Summary
यहां, हम एक सरल, कम इनवेसिव, और आसान करने के लिए संभाल में स्तन वसा पैड में छाती कैंसर कोशिकाओं प्रत्यारोपण के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद, और एक उचित स्तन वसा पैड वातावरण के साथ इस माउस orthotopic स्तन कैंसर मॉडल के विभिंन पहलुओं की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता कैंसर.
Abstract
एक उचित पशु मॉडल रोगों की एक बेहतर समझ के लिए महत्वपूर्ण है । विभिंन तरीकों द्वारा स्थापित पशु मॉडल (चमड़े के नीचे इंजेक्शन, xenografts, आनुवंशिक हेरफेर, रासायनिक रिएजेंट प्रेरण, आदि) विभिंन रोग अक्षर है और के कुछ पहलुओं की जांच में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते है रोगों. हालांकि कोई एक मॉडल पूरी तरह से पूरे मानव रोग प्रगति की नकल कर सकते हैं, एक उचित stromal वातावरण के साथ orthotopic अंगों रोग मॉडल रोगों को समझने और संभावित दवाओं के लिए स्क्रीनिंग में एक अपूरणीय भूमिका निभाते हैं । इस अनुच्छेद में, हम वर्णन कैसे स्तन वसा पैड में एक सरल, कम इनवेसिव, और आसान करने के लिए संभाल रास्ता, और दूर के अंगों के लिए मेटास्टेसिस का पालन में स्तनों के कैंसर कोशिकाओं प्रत्यारोपण के लिए । प्राथमिक ट्यूमर के विकास की उचित सुविधाओं के साथ, स्तन और निप्पल रोग परिवर्तन, और अन्य अंगों ' मेटास्टेसिस की एक उच्च घटना, इस मॉडल को अधिकतम रूप से मानव स्तन कैंसर प्रगति की नकल । सीटू मेंप्राइमरी ट्यूमर ग्रोथ, लंबे समय तक मेटास्टेसिस, और ब्रेस्ट कैंसर के ट्यूमर microenvironment इस मॉडल का इस्तेमाल करके जांच की जा सकती है ।
Introduction
स्तन कैंसर दुनिया भर में महिला मृत्युदर का प्रमुख कारण है. अपनी उत्तरोत्तर बढ़ती घटनाओं के साथ, स्तन कैंसर जन स्वास्थ्य के लिए एक गंभीर चुनौती बन गया है1. Murine कैंसर मॉडल नैदानिक और नैदानिक अध्ययन के बीच अच्छा पुल हैं, और एक अच्छी नकल Murine रोग मॉडल रोग और दवा पर अनुसंधान की सटीकता में वृद्धि होगी ।
प्राथमिक ट्यूमर विकास घातक रोग की प्रगति शुरू होता है, जबकि मेटास्टेसिस और जटिलताओं ज्यादातर कैंसर रोगियों में मौत और गरीब जीवन के गुणों का मुख्य कारण हैं । कई murine मॉडल मानव स्तन कैंसर की विकृति की नकल करने के लिए उपयोग किया जाता है2,3,4। Xenograft मॉडल व्यापक रूप से रोग पात्रों को समझने के लिए और सुरक्षा और प्रभावकारिता5,6,7के लिए दवाओं स्क्रीन करने के लिए कैंसर के अध्ययन के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं । आनुवंशिक रूप से इंजीनियर चूहों (मणि) के लिए कुछ oncogenes या ट्यूमर शमन करनेवाला जीन8लक्ष्यीकरण द्वारा मानव स्तन कैंसर की नकल उत्पंन कर रहे हैं । मणि कैंसर की प्रगति में जीन की भूमिका को समझने के लिए एक अपेक्षाकृत सरल और वर्दीधारी पृष्ठभूमि है; हालांकि, कृत्रिम वातावरण और पृष्ठभूमि मेटास्टेसिस विकृति और संबंधित चिकित्सा9की जांच करने के लिए सीमित हैं । मानव कैंसर की कोशिकाओं, हालांकि मानव रोग सुविधाओं के साथ, केवल प्रतिरक्षा की कमी चूहों में प्रत्यारोपित किया जा सकता है, और ट्यूमर-मेजबान प्रतिरक्षा बातचीत की कमी पक्षपातपूर्ण परिणाम10के लिए नेतृत्व कर सकते हैं ।
जहां ठोस ट्यूमर शुरू रोग11,12,13के जैविक और रोग पात्रों पर सीधा प्रभाव पड़ता है । के बाद से कैंसर की प्रगति ट्यूमर कोशिकाओं के बीच बातचीत के जटिल परिणाम है, stromal कोशिकाओं, इम्यूनोलॉजी कोशिकाओं, भड़काऊ कोशिकाओं, विकास कारकों, और teases, प्राथमिक सीटू में प्रत्यारोपित ट्यूमर बेहतर अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा और नकल कैंसर प्रक्रिया रासायनिक एजेंटों या ट्यूमर कोशिकाओं के एक चमड़े के नीचे इंजेक्शन द्वारा प्रेरित ट्यूमर की तुलना में अधिक सही है । रासायनिक ट्यूमर के लिए प्रेरित किया एजेंटों शोधकर्ताओं और पर्यावरण के लिए हानिकारक हो सकता है और यहां तक कि कुछ देशों में मना कर रहे हैं । एक स्तन वसा पैड पर्यावरण के अभाव के कारण, एक चमड़े के नीचे इंजेक्शन के रोग प्रगति असली स्तन कैंसर रोगियों, जिसका कैंसर के उद्भव और स्तन वसा पैड से परेशान में है कि के साथ अलग हो सकता है । चमड़े के नीचे इंजेक्शन के नुकसान ट्यूमर के विकास का अध्ययन करने के लिए orthotopic मॉडल के उपयोग को प्रोत्साहित करते हैं । पूर्व अनुसंधान में, उच्च मेटास्टेटिक एमडीए-एमबी-२३१ ट्यूमर, सात orthotopic प्रत्यारोपण के बाद विकसित, इंजेक्शन स्थान के महत्व का संकेत दिया14. हाल ही में, स्तन के कैंसर की कोशिकाओं के orthotopic शल्य चिकित्सा के साथ स्तन वसा पैड में आरोपण15,16की सूचना दी थी । स्तन पैड पर्यावरण के साथ, ट्यूमर विकास और दूर के अंगों में प्रवास रोग प्रासंगिक साइटों पर स्तन कैंसर की पूरी प्रक्रिया को कवर, जो इस मॉडल मानव रोगों की प्रगति की एक लघु बनाता है । हालांकि, सर्जरी के बाद, त्वचा स्वतः ही ठीक है, जो सामांय स्तन कैंसर व्युत्पत्ति और पूर्वाग्रह परिणामों के साथ हस्तक्षेप के संभावित जोखिम ले सकते है प्रयास करता है ।
हम कुछ स्तन कैंसर के मॉडल की तुलना में है और एक ंयूनतम इनवेसिव orthotopic स्तन कैंसर प्रगति17,18पर दवाओं के संभावित प्रभाव की जांच मॉडल की स्थापना की । इस अध्ययन में, कैसे एक सरल, कम इनवेसिव रास्ते में स्तन वसा पैड में स्तनों के कैंसर की कोशिकाओं इंजेक्षन करने के लिए orthotopically पर एक वीडियो प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है । सर्जरी के बिना यह orthotopic इंजेक्शन विधि कई मायनों में लाभप्रद है । सबसे पहले, आपरेशन सरल और तेजी से है, के बारे में 1 माउस प्रति मिनट । दूसरा, प्राथमिक ट्यूमर सही रोग साइटों पर शुरू घावों के साथ, यह ट्यूमर के विकास से स्तन कैंसर प्रगति के पूरे tumorigenic प्रक्रिया को शामिल किया गया अंय अंगों मेटास्टेसिस है, जो अध्ययन के लिए एक अच्छा प्रयोगात्मक पशु मॉडल प्रदान करता है ट्यूमर कोशिकाओं और ट्यूमर microenvironment की बातचीत । इसके अलावा, यह स्तन कैंसर के सभी चरणों में उपचार के प्रभाव का अनुमान लगाने के लिए एक मूल्यवान मॉडल हो सकता है । इस विधि के लक्ष्य को अधिकतम रूप से मानव स्तन कैंसर प्रगति की नकल करने के लिए एक पशु मॉडल प्रदान करने के लिए है ।
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Protocol
पशु प्रयोगों के प्रावधान और चीनी प्रायोगिक पशु प्रशासन कानून के आम सिफारिश के अनुसार आयोजित किया गया और पशु देखभाल और राजधानी चिकित्सा विश्वविद्यालय के उपयोग समिति की संस्था द्वारा अनुमोदित किया गया (Ref no. AEEI-2014-052) । महिला बालब/c चूहों आयु वर्ग 6 से 8 सप्ताह का उपयोग किया गया.
1. कोशिकाओं और जानवरों की तैयारी
- ऑपरेशन से एक दिन पहले, चौथे निपल्स के आसपास बाल दाढ़ी ऑपरेटिंग क्षेत्र को बेनकाब ।
- एक हाथ का उपयोग करने के लिए वापस माउस को कसकर पकड़ने के लिए सुनिश्चित करें कि माउस को आसानी से कदम नहीं होगा, माउस बारी करने के लिए ऑपरेटर के लिए अपने पेट बेनकाब, और फिर एक और हाथ का उपयोग करने के लिए एक इलेक्ट्रॉनिक शेविंग के साथ चौथे निपल्स के आसपास फर दाढ़ी ।
- 30-60 एस के लिए निपल्स के आसपास बालों को हटाने क्रीम की एक पतली परत रखो, आसुत जल के साथ क्रीम साफ दूर, और फिर नरम कागज के साथ माउस सूखी ।
- आपरेशन के दिन, murine स्तन कैंसर की कोशिकाओं को इकट्ठा (4T1-luc2), सेल संख्या गिनती, और 2 एक्स 105 कोशिकाओं को समायोजित करने के लिए और फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब) में एक microcentrifuge ट्यूबों के लिए सेल घनत्व () में वे बर्फ पर रखें । प्रत्येक माउस के लिए, 1-एमएल सिरिंज में एक एक्स 104 कोशिकाओं/50 µ एल तैयार किया जाता है ।
2. Orthotopic इंजेक्शन
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चूहों की संज्ञाहरण
- संज्ञाहरण प्रेरित । एक बंद पारदर्शी कंटेनर में चूहों रखो और 2% isoflurane गैस पर बारी के बारे में 5 मिनट के लिए चूहों anesthetize, जब तक वे सब नीचे झूठ और सो जाते हैं ।
- संज्ञाहरण बनाए रखें । व्यक्तिगत संज्ञाहरण मास्क करने के लिए कंटेनर से चूहों स्थानांतरण, सूखापन से बचने के लिए उनकी आंखों पर कुछ पशु चिकित्सक मरहम लगा, उनके निपल्स ऑपरेटर के लिए उजागर के साथ चूहों supinely रखने के लिए, और उन्हें कुछ मिनट के लिए isoflurane गैस श्वास करने के लिए जारी करते हैं जब तक इंजेक्शन का प्रदर्शन किया गया है ।
- एक पैर की अंगुली चुटकी वापसी पलटा की कमी से संज्ञाहरण की सफलता की पुष्टि करें ।
- आंख सूखापन को रोकने के लिए चूहों की आंखों के लिए नेत्र मरहम लागू करें ।
नोट: कंटेनर आकार और व्यक्तिगत संज्ञाहरण मास्क उपलब्ध की संख्या के अनुसार, चूहों के एक समूह एक साथ anesthetized जा सकता है और एक व्यक्ति संज्ञाहरण के तहत एक के बाद एक इंजेक्शन ।
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इंजेक्शन का प्रदर्शन
- एक हाथ का उपयोग करने के लिए चिमटी के साथ चौथे निप्पल के आसपास त्वचा तंबू, सिरिंज का पालन करने के लिए एक उत्थान "सुरंग" स्थापित करने के लिए । सुई के साथ सिरिंज पकड़ करने के लिए दूसरे हाथ का उपयोग करने के लिए ऊपर की ओर त्वचा में चमड़े के नीचे से 5-10 mm निप्पल से दर्ज; तब, "सुरंग" का पालन करें जब तक सुई टिप निप्पल के करीब आता है, ध्यान से सुई टिप तक स्तन वसा पैड में ले जाने तक सुई आँख निप्पल टिप के तहत आता है, चिमटी त्यागना, और कोशिकाओं धीरे सुई.
- सुई एक छोटे से चारों ओर मुड़ें और सिरिंज धीरे मुकर; 10-20 के लिए सुई घाव प्रेस करने के लिए एक कपास झाड़ू का प्रयोग करें यकीन है कि वहाँ कोई तरल पदार्थ टपका है बनाने के लिए ।
- चौथे निप्पल का निरीक्षण करने के लिए एक सफल इंजेक्शन की पुष्टि: एक सफेद के रूप में केंद्र के निप्पल के साथ पारदर्शी फ्लैट क्षेत्र देखा जा सकता है (चित्रा 1) ।
- चूहों एक मिनट के लिए anesthetized रखने के लिए चूहों को ठीक और कदम भी जल्दी से बचने के लिए, जो इंजेक्शन घाव को खोलने के लिए और ट्यूमर कोशिकाओं को बाहर लीक करने के लिए कारण होगा ।
3. ट्यूमर के विकास और मेटास्टेसिस का विश्लेषण
नोट: प्राथमिक ट्यूमर इंजेक्शन के बाद पारदर्शी या छाला की तरह धक्कों के रूप में पहचाने जाते हैं, और निप्पल के साथ गोलाकार या ellipsoid ठोस गांठ के रूप में कुछ दिनों बाद । ट्यूमर के विकास ट्यूमर मात्रा और ट्यूमर bioluminescence द्वारा मूल्यांकन किया जाता है ।
- ट्यूमर की मात्रा को स्थापित करने के लिए, एक हाथ से माउस पकड़ो । ऑपरेटर के लिए इसके पेट बेनकाब और दूसरे हाथ का उपयोग करने के लिए ट्यूमर लंबाई कैलिपर (एल) और चौड़ाई (डब्ल्यू) । इस प्रकार के रूप में ट्यूमर मात्रा (वी) की गणना.
वी = (एल एक्स डब्ल्यू2)/ - ट्यूमर bioluminescence को पकड़ने के लिए, माउस की गर्दन के पीछे, इमेजिंग से पहले 10 मिनट में १५० मिलीग्राम/kg D-luciferin इंजेक्ट करें । 5 मिनट के लिए 2% isoflurane गैस के साथ चूहों Anesthetize और उन्हें व्यक्तिगत संज्ञाहरण मास्क के लिए हस्तांतरण करने के लिए उन्हें 5 मिनट के लिए अब isoflurane गैस श्वास. निर्माता के निर्देशों का पालन, प्राथमिक ट्यूमर और मेटास्टेसिस के bioluminescence छवियों पर कब्जा, ऑटो जोखिम समय के साथ, मध्यम बिन्नी, और 1 पर एफ/
4. विश्लेषण के लिए प्राथमिक ट्यूमर और मेटास्टेसिस अंगों की कटाई
नोट: जब इस प्रयोग के उद्देश्य को प्राप्त करने, या मानवीय समापन बिंदु तक पहुंचने, प्राथमिक ट्यूमर आगे अध्ययन के लिए काटा जा सकता है । इस अध्ययन में, ट्यूमर 4 से 5 सप्ताह में इंजेक्शन के बाद हटा दिया जाता है, जब ट्यूमर की मात्रा के बारे में ८०० mm3तक पहुंचता है । 8 सप्ताह में फेफड़ों हटा रहे हैं ।
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प्राथमिक ट्यूमर की कटाई
- एक बाँझ डाकू में शल्य चिकित्सा करने के लिए एक बंजर वातावरण को बनाए रखने । isoflurane द्वारा पशुओं को Anesthetize । पैर की अंगुली चुटकी आहरण सजगता की कमी से संज्ञाहरण की सफलता की पुष्टि करें । उन्हें बाहर सुखाने से रोकने के लिए चूहों की आँखों के लिए नेत्र मरहम लागू करें ।
- अलग कर देना को कैंची के साथ त्वचा से ट्यूमर, dropwise दर्द निवारक (1 mg/एमएल tramadol के बारे में ५० µ एल के प्रति माउस की 1 बूंद) पश्चात की पीड़ा को दूर करने के लिए ।
- एक शल्य टांका के साथ त्वचा सिलाई, बंद अतिरिक्त टांका, चीरा बंद कपड़ा काट ।
- एक स्केलपेल के साथ छमाही में प्राथमिक ट्यूमर में कटौती, आगे hematoxylin और eosin के लिए 4% paraformaldehyde में ट्यूमर के 1/2 डाल (एच & ई) धुंधला और immunohistochemistry, और तुरंत पश्चिमी सोख्ता या एक आरएनए के लिए तरल नाइट्रोजन के साथ अन्य 1/2 फ्रीज अलगाव अध्ययन बाद में ।
- suturing के बाद, एक चिराग के साथ चूहों को गर्म जब तक वे ठीक हो, एक पिंजरों में चूहों पूरी तरह से बरामद तक रखें । लगातार सर्जरी के बाद 3 डी के लिए एक मौखिक gavage के साथ 10 मिलीग्राम/kg tramadol ।
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मेटास्टेसिस अंगों की कटाई
- pentobarbital की ओवरडोज के साथ चूहों को Euthanize, उनके चेस्ट को कैंची से खोल दें, धीरे से फेफड़ों को बाहर निकाल लें, और उन्हें पंजाबियों से धो लें । फेफड़े के मेटास्टेसिस घावों को सफेद पारदर्शी धक्कों के रूप में पहचाना जा सकता है जो सामान्य गुलाबी फेफड़े के ऊतकों से अलग और आकृति विज्ञान होते हैं ।
- 4% paraformaldehyde में फेफड़ों रखो एच & ई धुंधलाना द्वारा मेटास्टेसिस सत्यापित करने के लिए ।
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Representative Results
एक सफल इंजेक्शन के बाद, बाहर सतह दौर केंद्र के रूप में निप्पल के साथ एक सफेद पारदर्शी फ्लैट क्षेत्र (चित्रा 1) मनाया जा सकता है । प्राथमिक ट्यूमर वृद्धि ट्यूमर की मात्रा और रहने वाले ट्यूमर सेल bioluminescence (चित्रा 2) द्वारा मापा जा सकता है । दोनों ट्यूमर मात्रा और कुल प्रवाह लकीर से पहले प्रयोग के दौरान वृद्धि हुई । एक प्रारंभिक चरण में, मेटास्टेसिस नहीं पाया जा सकता है क्योंकि कोई द्वितीयक ट्यूमर हुआ है या प्राथमिक ट्यूमर के मजबूत bioluminescent संकेतों कमजोर संकेतों के साथ छोटे मेटास्टेसिस घावों का पता लगाने बाधा । लकीर के बाद, दूर के अंगों के मेटास्टेटिक घावों से bioluminescent संकेत का पता लगाया और विश्लेषण किया जा सकता है । प्राथमिक स्तन ट्यूमर और फेफड़ों के वर्गों दोनों की आकृति विज्ञान एच & ई धुंधला के साथ अध्ययन किया, जबकि angiogenesis microvessel घनत्व (MVD) (चित्रा 3) के लिए पोत मार्कर CD31 के साथ ट्यूमर धुंधला द्वारा जांच की गई थी ।
चित्रा 1: महिला बालब/सी चूहों के स्तन वसा पैड पर orthotopic इंजेक्शन से पहले और बाद में चित्र । आपरेशन किया गया था, और तस्वीरें ले जाया गया, जबकि चूहों isoflurane संज्ञाहरण के तहत किया गया । एक, इंजेक्शन से पहले, बी, इंजेक्शन के बाद.
चित्रा 2: मात्रा और प्राथमिक ट्यूमर के कुल प्रवाह प्रत्यारोपण के बाद 7 दिनों से मापा गया । सेल निलंबन आरोपण दोनों मात्रा में एक वृद्धि की प्राथमिक ट्यूमर उत्पन्न हुआ, जो visualized और कैलिपर्स का उपयोग कर निर्धारित किया गया था, और कुल प्रवाह में, जो स्पेक्ट्रम प्रणाली द्वारा मापा गया था. चित्रा प्राथमिक ट्यूमर के bioluminescent छवियों को दर्शाता है और मेटास्टेसिस प्रत्यारोपण के 7 दिन के बाद विभिंन समय बिंदुओं पर मनाया । p/s = फोटॉनों/ इस आंकड़े को झांग एट अल से संशोधित किया गया है । 17. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3: एच & ई धुंधला और प्राथमिक ट्यूमर और फेफड़ों मेटास्टेसिस के immunohistochemical धुंधला विश्लेषण । ऊतकों 4% paraformaldehyde में तय, तेल में एंबेडेड, और दाग थे । (A और B) अनुभाग hematoxylin और eosin (H & E) के साथ दाग थे । (सी और डी) वर्गों antiCD31 एंटीबॉडी के साथ दाग थे । भूरा धुंधला संकेत CD31 + जहाजों । पैनलों ए और सी वर्तमान प्राथमिक ट्यूमर ऊतक, पैनलों बी और डी वर्तमान फेफड़ों मेटास्टेसिस । सीडी भेदभाव के क्लस्टर = । आवर्धन उपयोग = 200X । स्केल बार = ५० µm । इस आंकड़े को झांग एट अल से संशोधित किया गया है । 17. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
इस अध्ययन में प्रयुक्त कोशिकाएं 4T1-luc2, murine ट्रिपल-नेगेटिव स्तन कैंसर की कोशिकाओं के साथ luciferase लेबलिंग, जो उनके अत्यधिक इनवेसिव प्रकृति के कारण दवाओं के अर्बुदरोधी और antimetastatic प्रभाव के निवेश के लिए एक उपयोगी उपकरण हैं2,19 . Luciferases, अगले सेल पीढ़ी के लिए स्थिर, दोनों स्तन ग्रंथि में और अंय दूर अंगों20पर रहने वाले ट्यूमर कोशिकाओं का संकेत किया जाता है । कुछ मामलों में, bioluminescent संकेत में कमी में ट्यूमर के परिणाम के भीतर हाइपोक्सिया और पोषक तत्वों की कमी, और प्राथमिक ट्यूमर की मात्रा ट्यूमर प्रगति के बाद के चरण में bioluminescent संकेत के साथ असंगत नहीं है । कोशिका निलंबन के सेलुलर orthotopic इंजेक्शन (सीओआई) की तकनीक भी अंय स्तन कैंसर सेल लाइनों के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है, जैसे मानव कोशिकाओं एमडीए-एमबी-२३१ (अप्रकाशित डेटा) । इस अध्ययन में, अपने पर्यावरण के रूप में स्तन ग्रंथि के साथ, यह ट्यूमर microenvironment का अध्ययन करने के लिए एक उचित पशु मॉडल है, ट्यूमर कोशिकाओं और stromal कोशिकाओं के बीच बात कर पार. ट्यूमर प्रगति के दौरान, कुछ चूहों में, निप्पल ulcerate कर सकते हैं, पपड़ी, लाल दानेदार ऊतक बढ़ने, समतल, या यहां तक कि गायब हो जाते हैं, स्तन कैंसर के दौरान मानव निपल्स में क्या होता है के समान । चूहों अल्सर के साथ असुविधा का अनुभव हो सकता है; मानवीय देखभाल की जानी चाहिए । अधिक निपल परिवर्तन चूहों में पाया गया है माइक्रो इनवेसिव सर्जरी तकनीक के साथ तुलना में इस सीओआई तकनीक का उपयोग कर । सर्जिकल orthotopic आरोपण (सोइ) histologically बरकरार मानव ट्यूमर ऊतक, सेल सस्पेंशन के सेलुलर orthotopic इंजेक्शन (सीओआई) के साथ तुलना में, मूत्राशय में उच्च घातक कैंसर से पता चलता है, फेफड़े, पेट, गुर्दे, और बृहदांत्र21 कि नकल क्या22रोगियों में देखा जाता है ।
मेटास्टेसिस की एक उच्च घटना के साथ, विशेष रूप से फेफड़ों मेटास्टेसिस, murine स्तन कैंसर मॉडल इस अध्ययन में स्थापित एक अच्छा syngeneic कैंसर मॉडल सहज प्रवास और आक्रमण का पता लगाने के लिए, एक कृत्रिम मेटास्टेसिस मॉडल के साथ तुलना में, जैसे एक पूंछ नस इंजेक्शन । ट्यूमर सेल गतिविधियों और पात्रों को भी मेटास्टेसिस में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । ऐसे मानव स्तन कैंसर कोशिका MCF-7 के रूप में अंय सेल लाइनों, यहां तक कि प्रतिरक्षा की कमी बालब के स्तन वसा पैड पर एक orthotopic इंजेक्शन द्वारा प्रत्यारोपित, एक कम मेटास्टेटिक क्षमता है । कोशिकाओं या चूहों के संशोधन के साथ, जैसे अधिक अभिव्यक्ति या नीचे एक निश्चित जीन की अभिव्यक्ति, इस तकनीक को और अधिक अनुसंधान क्षेत्रों में लागू किया जा सकता है ।
इस इंजेक्शन के महत्वपूर्ण आपरेशन के लिए ध्यान से और धीरे से सुई टिप ऊपर ले जाता है, स्तन वसा पैड में चमड़े के नीचे से । जब सिरिंज टिप निप्पल के करीब आता है, ऑपरेटर ऊतक से जिद महसूस होगा । के बाद से माउस ग्रंथि बहुत छोटा है, केवल एक छोटे से अधिक दबाव के लिए जाने की जरूरत है सिरिंज टिप जिद के माध्यम से गुजरती हैं । बहुत अधिक दबाव ग्रंथि के माध्यम से गुजर टिप में परिणाम और त्वचा को तोड़ने, जो इंजेक्शन की विफलता में परिणाम होगा । लघुगणक-चरण कक्ष, एकल-कक्ष निलंबन, मानक ऑपरेशन प्रोटोकॉल (शराबी), और कुशल ऑपरेटर सभी चूहों के बीच भिन्नता को कम करने के लिए आवश्यक हैं । ट्यूमर सेल व्यवहार गठन और ट्यूमर मॉडल के दोहराव के लिए महत्वपूर्ण है । फसल लघुगणक-चरण कक्ष जब वे के बारे में ८०%-९०% संगम को विकसित; बहुत कम या बहुत अधिक सेल घनत्व ट्यूमर मॉडल और प्रयोगों के बीच बदलाव में परिणाम के साथ हस्तक्षेप करेंगे । एकल-कक्ष निलंबन कक्ष संख्या के गलत परिकलनों में कक्ष के झुरमुट के परिणाम के बाद भी महत्वपूर्ण है । Trypsin, एक EDTA समाधान, या अंय उपयुक्त तरीकों को प्रयोग के अनुसार कोशिकाओं को अलग करना चुना है उद्देश्य और लक्ष्य शोधकर्ता में रुचि है सिरिंज स्केल और सेल घनत्व पर निर्भर, इंजेक्शन की मात्रा 25 से १०० µ एल के लिए भिन्न हो सकता है 1 x 104 से 1 x 106 कोशिकाओं की मात्रा आमतौर पर विभिन्न कोशिका प्रकार के अनुसार ट्यूमर वृद्धि परेशान करने के लिए प्रयोग किया जाता है । Trypan नीले दाग मृत लोगों से व्यवहार्य कोशिकाओं भेद करने के लिए प्रयोग किया जाता है । अधिक से अधिक ९५% सेल व्यवहार्यता एक अच्छी स्थिति के रूप में माना जाता है एक तेजी से ट्यूमर विकास और vivo मेंमेटास्टेसिस प्रेरित । ट्यूमर कोशिकाओं की तैयारी करते समय ये किसी भी अन्य ट्यूमर मॉडल के लिए भी उपयुक्त हैं । प्राथमिक ट्यूमर के आकार को सही ढंग से कैलिपर और एक सटीक bioluminescent संकेत प्राप्त करने के लिए, निप्पल के चारों ओर फर एक बार यह वापस बढ़ता है फिर से हटा दिया जाना चाहिए । जब प्राथमिक ट्यूमर एक बड़े पैमाने पर बढ़ता है और इसके bioluminescent संकेत शोधकर्ताओं के लिए भी मजबूत है अन्य अंग मेटास्टेसिस का पालन करने के लिए (जैसे, फेफड़े मेटास्टेसिस), यह bioluminescence छवियों से पहले काले बिजली के टेप के साथ कवर लिया जाता है, या द्वारा इसे दूर सर्जरी. एक दर्द निवारक सर्जरी के बाद शल्य चिकित्सा के लिए इस्तेमाल किया जा सकता ।
सफल टीका फेफड़ों मेटास्टेसिस में परिणाम कर सकते हैं: ९०% से अधिक की एक घटना की दर के साथ, गैर में मेटास्टेटिक घावों इंजेक्शन स्तनों, हड्डी, या लिम्फ नोड्स काफी आम हैं, जबकि सीलिएक मेटास्टेसिस दुर्लभ है । माध्यमिक ट्यूमर एक पारदर्शी द्रव्यमान रहे हैं और आसपास के सामान्य ऊतकों से प्रतिष्ठित किया जा सकता है । इंजेक्शन का एक गलत आवेदन ट्यूमर का आकार और आकार और मेटास्टेसिस स्थानों में प्रयोगात्मक त्रुटियों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । इंजेक्शन के बाद सपाट क्षेत्र से किसी भी रिसाव ट्यूमर का आकार कम हो जाएगा, "सुरंग" में स्तन ग्रंथि से किसी भी रिसाव एक लंबे बेलनाकार ट्यूमर जो ट्यूमर की मात्रा का निर्धारण बाधा जब हम एक डिजिटल कैलिपर का उपयोग करेंगे में परिणाम होगा यह उपाय । स्तन वसा पैड के आसपास चमड़े के नीचे इंजेक्शन शायद ही कभी फेफड़े मेटास्टेसिस के लिए नेतृत्व और दूर मेटास्टेसिस के लिए उपयुक्त नहीं है-संबद्ध अध्ययन । टीका स्थिर बनाने के लिए और रिसाव के जोखिम को कम करने के लिए, Matrigel इस्तेमाल किया जा सकता है जब ट्यूमर कोशिकाओं सस्पैंड । हालांकि, Matrigel एक विलायक नहीं है, यह extracellular मैट्रिक्स (ECM) के एक प्रकार के रूप में माना जाता है, और जेल के कुछ प्रकार के भी कारक है जो प्रयोगों के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं शामिल हैं । ट्यूमर microenvironment, ECM, ट्यूमर कोशिकाओं के बीच या stromal कोशिकाओं के बीच बात कर पार करने के उद्देश्य से प्रयोग में, यह Matrigel का उपयोग करने से बचने के लिए बेहतर है । luciferase टैग डी-luciferin के साथ इंजेक्शन कोशिकाओं के लिए, luciferase के सब्सट्रेट चूहों में रहने वाले ट्यूमर कोशिकाओं को बांध करने के लिए इंजेक्शन है. इस अध्ययन में, vivo में bioluminescence की गतिशीलता का सुझाव दिया है कि पर 10 मिनट के बाद डी-luciferin इंजेक्शन, bioluminescent संकेत शिखर तक पहुँचने और के बारे में 10-15 मिनट के लिए स्थिर हो सकता है (विभिन्न चूहों के बीच अलग), चाहे के साथ एक intraperitoneal इंजेक्शन या एक चमड़े के नीचे इंजेक्शन । परीक्षण दवा intraperitoneally इंजेक्ट किया जाता है पर विचार, डी-luciferin के साथ परीक्षण दवा की बातचीत से बचने के लिए और पेरिटोनियल जलन को कम करने के लिए, एक चमड़े के नीचे इंजेक्शन का सुझाव दिया है.
अंत में, स्तन कैंसर की कोशिकाओं के orthotopic इंजेक्शन इस पत्र में उल्लिखित विकृति और स्तन कैंसर की प्रगति का अध्ययन में एक बहुत ही उपयोगी और शक्तिशाली उपकरण है । इसे संभालना आसान है और जल्दी से किया जा सकता है । प्राथमिक ट्यूमर मेटास्टेसिस की एक उच्च घटना है, जो अधिकतम रूप से मानव स्तन कार्सिनोमा की pathophysiological प्रक्रिया नकल के साथ स्तन ग्रंथि में शुरू होता है ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
लेखकों को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान सं ८१८७३१११, ८१६७३९२४, ८१७७४०३९, ८१५०३५१७), बीजिंग प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान नहीं ७१७२०९५, ७१६२०८४, ७१६२०८३), और Xu ज़िया के बीजिंग अस्पताल के फाउंडेशन का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा पारंपरिक चीनी चिकित्सा (अनुदान नहीं, xx201701) । हम प्रो चांग-Zhen लियू, प्रयोगात्मक अनुसंधान केंद्र, चीनी चिकित्सा विज्ञान के चीन अकादमी से, bioluminescent छवियों के लिए धंयवाद ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anesthesia machine | Midmark Corporation, Dayton, OH, USA | Matrx VMS | anesthesia |
| In-Vivo Imaging System | PerkinElmer | IVIS Spectrum | used for bioluminescence detecion |
| isoflurane | Hebei yipin chemical reagents company | O21400 | anesthesia |
| 1 ml syringe | Becton,Dickinson and Company | A257 | cell injection |
| digital caliper | Shang Hai Shen Han Measuring Tools Co., Ltd. | S-H | volume measurement |
| tramadol | Mundipharma company | - | pain killer |
| D-luciferin | Gold Biotechnology Inc. | LUCK-1G | used for bioluminescence detecion |
| The primary antibody against cluster of differentiation (CD) 31 | Abcam | ab28364 | used for MVD detection |
| hematoxylin and eosin staining kit | Beijing Zhong Shan Jinqiao Biotechnology Co., Ltd. | ZLI-9615 | histology |
| hair removal cream | Veet | - | hair removal cream |
| Carbomer Eye Gel | Dr.GerhardMannChem-Pharm.FabrikGmbH | - | ophthalmic ointment |
| sewing needle | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. | 17U0302J | suture |
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