Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Bovin bröstkörteln biopsi tekniker

doi: 10.3791/58602 Published: December 23, 2018

Summary

Denna artikel presenterar en nötkreatur bröstkörteln biopsi med kärna och nål biopsi verktyg. Skördade vävnad kan användas för cellodling eller att bedöma mjölkkörtlar fysiologi och metabolism inklusive genuttryck, proteinuttryck, protein modifieringar, immunohistokemi och metaboliten koncentrationer.

Abstract

Bovin bröstkörteln biopsier tillåter forskare att samla in vävnadsprover för att studera cellbiologi inklusive genuttryck, histologisk analys, signalering vägar och protein översättning. Den här artikeln beskrivs två metoder för biopsi av nötkreatur bröstkörteln (MG). Tre friska Holstein mjölkkor var betvingar. Innan biopsier, var Korna mjölkas och därefter fastspända i en nötkreatur ränna. Ett analgetikum (flunixin meglumin, 1.1 till 2,2 mg/kg kroppsvikt) administrerades via jugular intravenös [IV] injektion 15-20 min före till biopsi. För stående sedering, Xylazinhydroklorid (0,01-0,05 mg/kg kroppsvikt) injicerades via svans fartygen 5-10 min innan förfarandet. När tillräckligt drogad, biopsi platsen aseptiskt utarbetades och lokalt bedövad med 6 mL 2% lidokain hydroklorid via subkutan injektion. Använd aseptisk teknik, gjordes en 2 till 3 cm vertikala snitt med en nummer 10 skalpell. Core och nål biopsi verktyg användes. Verktyget core biopsi var kopplad till en sladdlös borr och infogas i MG vävnaden genom snittet med viss borr. Verktyget nål biopsi infogades manuellt i snitt webbplatsen. Omedelbart efter ingreppet tillämpas en assistent trycket på webbplatsen snitt för 20-25 min med en steril handduk för att uppnå hemostas. Rostfritt stål kirurgiska häftklamrar användes att motsätta sig huden snittet. Staples var borttagna 10 dagar efter ingreppet. De främsta fördelarna med kärna och nål biopsier är att båda metoderna är minimalt invasiva ingrepp som kan utföras på ett säkert sätt i friska kor. Mjölkavkastningen efter biopsin var opåverkad. Dessa procedurer kräver en kort återhämtningstid och resultera i färre risker för komplikationer. Särskilda begränsningar kan inkludera blödning efter biopsi och infektion på webbplatsen för biopsi. Tillämpningar av dessa tekniker inkluderar vävnad samling för klinisk diagnos och forskningsändamål, såsom primär cellkultur.

Introduction

En biopsi är ett förfarande för att skörda ett core avsnitt av vävnad från patienter för medicinsk- eller forskningsändamål. Det är en minimalt invasiv och allmänt använd teknik för att samla vävnad som ett alternativ till dödshjälp1 för att möjliggöra analys av vävnad Svaren till behandling eller andra faktorer av intresse. Prover av nötkreatur bröstkörteln (MG) vävnader är väsentliga för mejeri forskning att studera genen och protein uttryck, histologi, organisationen av cellulära organeller, signalvägar och metaboliska processer som svar på förändringar i förvaltningen eller den miljö. Dessutom behövs MG vävnad att diagnostisera och forskning vissa smittsamma sjukdomar, såsom bovin mastit orsakad av bakterieinfektioner2.

Juvret av nötkreatur innehåller fyra separata körtlar och varje körtel innehåller en oberoende sekretoriska mjölksystemet kollektivt kallas parenkymet. I alveolerna, kanaler och bindväv finns i mjölkkörtlar parenkymet. Alveolerna är mikroskopiska sfäriska ihåliga strukturer som består av epitelceller i inre yta (luminala) och specialiserade myoepithelial celler på utsidan (basala). Alveolerna är ansvariga för syntes och sekretion av mjölk. Fibrös bindväv vävnaden i parenkymet kan skilja en grupp av alveolerna från andra grupper av alveolerna, och varje grupp kallas en LOB3. Flera faktorer kan påverka utveckling och funktion av en MG inklusive Djurfysiologi, kost, management, genetik och miljö4. Mastit är också en kritisk faktor som negativt påverkar MG funktion och mjölk kvalitet5. De gifter som släpptes av mastitic patogener kan orsaka skador på alveolerna och inducera nekros leder till biokemiska och histologiska förändringar i MG vävnad6. Således kan den histologi och metaboliska processer varje alveolerna eller LOB i MG vara väsentligt annorlunda från andra. Som sådan, är biopsier som är representativa prover av hela bröstkörteln önskvärt. Små biopsier kan bara fånga en enda LOB eller enskilda alveolerna, begränsa den resulterande vetenskapliga eller diagnostiska informationen. För forskningsändamål, är det nödvändigt att vara medveten om att ett bröst biopsi ger en ”ögonblicksbild” av vävnad egenskaper men en biopsi inte tillräckligt karakterisera mjölkkörtlar summafunktion i avsaknad av uppskattningar av totala bröstkörteln massa.

Flera biopsi verktyg har utvecklats under de senaste 30 åren för humant bruk. Anpassningar av dessa instrument är för närvarande tillgängliga för användning med djur. För mjölkkor, har prover av MG vävnad erhållits med olika tekniker inklusive kirurgisk excision (trubbig dissektion)7, biopsi nålar1,8och core biopsi instrument9,10. Således, MG biopsi tekniker i lakterande mjölkkor har övergått från förfaranden använda recumbent sedering med kirurgisk dissektion med diatermi hemostas i 19927 till samling av core biopsier enligt stående sedering9, 10,11,12. Kirurgisk biopsi är en invasiv metod, som kan vara dyra och har en högre förekomst av komplikationer såsom hematom, sår problem, och tumören spridit13. För närvarande, core biopsi och nål biopsi (kallas även en tru-cut-biopsi) antagits allmänt som alternativ till kirurgisk biopsi. Fördelarna med kärna och nål biopsier jämfört med kirurgisk biopsi är: förfarandet är minimalt invasiv; större komplikationer är sällsynta. generell anestesi krävs inte; förfarandet är relativley snabbt. återhämtningstiden är kort. Det finns minimal negativa effekter på juverhälsa och bara kortsiktiga effekter på mjölk avkastning och sammansättning8,9,10. och kostnaden är mindre än kirurgisk biopsi13.

En core biopsi-förfarande som beskrivs i 1996 används en steril kanyl i rostfritt stål med löstagbart infällbar klinga att ta bort en representativ mängd vävnad från nötkreatur MG utan narkos9,10,11 ,12. Under förfarandet fästes instrumentet till en sladdlös borr att skapa en låg hastighet, roterande rörelse som rent skär en vävnad kärna som verktyget avancerad i vävnaden. Fördelen var en större vävnad prov (70 mm x 4 mm i diameter, ca 0,75-1 g) 9. En senare studie10 visade att biopsi proceduren som beskrivs av V. C. Farro.a. 9 kan användas för att utföra upprepade MG vävnad samlingar utan negativ inverkan på prestanda och juver hälsan hos lakterande mjölkkor. Nyligen genomfördes en studie14 hos mjölkkor att utvärdera upprepade biopsier av MG med en större troakar (31 cm lång, yttre diameter på 9,5 mm, inre diameter 8 mm) med vakuum som tillämpas på en inre rostfritt stål kanyl för att samla biopsi . Denna metod används för sedering (xylazin) och lokalbedövning (2% lidokain hydroklorid).

Nål biopsi är en annan teknik för att samla bröstvävnad. Flera studier har antagit denna teknik. En studie1 används sedering (detomidin) och lokalbedövning (1% lidokain) i proceduren. Efter biopsi fick korna en profylaktisk behandling med antibiotika. Bröstkörteln var manuellt masseras före och efter mjölkningen. Blod i mjölken observerades för upp till 84 h efter biopsi. Mängden och mjölkens sammansättning påverkades under en kort tid. Nyligen har brukade en studie en biopsi nål utföra upprepade MG biopsier i mjölkkor8. Sedering (1% Acepromazin, intramuskulär) och lokalbedövning (2% lidokain hydroklorid, subkutan) administrerades till djuren. Djuren fick inte intramammär läkemedel eller antibiotika före eller efter ingreppet, och det fanns inga tecken på infektion vid biopsi platsen under den postoperativa perioden. I denna studie hade upprepade nötkreatur MG biopsier med hjälp av en nål en mindre negativ inverkan på mjölk produktion och juver hälsa mjölkkor. I allmänhet verkar nål biopsi vara en mindre invasiv metod än core biopsi instrumentet. Som nämnts tidigare, är det dock viktigt för biopsi tekniken att skörda ett representativt urval av MG vävnad. Begränsning av en nål biopsi är att en liten mängd bovint MG vävnad erhålls (cirka 20 till 25 mg)8,15.

Nästan samtliga studier används en kombination av α-2-agonist sedering och lokalbedövning8,9,10, oavsett om biopsin var via en nål eller en större kärna. I den bovin MG är de flesta nervändar associerade med huden. Innervation till parenkymal vävnad är till stor del via stretch receptorer med gles typ en nervtrådar att upptäcka skarp kirurgisk smärta. Som ett resultat, är fysiologiska mekanismer av smärta på grund av kirurgisk manipulation av en MG via hud och subkutan vävnad3 och inte djupa vävnader såsom parenkymal vävnad. Därför för biopsi förfaranden är det endast nödvändigt att lokalt söva hud och subkutan vävnad, som infiltration av lokalbedövning i de djupa vävnaderna inte avsevärt minskar kirurgisk smärta. Efter en lämplig preparering av området biopsi, djur obehag är, i första hand förknippas med återhållsamhet.

Insamling av större borrkärnor kan öka hematom bildas och ökar risken för infektion inom MG parenkymet. Därför, perioperativ protokoll ofta inkluderar administration av parenteral antibiotika7, även om det inte är universals8. Att uppnå hemostas är också en viktig faktor för att minska Ko sjuklighet. I den ovannämnda studien med en stor kärna biopsi instrument14, manuellt tryck tillämpades till webbplatsen biopsi och en ko BH användes för att tillämpa is sår för minst 2 h efter förfarandet. Trots den stora mängden vävnad som skördats, enda liten minskning i foder intag och mjölk avkastning observerades och proceduren upprepades varje tre veckor utan negativa effekter på Ko hälsa.

Forskare som utför MG biopsi hos mjölkkor behöver överväga den resulterande biopsin diagnostiska eller analytisk kvalitet, enkel teknik och Ko-morbiditet. Korrekt och förplanerade kirurgiska tekniker är absolut nödvändigt att uppnå dessa mål. Hittills har MG biopsi studier har fokuserat på att beskriva biopsi resultat, i motsats till som beskriver biopsi tekniken själv, och beskrivningar för lakterande mjölkkor saknar tillräckligt detaljerade för att möjliggöra replikering. Således, syftet med detta arbete var att beskriva både nål biopsi och större core biopsi tekniker i tillräckligt detaljerade för att möjliggöra säker och Human replikering av MG biopsi av nötkreatur.

Protocol

Alla metoder beskrivs godkändes av Virginia Tech institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC).

1. personal

  1. Har minst två assistenter med kirurgiska och Ko-hantering erfarenhet.
  2. Träna alla assistenter minst tre gånger, om möjligt med avlidna material, innan du utför förfaranden i samband med detta protokoll på levande djur.
    Obs: Utbildning bör utföras av en instruktör som har varit tidigare utbildad och medverkat tekniken.
  3. Har en stor djur veterinär behållning för drug administration och i händelse att akut behandling blir nödvändig under förfarandet. Nödsituationer som kan uppstå under denna procedur innefattar men är inte begränsade till: blödning, α-2-agonist överdosering och lungödem, uppstötningar och aspiration av mat material, smärta och patientens motstånd som kräver ytterligare sedering.

2. upprättande av kirurgiska instrument, förbrukningsartiklar och anläggning

  1. Inventera och köpa all utrustning och tillförsel (se Tabell för material).
  2. Ren och autoklav operationsdukar, biopsi-instrument, skalpell innehavare, kirurgiska handdukar och pincett.
  3. Har rätt storlek squeeze ränna och huvudet gate att hålla korna.
  4. Upprätta en arbetsplats med ett bord nära squeeze banan.
  5. Se till att arbetsytan är ren och har begränsad genom-kotrafik.
  6. Organisera utrustning och förnödenheter i arbetsutrymme för enkel åtkomst.
  7. Har ordentlig belysning inne i arbetsytan.

3. förberedelse av djuren

  1. En dag innan schemalagd biopsi, tvätta och skrubba djuret, särskilt juvret ta bort gödsel och smutsiga material.
  2. Följ rutiner för säker och Human återhållsamhet av nötkreatur.
  3. I förväg om biopsi och igen vid tidpunkten för biopsi, bedöma hälsa, kondition och beteendet hos djuret.
    Obs: En minsta undersökning inkluderar temperatur, puls, andningsfrekvens samt undersökning för dermatit över den föreslagna kirurgiska platsen eller andra områden av bakteriell infektion. Samla in mjölkprover från varje kvartal och kontrollera mastit.
  4. Använd endast friska kor.
  5. Helt mjölk kon.
  6. Flytta djuret till squeeze banan, helst inom 2 h efter mjölkningen för att minimera mjölk närvaro i körtlar.
  7. Hindra djuret med en huvud-grind.

4. analgesi och sedering

  1. Placera en rep-grimma på huvudet av ko för att förhindra bakåt och framåt rörelse.
  2. Dra djurets huvud åt sidan, och knyta repet till squeeze hålan med en snabbkoppling Knut för att hålla huvudet på plats.
  3. Rengör injektionsstället med en 70% isopropylalkohol och administrera flunixin meglumin (1.1 till 2,2 mg/kg kroppsvikt) intravenöst via halsvenen 15-20 min föregående till biopsi.
    Obs: I vissa protokoll, icke-steroida antiinflammatoriska läkemedel administreras efter biopsi om antiinflammatoriska läkemedel inte kommer att påverka forskningsresultat.
    1. Leta upp halsvenen.
    2. Höja halsvenen genom tillämpning av tryck vid basen av den jugular groove.
    3. Kontrollera att det finns inga bubblor i sprutan.
    4. Stick in nålen i den upphöjda halsvenen, och dra upp 0,5 mL blod i sprutan två gånger och blanda med innehållet. Om inget blod visar i sprutan, flytta nålen. Om nålen är bosatt i venen, injicera innehållet.
    5. Ta försiktigt bort nålen.
    6. Gäller gasväv med lätt tryck på injektionsstället att förhindra blödning.
  4. Administrera Xylazinhydroklorid intravenöst (0,01 till 0,05 mg/kg kroppsvikt) i svans fartyget cirka 5-10 min före biopsi att ge tillräcklig tid för etablering av sedering.
    FÖRSIKTIGHET: Kontrollera djuret för tecken på lungödem. Kliniska tecken på lungödem innefattar andnöd, svår dyspné, andningssvårigheter, hosta, skummande sputum och blå tunga. Om tecken på lungödem observeras, rekommenderas det att använda tolazine (2 till 4 mg/kg kroppsvikt) att upphäva xylazin effekterna.
    1. Höja svansen och rengör injektionsstället med en 70% isopropylalkohol.
    2. Kontrollera att det finns inga bubblor i sprutan.
    3. Stick in nålen i svansen fartyget, dra 0,2 mL blod i sprutan och blanda med innehållet att se till att nålen är bosatt i fartyget. Om nålen är bosatt i fartyget, injicera spruta innehållet.
    4. Ta försiktigt bort nålen.
    5. Gäller gasväv med lätt tryck mot injektionsstället.

5. beredning av biopsi platsen

  1. Har en assistent som binda upp svansen för förfarandet.
  2. Välj webbplatsen biopsi på juvret (vanligtvis i ett övre område att minimera samling av bindväv och undvika inträngning i körtel cisternen, figur 1) och ta bort smutsiga material eller gödsel från valda biopsi platsen.

Figure 1
Figur 1 . Bilden av nötkreatur juver som illustrerar biopsi platsen. Klicka här för att se en större version av denna siffra. 

  1. Observera och palpera huden med särskild uppmärksamhet att identifiera eventuella stora subkutan blodkärl för att undvika dessa fartyg under biopsin.
  2. Klipp håret från en 15 x 15 cm området runt biopsi platsen.
  3. Förbereda området biopsi med povidonjod (0,75% tillgängliga jod) eller klorhexidin glukonat scrub. Varvas med 70% isopropylalkohol minst tre gånger att ta bort alla synliga och osynliga skräp. Tillämpa aseptiska scrub lösning och isopropylalkohol i en cirkelrörelse använder inside-out strategi. Säkerställa att den antiseptiska scrub lösningen förblir i kontakt med huden för minst 5 min.
  4. Använda en fjäril infusionsset med en 18 G nål att sätta in 6 mL 2% lidokain hydroklorid subkutant på webbplatsen snitt för att skapa en linje-block. Inte tränga in i djupare vävnaderna.
    Obs: Dosering av lidokain varierar mellan 3 och 8 mL.
  5. Låt den lokalbedövning till diffus för 3 till 5 min. utföra en annan upprepning av scrub lösning och alkohol före snittet. Medan du väntar, förbereda de biopsi-instrument.

6. biopsi förfarande

  1. Använd aseptisk teknik vid hantering av verktygen biopsi och för snittet.
  2. Tvätta händerna för att ta bort all synlig kontaminering och tillämpa sterila operationshandskar.
  3. Ordna de kirurgiska instrument i ett sterilt område i ordning de används. Har en nummer 10 skalpell, steril gasbinda, ett monterade biopsi-instrument och en steril handduk för hemostas.
    Obs: Följ proceduren 1 att utföra en Core biopsi eller förfarande 2 att utföra en nål biopsi.

Figure 2
Figur 2 . Schematisk framställning av montering och installation av verktyget core biopsi beskrivs av V. C. Farr, et al. 9 skalstapeln är 1 cm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

  1. Core biopsi Instrument (Farr et al.9)
    1. Montera instrumentet core biopsi använder sterila handskar (figur 2).
      1. Placera 7 sterila bitar på en steril draperi (figur 2A).
      2. Infoga bladet (stycke 1) i dockningssystem på bit 2 (figur 2B ).
        Varning: Placera inte fingrarna direkt i bladet linje.
      3. Infoga bit 3 ovanpå bit 2 (figur 2 c) se till att dockningsstationen justeras.
        Obs: Observera ett dockningssystem i innerväggen av bit 4 (figur 2D).
      4. Engagera den slutliga kanten av bladet (stycke 1) i dockningssystem av bit 4 (figur 2D).
      5. Driva bit 4 och observera om bit 4 är bredvid bit 3 (figur 2E).
      6. Infoga bit 5 på enheten (blade + bit 2) (figur 2F).
      7. Se till att dockningsstationen är justerad (figur 2 g).
      8. Infoga bit 6 i toppen av bit 2 (motsatta sidan av bladet) (figur 2 H)
      9. Se till att dockningsstationen är justerad (figur 2 H).
      10. Infoga låsskruven (stycke 7) i dockningsstationen (figur 2I).
      11. Driva bit 3 (svart) för att täcka låsskruven.
        Varning: Placera inte fingrar på avfarten blad.
      12. Aktivera verktyget driva bit 4 och observera bladet utanför verktyget.
      13. Dra bit 4 tillbaka för att dra tillbaka bladet i verktyget (bruksfärdig).
        Obs: Bladet bör aktiveras endast när verktyget har trängt in önskade avståndet inuti vävnaden vara biopsier.
    2. Se till att kon är tillräckligt drogad och biopsi platsen är tillräckligt sövd. Nyp i huden för att säkerställa att ingen reaktion.
    3. Gör en 2 till 3 cm vertikala snitt genom hud och subkutan vävnad från proximalt distala använda nummer 10 skalpell.
    4. Bifoga det biopsi-instrumentet till en borrmaskin med steril teknik.
    5. Placera borren mot verktyget biopsi och kontrollera om verktyget är ordentligt ansluten till borren.
    6. Säkerställa adekvat återhållsamhet genom att ha en individ höja svansen under alla förfarandet.
    7. Slå på borren med medsols rotation och en låg hastighet.
      Obs: Borren är inte sterilt, och operatören förblir inte steril när du använder borren.
    8. Förväg verktyget hela biopsi (cirka 7,5 cm) i juvret genom snittet medan borren roterar vägtullen.
    9. Stäng av borren och manuellt utöka bit 4 av verktyget.
    10. Slå på borren med medsols rotation och låg hastighet.
    11. Ta bort instrumentet som innehåller vävnad kärnan från juvret.
    12. Tillämpa starkt tryck omedelbart på såret med hjälp av en steril handduk i minst 20 min.
      Obs: Har en assistent utföra detta med sin näve för att säkerställa tillräcklig tryck appliceras.
    13. Ta bort vävnad från biopsi verktyg använda pincett.
    14. Förvara provet i 1 x fosfatbuffrad saltlösning och utvärdera mängden vävnad.
    15. Ta kons vitala tecken varje 10 min efter biopsi för minst 30 min.
    16. Kontrollera blödning efter 20 min av trycket på webbplatsen för biopsi. Om det finns droppar blod fortsätta att utöva påtryckningar för en ytterligare 5-10 min.
    17. Stäng de snitt som använder rostfria klammer med 5 mm mellanrum ju blödningen har upphört. Använd mellan 5 och 8 häftklamrar.
    18. Applicera en aerosol bandage till området biopsi.
    19. Iaktta djuret för 50 min efter ingreppet.
  2. Nål biopsi Instrument
    1. Följ tillverkarens instruktioner för enheten.
    2. Biopsin nålen från paketet med steril teknik.
    3. Kassera injektionsnålen om någon skada observeras.
    4. Fäst nålen till enheten.
    5. Stäng luckan och kuk enheten.
    6. Se till att kon är tillräckligt drogad och biopsi platsen är tillräckligt sövd. Nyp i huden för att säkerställa att ingen reaktion.
    7. Gör en 1 till 2 cm vertikala snitt genom hud och subkutan vävnad från proximalt distala använda nummer 10 skalpell.
      Obs: Snittet för biopsi nål instrumentet kan vara mindre (1-2 cm) än för core biopsi instrumentet.
    8. Biopsin nålen i snitt webbplats (runt 10-13 cm från huden).
    9. Aktivera på biopsi kanylen för att samla in vävnaden.
    10. Ta bort nålen från juvret.
    11. Tillämpa omedelbar, stark press på såret med hjälp av en steril handduk i minst 20 min.
    12. Ta bort vävnad från biopsin nålen med hjälp av pincett.
    13. Förvara provet i 1 x fosfatbuffrad saltlösning och utvärdera mängden vävnad.
    14. Ta vitala tecken varje 10 min efter biopsi för minst 30 min.
    15. Kontrollera blödning efter 20 min av trycket på webbplatsen för biopsi.
    16. Stäng de snitt som använder rostfria klammer efter alla blödningen har upphört.
    17. Applicera en aerosol bandage till området biopsi.
    18. Iaktta djuret för 50 min efter ingreppet.

7. efter biopsi djurvård

  1. Dokumentera alla läkemedel som administreras till djur.
    Obs: Mjölk förkastades under en period av 36 h efter förfarandet. kött tillbakadragandet var 4 d. karensperioder för mjölk- och köttproduktion kan variera beroende på landet eller jurisdiktion och de läkemedel som används. Kontrollera lokala lagar och föreskrifter.
  2. Kontrollera för förekomst av blod i mjölken för 7 till 10 d efter biopsi.
  3. Hand strip blodproppar från kvarteret biopsier på efterföljande mjölkningar och säkerställa att fullständig mjölk borttagning inträffar.
    Obs: Förväntas förekomsten av blodproppar från kvarteret biopsier för 1-3 mjölkningar efter förfarandet. Blod i mjölken kan observeras för 1 till 6 d efter biopsi.
  4. Observera mjölk avkastning och om möjligt den individuella dagligen foderintag tills kirurgiska häftklamrar har tagits bort.
  5. Övervaka djuret dagligen för kroppstemperatur och hjärtfrekvens, andning och hållning tills kirurgiska häftklamrar har tagits bort.
  6. Kontrollera biopsi platsen två gånger dagligen för svullnad, ömhet, och några tecken på dränering tills de kirurgiska häftklamrarna har tagits bort. Om dessa observeras, rådfråga en veterinär.
    Obs: Håll biopsi platsen ren och återapplicera aerosol bandaget var en till tre dagar efter behov.
  7. Ta bort häftklamrar från webbplatsen snitt 10 till 14 d efter biopsi, beroende på helande.
  8. Rådfråga en veterinär om några tecken på lokal eller systemisk infektion iakttas.

Representative Results

I detta protokoll, core biopsi tekniken producerade vävnadsprov 200 till 600 mg medan nål biopsi producerade prover av 10 till 30 mg per biopsi. Djur observerades dagligen för 10 d efter ingreppet. Inga komplikationer inträffade under förfarandet eller under den postoperativa perioden, med vitala parametrar av korna kvar inom normala gränser (genomsnittlig andningsfrekvens = 31,4 ± 7.04 (SD) andetag per minut, snittpuls = 75,9 ± 8,9 slag per min och genomsnittet rektal temperatur = 38,2 ± 0,68 ° C, figur 3).

Efter manuell tryck på biopsi att uppnå hemostas (ca 25 min), visade det öppna såret minimal blödning (figur 4). Korna matades samma kost ad lib och djuren som förvarades på samma anläggning under den postoperativa perioden. Djuren visade inte tecken på infektion vid biopsi platsen; Det fanns ingen smärta, blödning, svullnad, dränering eller förhöjd temperatur (figur 5). Såret läkt inom 8 till 10 d i biopsi (figur 5 c).

Ett djur framkallade mindre hudirritation på grund till såret gnugga på dag 8 efter ingreppet. Denna ko behandlades av rengöring biopsi platsen med hjälp av povidon-jodlösning och 70% isopropylalkohol. Rostfria klammer togs bort för att möjliggöra dränering och povidon jod salva (1%) var appliceras två gånger dagligen på biopsi platsen för 2 till 3 d. Hudirritation försvann 2 d efter applicering povidonjod salva och såret läkt med ingen ytterligare komplikationer.

Blodproppar har tagits bort för hand strippar av mjölk från biopsier kvartal innan maskinen mjölkning. I detta protokoll observerades förekomsten av blodproppar i mjölken för upp till tre mjölkningar (ca 36 h) efter biopsi. Blod kontaminering av mjölken observerades för upp till 48 h efter biopsi. Det fanns inga visuella skillnader mellan core och nål biopsier i förhållande till mängden blod i mjölken. Djuren visade inte en signifikant minskning av mjölkavkastningen efter ingreppet (figur 6). Genomsnittliga mjölksammansättning var 4,37% fett, 3,34% protein och 4,64% laktos. Den genomsnittliga mjölk somatiska (SCC) var mindre än 200 000 celler per mL.

MG vävnaden erhålls kan användas för olika forskningsändamål såsom primära cellkulturer (figur 7).

Figure 3
Figur 3 . Utvärdering av indikatorer för djurs hälsa efter bovin bröstkörteln biopsi. Klicka här för att se en större version av denna siffra. 

Figure 4
Figur 4 . Biopsi webbplats utseende efter manuellt tryck tillämpades på området biopsi för att uppnå hemostas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 . Biopsi webbplats fotografier. (A) biopsi webbplats 3 d efter ingreppet. (B) biopsi webbplats 6 d efter ingreppet. (C) biopsi webbplats 10 d efter ingreppet som illustrerar att såret var läkt tillräckligt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6 . Dagliga mjölkproduktionen före och efter bovin bröstkörteln biopsi (n = 3 kor). En linjär modell uppskattas att 10 dagar innan biopsin djuren produceras 23.35 kg mjölk per dag. Mjölkavkastningen förändrades inte betydligt (P > 0,05) från 10 dagar innan till 10 dagar efter biopsi trots en liten ökning i mjölkavkastningen noterades (ökning av 0,0005 kg/d mjölk för varje dag från 10 dagar innan biopsi). Tre djur användes i detta protokoll. ett djur var biopsier dubbelt (Animal 1: core biopsi på vänster sida av juvret och nål biopsi på höger sida av juver) och två djur en gång var biopsier (djur 2 och 3: endast på höger sida av juver med core eller nål procedur). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7 . Representativa bilder av primära nötkreatur bröst epitelceller kultur. Skalstapeln är 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Discussion

Core och nål biopsi metoder har beskrivits i detta protokoll9,16. En detaljerad utvärdering av djurens hälsa och förekomst av mastit14 innan biopsi krävs för båda förfarandena. För forskningsändamål, bör utföra tekniken hos djur med uppenbara tecken på inflammation eller smittsamma sjukdomar undvikas. Detta minskar risken för komplikationer under och efter en biopsi. Alla biopsi-instrument och enheter bör vara ren, desinficeras och steriliseras för att undvika kontaminering av biopsi platsen. Innan förfarandet är det nödvändigt att minimera kirurgiska infektioner (SSI). I allmänhet är SSI associerade med animaliskt sjuklighet, förlorad prestanda och högre produktionskostnader hos mjölkkor. Studier rapporterat tidigare metoder för att förhindra SSI på grund av biopsi inklusive klippning håret runt snittet webbplatsen, tvätta området biopsi för att ta bort föroreningar9,14, och använda antiseptisk agenter (70% alkohol, jod kirurgiska skrubba9, 2% klorhexidin Acetat lösning14, 10% povidonjod8) för huden förberedelse. I några studier antogs administrering av antibiotika under7 eller omedelbart efter biopsi9; men antibiotikaprofylax användes inte i den nuvarande arbetet och inga infektioner av biopsi platsen observerades. För att förhindra kontaminering av biopsin sår, bör svansen säkras för att förhindra kontakt med biopsi platsen tills aerosol bandaget har tillämpats. I detta protokoll bort staples ca 10 till 14 d efter biopsi.

Innan en core biopsi är det viktigt att korrekt konfigurera verktyget och bifoga det till borren; välja en långsam rotationshastighet, Välj framåt rotation och Använd inte omvända funktionsläget av borren. Under förfarandet är det viktigt att använda digitala trycket på båda sidor av snittet att hålla huden kanterna isär och ha en tillräckligt lång incision att tillåta verktyg posten utan att kontakta hud eller bindväv. Om detta förfarande inte görs kan en drar i snitt kanterna under rotation av core biopsi instrumentet uppstå och orsaka ytterligare hud vävnad trauma vilket ökar risken för infektion och kan fördröja läkning av sår. De nuvarande biopsi förfaranden som beskrivs i detta protokoll utfördes av en styrelse-certifierad stora djur kirurg. Förfaranden som utfördes framgångsrikt (figur 5). Båda tekniker är relativt enkel och snabb att utföra jämfört med kirurgisk excision förfarandet.

Blödning från biopsi är vanliga efter MG biopsi i mjölkkor8,9,10,14. I detta protokoll, blödning observerats var minimal (figur 4), vilket kan bero på tillämpning av adekvat (starka) Tryck på såret omedelbart efter ingreppet. Starka påtryckningar för minst 20 min krävs, och det kan krävas för mer än 30 min i vissa fall. Om måttlig till allvarlig blödning observeras efter tillämpning av tryck till biopsi platsen, rekommenderas det att fortsätta pressa, och omedelbart kontakta veterinär.

Hemostas är en viktig faktor för att minska Ko sjuklighet, packade en studie hemostatiska kuddar i biopsi platsen att kontrollera blödning9. Användning av hemostatiska pads på ett sådant sätt har dock en hög potentiell risk för mikrobiologisk förorening i miljön mjölkgård. En annan studie14 tillämpas manuellt tryck på biopsi platsen mellan upprepade biopsier och efter biopsi och huden stängning och tillämpas is till platsen för minst 2 h efter biopsin. I detta protokoll var starka påtryckningar till biopsi platsen för 20-25 min tillräckliga för att kontrollera blödning.

En lyckad biopsi teknik bör resultera i minsta blod i mjölken som kvarstår under en kort tid efter ingreppet. För att undvika ett avbrott i mjölk sekretion under mjölk besvikelse och mastit infektioner, bör intramammär blodproppar tas bort för hand strippar från biopsier kvartalet10,14. I detta protokoll observerades blod i mjölken upp till 48 timmar efter biopsi. I en studie som använde ett större antal djur, observerades dock blod i mjölken i flesta kor för mindre än 6 dagar. Få djur visade blod i mjölken efter 6 dagar8. Av denna anledning krävs daglig observation av mjölk utseende för 6 d efter ingreppet. Djur inte uppvisar några tecken på mastit infektion när ett stort vävnadsprov erhölls14. Tidigare forskning som utförs upprepade biopsier på samma djur med hjälp av en nål fann dock att mastit infektion incidensen var cirka 12% efter den procedur8. I detta protokoll hade varken djur visuella tecken på klinisk mastit infektion efter ingreppet. Det finns också en liten chans att snittet webbplatsen kan bli smittade efter biopsi.

Tolazoline hydrochloride, en drog som upphäver effekterna av sedering, bör finnas tillgänglig i händelse av överdosering från xylazin. En alltför stor dos av xylazin kan orsaka lungödem. Kliniska tecken på lungödem innefattar andnöd, svår dyspné, andningssvårigheter, hosta och skummande sputum. Om tecken på lungödem observeras, rekommenderas det att använda tolazine (2 till 4 mg/kg kroppsvikt) att upphäva xylazin effekterna.

Protokolls beskriver tekniken för att utföra både en nål biopsi och core biopsi. Fördelen med en core biopsi jämfört med nål biopsi är i allmänhet större vävnad prov (0,75-1 g)9 med lägsta negativa effekt på juverhälsa. Nål biopsi är en mindre invasiv metod än core biopsi instrumentet. Dock försöker flera biopsi få en större mängd vävnad med hjälp av en nål biopsi förfarande kan öka risken för större blödning efter den proceduren, samt blodproppar i mjölken. Båda teknikerna orsakade minimal Ko sjuklighet och var lätt uppnås med minimal utbildning av kirurgiska personal. En kortsiktig förändring i dagliga mjölkavkastning (8 till 10% minskning) och dess sammansättning9 och foderintag minskning14 förväntas efter de kärna och nål biopsier, respektive. Begränsningar av förfarandet nål biopsi är den lilla volymen av vävnad tas bort med nålen. Instrumentet behöver aktiveras endast när nålen är inom vävnaden som ska biopsier och flera försök är ofta nödvändigt att få tillräckliga mängder av vävnad, vilket ökar risken för blod i mjölken och mastit efter ingreppet. Begränsningar av core biopsi är en högre risk för blödning efter ingreppet om en stor mängd vävnad (> 200 mg) erhålls. Verktyget biopsi är dessutom svårare att montera som kräver lämplig utbildning före användning.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Denna forskning stöddes av National Animal Nutrition Program och Virginia Tech. Tekniskt bistånd av Ms. Tara Pilonero, Dr. Julie Settlage och Dr. Izabelle Teixeira är erkänt tacksamt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
70% Isopropyl alcohol  Walmart  565106257 1 L
Aerosol spray to kill and repel flies MWI 14339 1 bottle (if necessary)
Biopsy needles, 12 G × 16 cm C. R. Bard MN1216 2
Butterfly infusion set (18 G needle) Fisher 22-258087 1
Cell culture dishes Fisher 08-772E 4
Cordless drill (low speed) Hitachi   DS10DFL  1
Core biopsy instrument, Farr et al. (1996) 2, custom metal fabrication. To request the tool contact the authors.
Cows cattle healthy
Flunixin meglumine MWI/VetOne 501018 1.1 to 2.2 mg/kg of body weight
Folding table   Amazon 1
Forceps Fisher 09-753-50 1
Gloves non-sterile  Fisher 17-200-845 9, size dependent
Hard brush  Sullivan Supply 18270 1, to wash the cows
Head gate  1, customized for dairy cows
Lidocaine hydrochloride 2% injectable  MWI/VetOne 510212 6 mL was used,  from 3 to 8 mL
Livestock body wash eZall Technologies 39384 1, to wash the cows
Needle 18 G  (1 to 1/5“) Fisher 14-821-15A 6
Needle 20 G (1 to 1/5“) Fisher 14-815-526 6
Phosphate buffered saline (0.9%) Fisher 20-012-043 1 L
Povidone Iodine ointment Jeffers #VED1A 500 g (if necessary)
Povidone iodine scrub solution (0.75% iodine) MWI/VetOne 510094 1 L
Reusable biopsy instrument  C. R. Bard MG1522 1
Rope halter Nasco farm and ranch C10852 2, cow size
Scalpel blades (#10) MWI 033870 2
Scalpel holders (#3) MWI 602008 1
Self seal autoclave pouch 10 x 5.5 in. Fisher 19-130-0038 1 case of 800
Sterile cotton gauze sponges Fisher 22-037-986 4
Sterile gauze pads Fisher 19-090-735 4
Sterile surgical gloves  Surgical gloves 19-166-679 3,  size dependent
Sterile surgical towels Fisher 50-118-0339 6
Stethoscope Littmann Master Classic II 1392 1
Surgical clipper Oster A5 078005-010-003 1, preparation of the animal for biopsy
Surgical clipper blades (#40 ) Oster  78919-016 1, preparation of the animal for biopsy
Surgical staple remover MWI 541 1
Surgical stapler pre-loaded MWI 17713 5
Syringes of 10 mL Fisher 14-823-224 3
Syringes of 2 mL Fisher 22-028854 3
Syringes of 20 mL Fisher 22-034507 3
Syringes of 5 mL Fisher 22-028855 3
Thermometer Agri-Pro Enterprises Inc 72000 1
Tolazine hydrochloride Akorn Animal Health 61311-486-10 2 to 4 mg/kg of body weight (if necessary)
Tweezer  Fisher 14-955-025 1, for handle the tissue sample
Water hose Miracle-Gro, Walmart 554990501 1, to wash the cows
Water-resistant aerosol bandage (aluminum powder 40 mg) MWI 010728 1 bottle 
Xylazine hydrochloride MWI/VetOne 510650 0.01 to 0.05 mg/kg of body weight

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Khatun, M., Sorensen, P., Ingvartsen, K. L., Bjerring, M., Rontved, C. M. Effects of combined liver and udder biopsying on the acute phase response of dairy cows with experimentally induced E. coli mastitis. Animal. 7, (10), 1721-1730 (2013).
  2. Buitenhuis, B., Rontved, C. M., Edwards, S. M., Ingvartsen, K. L., Sorensen, P. In depth analysis of genes and pathways of the mammary gland involved in the pathogenesis of bovine Escherichia coli-mastitis. BMC Genomics. 12, 130 (2011).
  3. Nickerson, S. C., Akers, R. M. Mammary Gland | Anatomy. Fuquay JW, Fox PF and McSweeney PLH (eds.), Encyclopedia of Dairy Sciences, Second Edition. 3, Academic Press. San Diego. 328-337 (2011).
  4. Akers, R. M. A 100-Year Review: Mammary development and lactation. Journal of Dairy Science. 100, (12), 10332-10352 (2017).
  5. Ruegg, P. L. A 100-Year Review: Mastitis detection, management, and prevention1. Journal of Dairy Science. 100, (12), 10381-10397 (2017).
  6. Zhao, X., Lacasse, P. Mammary tissue damage during bovine mastitis: Causes and control. Journal of Animal Science. 86, (13), 57-65 (2008).
  7. Knight, C. H., Hillerton, J. E., Teverson, R. M., Winter, A. Biopsy of the bovine mammary gland. British Veterinary Journal. 148, (2), 129-132 (1992).
  8. Lima, J. A., et al. Effects of bovine mammary gland biopsy and increased milking frequency on post-procedure udder health, histology, and milk yield. Animal. 10, (5), 838-846 (2016).
  9. Farr, V. C., et al. An improved method for the routine biopsy of bovine mammary tissue. Journal of Dairy Science. 79, (4), 543-549 (1996).
  10. Weng, X., et al. Short communication: Repeated mammary tissue collections during lactation do not alter subsequent milk yield or composition. Journal of Dairy Science. 100, (10), 8422-8425 (2017).
  11. Peterson, D. G., Matitashvili, E. A., Bauman, D. E. Diet-induced milk fat depression in dairy cows results in increased trans-10, cis-12 CLA in milk fat and coordinate suppression of mRNA abundance for mammary enzymes involved in milk fat synthesis. Journal of Nutrition. 133, (10), 3098-3102 (2003).
  12. Baumgard, L. H., Matitashvili, E., Corl, B. A., Dwyer, D. A., Bauman, D. E. trans-10, cis-12 conjugated linoleic acid decreases lipogenic rates and expression of genes involved in milk lipid synthesis in dairy cows. Journal of Dairy Science. 85, (9), 2155-2163 (2002).
  13. Kasraeian, S., Allison, D. C., Ahlmann, E. R., Fedenko, A. N., Menendez, L. R. A comparison of fine-needle aspiration, core biopsy, and surgical biopsy in the diagnosis of extremity soft tissue masses. Clinical Orthopaedics and Related Research. 468, (11), 2992-3002 (2010).
  14. de Lima, L. S., et al. A new technique for repeated biopsies of the mammary gland in dairy cows allotted to Latin-square design studies. Canadian Journal of Veterinary Research-Revue Canadienne De Recherche Veterinaire. 80, (3), 225-229 (2016).
  15. Ollier, S., et al. Whole intact rapeseeds or sunflower oil in high-forage or high-concentrate diets affects milk yield, milk composition, and mammary gene expression profile in goats. Journal of Dairy Science. 92, (11), 5544-5560 (2009).
  16. Soberon, F., et al. Effects of increased milking frequency on metabolism and mammary cell proliferation in Holstein dairy cows. Journal of Dairy Science. 93, (2), 565-573 (2010).
Bovin bröstkörteln biopsi tekniker
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Daley, V. L., Dye, C., Bogers, S. H., Akers, R. M., Rodriguez, F. C., Cant, J. P., Doelman, J., Yoder, P., Kumar, K., Webster, D., Hanigan, M. D. Bovine Mammary Gland Biopsy Techniques. J. Vis. Exp. (142), e58602, doi:10.3791/58602 (2018).More

Daley, V. L., Dye, C., Bogers, S. H., Akers, R. M., Rodriguez, F. C., Cant, J. P., Doelman, J., Yoder, P., Kumar, K., Webster, D., Hanigan, M. D. Bovine Mammary Gland Biopsy Techniques. J. Vis. Exp. (142), e58602, doi:10.3791/58602 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter