Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Storfe melkekjertlene biopsi teknikker

doi: 10.3791/58602 Published: December 23, 2018

Summary

Denne artikkelen presenterer en storfe melkekjertlene biopsi bruke kjerne og nål biopsi verktøy. Høstet vev kan brukes for cellekultur eller å vurdere mammary fysiologi og metabolisme inkludert genuttrykk, protein uttrykk, protein modifikasjoner, immunohistochemistry og metabolitten konsentrasjoner.

Abstract

Storfe melkekjertlene biopsier tillate forskere å samle vevsprøver å studere cellebiologi inkludert genuttrykk, histologiske analyse, signalnettverk trasé og protein oversettelsen. Denne artikkelen beskriver to teknikker for biopsi i bovin melkekjertlene (MG). Tre sunn Holstein mjølkekyr var fagene. Før biopsier, kyr melket og senere restriktiv storfe rutsjebane. En analgesic (flunixin meglumine, 1.1 til 2,2 mg/kg kroppsvekt) ble administrert via jugulare intravenøs [IV] injeksjon 15-20 min før til biopsi. For stående sedasjon, xylazine hydroklorid (0.01 til 0.05 mg/kg kroppsvekt) ble injisert via coccygeal fartøyene 5-10 min før prosedyren. Når tilstrekkelig bedøvet, var området biopsi tas aseptisk forberedt og lokalt anaesthetized med 6 mL av 2% lidokain hydroklorid via injeksjon. Bruker steril teknikk, ble en 2-3 cm loddrett snitt gjort med nummer 10 skalpell. Kjernen og nål biopsi verktøy ble brukt. Kjernen biopsi verktøyet var knyttet til en Oppladbar drill og inn MG vevet gjennom snittet en clock-wise bore-handlingen. Verktøyet nål biopsi var manuelt satt inn i såret området. Umiddelbart etter inngrepet, assistent brukt press på snitt i 20 til 25 minutter bruke et sterilt håndkle for å oppnå hemostasen. Rustfritt stål kirurgisk stifter ble brukt til å motsette seg den hud snittet. Stiftene var fjernet 10 dager etter prosedyren. De viktigste fordelene med core og nål biopsier er at begge tilnærminger er minimal invasiv prosedyrer som kan utføres sikkert friske kyr. Melk avkastning etter biopsy var upåvirket. Disse fremgangsmåtene krever en korte utvinning tid og resultere i mindre risiko for komplikasjoner. Spesifikke begrensninger kan inkludere blødning etter biopsi og infeksjon på webområdet biopsi. Programmene av disse teknikkene omfatter vev samling for klinisk diagnose og forskningsformål, for eksempel primær cellekultur.

Introduction

En biopsi er en prosedyre for å høste en kjernen del av fag for medisinsk eller forskningsformål. Det er en minimal invasiv og utbredt teknikk å samle vev som et alternativ til euthanasia1 analyse av vev svar til behandling eller andre faktorer av interesse. Prøver av bovin melkekjertlene (MG) vev er avgjørende for meieri forskning å studere genet og protein uttrykk, histology, organiseringen av mobilnettet organeller, signalveier og metabolske prosesser i respons på endringer i ledelsen eller miljø. I tillegg er MG vev nødvendig for å diagnostisere og forskning visse infeksjonssykdommer, som storfe mastitt forårsaket av bakterielle infeksjoner2.

I juret kyr inneholder fire separate kjertler og hver kjortelen behersker en uavhengig melk sekretoriske system kollektivt kalt parenchyma. Den alveoler, rør og bindevev finnes i den mammary parenchyma. Spesialisert myoepithelial celler på den ytre overflaten (basale) alveoler er mikroskopiske sfærisk hul strukturer som består av epitelceller i interne overflaten (luminal). Alveoler er ansvarlige for syntese og sekresjon av melk. Fibrøs connective vev i parenchyma kan skille en gruppe alveoler fra andre grupper av alveoler, og hver gruppe kalles en lobule3. Flere faktorer kan påvirke utvikling og funksjon av MG inkludert dyr fysiologi, ernæring, ledelse, genetikk og miljø4. Mastitis er også en kritisk faktor som negativt påvirker MG funksjon og melk kvalitet5. Den giftstoffer ut av mastitic patogener kan skade alveoler og indusere nekrose resulterer i biokjemiske og histologiske endringer i MG vev6. Dermed være kan histology og metabolske prosesser hver alveoler eller lobule i MG vesentlig forskjellig fra andre. Slik er biopsier som er representative utvalg av hele melkekjertlene ønskelig. Liten biopsies kan bare ta en enkelt lobule eller personlige alveolus, begrenser vitenskapelig eller diagnostiske resultatinformasjonen. Til forskningsformål, er det nødvendig å være klar over at en mammary biopsi gir et "øyeblikksbilde" av vevet egenskaper, men en biopsi ikke tilstrekkelig karakterisere mammary sammendragsfunksjon i fravær av anslag over total melkekjertlene masse.

Flere biopsi verktøy har blitt utviklet over de siste 30 årene for menneskelig bruk. Foreløpig er tilpasninger av disse instrumentene tilgjengelig for bruk med dyr. For melkeku, er prøver av MG vev anskaffet ved hjelp av forskjellige teknikker inkludert inngrep forbrukeravgift (sløv disseksjon)7og biopsi nåler1,8core biopsi instrumenter9,10. Dermed har MG biopsi teknikker i ammende mjølkekyr overført fra prosedyrer som bruker liggende sedasjon med kirurgisk disseksjon bruke electrocautery hemostasen i 19927 til samling av kjernen biopsier under stående sedasjon9, 10,11,12. Kirurgisk biopsi er en invasiv metode, som kan være dyrt og har en høyere forekomst av komplikasjoner som hematom, sår problemer, og svulst spre13. Foreløpig har kjernen biopsi og håndarbeide biopsy (også kjent som en tru-kutt biopsi) vært allment vedtatt som alternativer til kirurgisk biopsi. Fordelene med core og nål biopsier sammenlignet med kirurgisk biopsi inkluderer: prosedyren er minimal invasiv; store komplikasjonene er sjeldne; generell anestesi er ikke nødvendig; prosedyren er slektning rask; Utvinningen tid er kort; Det er minimal negative effekter på udder helse og bare kortsiktige effekter på melk avkastning og komposisjon8,9,10; kostnadene er mindre enn kirurgisk biopsi13.

En kjerne biopsi fremgangsmåten som er beskrevet i 1996 brukes en steril, rustfritt stål kanyle med flyttbare uttrekkbar blad fjerne en representant mengden vev fra storfe MG uten narkose9,10,11 ,12. Under inngrepet, var maskinen festet til en Oppladbar drill til å lage en lav hastighet, roterende bevegelse som ren kutte en vev kjerne som verktøyet var avansert inn i vevet. Fordelen var en større vev prøve (70 x 4 mm i diameter, ca 0,75 1 g) 9. En fersk studie10 viste at biopsi prosedyren beskrevet av V. C. Farret al. 9 kan brukes til å utføre gjentatte MG vev samlinger uten negativ innvirkning på ytelsen og udder helse ammende mjølkekyr. Nylig ble en studie14 gjennomført i melkekyr å evaluere gjentatte biopsies av MG med en større trocar (31 cm lang, ytre diameter 9.5 mm, indre diameter 8 mm) med vakuum brukt en interne rustfritt stål kanyle for å samle biopsy . Denne metoden brukes sedasjon (xylazine) og lokal anestesi (2% lidokain hydroklorid).

Håndarbeide biopsy er en annen teknikk for å samle mammary vev. Flere studier har vedtatt denne teknikken. 1 studier brukt sedasjon (detomidine) og lokal bedøvelse (1% lidocaine) i prosedyren. Etter biopsy fikk kyrne en forebyggende antibiotikabehandling. Melkekjertlene var manuelt massert før og etter den melking. Blod i melk ble observert til 84 h etter biopsy. Mengden og sammensetningen av melk ble berørt i en kort tidsperiode. Nylig brukt en studie en biopsi nål for å utføre gjentatte MG biopsi i mjølkekyr8. Sedasjon (1% acepromazine, intramuskulær) og lokal anestesi (2% lidokain hydroklorid, subkutan) ble utøvet på dyrene. Dyrene får ikke intramammary narkotika eller antibiotika før eller etter inngrepet, og det var ingen tegn til infeksjon på webområdet biopsi i post-kirurgiske perioden. I denne studien hadde gjentatte bovin MG biopsier bruker en nål, mindre negativ innvirkning på melk produksjon og udder helse mjølkekyr. Generelt synes håndarbeide biopsy å være en mindre invasiv metode enn kjernen biopsi instrumentet. Men som nevnt tidligere, er det avgjørende for biopsi teknikken å høste et representativt utvalg av MG vev. Begrensning av en håndarbeide biopsy er at en liten mengde bovin MG vev er oppnådd (ca 20 til 25 mg)8,15.

Nesten alle studiene brukte en kombinasjon av α-2 Agonistiske sedasjon og lokal bedøvelse8,9,10, om biopsy var via en nål eller en større kjerne. I bovin MG knyttes de fleste nerveender huden. Gir til parenchymal vev er hovedsakelig via strekk reseptorer sparsom type en nerve fibre å oppdage skarp kirurgisk smerte. Resultatet er fysiologiske mekanismene av smerte på grunn av kirurgisk manipulasjon av MG via hud og subkutant vev3 og ikke dypt vev som parenchymal vev. Derfor for biopsi prosedyrer er det bare nødvendig å bedøve lokalt huden og underhud vev, som infiltrasjon av lokal bedøvelse i dypere vev ikke betydelig redusere kirurgisk smerte. Etter en passende forberedelse av området biopsi er dyr ubehag, hovedsakelig forbundet med tilbakeholdenhet.

Samling av større kjerneprøver kan øke hematom dannelse og øke risikoen for infeksjon i MG parenchyma. Derfor inkluderer peri-operative protokoller ofte administrasjon av parenteral antibiotika7, men det ikke er universals8. Oppnå hemostasen er også en viktig faktor for å redusere ku sykelighet. I nevnte studien bruker en stor kjernen biopsi instrument14, manuell trykk ble brukt til biopsi området og ku BH ble brukt til å bruke is sår minst 2 h følge fremgangsmåten. Den store mengden vev høstet, bare små reduksjoner i feed inntak og melk yield ble observert og prosedyren ble gjentatt hver tredje uke uten negative effekter på ku helse.

Forskere utfører MG biopsi i mjølkekyr må vurdere diagnostiske eller analytiske kvaliteten på den resulterende biopsy, teknikk og ku sykelighet. Nøyaktig og pre-planlagte kirurgiske teknikker er viktig å oppnå disse målene. Hittil MG biopsi studier har fokusert på å beskrive biopsi resultater, i motsetning til som beskriver biopsi teknikken, og beskrivelser for ammende melkekyr mangler tilstrekkelig detalj slik at replikering. Dermed var formålet med dette verket å beskrive både håndarbeide biopsy og større kjernen biopsi teknikker i tilstrekkelig detalj tillate sikker og Human replikering av MG biopsi kyr.

Protocol

Alle metodene beskrevet ble godkjent av Virginia Tech institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC).

1. personell

  1. Har minst to assistenter med kirurgisk og ku-håndtering.
  2. Trene alle assistenter minst tre ganger, bruker om mulig cadaveric materiale, før du utfører fremgangsmåtene som er tilknyttet denne protokollen på levende dyr.
    Merk: Opplæring skal utføres av en instruktør som har vært tidligere trent og utført teknikken.
  3. Har en stor dyr veterinær beholdning for narkotika administrasjon og i tilfelle at akutt behandling blir nødvendig under prosedyren. Nødhjelp som kan oppstå under denne prosedyren inkluderer men er ikke begrenset til: blødning, α-2 Agonistiske overdose og lungeødem, gulpe opp og aspirasjon av maten materiale, smerte og pasienten motstand krever ytterligere sedasjon.

2. forberedelse av kirurgiske instrumenter, forsyninger og anlegg

  1. Inventar og kjøpe alle utstyret og forsyner (se Tabell for materiale).
  2. Ren og autoklav kirurgisk gardiner, biopsi instrumenter, skalpell holdere, kirurgisk håndklær og tang.
  3. Har riktig størrelse klem kastere og hodet gate å holde kyrne.
  4. Opprette et arbeidsområde med en tabell i nærheten klem sjakten.
  5. Kontroller at arbeidsområdet er rent og har begrenset ku gjennomgangstrafikk.
  6. Organisere utstyr og forsyninger i arbeidsområdet for enkel tilgang.
  7. Ha riktig belysning i arbeidsområdet.

3. forberedelse av dyrene

  1. En dag før den planlagte biopsy, vask og skrubbe dyr, spesielt i juret fjerne gjødsel og skitne materiale.
  2. Følg prosedyrene for sikker og Human beherskelse av storfe.
  3. Før biopsy og igjen ved biopsy, vurdere helse, fitness og atferd av dyr.
    Merk: En minimum eksamen omfatter temperatur, puls, og respiratoriske priser samt eksamen for dermatitt over foreslåtte kirurgiske området eller andre områder av bakteriell infeksjon. Oppsamling melk fra hvert kvartal og sjekk for mastitt.
  4. Bruk bare friske kyr.
  5. Helt melk kua.
  6. Flytte dyret til klem sjakten, ideelt i 2 timer med melking for å minimere melk tilstedeværelse i kjertler.
  7. Holde dyr med hodet gate.

4. analgesi og sedasjon

  1. Plass en bardunen stoppet på hodet av kua å hindre bakover og fremover bevegelse.
  2. Trekk at dyret til side, og binde tauet for å presse sjakten med en rask utgivelse knute for å holde hodet på plass.
  3. Rengjør området på injeksjon med en 70% isopropylalkohol vattpinne og administrere flunixin meglumine (1.1 til 2,2 mg/kg kroppsvekt) intravenøst via vena jugularis 15-20 min før til biopsi.
    Merk: I enkelte protokoller, administreres nonsteroidal anti-inflammatoriske legemidler etter biopsy hvis inflammatoriske ikke påvirker søkeresultater.
    1. Finn vena jugularis.
    2. Øke vena jugularis ved anvendelse av press på undersiden av jugulare sporet.
    3. Kontroller at det er noen bobler i sprøyten.
    4. Sett inn nålen i hevet vena jugularis, og trekke 0,5 mL blod i sprøyten to ganger og bland med innholdet. Hvis ingen blod i sprøyten, flytte nålen. Hvis nålen er bosatt i blodåre, Injiser innholdet.
    5. Fjern nålen.
    6. Bruke gasbind med lett press på injeksjonsstedet å hindre blødning.
  4. Administrere xylazine hydroklorid intravenøst (0,01 til 0,05 mg/kg kroppsvekt) i coccygeal fartøyet ca 5-10 min før biopsi å gi tilstrekkelig tid for etablering av sedasjon.
    FORSIKTIG: Når Dyret for underskriver av lungeødem. Klinisk underskriver av lungeødem inkluderer luftveissykdom, alvorlig dyspné, pustevansker, hoste, skummende sputum og blå tungen. Hvis tegn på lungeødem er observert, anbefales det å bruke tolazine (2-4 mg/kg kroppsvekt) å reversere xylazine effektene.
    1. Høyne halen og rense området på injeksjon med en 70% isopropylalkohol vattpinne.
    2. Kontroller at det er noen bobler i sprøyten.
    3. Sett inn nålen i halen fartøyet, tegne 0,2 mL blod i sprøyten og bland med innholdet å sikre nålen er bosatt i fartøyet. Hvis nålen er bosatt i fartøyet, injisere sprøyte innholdet.
    4. Fjern nålen.
    5. Bruke gasbind med lett press på injeksjonsstedet.

5. utarbeidelse av webområdet biopsi

  1. Ha en assistenten binde opp halen for prosedyren.
  2. Velge biopsi området i juret (vanligvis i en øvre området å minimere samling av bindevev og unngå gjennomtrengning i kjertel sisternen, figur 1), og fjern skitnet materiale eller gjødsel fra webområdet valgte biopsi.

Figure 1
Figur 1 . Bilde av bovin juret illustrerer webområdet biopsi. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 

  1. Observere og palpate huden med spesiell oppmerksomhet til identifisere alle store subkutan blodkar for å unngå disse fartøyene under biopsy.
  2. Klippet håret fra en 15 cm x 15 cm området rundt området biopsi.
  3. Forberede biopsi området med povidon-jod (0,75% tilgjengelig jod) eller chlorhexidine gluconate kratt. Alternative med 70% isopropylalkohol minst tre ganger for å fjerne alle synlige og usynlige rusk. Bruke aseptiske scrub løsning og isopropyl alkohol i en sirkulær bevegelse med innsiden ut tilnærming. Påse at antiseptisk scrub løsningen hudkontakt i minst 5 minutter.
  4. Bruk en sommerfugl infusjon med en 18 G p for å sette 6 mL av 2% lidokain hydroklorid subcutaneously på webområdet snitt til å opprette en linje-blokk. Ikke trenge gjennom inn i dypere vev.
    Merk: Dosering av lidocaine varierer mellom 3 og 8 mL.
  5. Tillat lokal bedøvelse å spre for 3 til 5 min. utføre en gjentagelse av scrub løsning og alkohol før snitt. Mens du venter, forberede biopsi instrumenter.

6. biopsiprosedyre

  1. Bruk steril teknikk ved håndtering biopsi verktøyene og innsnitt.
  2. Vask hendene for å fjerne alle synlig kontaminering og bruke sterilt kirurgiske hansker.
  3. Ordne Kirurgiske instrumenter i et sterilt i bruksrekkefølge. Har nummer 10 skalpell, sterilt gasbind, et samlet biopsi instrument og et sterilt håndkle for hemostasen.
    Merk: Følg fremgangsmåten 1 å utføre en Core biopsi eller prosedyre 2 å utføre en håndarbeide biopsy.

Figure 2
Figur 2 . Skjematisk fremstilling av montering og oppsett av kjernen biopsi verktøyet beskrevet av V. C. Farr, et al. 9 skala bar er 1 cm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

  1. Kjernen biopsi Instrument (Farr et al.9)
    1. Samle kjernen biopsi instrumentet med sterilt hansker (figur 2).
      1. Plass 7 sterilt bitene på et sterilt drapere (figur 2A).
      2. Sette inn blad (del 1) i dokkingsystemet på stykke 2 (figur 2B ).
        FORSIKTIG: Ikke plass fingrene direkte på blad-linjen.
      3. Sette inn 3 over del 2 (figur 2C) sikrer at dokkingstasjonen justeres.
        Merk: Observere en docking system i det indre veggen av 4 (figur 2D).
      4. Engasjere siste kanten av bladet (del 1) inn i docking system av 4 (figur 2D).
      5. Push fremover stykke 4 og observere hvis 4 er ved siden av del 3 (figur 2E).
      6. Sette inn 5 på enheten (bladet + del 2) (figur 2F).
      7. Sikre at dokkingstasjonen justeres (figur 2 g).
      8. Sette inn 6 på toppen av del 2 (motsatt side av bladet) (figur 2 H)
      9. Sikre at dokkingstasjonen justeres (figur 2 H).
      10. Sett inn låseskruen (del 7) i dokkingstasjonen (figur 2I).
      11. Presse frem del 3 (svart) til å dekke låseskruen.
        FORSIKTIG: Ikke plass fingrene på bladet exit.
      12. Aktivere verktøyet skyve frem stykke 4 og observere bladet utenfor verktøyet.
      13. Skyv stykke 4 for å trekke bladet i verktøyet (klar til å bruke).
        Merk: Bladet skal aktiveres bare når verktøyet har trengt ønsket avstand i vevet skal biopsied.
    2. Kontroller at kua er tilstrekkelig bedøvet og webområdet biopsi er tilstrekkelig anesthetized. Klype i huden for å sikre at ingen reaksjon.
    3. Gjøre en 2 til 3 cm loddrett snitt gjennom huden og subkutant vev fra proksimale til distale bruker nummer 10 skalpell.
    4. Fest biopsi apparatet til en Oppladbar drill bruker steril teknikk.
    5. Plasser bore mot verktøyet biopsi og sjekk hvis verktøyet er godt festet til boret.
    6. Sikre tilstrekkelig tilbakeholdenhet ved å ha en individuell heve halen under alle prosedyren.
    7. Slå på drill med klokken og en lav hastighet.
      Merk: Drill er ikke sterile og operatøren forblir ikke sterilt ved bore.
    8. Forhånd verktøyet hele biopsi (rundt 7,5 cm) i juret gjennom snittet mens bore roterer toll.
    9. Slå av drill og manuelt utvide 4 stykke verktøyet.
    10. Slå på drill med klokken og lav hastighet.
    11. Fjerne apparatet inneholder vev kjernen fra juret.
    12. Bruk sterke trykk umiddelbart til såret med et sterilt håndkle for minst 20 min.
      Merk: Ha en assistenten utfører dette med sine neve for å sikre tilstrekkelig press er brukt.
    13. Fjern vev fra biopsi verktøyet ved hjelp av pinsett.
    14. Holde prøven i 1 x fosfat bufret saltvann og vurdere mengden vev.
    15. Ta den kua vitale hvert 10 min etter biopsy i minst 30 min.
    16. Kontrollere blødning etter 20 min press på webområdet biopsi. Hvis det drypper av blod fortsetter å bruke press for en ytterligere 5-10 minutter.
    17. Lukke snittene bruker rustfritt stål stifter med 5 mm mellomrom etter alle blødning har stoppet. Bruk mellom 5 og 8 stifter.
    18. Bruke en aerosol bandasje biopsi området.
    19. Observere dyr for 50 min etter inngrepet.
  2. Nål biopsi Instrument
    1. Følg produsentens instruksjoner for enheten.
    2. Fjern biopsi nålen fra pakken med sterilt teknikker.
    3. Kaste nålen hvis skade er observert.
    4. Feste nålen til enheten.
    5. Lukk dekslet og kuk enheten.
    6. Kontroller at kua er tilstrekkelig bedøvet og webområdet biopsi er tilstrekkelig anesthetized. Klype i huden for å sikre at ingen reaksjon.
    7. Gjøre en 1 til 2 cm loddrett snitt gjennom huden og subkutant vev fra proksimale til distale bruker nummer 10 skalpell.
      Merk: I snitt biopsi nål instrumentet kan være mindre (1-2 cm) enn for kjernen biopsi instrumentet.
    8. Biopsi nålen inn incision sted (rundt 10 og 13 cm fra huden).
    9. Aktivere biopsi nål enheten å samle vev.
    10. Fjern nålen fra juret.
    11. Bruk umiddelbar, kraftig trykk til såret med et sterilt håndkle for minst 20 min.
    12. Fjern vev fra biopsi nålen ved hjelp av pinsett.
    13. Holde prøven i 1 x fosfat bufret saltvann og vurdere mengden vev.
    14. Ta vitale hvert 10 min etter biopsy i minst 30 min.
    15. Kontrollere blødning etter 20 min press på webområdet biopsi.
    16. Lukke snittene bruker rustfritt stål stifter tross alt blødning har stoppet.
    17. Bruke en aerosol bandasje biopsi området.
    18. Observere dyr for 50 min etter inngrepet.

7. etter biopsi dyr omsorg

  1. Dokumentere alle medisiner gis til dyr.
    Merk: Melk ble forkastet under en periode med 36 h etter prosedyren; kjøtt tilbaketrekning var 4 d. uttak perioder for melk og kjøtt kan variere avhengig av landet eller jurisdiksjon og legemidler som brukes. Kontroller lokale regler og forskrifter.
  2. Se etter blod i melk for 7 til 10 d etter biopsy.
  3. Hånd stripe blodpropp fra biopsied kvartal på etterfølgende milkings og sikre at komplett melk fjerning oppstår.
    Merk: Tilstedeværelsen av blodpropp fra biopsied kvartal for 1-3 milkings følge fremgangsmåten er forventet. Blod i melk kan være observert for 1 til 6 d etter biopsy.
  4. Observere melk gir, og hvis mulig, den individuelle daglige feed inntak til kirurgisk stifter er fjernet.
  5. Overvåke dyret to ganger om dagen for kroppstemperatur, åndedrett og hjerte priser og holdning til kirurgisk stifter er fjernet.
  6. Sjekk biopsi området to ganger daglig for hevelse, ømhet og tegn av drenering til kirurgisk stiftene er fjernet. Hvis dette er observert, oppsøke veterinær.
    Merk: Holde biopsi området rent og bruk aerosol bandasjen hver én til tre dager etter behov.
  7. Fjerne stiftene fra webområdet snitt 10 til 14 d etter biopsy, avhengig helbredende.
  8. Oppsøke veterinær hvis noen tegn til lokale eller systemisk infeksjon er observert.

Representative Results

Nåværende protokoll, kjerne biopsi teknikken produsert Vevsprøve 200 til 600 mg mens håndarbeide biopsy produsert prøver av 10 å 30 mg per biopsi. Dyrene ble observert to ganger om dagen for 10 d etter inngrepet. Ingen komplikasjoner oppstått under prosedyren eller i postoperativ perioden, med viktige parametere av kyrne gjenværende innenfor normale grenser (gjennomsnittlig respirasjonsfrekvens = 31.4 ± 7.04 (SD) åndedrag per min, Gjennomsnittlig hjertefrekvens = 75.9 ± 8,9 slag per min og gjennomsnitt endetarms temperatur = 38.2 ± 0.68 ° C, Figur 3).

Etter manuell Trykk på biopsi området å oppnå hemostasen (ca 25 min), viste det åpne såret minimal blødning (Figur 4). Kyr ble matet den samme dietten ad lib, og dyrene ble holdt i samme boliganlegget i postoperativ perioden. Dyrene viser ikke tegn på infeksjon på biopsi området. Det var ingen smerte, blødning, hevelse, drenering, eller høy temperatur (figur 5). Såret leget innen 8 til 10 d av biopsi (figur 5C).

En dyr utviklet mindre hudirritasjon grunn for å sår gni på dag 8 etter inngrepet. Denne kua ble behandlet av rengjøring biopsi området povidon-jod løsning og 70% isopropylalkohol. Rustfritt stål stiftene ble fjernet for å tillate drenering og povidon jod salve (1%) ble brukt to ganger om dagen på biopsi for 2 til 3 d. Hudirritasjon forsvant 2 d etter anvender povidon-jod salve og såret leget uten ytterligere komplikasjoner.

Blodpropp ble fjernet ved hånden stripping av melk fra biopsied kvartal før maskinen melking. I stede protokollen, ble tilstedeværelse av blodpropp i melk observert for opptil tre milkings (ca 36 h) etter biopsy. Blod forurensning av melk ble observert i opptil 48 timer etter biopsy. Det var ingen visuelle forskjeller observert mellom kjernen og nål biopsier i forhold til mengden av blod i melk. Dyrene viser ikke en betydelig reduksjon i melk avkastning etter prosedyren (figur 6). Gjennomsnittlig melk sammensetningen var 4,37% fett, 3.34% protein og 4.64% laktose. Den gjennomsnittlige melk somatisk celletall (SCC) var mindre enn 200 000 celler per mL.

MG vev innhentes benyttes for andre forskningsformål som primært cellekulturer (figur 7).

Figure 3
Figur 3 . Evaluering av dyrehelse indikatorer etter den bovine melkekjertlene biopsy. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 

Figure 4
Figur 4 . Biopsi nettstedet utseende etter manuell trykk ble brukt til biopsi området for å oppnå hemostasen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 . Biopsi området fotografier. (A) biopsi nettstedet 3 d etter prosedyren. (B) biopsi området 6 d etter prosedyren. (C) biopsi området 10 d etter inngrepet illustrerer at såret leget tilstrekkelig. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6 . Daglig melk produksjon før og etter bovin melkekjertlene biopsi (n = 3 kyr). En lineær modell anslått at 10 dager før biopsy dyrene produsert 23.35 kg melk per dag. Melk avkastningen ikke endre signifikant (P > 0,05) fra 10 dager før til 10 dager etter biopsy selv om en liten økning i melk avkastning ble observert (øke 0.0005 kg/d melk hver dag fra 10 dager før biopsi). Tre dyr ble brukt i denne protokollen; en dyr var biopsied to ganger (dyr 1: core biopsi til venstre i juret og needle biopsy til høyre i juret) og to dyr ble biopsied (dyr 2 og 3: bare på høyre side i juret bruker core eller p prosedyren). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7 . Representant bilder av primære bovin mammary epitelceller kultur. Skala bar er 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Kjernen og nål biopsi metoder ble beskrevet i denne protokollen9,16. En detaljert vurdering av dyrehelse og forekomsten av mastitt14 før biopsy kreves for begge prosedyrer. Til forskningsformål, bør utføre teknikken i dyr med tydelig underskriver av betennelse eller smittsomme sykdommer unngås. Dette vil redusere risikoen for komplikasjoner under og etter en biopsi. Biopsi instrumenter og enheter bør være rene, desinfiseres og sterilisert å unngå forurensning av webområdet biopsi. Før prosedyren er det nødvendig å minimere kirurgiske området infeksjoner (SSI). Generelt, er SSI tilknyttet dyr sykelighet, tapt ytelse og høyere kostnader i mjølkekyr. Studier rapportert tidligere metoder for å hindre at SSI på grunn av biopsi inkludert klipping håret rundt såret området, vaske biopsi området for å fjerne forurensning9,14, og bruker antiseptisk agenter (70% alkohol, jod kirurgisk skrubbe9, 2% chlorhexidine acetate løsning14, 10% povidon-jod8) for huden forberedelse. I noen studier, ble administrasjon av antibiotika vedtatt under7 eller umiddelbart etter biopsi9; men antibiotika profylakse ble ikke brukt i dette arbeidet, og ingen infeksjoner av biopsi området ble observert. For å hindre forurensning av biopsi sår, skal halen være sikret for å unngå kontakt med biopsi området til aerosol bandasjen er utlignet. I denne protokollen fjernet stifter ca 10 til 14 d etter biopsy.

Før en kjerne biopsi er det viktig å riktig sette opp verktøyet og knytte den til drill; velge en langsom hastighet, Velg frem rotasjonen og bruker ikke omvendt modus av bore. I prosedyren er det viktig å bruke digital press på begge sider av innsnitt å holde huden kantene fra hverandre og har en lang nok snitt tillate verktøyet oppføringen uten kontakter huden eller bindevev. Hvis denne fremgangsmåten ikke gjøres, kan en dra på snitt kantene under rotasjon av kjernen biopsi instrumentet oppstår og forårsake ekstra hud vev traumer som øker risikoen for infeksjon og kan forsinke sårheling. Nåværende biopsi prosedyrene som er beskrevet i denne protokollen ble utført av en bord-sertifisert store dyr kirurg. Prosedyrene ble utført (figur 5). Begge teknikkene er relativt enkelt og raskt å utføre sammenlignet med kirurgisk excision prosedyren.

Blødning fra webområdet biopsi er vanlig etter MG biopsi i mjølkekyr8,9,10,14. I den nåværende protokollen, blødning observert var minimal (Figur 4), som kan være av anvendelse av tilstrekkelig (sterk) press på såret umiddelbart etter inngrepet. Sterkt press for minst 20 min kreves, og det kan være nødvendig i mer enn 30 min i noen tilfeller. Hvis moderat til alvorlig blødning er observert etter anvendelse av press på biopsi området, anbefales det å fortsette press, og umiddelbart kontakte veterinær.

Hemostasen er en viktig faktor for å redusere ku sykelighet, pakket en studie hemostatic pads i området biopsi å kontrollere blødning9. Bruk av hemostatic pads på en måte har imidlertid en potensiell risiko i mikrobiologisk forurensning i melkeprodusenter miljøet. En annen studie14 brukes manuell trykk til biopsi området mellom gjentatte biopsier og etter biopsi og huden lukking, og is på nettstedet for minst 2 timer etter biopsy. I den nåværende protokollen var sterkt press på webområdet biopsi i 20 til 25 min tilstrekkelig til å kontrollere blødning.

En vellykket biopsi teknikk skal resultere i minimum blod i melken som vedvarer for en kort periode etter inngrepet. For å unngå et avbrudd i melk sekret under melk letdown og mastitt infeksjoner, bør intramammary blodpropp fjernes hånd stripping biopsied kvartal10,14. I stede protokollen, ble blod observert i melk opptil 48 h etter biopsy. Men i en studie som brukes flere dyr, ble blod i melk observert i fleste kyr for mindre enn 6 dager. Få dyr viste blod i melk etter 6 dager8. Derfor er daglig observasjon av melk utseende nødvendig for 6 d etter inngrepet. Dyr ikke viser noen tegn til mastitt infeksjon når en stor Vevsprøve ble innhentet14. Men fant tidligere undersøkelser som utføres gjentatte biopsier på samme dyret bruker en nål, at mastitt infeksjon insidensen var ca 12% etter prosedyren8. I den nåværende protokollen hadde ingen dyr visuelle tegn på klinisk mastitt infeksjon etter inngrepet. Det er også en liten sjanse for at webområdet snitt kan bli smittet etter biopsy.

Tolazoline hydroklorid, et stoff som reverserer effekten av sedasjon, skal finnes ved en overdose fra xylazine. En høy dose av xylazine kan forårsake lungeødem. Klinisk underskriver av lungeødem inkluderer luftveissykdom, alvorlig dyspné, pustevansker, hoste og skummende sputum. Hvis tegn på lungeødem er observert, anbefales det å bruke tolazine (2-4 mg/kg kroppsvekt) å reversere xylazine effektene.

Nåværende protokollen beskriver teknikken for å utføre en håndarbeide biopsy og kjernen biopsi. Generelt, er fordelen av en kjerne biopsi sammenlignet med håndarbeide biopsy større vev utvalg (0,75 1 g)9 med minst mulig negativ effekt på udder helse. Håndarbeide biopsy er en mindre invasiv metode enn kjernen biopsi instrumentet. Imidlertid forsøker flere biopsi å hente en større mengde vev ved hjelp av en nål biopsiprosedyre kan øke risikoen for stor blødning etter prosedyren, i tillegg til blodpropp i melken. Begge teknikkene forårsaket minimal ku sykelighet og var lett oppnås med minimal trening av kirurgiske personell. En kortsiktig endring i daglig melk avkastning (8 til 10% reduksjon) og komposisjon9 og fôrinntak reduksjon14 forventes etter de kjernen og nål biopsier, henholdsvis. Nål biopsi prosedyrens begrensninger er små volumet av vev fjernet med nålen. Apparatet må aktiveres bare når nålen er i vevet skal biopsied og flere forsøk ofte er nødvendig for å oppnå tilstrekkelig mengder vev, som øker risikoen for blod i melk og mastitt etter inngrepet. Begrensninger av kjernen biopsi omfatter en høyere risiko for blødninger etter prosedyren hvis mye vev (> 200 mg) er oppnådd. Dessuten er biopsy verktøyet vanskeligere å montere krever tilstrekkelig opplæring før bruk.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Denne forskningen ble støttet av National Animal ernæringsprogram og Virginia Tech. Teknisk assistanse av Ms. Tara Pilonero, Dr. Julie Settlage og Dr. Izabelle Teixeira er takknemlig anerkjent.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
70% Isopropyl alcohol  Walmart  565106257 1 L
Aerosol spray to kill and repel flies MWI 14339 1 bottle (if necessary)
Biopsy needles, 12 G × 16 cm C. R. Bard MN1216 2
Butterfly infusion set (18 G needle) Fisher 22-258087 1
Cell culture dishes Fisher 08-772E 4
Cordless drill (low speed) Hitachi   DS10DFL  1
Core biopsy instrument, Farr et al. (1996) 2, custom metal fabrication. To request the tool contact the authors.
Cows cattle healthy
Flunixin meglumine MWI/VetOne 501018 1.1 to 2.2 mg/kg of body weight
Folding table   Amazon 1
Forceps Fisher 09-753-50 1
Gloves non-sterile  Fisher 17-200-845 9, size dependent
Hard brush  Sullivan Supply 18270 1, to wash the cows
Head gate  1, customized for dairy cows
Lidocaine hydrochloride 2% injectable  MWI/VetOne 510212 6 mL was used,  from 3 to 8 mL
Livestock body wash eZall Technologies 39384 1, to wash the cows
Needle 18 G  (1 to 1/5“) Fisher 14-821-15A 6
Needle 20 G (1 to 1/5“) Fisher 14-815-526 6
Phosphate buffered saline (0.9%) Fisher 20-012-043 1 L
Povidone Iodine ointment Jeffers #VED1A 500 g (if necessary)
Povidone iodine scrub solution (0.75% iodine) MWI/VetOne 510094 1 L
Reusable biopsy instrument  C. R. Bard MG1522 1
Rope halter Nasco farm and ranch C10852 2, cow size
Scalpel blades (#10) MWI 033870 2
Scalpel holders (#3) MWI 602008 1
Self seal autoclave pouch 10 x 5.5 in. Fisher 19-130-0038 1 case of 800
Sterile cotton gauze sponges Fisher 22-037-986 4
Sterile gauze pads Fisher 19-090-735 4
Sterile surgical gloves  Surgical gloves 19-166-679 3,  size dependent
Sterile surgical towels Fisher 50-118-0339 6
Stethoscope Littmann Master Classic II 1392 1
Surgical clipper Oster A5 078005-010-003 1, preparation of the animal for biopsy
Surgical clipper blades (#40 ) Oster  78919-016 1, preparation of the animal for biopsy
Surgical staple remover MWI 541 1
Surgical stapler pre-loaded MWI 17713 5
Syringes of 10 mL Fisher 14-823-224 3
Syringes of 2 mL Fisher 22-028854 3
Syringes of 20 mL Fisher 22-034507 3
Syringes of 5 mL Fisher 22-028855 3
Thermometer Agri-Pro Enterprises Inc 72000 1
Tolazine hydrochloride Akorn Animal Health 61311-486-10 2 to 4 mg/kg of body weight (if necessary)
Tweezer  Fisher 14-955-025 1, for handle the tissue sample
Water hose Miracle-Gro, Walmart 554990501 1, to wash the cows
Water-resistant aerosol bandage (aluminum powder 40 mg) MWI 010728 1 bottle 
Xylazine hydrochloride MWI/VetOne 510650 0.01 to 0.05 mg/kg of body weight

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Khatun, M., Sorensen, P., Ingvartsen, K. L., Bjerring, M., Rontved, C. M. Effects of combined liver and udder biopsying on the acute phase response of dairy cows with experimentally induced E. coli mastitis. Animal. 7, (10), 1721-1730 (2013).
  2. Buitenhuis, B., Rontved, C. M., Edwards, S. M., Ingvartsen, K. L., Sorensen, P. In depth analysis of genes and pathways of the mammary gland involved in the pathogenesis of bovine Escherichia coli-mastitis. BMC Genomics. 12, 130 (2011).
  3. Nickerson, S. C., Akers, R. M. Mammary Gland | Anatomy. Fuquay JW, Fox PF and McSweeney PLH (eds.), Encyclopedia of Dairy Sciences, Second Edition. 3, Academic Press. San Diego. 328-337 (2011).
  4. Akers, R. M. A 100-Year Review: Mammary development and lactation. Journal of Dairy Science. 100, (12), 10332-10352 (2017).
  5. Ruegg, P. L. A 100-Year Review: Mastitis detection, management, and prevention1. Journal of Dairy Science. 100, (12), 10381-10397 (2017).
  6. Zhao, X., Lacasse, P. Mammary tissue damage during bovine mastitis: Causes and control. Journal of Animal Science. 86, (13), 57-65 (2008).
  7. Knight, C. H., Hillerton, J. E., Teverson, R. M., Winter, A. Biopsy of the bovine mammary gland. British Veterinary Journal. 148, (2), 129-132 (1992).
  8. Lima, J. A., et al. Effects of bovine mammary gland biopsy and increased milking frequency on post-procedure udder health, histology, and milk yield. Animal. 10, (5), 838-846 (2016).
  9. Farr, V. C., et al. An improved method for the routine biopsy of bovine mammary tissue. Journal of Dairy Science. 79, (4), 543-549 (1996).
  10. Weng, X., et al. Short communication: Repeated mammary tissue collections during lactation do not alter subsequent milk yield or composition. Journal of Dairy Science. 100, (10), 8422-8425 (2017).
  11. Peterson, D. G., Matitashvili, E. A., Bauman, D. E. Diet-induced milk fat depression in dairy cows results in increased trans-10, cis-12 CLA in milk fat and coordinate suppression of mRNA abundance for mammary enzymes involved in milk fat synthesis. Journal of Nutrition. 133, (10), 3098-3102 (2003).
  12. Baumgard, L. H., Matitashvili, E., Corl, B. A., Dwyer, D. A., Bauman, D. E. trans-10, cis-12 conjugated linoleic acid decreases lipogenic rates and expression of genes involved in milk lipid synthesis in dairy cows. Journal of Dairy Science. 85, (9), 2155-2163 (2002).
  13. Kasraeian, S., Allison, D. C., Ahlmann, E. R., Fedenko, A. N., Menendez, L. R. A comparison of fine-needle aspiration, core biopsy, and surgical biopsy in the diagnosis of extremity soft tissue masses. Clinical Orthopaedics and Related Research. 468, (11), 2992-3002 (2010).
  14. de Lima, L. S., et al. A new technique for repeated biopsies of the mammary gland in dairy cows allotted to Latin-square design studies. Canadian Journal of Veterinary Research-Revue Canadienne De Recherche Veterinaire. 80, (3), 225-229 (2016).
  15. Ollier, S., et al. Whole intact rapeseeds or sunflower oil in high-forage or high-concentrate diets affects milk yield, milk composition, and mammary gene expression profile in goats. Journal of Dairy Science. 92, (11), 5544-5560 (2009).
  16. Soberon, F., et al. Effects of increased milking frequency on metabolism and mammary cell proliferation in Holstein dairy cows. Journal of Dairy Science. 93, (2), 565-573 (2010).
Storfe melkekjertlene biopsi teknikker
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Daley, V. L., Dye, C., Bogers, S. H., Akers, R. M., Rodriguez, F. C., Cant, J. P., Doelman, J., Yoder, P., Kumar, K., Webster, D., Hanigan, M. D. Bovine Mammary Gland Biopsy Techniques. J. Vis. Exp. (142), e58602, doi:10.3791/58602 (2018).More

Daley, V. L., Dye, C., Bogers, S. H., Akers, R. M., Rodriguez, F. C., Cant, J. P., Doelman, J., Yoder, P., Kumar, K., Webster, D., Hanigan, M. D. Bovine Mammary Gland Biopsy Techniques. J. Vis. Exp. (142), e58602, doi:10.3791/58602 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter