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Biology

Técnicas de biópsia da glândula mamária bovina

doi: 10.3791/58602 Published: December 23, 2018

Summary

Este artigo apresenta uma biópsia da glândula mamária bovina usando ferramentas de núcleo e uma agulha de biópsia. Colheita de tecido pode ser usado para cultura de células ou para avaliar a fisiologia mamária e metabolismo, incluindo a expressão de gene, expressão da proteína, modificações de proteína, imuno-histoquímica e as concentrações do metabólito.

Abstract

Biópsias da glândula mamária bovina permitem aos investigadores coletar amostras de tecido para estudar Biologia celular, incluindo a expressão de gene, análise histológica, sinalização de caminhos e tradução de proteínas. Este artigo descreve duas técnicas para biópsia da glândula mamária bovina (MG). Três saudáveis vacas leiteiras Holstein foram os assuntos. Antes de biópsias, vacas ordenhadas e posteriormente contidas em um para-quedas do gado. Um analgésico (flunixin meglumine, 1,1 a 2,2 mg/kg de peso corporal) foi administrado via jugular venosa prévia de 15-20 min de injeção [IV] para fazer a biópsia. Para sedação em pé, cloridrato de xilazina (0,01-0,05 mg/kg de peso corporal) foi injetado através dos vasos coccígeas 5-10 min antes do procedimento. Uma vez adequadamente sedado, no local da biópsia foi assepticamente preparado e anestesiado localmente com 6 mL de cloridrato de lidocaína a 2%, via subcutânea. Utilizando técnica asséptica, uma incisão vertical de 2 a 3 cm foi feita usando um bisturi número 10. Foram utilizadas ferramentas de núcleo e uma agulha de biópsia. A ferramenta de biópsia do núcleo foi anexada a um berbequim e colocada no tecido MG através da incisão usando uma broca clock-wise ação. A ferramenta de biópsia de agulha foi inserida manualmente no local da incisão. Imediatamente após o procedimento, um assistente aplicar pressão no local da incisão para 20 a 25 min usando uma toalha estéril para obter hemostasia. Grampos cirúrgicos de aço inoxidável foram usados para opor-se a incisão da pele. Os grampos foram removido 10 dias após o procedimento. As principais vantagens das biópsias de núcleo e a agulha é que ambas as abordagens são procedimentos minimamente invasivos que podem ser executados com segurança em vacas saudáveis. Produção de leite após a biópsia não foi afetada. Esses procedimentos exigem um tempo de recuperação curto e resultam em menos riscos de complicações. Limitações específicas podem incluir sangramento após a biópsia e a infecção no local da biopsia. As aplicações destas técnicas incluem coleta de tecido para fins de investigação, tais como a cultura de célula primária e diagnóstico clínico.

Introduction

A biópsia é um procedimento para colher uma seção do núcleo de tecido do temas para médica ou para fins de pesquisa. É uma técnica minimamente invasiva e amplamente utilizada para coletar o tecido como uma alternativa à eutanásia1 para permitir a análise de respostas teciduais ao tratamento ou outros fatores de interesse. Amostras de tecidos de glândula mamária bovina (MG) são essenciais para lácteos pesquisa estudar a expressão de gene e proteína, histologia, a organização das organelas celulares, sinalização de caminhos e processos metabólicos em resposta a alterações na gestão ou a meio ambiente. Além disso, tecido de MG é necessária para diagnosticar e investigação de determinadas doenças infecciosas, como a mastite bovina causada por infecções bacterianas2.

O úbere de bovinos contém quatro glândulas separadas e cada glândula contém um sistema secretor de leite independente coletivamente chamado parênquima. Os alvéolos, ductos e tecido conjuntivo estão presentes no parênquima mamário. Os alvéolos são estruturas ocas esféricas microscópicas são compostos de células epiteliais na superfície interna (luminal) e mioepiteliais especializadas células na superfície externa (basal). Os alvéolos são responsáveis pela síntese e secreção de leite. O tecido conjuntivo fibroso presente no parênquima pode separar um grupo de alvéolos de outros grupos de alvéolos e cada grupo é chamado um lóbulo3. Vários fatores podem afetar o desenvolvimento e a função do MG, incluindo a fisiologia animal, nutrição, gestão, genética e o ambiente4. Mastite é também um fator crítico que afeta negativamente a MG função e leite de qualidade5. As toxinas liberadas por patógenos mastitic podem causar danos aos alvéolos e induzir necrose resultando em alterações bioquímicas e histológicas no tecido MG6. Assim, a histologia e processos metabólicos de cada alvéolo ou lóbulo na MG podem ser significativamente diferentes dos outros. Como tal, biópsias que são amostras representativas da glândula mamária inteira são desejáveis. Biópsias pequenas podem capturar apenas um único lóbulo ou alvéolos individuais, limitando a informação científica ou diagnóstica resultante. Para fins de investigação, é necessário estar ciente que uma biópsia mamária fornece um 'instantâneo' das características do tecido, mas uma biópsia adequadamente não pode caracterizar a função mamária total na ausência de estimativas do total da glândula mamária em massa.

Várias ferramentas de biópsia foram desenvolvidas nos últimos 30 anos para uso humano. Atualmente, adaptações desses instrumentos estão disponíveis para uso com os animais. Para o gado leiteiro, foram obtidas amostras de tecido de MG usando técnicas diferentes, incluindo excisão cirúrgica (dissecção romba)7, biópsia agulhas1,8e núcleo biópsia instrumentos9,10. Assim, técnicas de biópsia MG em vacas leiteiras lactantes têm uma transição de procedimentos usando sedação reclinada com dissecação cirúrgica utilizando eletrocautério hemostasia em 19927 a coleção de biopsias sob permanente sedação9, 10,11,12. Biópsia cirúrgica é um método invasivo, que pode ser caro e têm uma maior incidência de complicações como hematoma, ferida de problemas, e o tumor espalhou13. Atualmente, biopsias e biópsia de agulha (também conhecido como uma biópsia de tru-cut) foram amplamente adotados como alternativas para biópsia cirúrgica. As vantagens do núcleo e agulha biópsias em comparação com a biópsia cirúrgica incluem: o procedimento é minimamente invasivo; as principais complicações são raras; anestesia geral não é necessária; o procedimento é confortavel rápida; o tempo de recuperação é curto; Há um mínimo de efeitos negativo sobre a saúde do úbere e apenas os efeitos a curto prazo em leite rendimento e composição8,9,10; e o custo é de biópsia cirúrgica menos de13.

Um procedimento de biópsia do núcleo descrito em 1996 usado uma estéril, cânula de aço inoxidável com uma lâmina retrátil removível para remover uma quantidade representativa de tecido da MG bovina sem anestesia geral9,10,11 ,12. Durante o procedimento, o instrumento foi anexado a um berbequim para criar uma baixa velocidade, o movimento rotacional que limpa, cortar um núcleo de tecido como a ferramenta foi avançada no tecido. O benefício foi um tecido maior amostra (70 mm x 4 mm de diâmetro, cerca de 0,75 a 1 g) 9. Um recente estudo10 mostrou que o procedimento de biópsia, descrito por V. C. Farret al . 9 pode ser usado para executar repetidas coleções de tecido MG sem o impacto negativo sobre a saúde de desempenho e úbere de vacas em lactação. Mais recentemente, um estudo14 foi realizado em vacas leiteiras para avaliar repetidas biópsias do MG usando um trocarte maior (31 cm longo, exterior diâmetro de 9,5 mm, diâmetro interno de 8 mm) com vácuo aplicado a uma cânula interna de inox para coletar a biópsia . Este método usado (xilazina) de sedação e anestesia local (cloridrato de lidocaína 2%).

A biópsia de agulha é outra técnica para coletar o tecido mamário. Vários estudos têm adotado essa técnica. Um estudo1 usado sedação (detomidine) e anestésico local (lidocaína a 1%) no procedimento. Após a biópsia, as vacas receberam um tratamento antibiótico profilático. A glândula mamária foi massageada manualmente antes e após a ordenha. Sangue no leite foi observado para até 84 h depois da biópsia. A quantidade e a composição do leite foram afetados por um curto período de tempo. Recentemente, um estudo usado uma agulha de biópsia para realizar biópsias repetidas de MG em vacas leiteiras8. (Acepromazina 1%, intramuscular) de sedação e anestesia local (2% cloridrato de lidocaína, subcutânea) foram administrados aos animais. Os animais não receberam drogas intramamárias ou antibióticos antes ou após o procedimento, e não havia sinais de infecção no local da biopsia durante o período pós-cirúrgico. Neste estudo, repetidas biópsias MG bovina, usando uma agulha tinham um menor impacto negativo sobre a saúde de produção e úbere de leite de vacas leiteiras. Em geral, a biópsia de agulha parece ser um método menos invasivo do que o instrumento de biópsia do núcleo. No entanto, conforme observado anteriormente, é essencial para a técnica de biópsia colher uma amostra representativa do tecido MG. A limitação de uma biópsia de agulha é que uma pequena quantidade de tecido bovino de MG é obtida (cerca de 20 a 25 mg)8,15.

Quase todos os estudos usou uma combinação de α-2 agonista sedação e anestesia local8,9,10, se a biópsia foi através de uma agulha ou um núcleo maior. Na espécie bovina MG, a maioria das terminações nervosas estão associadas com a pele. Inervação aos tecidos parenquimatosos é em grande parte através de receptores de estiramento com esparso tipo um fibras nervosas para detectar dor aguda cirúrgica. Como resultado, os mecanismos fisiológicos da dor devido à manipulação cirúrgica do MG é através da pele e tecidos subcutâneos3 e não tecidos tais como tecidos parenquimatosos. Portanto, para procedimentos de biópsia, é apenas necessário anestesiar localmente a pele e tecido subcutâneo, como infiltração de anestésico local em tecidos mais profundos não contribui significativamente para reduzir dor cirúrgica. Após uma preparação adequada da área da biópsia, desconforto animal é, principalmente, associado com moderação.

Coleção de amostras maiores pode aumentar a formação de hematoma e aumentar o risco de infecção dentro do parênquima do MG. Portanto, peri-operatório protocolos geralmente incluem administração de antibióticos parenteral7, embora não seja universais8. Alcançar a hemostasia é também um fator importante para reduzir a morbilidade de vaca. No referido estudo usar um grande núcleo de instrumento de biópsia14, pressão manual aplicou-se para o local da biopsia e um sutiã de vaca foi usado para aplicar gelo para as feridas pelo menos 2h após o procedimento. Apesar da grande quantidade de tecido colhido, observaram-se reduções apenas ligeiras no rendimento de leite e ingestão de alimentos, e o procedimento foi repetido a cada três semanas, sem efeitos negativos sobre a saúde da vaca.

Pesquisadores realizando biópsia MG em vacas leiteiras precisam considerar a qualidade analítica ou diagnóstica da biópsia resultante, facilidade da técnica e a morbidade de vaca. Técnicas cirúrgicas precisas e previamente planejadas são imperativas para atingir esses objetivos. Até à data, estudos de biópsia MG centraram-se em descrever os resultados da biópsia, em oposição a descrever a técnica de biópsia em si, e descrições para vacas leiteiras em lactação faltam pormenor suficiente para permitir a replicação. Assim, o objetivo deste trabalho foi descrever tanto a agulha de biópsia e maiores técnicas de biópsia do núcleo em detalhes suficientes para permitir replicação segura e humana de biópsia MG de gado.

Protocol

Todos os métodos descritos foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) e Virginia Tech institucional Cuidado Animal.

1. o pessoal

  1. Tem pelo menos dois assistentes com experiência cirúrgica e manipulação de vaca.
  2. Treine todos os assistentes, pelo menos três vezes, se possível, usando material cadavérico, antes de realizar procedimentos associados com este protocolo em animais vivos.
    Nota: O treinamento deve ser conduzido por um instrutor que tenha sido previamente treinado e executada a técnica.
  3. Tenho um grande animal veterinário na mão para administração de drogas e no evento que o tratamento de emergência torna-se necessário durante o procedimento. Emergências que possam ocorrer durante este procedimento incluem mas não estão limitadas a: hemorragia, overdose de α-2 agonista e edema pulmonar, regurgitação e aspiração do alimento material, dor e resistência paciente exigindo mais sedação.

2. preparação dos instrumentos cirúrgicos, mantimentos e instalações

  1. Inventário e comprar todos os equipamentos e suprimentos (ver Tabela de materiais).
  2. Limpo e cirúrgico drapeja autoclave, instrumentos de biópsia, titulares de bisturi, toalhas cirúrgicas e fórceps.
  3. Ter um tamanho adequado apertar para-quedas e portão de cabeça para conter as vacas.
  4. Estabelece um espaço de trabalho com uma mesa perto do para-quedas do aperto.
  5. Certifique-se que a área de trabalho é limpa e tem limitado a vaca através de tráfego.
  6. Organize e equipamentos no espaço de trabalho para facilitar o acesso.
  7. Tem iluminação apropriada dentro do espaço de trabalho.

3. preparação dos animais

  1. Um dia antes da biópsia regular, lave e esfregue o animal, particularmente o úbere para remover material suja e estrume.
  2. Siga os procedimentos para a contenção segura e humana de gado.
  3. Previamente a biópsia e novamente no momento da biópsia, avalie a saúde, a condição física e o comportamento do animal.
    Nota: Um exame mínimo inclui temperatura, pulso e taxas respiratórias, bem como exame para dermatite sobre o local cirúrgico proposto ou outras áreas de infecção bacteriana. Coletar amostras de leite de cada trimestre e verificar para mastite.
  4. Use apenas as vacas saudáveis.
  5. Completamente o leite da vaca.
  6. Mova o animal para o contentor de aperto, idealmente até 2 horas após a ordenha para minimizar a presença de leite nas glândulas.
  7. Conter o animal com um portão de cabeça.

4. analgesia e sedação

  1. Coloque um cabresto de corda na cabeça da vaca para impedir para trás e para frente o movimento.
  2. Puxe a cabeça do animal para um lado e amarrar a corda para o para-quedas aperto usando um nó de liberação rápida para segurar a cabeça no lugar.
  3. Limpe o local da injeção com um algodão com álcool isopropílico 70% e administrar por via intravenosa o flunixin meglumine (1,1 a 2,2 mg/kg de peso corporal) através do veia jugular 15-20 min antes para biópsia.
    Nota: em alguns protocolos, antiinflamatórios não-esteroides anti-inflamatórios não esteroides são administrados após a biópsia se drogas antiinflamatórias não afetará os resultados da investigação.
    1. Localize a veia jugular.
    2. Elevar a veia jugular por aplicação de pressão na base do sulco jugular.
    3. Verifique se que não há nenhum bolhas na seringa.
    4. Insira a agulha na veia jugular levantada e desenhar 0,5 mL de sangue para a seringa duas vezes e misturar com o conteúdo. Se não há sangue mostra na seringa, realoca a agulha. Se a agulha é residente na veia, injete o conteúdo.
    5. Remova cuidadosamente a agulha.
    6. Aplica gaze com ligeira pressão no local da injeção para evitar sangramento.
  4. Administrar por via intravenosa o cloridrato de xilazina (0,01 a 0,05 mg/kg de peso corporal) no recipiente coccígeo aproximadamente 5-10 min antes da biópsia para permitir tempo suficiente para o estabelecimento de sedação.
    Atenção: Verifique se o animal para sinais de edema pulmonar. Os sinais clínicos de edema pulmonar incluem dificuldade respiratória, dispneia grave, dificuldades respiratórias, tosse, expectoração espumosa e língua azul. Se forem observados sinais de edema pulmonar, é recomendável usar tolazine (2 a 4 mg/kg de peso corporal) para reverter os efeitos de xilazina.
    1. Levantar o rabo e limpe o local da injeção com um algodão com álcool isopropílico 70%.
    2. Verifique se que não há nenhum bolhas na seringa.
    3. Insira a agulha no vaso a cauda, desenhar 0,2 mL de sangue para a seringa e misture com o conteúdo para assegurar que a agulha é residente no vaso. Se a agulha for residente no vaso, injete o conteúdo da seringa.
    4. Remova cuidadosamente a agulha.
    5. Aplica gaze com pressão suave para o local da injeção.

5. preparação do local da biópsia

  1. Tenho uma assistente que amarrar a cauda para o procedimento.
  2. Selecione o local da biopsia no úbere (tipicamente em uma área superior a minimizar a coleção de tecido conjuntivo e para evitar a penetração dentro da cisterna da glândula, Figura 1) e remover qualquer material sujo ou estrume do local da biopsia selecionado.

Figure 1
Figura 1 . Imagem do úbere bovino ilustrando o local da biopsia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

  1. Observar e palpar a pele com especial atenção para identificar qualquer grandes vasos subcutâneos para evitar estes navios durante a biópsia.
  2. Corte o cabelo de uma área de 15 x 15 cm em torno do local da biópsia.
  3. Prepare a área de biópsia com iodo-povidona (0,75% de iodo disponível) ou esfoliação de gluconato de clorexidina. Alternam-se com álcool isopropílico a 70% pelo menos três vezes para remover todos os resíduos visíveis e invisíveis. Aplica a solução esfoliante asséptico e álcool isopropílico em movimentos circulares usando a abordagem de dentro para fora. Certifique-se de que a solução anti-séptica esfoliante permanece em contacto com a pele pelo menos 5 min.
  4. Use uma conjunto com uma agulha de 18 G de infusão de borboleta para depositar 6 mL de cloridrato de lidocaína a 2% por via subcutânea no local da incisão, para criar um linha-bloco. Não penetra os tecidos mais profundos.
    Nota: A dosagem de lidocaína varia entre 3 e 8 mL.
  5. Permitir que o anestésico local difundir para 3 a 5 min. realizar outra repetição de solução esfoliante e álcool antes da incisão. Enquanto espera, prepare-se os instrumentos de biópsia.

6. a biópsia

  1. Utilize técnicas assépticas quando manusear as ferramentas de biópsia e para a incisão.
  2. Lave as mãos para remover a contaminação visível todas e aplicar luvas cirúrgicas estéreis.
  3. Disponha os instrumentos cirúrgicos em uma área estéril em ordem de uso. Tenho um bisturi número 10, gaze estéril, um instrumento de biópsia montado e uma toalha estéril para hemostasia.
    Nota: Siga o procedimento 1, para realizar uma biópsia do núcleo ou procedimento 2 para realizar uma biópsia de agulha.

Figure 2
Figura 2 . Representação esquemática da montagem e instalação da ferramenta de biópsia de núcleo descrita por V. C. Farr, et al 9 barra de escala é 1 cm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Instrumento de biópsia do núcleo (Farr et al.9)
    1. Monte o instrumento de biópsia do núcleo usando luvas estéreis (Figura 2).
      1. Coloque os 7 pedaços de estéril sobre um pano estéril (Figura 2A).
      2. Coloque a lâmina (parte 1) no sistema de acoplagem na parte 2 (Figura 2B ).
        Atenção: Não coloque os dedos diretamente na linha de lâmina.
      3. Inserir parte 3 sobre parte 2 (Figura 2), garantindo que a docking station alinhará.
        Nota: Observe um sistema de encaixe na parede interior da parte 4 (Figura 2D).
      4. Encaixe a extremidade final da lâmina (parte 1) no sistema de acoplagem da peça 4 (Figura 2D).
      5. Empurre para a frente a parte 4 e observar se a parte 4 está ao lado de parte 3 (Figura 2E).
      6. Insira a peça 5 no dispositivo (blade + parte 2) (Figura 2F).
      7. Certifique-se de que a docking station está alinhada (Figura 2).
      8. Insira o topo da peça 2 peça 6 (lado oposto da lâmina) (Figura 2 H)
      9. Certifique-se de que a docking station está alinhada (Figura 2 H).
      10. Insira o parafuso de bloqueio (parte 7) na estação de ancoragem (Figura 2I).
      11. Empurre para a frente, parte 3 (preto) para cobrir o parafuso de bloqueio.
        Atenção: Não coloque os dedos sobre a saída de lâmina.
      12. Ativar a ferramenta empurrar para a frente a parte 4 e observar a lâmina fora a ferramenta.
      13. Puxe a parte 4 para retrair a lâmina na ferramenta (pronta para uso).
        Nota: A lâmina deve ser ativada somente quando a ferramenta penetrou a distância desejada dentro do tecido a biopsar.
    2. Certifique-se que a vaca está suficientemente sedada e no local da biópsia é suficientemente anestesiado. Belisca a pele para não garantir nenhuma reação.
    3. Faça uma incisão vertical de 2 a 3 cm, através da pele e tecidos subcutâneos de proximal para distal, usando um bisturi número 10.
    4. Anexe o instrumento de biópsia a um berbequim, usando uma técnica estéril.
    5. Coloque a broca contra a ferramenta de biópsia e verifique se a ferramenta está firmemente acoplada ao perfurador.
    6. Assegure a contenção adequada por ter um indivíduo elevar a cauda durante todo o procedimento.
    7. Liga a furadeira, usando a rotação no sentido horário e baixa velocidade.
      Nota: A broca não é estéril, e o operador não permaneça estéril quando usando a broca.
    8. Avance a ferramenta toda biópsia (cerca de 7,5 cm) para o úbere através da incisão enquanto a broca é rodar o pedágio.
    9. Desligue a broca e estender manualmente parte 4 da ferramenta.
    10. Liga a furadeira, usando a rotação no sentido horário e baixa velocidade.
    11. Retire o instrumento que contém o núcleo do tecido do úbere.
    12. Aplique pressão forte imediatamente o ferimento com uma toalha estéril pelo menos 20 min.
      Nota: Tem uma assistente executar esta usando seu punho para garantir a adequada pressão é aplicada.
    13. Remova o tecido da ferramenta de biópsia usando uma pinça.
    14. Manter a amostra em 1 tamponado de fosfato x salina e avaliar a quantidade de tecido.
    15. Tirar os sinais vitais da vaca cada 10min após a biópsia pelo menos 30 min.
    16. Verifique se há sangramento depois de 20 min de pressão no local da biopsia. Se existem pingos de sangue continuam a aplicar pressão para um adicional 5-10 min.
    17. Feche as incisões usando grampos de aço inoxidável em intervalos de 5 mm, afinal a hemorragia parou. Usar entre 5 e 8 grampos.
    18. Aplica um curativo de aerossol para a área da biópsia.
    19. Observe o animal durante 50 minutos após o procedimento.
  2. Instrumento de biópsia de agulha
    1. Siga as instruções do fabricante para o dispositivo.
    2. Retire a agulha de biopsia do pacote usando técnicas estéreis.
    3. Descarte a agulha se observar qualquer dano.
    4. Fixe a agulha no dispositivo.
    5. Feche a tampa e galo o dispositivo.
    6. Certifique-se que a vaca está suficientemente sedada e no local da biópsia é suficientemente anestesiado. Belisca a pele para não garantir nenhuma reação.
    7. Faça uma incisão vertical de 1 a 2 cm, através da pele e tecidos subcutâneos de proximal para distal, usando um bisturi número 10.
      Nota: A incisão para o instrumento de agulha de biópsia pode ser menor (1-2 cm) do que para o instrumento de biópsia do núcleo.
    8. Insira a agulha de biópsia no local da incisão (cerca de 10 a 13 cm de pele).
    9. Ative o dispositivo de agulha de biopsia para coletar o tecido.
    10. Retire a agulha do úbere.
    11. Aplique uma pressão imediata e forte da ferida usando uma toalha estéril pelo menos 20 min.
    12. Remova o tecido da agulha de biopsia usando uma pinça.
    13. Manter a amostra em 1 tamponado de fosfato x salina e avaliar a quantidade de tecido.
    14. Leve os sinais vitais cada 10min após a biópsia pelo menos 30 min.
    15. Verifique se há sangramento depois de 20 min de pressão no local da biopsia.
    16. Feche as incisões usando grampos de aço inoxidável, afinal a hemorragia parou.
    17. Aplica um curativo de aerossol para a área da biópsia.
    18. Observe o animal durante 50 minutos após o procedimento.

7. pós-biópsia cuidados com animais

  1. Documente todas as drogas administradas aos animais.
    Nota: O leite foi Descartado durante um período de 36 h após o procedimento; retirada de carne foi 4 d. intervalos de segurança para leite e carne podem variar consoante o país ou jurisdição e as drogas usadas. Por favor, verifique as regras locais e regulamentos.
  2. Verificar a presença de sangue no leite por 7 a 10 d depois da biópsia.
  3. Mão de coágulos de sangue tira do bairro uma biópsia no ordenhas subsequentes e certifique-se de que o leite completo remoção ocorre.
    Nota: A presença de coágulos de sangue do bairro uma biópsia para ordenhas de 1-3 o procedimento a seguir é esperada. Sangue no leite pode ser observados para 1 a 6 d depois da biópsia.
  4. Observar o leite rende, e se possível, o individual diário alimenta ingestão até grampos cirúrgicos foram removidos.
  5. Monitore o animal duas vezes por dia para a temperatura do corpo, respiração e taxas de coração e comportamento até grampos cirúrgicos foram removidos.
  6. Verifique o local da biopsia duas vezes ao dia para inchaço, ternura e todos os sinais de drenagem até os grampos cirúrgicos foram removidos. Se estas forem observadas, consulte um veterinário.
    Nota: Limpe o local da biopsia e reaplicar o curativo de aerossol cada um a três dias, conforme necessário.
  7. Retire os grampos do local da incisão de 10 a 14 d após a biópsia, dependendo da taxa de cura.
  8. Consulte um veterinário, se forem observados sinais de infecção local ou sistêmica.

Representative Results

No presente protocolo, a técnica de biópsia do núcleo produzido a amostra de tecido de 200 a 600 mg enquanto a biópsia de agulha produzidas amostras de 10 a 30 mg por biópsia. Os animais foram observados duas vezes por dia para 10 d após o procedimento. Sem complicações ocorreram durante o procedimento ou no período pós-operatório, com parâmetros vitais das vacas permanecendo dentro dos limites normais (média frequência respiratória = 31,4 ± 7.04 (SD) respirações por minuto, a média da frequência cardíaca = 75,9 ± 8,9 batidas por minuto e a média temperatura retal = 38,2 ± 0,68 ° C, Figura 3).

Após pressão manual sobre a área da biópsia para obter hemostasia (cerca de 25 min), a ferida aberta mostrou hemorragia mínima (Figura 4). As vacas foram alimentadas com a mesma dieta ad libitum, e os animais foram mantidos na mesma instalação de habitação durante o período pós-operatório. Os animais não mostrou sinais de infecção no local da biópsia; Não havia nenhuma dor, sangramento, inchaço, drenagem ou temperatura elevada (Figura 5). A ferida sarou dentro de 8 a 10 d da biópsia (Figura 5).

Um animal desenvolvido irritação de pele menores devido a ferimento esfregando no 8º dia após o procedimento. Esta vaca foi tratada por limpeza usando solução de iodo-povidona e álcool isopropílico a 70% no local da biópsia. Os grampos de aço inoxidável foram removidos para permitir a drenagem e pomada de iodo povidona (1%) foi aplicada duas vezes por dia no local da biópsia para 2 a 3 d. A irritação de pele desapareceu d 2 depois de aplicar a pomada povidone-iodo e a ferida sarou com sem maiores complicações.

Coágulos de sangue foram removidos pela mão de descascamento de leite do bairro uma biópsia antes da máquina de ordenha. No presente protocolo, a presença de coágulos de sangue no leite foi observada para até três ordenhas (cerca de 36 h) após a biópsia. Contaminação de sangue de leite foi observada para até 48 h após a biópsia. Não havia diferenças visuais observadas entre o núcleo e agulha biópsias em relação a quantidade de sangue no leite. Os animais não mostrou uma diminuição significativa na produção de leite após o procedimento (Figura 6). Composição média do leite foi 4.37% de gordura, proteína de 3,34% e 4.64% lactose. A contagem de células somáticas de leite de média (SCC) era menos de 200.000 células por mL.

O tecido de MG obtido pode ser usado para fins de investigação diferentes, tais como culturas de células primárias (Figura 7).

Figure 3
Figura 3 . Avaliação dos indicadores de saúde animal após a biópsia da glândula mamária bovina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

Figure 4
Figura 4 . Aparência do site biópsia após pressão manual foi aplicado para a área da biópsia para obter hemostasia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5 . Fotografias de biópsia local. (A) biópsia d 3 do site após o procedimento. (B) biópsia site d 6 após o procedimento. (C) biópsia site d 10 após o procedimento, ilustrando que a ferida foi curada adequadamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6 . Produção de leite diária antes e após a biópsia da glândula mamária bovina (n = 3 vacas). Um modelo linear estima-se que 10 dias antes da biópsia dos animais produziram 23,35 kg de leite por dia. A produção de leite não se alterou significativamente (P > 0,05) de 10 dias antes de 10 dias após a biópsia apesar de um ligeiro aumento na produção de leite foi observada (aumento de 0,0005 kg/d de leite para cada dia de 10 dias antes da biópsia). Três animais foram utilizados no presente protocolo; um animal foi biopsiado duas vezes (Animal 1: core biópsia no lado esquerdo do úbere e agulha de biopsia no lado direito do úbere) e dois animais foram biopsiados uma vez (Animal 2 e 3: somente no lado direito do úbere usando o procedimento de núcleo ou agulha). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7 . Imagens representativas da cultura primária bovina mamárias de células epiteliais. Barra de escala é 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Métodos de biópsia Core e agulha foram descritos no presente protocolo9,16. Uma avaliação detalhada da saúde animal e incidência de mastite14 antes da biópsia é necessária para ambos os procedimentos. Para fins de pesquisa, realizando a técnica em animais com sinais evidentes de inflamação ou doenças infecciosas deve ser evitado. Isso reduzirá o risco de complicações durante e após uma biópsia. Todos os dispositivos e instrumentos de biópsia devem ser limpos, desinfectados e esterilizados para evitar a contaminação do local da biopsia. Antes do procedimento, é necessário minimizar infecções do sítio cirúrgico (SSI). Em geral, a SSI está associada com morbidade animal, perdido desempenho e custos de produção mais elevados em vacas leiteiras. Estudos anteriormente relataram métodos para evitar a SSI devido à biópsia incluindo recorte o cabelo em torno do local da incisão, lavando a área de biópsia para remover contaminação9,14e usando agentes anti-séptico (álcool 70%, iodo cirúrgico Esfregue-se9, de solução de acetato de clorexidina 2%14, 10% de iodo-povidona8) para a preparação da pele. Em alguns estudos, a administração de antibióticos foi adotada durante7 ou imediatamente após a biópsia,9; no entanto, profilaxia antibiótica não foi utilizada no presente trabalho, e não infecções do local da biópsia foram observadas. Para evitar a contaminação da ferida da biópsia, a cauda deve ser protegida para evitar o contato com o local da biópsia até o curativo de aerossol foi aplicado. Neste protocolo, grampos são removidos cerca de 10 a 14 d depois da biópsia.

Antes de uma biópsia do núcleo, é importante para corretamente configurar a ferramenta e anexá-lo para a broca; Escolha uma velocidade de rotação lenta, selecionar a rotação para frente e não use o modo reverso da broca. Durante o procedimento, é importante usar pressão digital em ambos os lados da incisão para separar as bordas de pele e ter uma incisão tempo suficiente para permitir a entrada de ferramenta sem contato com a pele ou tecido conjuntivo. Se este procedimento não é feito, um arrasto sobre as bordas da incisão durante a rotação do instrumento de biópsia do núcleo pode ocorrer e causar trauma de tecido de pele adicional que aumentará o risco de infecção e pode retardar a cicatrização de feridas. Os presentes procedimentos de biópsia descritos neste protocolo foram realizados por um cirurgião credenciado de animais grande. As cirurgias foram realizadas com sucesso (Figura 5). Ambas as técnicas são relativamente fáceis e rápidos para realizar em comparação com o procedimento da excisão cirúrgica.

Sangramento do local da biopsia são comuns após biópsia MG em vacas leiteiras8,9,10,14. No presente protocolo, sangramento observado foi mínimo (Figura 4), que pode ser devido à aplicação de pressão (forte) adequada na ferida imediatamente após o procedimento. Forte pressão pelo menos 20 min é necessária, e pode ser necessária para mais de 30 min, em alguns casos. Se moderada a grave sangramento é observada após a aplicação de pressão para o local da biopsia, é aconselhável continuar a pressão e imediatamente, entre em contato com um veterinário.

Como a hemostasia é um fator importante para reduzir a morbilidade da vaca, um estudo lotaram almofadas hemostáticas no local da biópsia para controle do sangramento9. No entanto, o uso de almofadas hemostáticas de tal forma tem um alto risco potencial de contaminação microbiológica no ambiente de fazenda de gado leiteiro. Outro estudo14 aplicada pressão manual para entre biópsias repetidas e após o encerramento de biópsia e a pele no local da biópsia e aplicado gelo o local pelo menos 2h após a biópsia. No presente protocolo, a forte pressão aplicada no local da biópsia para 20 a 25 min foi adequada para controlar a hemorragia.

Uma técnica bem sucedida biópsia deve resultar em sangue mínimo no leite que persiste por um curto período de tempo após o procedimento. Para evitar a interrupção da secreção de leite durante infecções de decepção e mastite leite, coágulos sanguíneos intramamário devem ser removidos por mão descascar da biopsia trimestre10,14. No presente protocolo, sangue foi observada no leite até 48 h após a biópsia. Entretanto, num estudo que usou um número maior de animais, sangue no leite foi observada na maioria das vacas por menos de 6 dias. Alguns animais apresentaram sangue no leite após 6 dias8. Por esta razão, observação diária de aparência de leite é necessária para 6 d após o procedimento. Animais não apresentam sinais de infecção de mastite quando obteve-se uma amostra de tecido grande14. No entanto, as pesquisas anteriores que realizada biópsias repetidas do mesmo animal, usando uma agulha encontraram que essa incidência de infecção de mastite foi de aproximadamente 12% seguindo o procedimento8. No presente protocolo, nem animal tinha sinais visíveis de infecção de mastite clínica após o procedimento. Há também uma ligeira possibilidade de que o local da incisão pode tornar-se infectado depois da biópsia.

Cloridrato de tolazolina, uma droga que reverte os efeitos de sedação, deve estar disponível no caso de uma overdose de xilazina. Uma dose excessiva de xilazina pode causar edema pulmonar. Os sinais clínicos de edema pulmonar incluem dificuldade respiratória, dispneia grave, dificuldades respiratórias, tosse e expectoração espumosa. Se forem observados sinais de edema pulmonar, é recomendável usar tolazine (2 a 4 mg/kg de peso corporal) para reverter os efeitos de xilazina.

O presente protocolo descreve a técnica para realizar uma biópsia de agulha e biopsias. Em geral, a vantagem de uma biópsia do núcleo em comparação com a biópsia de agulha é o maior de tecido amostra (0,75 a 1 g)9 com mínimo efeito negativo sobre a saúde do úbere. A biópsia de agulha é um método menos invasivo do que o instrumento de biópsia do núcleo. No entanto, biópsia múltiplas tentativas para obter uma maior quantidade de tecido usando que um procedimento de biópsia de agulha pode aumentar o risco de sangramento importante após o procedimento, bem como coágulos de sangue no leite. Ambas as técnicas causaram morbidade mínima de vaca e foram facilmente alcançadas com treinamento mínimo de pessoal cirúrgico. Uma mudança a curto prazo na produção de leite diária (8 a 10% de redução) e sua composição9 e de redução de consumo de ração14 é esperada após os núcleo e agulha biópsias, respectivamente. Limitações do procedimento de biópsia de agulha são o pequeno volume de tecido removido com a agulha. O instrumento precisa ser ativado somente quando a agulha está dentro do tecido a biopsar e várias tentativas, muitas vezes, são necessárias para obter a quantidade adequada de tecido, o que aumenta o risco de sangue no leite e mastite após o procedimento. Limitações da biópsia núcleo incluem um maior risco de sangramento após o procedimento, se uma grande quantidade de tecido (> 200 mg) é obtido. Além disso, a ferramenta de biópsia é mais difícil de montar que exigem treinamento adequado antes do uso.

Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Esta pesquisa foi apoiada pelo programa nacional de Nutrição Animal e Virginia Tech. A assistência técnica da Sra. Tara Pilonero, Dr. Julie Settlage e Dr. Izabelle Teixeira são reconhecidos com gratidão.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
70% Isopropyl alcohol  Walmart  565106257 1 L
Aerosol spray to kill and repel flies MWI 14339 1 bottle (if necessary)
Biopsy needles, 12 G × 16 cm C. R. Bard MN1216 2
Butterfly infusion set (18 G needle) Fisher 22-258087 1
Cell culture dishes Fisher 08-772E 4
Cordless drill (low speed) Hitachi   DS10DFL  1
Core biopsy instrument, Farr et al. (1996) 2, custom metal fabrication. To request the tool contact the authors.
Cows cattle healthy
Flunixin meglumine MWI/VetOne 501018 1.1 to 2.2 mg/kg of body weight
Folding table   Amazon 1
Forceps Fisher 09-753-50 1
Gloves non-sterile  Fisher 17-200-845 9, size dependent
Hard brush  Sullivan Supply 18270 1, to wash the cows
Head gate  1, customized for dairy cows
Lidocaine hydrochloride 2% injectable  MWI/VetOne 510212 6 mL was used,  from 3 to 8 mL
Livestock body wash eZall Technologies 39384 1, to wash the cows
Needle 18 G  (1 to 1/5“) Fisher 14-821-15A 6
Needle 20 G (1 to 1/5“) Fisher 14-815-526 6
Phosphate buffered saline (0.9%) Fisher 20-012-043 1 L
Povidone Iodine ointment Jeffers #VED1A 500 g (if necessary)
Povidone iodine scrub solution (0.75% iodine) MWI/VetOne 510094 1 L
Reusable biopsy instrument  C. R. Bard MG1522 1
Rope halter Nasco farm and ranch C10852 2, cow size
Scalpel blades (#10) MWI 033870 2
Scalpel holders (#3) MWI 602008 1
Self seal autoclave pouch 10 x 5.5 in. Fisher 19-130-0038 1 case of 800
Sterile cotton gauze sponges Fisher 22-037-986 4
Sterile gauze pads Fisher 19-090-735 4
Sterile surgical gloves  Surgical gloves 19-166-679 3,  size dependent
Sterile surgical towels Fisher 50-118-0339 6
Stethoscope Littmann Master Classic II 1392 1
Surgical clipper Oster A5 078005-010-003 1, preparation of the animal for biopsy
Surgical clipper blades (#40 ) Oster  78919-016 1, preparation of the animal for biopsy
Surgical staple remover MWI 541 1
Surgical stapler pre-loaded MWI 17713 5
Syringes of 10 mL Fisher 14-823-224 3
Syringes of 2 mL Fisher 22-028854 3
Syringes of 20 mL Fisher 22-034507 3
Syringes of 5 mL Fisher 22-028855 3
Thermometer Agri-Pro Enterprises Inc 72000 1
Tolazine hydrochloride Akorn Animal Health 61311-486-10 2 to 4 mg/kg of body weight (if necessary)
Tweezer  Fisher 14-955-025 1, for handle the tissue sample
Water hose Miracle-Gro, Walmart 554990501 1, to wash the cows
Water-resistant aerosol bandage (aluminum powder 40 mg) MWI 010728 1 bottle 
Xylazine hydrochloride MWI/VetOne 510650 0.01 to 0.05 mg/kg of body weight

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References

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Técnicas de biópsia da glândula mamária bovina
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Daley, V. L., Dye, C., Bogers, S. H., Akers, R. M., Rodriguez, F. C., Cant, J. P., Doelman, J., Yoder, P., Kumar, K., Webster, D., Hanigan, M. D. Bovine Mammary Gland Biopsy Techniques. J. Vis. Exp. (142), e58602, doi:10.3791/58602 (2018).More

Daley, V. L., Dye, C., Bogers, S. H., Akers, R. M., Rodriguez, F. C., Cant, J. P., Doelman, J., Yoder, P., Kumar, K., Webster, D., Hanigan, M. D. Bovine Mammary Gland Biopsy Techniques. J. Vis. Exp. (142), e58602, doi:10.3791/58602 (2018).

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