden. Färsk rapport har visat att placera maskinen på 11 ° C, vilket möjliggör OCR inspelningen av flugor vid 25 ° C21. Flyga huvud separation bör dock utföras vid rumstemperatur. Dessutom temperaturvariationer gör det utmanande att kontrollera pH-förändringar och därför rekommenderas det starkt att testa effekterna av fysiologiska villkor/droger på OCR med hjälp av liknande försöksuppställningar. Dessutom har bidrag syreförbrukning genom icke-mitokondrie-oberoende mekanismer ännu inte etablerade26. Genom att använda olika respiratoriska hämmare som är effektiva i att flyga huvuden, skulle det vara möjligt att upprätta sådana icke-mitokondriell syre förbrukning.

Det är anmärkningsvärt att olika däggdjur sjukdomar kännetecknas av förändringar i energimetabolism. Bland dem sjukdomar som kännetecknas av antingen metabola minskning såsom Alzheimers sjukdom eller metabolisk omkoppling såsom cancer. Intressant, används KDAC-hämmare för både Alzheimers sjukdom och cancer behandling27. Medan de exakta mekanismer genom vilka KDAC hämmare uppnår den terapeutiska aspekten förblir oklart, stöder data från vår teknik roman uppfattningen att sådana hämmare kan modulera metabolism.

Sammanfattningsvis är denna metod värdefulla för mäta övergripande syreförbrukning i vivo och mer exakt visar läkemedelseffekter på allmänna metabolism, som kan förbises i isolerade mitokondrier protokoll12. Resultat från denna metod, snarare än tidigare tekniker, har exempelvis inblandade nya insikter för ålder-associerade metabola stelhet vid KDAC behandling. Medan ytterligare arbete krävs för att optimera de experimentella villkor för flyga huvuden, kombinationen av vår teknik och lämplig analys kan leda till ytterligare klargörande av de mitokondriell aktiviteten inom ramen för hela levande vävnader.

Disclosures

Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.

Acknowledgments

Vi tackar Andreas Ladurner, Carla Margulis och deras team för omfattande experimentellt stöd. Vi tackar Caitlin Ondracek för hennes synpunkter på manuskriptet. Vi vill tacka Sofia Vikstrom för att hjälpa oss att etablera tidiga faser av denna teknik. Vi tackar också kan Sanderhoff hennes teknisk hjälp. LB finansieras av den tyska federala ministeriet för utbildning och forskning (Infrafrontier grant 01KX1012). SP har finansierats av en AXA forskningsfond postdoktorsstipendium och NSFC (licensnummer 81870900). AVV finansieras av QBM.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glucose Sigma-Aldrich G8644 D-(+)-Glucose solution 100 g/L in H2O, sterile-filtered
XF assay Medium Agilent 103575-100 Seahorse XF DMEM Medium, pH 7.4
Sodium butyrate Merck 817500 Dissolved in XF assay buffer
Seahorse XF24/e24 analyzer Agilent
XF24/e24 Extracellular Assay Kit Agilent 100850-001 Cartridge
XF24/e24 Islet Capture Microplates Agilent 101122-100 Plate
Seahorse Capture Screen Insert Tool Agilent 101135-10 Insertor
Petri dish Sarstedt 821,472 Petri dish 92 x 16 mm

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wallace, D. C. Mitochondrial diseases in man and mouse. 283, (5407), Science. New York, N.Y. 1482-1488 (1999).
  2. Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Analytical chemistry. 81, (16), 6868-6878 (2009).
  3. Cunnane, S., et al. Brain fuel metabolism, aging, and Alzheimer's disease. Nutrition. 27, (1), Burbank, Los Angeles County, Calif. 3-20 (2011).
  4. Wang, Y., Hekimi, S. Mitochondrial dysfunction and longevity in animals: Untangling the knot. 350, (6265), Science. New York, N.Y. 1204-1207 (2015).
  5. Wallace, D. C., Fan, W., Procaccio, V. Mitochondrial energetics and therapeutics. Annual review of pathology. 5, 297-348 (2010).
  6. Zhang, X., et al. Induction of mitochondrial dysfunction as a strategy for targeting tumour cells in metabolically compromised microenvironments. Nature communications. 5, 3295 (2014).
  7. Wheaton, W. W., et al. Metformin inhibits mitochondrial complex I of cancer cells to reduce tumorigenesis. eLife. 3, e02242 (2014).
  8. Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods. PloS one. 6, (3), e18317 (2011).
  9. Baker, D. J., Peleg, S. Biphasic Modeling of Mitochondrial Metabolism Dysregulation during Aging. Trends in biochemical sciences. 42, (9), 702-711 (2017).
  10. Zhao, S., et al. Regulation of cellular metabolism by protein lysine acetylation. 327, (5968), Science. New York, N.Y. 1000-1004 (2010).
  11. Baeza, J., Smallegan, M. J., Denu, J. M. Mechanisms and Dynamics of Protein Acetylation in Mitochondria. Trends in biochemical sciences. 41, (3), 231-244 (2016).
  12. Picard, M., et al. Mitochondrial functional impairment with aging is exaggerated in isolated mitochondria compared to permeabilized myofibers. Aging cell. 9, (6), 1032-1046 (2010).
  13. Becker, L., Nogueira, M. S., Klima, C., de Angelis, M. H., Peleg, S. Rapid and transient oxygen consumption increase following acute HDAC/KDAC inhibition in Drosophila tissue. Scientific reports. 8, (1), 4199 (2018).
  14. Volkenhoff, A., et al. Glial Glycolysis Is Essential for Neuronal Survival in Drosophila. Cell metabolism. 22, (3), 437-447 (2015).
  15. Newell, C. Physiological Entomology. 41, 96-102 (2016).
  16. Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PloS one. 6, (7), e21746 (2011).
  17. Wikstrom, J. D., et al. A novel high-throughput assay for islet respiration reveals uncoupling of rodent and human islets. PloS one. 7, (5), e33023 (2012).
  18. Koopman, M., et al. A screening-based platform for the assessment of cellular respiration in Caenorhabditis elegans. Nature. 11, (10), 1798-1816 (2016).
  19. Kumar, M. G., et al. Altered Glycolysis and Mitochondrial Respiration in a Zebrafish Model of Dravet Syndrome. eNeuro. 3, (2), (2016).
  20. Neville, K. E., et al. A novel ex vivo method for measuring whole brain metabolism in model systems. Journal of neuroscience. 296, 32-43 (2018).
  21. Neville, K. E., et al. Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains. Journal of visualized experiments: JoVE. (138), (2018).
  22. Peleg, S., et al. Life span extension by targeting a link between metabolism and histone acetylation in Drosophila. EMBO reports. 17, (3), 455-469 (2016).
  23. Peleg, S., et al. Altered histone acetylation is associated with age-dependent memory impairment in mice. 328, (5979), Science. New York, N.Y. 753-756 (2010).
  24. Drazic, A., Myklebust, L. M., Ree, R., Arnesen, T. The world of protein acetylation. Biochimica et biophysica acta. 1864, (10), 1372-1401 (2016).
  25. Miquel, J., Lundgren, P. R., Bensch, K. G., Atlan, H. Effects of temperature on the life span, vitality and fine structure of Drosophila melanogaster. Mechanisms of ageing and development. 5, (5), 347-370 (1976).
  26. Banh, R. S., et al. PTP1B controls non-mitochondrial oxygen consumption by regulating RNF213 to promote tumour survival during hypoxia. Nature cell biology. 18, (7), 803-813 (2016).
  27. Falkenberg, K. J., Johnstone, R. W. Histone deacetylases and their inhibitors in cancer, neurological diseases and immune disorders. Nature reviews. Drug discovery. 13, (9), 673-691 (2014).
Mäta och tolka syre förbrukning helt flyga Head segment
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dietz, L. J., Venkatasubramani, A. V., Müller-Eigner, A., Hrabe de Angelis, M., Imhof, A., Becker, L., Peleg, S. Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments. J. Vis. Exp. (143), e58601, doi:10.3791/58601 (2019).More

Dietz, L. J., Venkatasubramani, A. V., Müller-Eigner, A., Hrabe de Angelis, M., Imhof, A., Becker, L., Peleg, S. Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments. J. Vis. Exp. (143), e58601, doi:10.3791/58601 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter