Summary
在这里, 我们提出了一个协议, 植入乳腺癌细胞在一个简单, 侵入性较低, 易于操作的方式, 和这个小鼠原位乳腺癌模型具有适当的乳房脂肪垫环境, 可以用来调查各个方面的癌症。
Abstract
适当的动物模型对于更好地了解疾病至关重要。通过不同的方法 (皮下注射、异种移植、基因操作、化学试剂诱导等) 建立的动物模型具有不同的病理特征, 在调查某些方面发挥着重要作用。疾病。虽然没有一个单一的模型能够完全模仿整个人类疾病的进展, 但具有适当的基质环境的原位器官疾病模型在了解疾病和筛选潜在药物方面发挥着不可替代的作用。在这篇文章中, 我们描述了如何植入乳腺癌细胞在乳房脂肪垫在一个简单, 侵入性较低, 易于处理的方式, 并跟踪转移到遥远的器官。由于原发肿瘤生长、乳腺和病变的适当特征 , 以及其他器官转移的高发生率 , 该模型最大限度地模仿了人类乳腺癌的进展。利用该模型可以研究乳腺癌的原发肿瘤原位生长、远距离转移和肿瘤微环境。
Introduction
乳腺癌是全世界女性死亡的主要原因。随着乳腺癌发病率的逐步上升, 乳腺癌已成为对公共卫生的严重挑战1。小鼠癌症模型是临床前和临床研究之间的良好桥梁, 良好的模拟小鼠疾病模型将提高疾病和医学研究的准确性。
原发性肿瘤生长开始了恶性肿瘤的发展, 而转移和并发症是大多数癌症患者死亡和生活质量差的主要原因。几种小鼠模型被用来模拟人类乳腺癌的病理 2,3,4。异种移植模型被广泛用于癌症研究, 以了解病理特征, 筛选药物的安全性和有效性5, 6,7.基因工程小鼠 (gem) 是通过针对某些癌基因或肿瘤抑制基因而产生的, 以模仿人类乳腺癌.创业板具有相对简单和统一的背景, 可以了解基因在癌变进展中的作用;然而, 人工环境和背景有限, 研究转移病理及相关治疗 9.人类癌细胞虽然具有人类病理特征, 但只能植入免疫缺陷小鼠体内, 而肿瘤-宿主免疫相互作用不足可能会导致偏颇的结果10。
固体肿瘤的发生地直接影响到疾病的生物和病理特征 11, 12,13.由于癌变进展是肿瘤细胞、间质细胞、免疫细胞、炎症细胞、生长因子和蛋白酶相互作用的复杂结果,植入原位的原发肿瘤将提供更好的洞察和模仿与化学剂或皮下注射肿瘤细胞引起的肿瘤相比, 癌变过程更准确。用于诱发肿瘤的化学剂可能对研究人员和环境有害, 甚至在一些国家被禁止。由于没有乳腺脂肪垫环境, 皮下注射的病理进展可能与真正的乳腺癌患者不同, 他们的癌症源于乳腺脂肪垫并刺激。皮下注射的缺点鼓励使用原位模型来研究肿瘤的生长。在早期的研究中, 经过7次原位移植后出现的高度转移性 mda-mb-231 肿瘤表明了注射部位14的重要性.最近, 经手术将乳腺癌细胞原位植入乳腺脂肪垫的报道为15,16例。随着乳腺垫环境的出现, 肿瘤的生长和向远处器官的迁移覆盖了与病理相关的部位的乳腺癌的整个过程, 使这一模型成为人类疾病进展的缩影。然而, 手术后, 皮肤会自动尝试自愈, 这可能会带来干扰正常乳腺癌起源的潜在风险, 并影响结果。
我们比较了一些乳腺癌模型, 建立了微创原位模型, 以研究药物对乳腺癌进展的潜在影响17,18.在这项研究中, 提出了一个视频协议如何正声表入乳腺癌细胞在乳房脂肪垫在一个简单的, 侵入性较小的方式。这种不经手术的原位注射方法在许多方面都是有利的。首先, 操作简单快捷, 每只鼠标约1分钟。其次, 原发肿瘤病灶从正确的病理部位开始, 涵盖了乳腺癌从肿瘤生长到其他器官转移的整个肿瘤发生过程, 为研究乳腺癌提供了良好的实验动物模型。肿瘤细胞与肿瘤微环境的相互作用。此外, 估计乳腺癌各阶段的治疗效果也是一个有价值的模型。这种方法的目的是提供一个动物模型, 以最大限度地模仿人类乳腺癌的进展。
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Protocol
动物实验是根据中国实验动物管理局立法的规定和一般建议进行的, 并得到了首都医科大学动物护理和使用委员会的批准 (参考编号:)。aeei-00552)。使用6至8周的雌性 balbbe 小鼠。
1. 细胞和动物的制备
- 手术前一天 , 剃光第四周围的头发 , 露出手术区域。
- 用一只手将鼠标紧紧地握在后面 , 以确保鼠标不会自由移动 , 打开鼠标将其腹部暴露给操作员 , 然后用另一只手用电子剃须刀刮掉第四周围的皮毛。
- 在奶嘴周围放一层薄薄的脱毛霜, 用蒸馏水清洗奶油, 然后用软纸擦干老鼠。
- 手术当天, 收集小鼠乳腺癌细胞 (4t1-luc2), 计数细胞数, 并将无菌微离心管中磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 中的细胞密度调整为 2x10 5 细胞, 并将其保持在冰上。对于每个小鼠, 在1-ml 注射器中制备 1 x 10 4 细胞 50μl.
2. 原位注射
-
小鼠麻醉
- 麻醉。将小鼠放入一个密闭的透明容器中, 打开2% 的异氟烷气体, 给小鼠麻醉约 5分钟, 直到它们都躺下睡着。
- 保持麻醉。将小鼠从容器转移到单独的麻醉面罩上 , 在眼睛上涂上一些兽医软膏 , 以避免干燥 , 让老鼠在暴露给操作员的情况下保持仰卧 , 让它们继续吸入异氟烷气体几分钟 , 直到注射已完成。
- 确认麻醉的成功, 缺乏脚趾捏戒断反射。
- 在小鼠的眼睛上涂抹眼药膏, 以防止眼睛干燥。
注: 根据容器大小和可用的个别麻醉面罩的数量, 一组小鼠可以一起麻醉, 并在单独麻醉下逐一注射。
-
注射的性能
- 用一只手用推子将第四奶嘴周围的皮肤搭起帐篷, 设置一个隆起的 "隧道", 供注射器跟随。用另一只手按住注射器, 针头向上转动, 在奶嘴5-10 毫米的皮下部进入皮肤;然后 , 按照隧道 , 直到针尖靠近 , 小心地将针尖向上移动到乳房脂肪垫中 , 直到针眼进入尖端下 , 丢弃推子 , 慢慢注射细胞。
- 稍微转一下针头, 慢慢地收回注射器;使用棉签按压针伤10-20 秒, 以确保没有液体渗出。
- 观察第四个以确认注射成功 : 可以观察到一个以为中心的白色透明扁平球体 (图 1) 。
- 将小鼠再麻醉一分钟, 以避免让老鼠恢复和动作过快, 这将导致注射伤口打开, 肿瘤细胞泄漏出去。
3. 肿瘤生长和转移分析
注意 : 原发肿瘤被确定为透明或水泡样的隆起注射后 , 并被确定为球形或椭圆形固体肿块与几天后。肿瘤生长是通过肿瘤体积和肿瘤生物发光来评价的。
- 要确定肿瘤体积, 用一只手握住小鼠。将其腹部暴露给操作人员, 并使用另一只手卡钳肿瘤长度 (l) 和宽度 (w)。计算肿瘤体积 (v) 如下。
v = (长 x 宽2)/2 - 要捕捉肿瘤的生物发光, 在小鼠颈部后部注射 150 mg/kg d-荧光素, 成像前10分钟。用2% 异氟醚气体对小鼠进行5分钟的麻醉, 并将其转移到单独的麻醉面罩中, 让它们吸入异氟醚气体的时间延长5分钟。按照制造商的说明, 捕获原发肿瘤和转移的生物发光图像, 自动曝光时间、中等分球时间和停止在1。
4. 收集原发肿瘤和转移器官进行分析
注意: 当达到这个实验的目的, 或达到人道的终点, 原发肿瘤可以收获进一步研究。在这项研究中, 肿瘤在注射后4至5周被切除, 当肿瘤体积达到约800毫米3。肺部在第8周被切除。
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原发肿瘤的收集
- 在无菌罩中进行手术, 以保持无菌气氛。用异氟烷对动物进行麻醉。通过缺乏脚趾夹紧戒断反射来确认麻醉的成功。将眼药膏涂在小鼠的眼睛上, 防止它们干燥。
- 将肿瘤与皮肤用剪刀、滴状止痛药 (1 mgml 曲马多, 1 滴约每只小鼠 50μl) 分离, 以缓解术后疼痛。
- 用手术缝合缝合皮肤, 切断多余的缝合线, 悬垂切口。
- 用手术刀将原发肿瘤切成两半, 将肿瘤的一半放入4% 的甲醛中, 作进一步的血红素和 eosin (h & e) 染色和免疫组织化学, 并立即用液氮冷冻另一半用于西部印迹或 rna隔离研究后。
- 缝合后, 用灯温暖老鼠, 直到它们恢复, 把老鼠关在一个笼子里, 直到完全康复。手术后连续服用 10 mg/kg 曲马多, 口服灌胃为3天。
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转移器官的采集
- 用过量的戊巴比妥对小鼠进行安乐死, 用剪刀打开它们的箱子, 轻轻取出肺部, 用 pbs 清洗它们。肺转移病灶可被确定为白色透明凸起, 在形态上是不同的, 可与正常的粉红色肺组织区分开来。
- 将肺部放入4% 的甲醛中, 通过 h & e 染色验证转移。
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Representative Results
注射成功后 , 可以观察到一个白色透明的扁平球体 , 奶嘴以为外表面圆的中心 (图 1) 。原发肿瘤生长可以通过肿瘤体积和活肿瘤细胞的生物发光来衡量 (图 2)。在切除前的实验中, 肿瘤体积和总通量都增加了。在早期, 由于没有发生继发性肿瘤或原发肿瘤的强生物发光信号阻碍了微弱信号小转移病灶的检测, 因此无法找到转移。切除后, 可以检测和分析远处器官转移病灶的生物发光信号。用 h & e 染色研究了原发乳腺肿瘤和肺切片的形态, 用血管标记 cd31 染色肿瘤的微血管密度 (mvd), 研究了血管生成情况 (图 3)。
图 1: 在雌性 balb c1 小鼠乳腺脂肪垫进行原位注射前后的图片.手术进行, 并在小鼠进行异氟烷麻醉时拍摄照片。a,注射前, b, 注射前.
图 2: 从植入后7天开始测量原发肿瘤的体积和总通量.细胞悬浮植入在体积上和总通量上都产生了增加的原发肿瘤, 用卡钳进行了可视化和确定, 并通过光谱系统进行了测量。该图显示了在植入后第7天之后的不同时间点观察到的原发肿瘤和转移的生物发光图像。p s = 光子/秒。这一数字已从张等人的数字中修改。17.请点击此处查看此图的较大版本.
图 3:h & e 染色及原发肿瘤和肺转移的免疫组织化学染色分析.在4% 的聚甲醛中固定了组织, 嵌入石蜡中, 并染色。(a和b) 切片被血红素和 eosin (h & e) 染色。(c和d) 切片被染成抗 cd31 抗体。棕色染色显示 cd31 + 血管。a和c片存在原发肿瘤组织, b 片和d片存在肺转移。cd = 一组差异。使用的放大倍率 = 200x。刻度杆 = 50μm。这一数字已从张等人的数字中修改。17.请点击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
本研究中使用的细胞为 4t1-luc2, 小鼠三阴性乳腺癌细胞, 具有荧光素酶标记, 是投资药物抗肿瘤和抗肿瘤作用的有用工具,因为它们具有高度侵入性 2,19。.荧光素酶, 稳定到下一代, 被用来表明活的肿瘤细胞, 无论是在乳腺和其他遥远的器官 20.在某些情况下, 肿瘤内缺氧和营养缺乏会导致生物发光信号减少, 原发肿瘤的体积与肿瘤进展后期的生物发光信号并不矛盾。细胞原位注射 (coi) 的技术也可以与其他乳腺癌细胞系进行, 如人体细胞 mda-mb-231 (未公布的数据)。本研究以乳腺为环境, 研究肿瘤微环境, 在肿瘤细胞和间质细胞之间进行交叉说话, 是一个合适的动物模型。在肿瘤的进展过程中 , 在一些小鼠中 , 会溃疡、结疤、生长红色肉芽组织、扁平甚至消失 , 类似于乳腺癌期间人类的情况。小鼠可能会感到溃疡不适;应该采取人道的照顾。使用这种 coi 技术的小鼠比微创手术技术发现的改变更多。手术原位植入术 (soi) 的组织学完整的人类肿瘤组织, 相比细胞原位注射 (coi) 的细胞悬浮液, 显示更高的恶性癌症在膀胱, 肺, 胃, 肾, 结肠21模仿在22岁患者中看到的东西。
本研究建立的小鼠乳腺癌模型具有较高的转移发生率, 尤其是肺转移发生率, 是探索自发性转移和侵袭的良好的联合癌症模型, 与人工转移模型相比, 如尾静脉注射。肿瘤细胞的活性和特征在转移中也起着重要作用。其他细胞系, 如人类乳腺癌细胞 mcf-7, 甚至通过原位注射植入免疫缺陷的 balb 小鼠的乳腺脂肪垫, 具有较低的转移性。随着细胞或小鼠的修饰, 如某一基因的过度表达或向下表达, 这项技术可以应用于更多的研究领域。
这种注射的关键操作是小心地缓慢地向上移动针尖, 从皮下进入乳腺脂肪垫。当注射器尖端靠近奶嘴时, 操作人员会感觉到组织的坚持。由于小鼠的腺体非常小, 只需要更多的压力, 就可以让注射器尖端通过坚持。压力过大, 会导致尖端通过腺体, 皮肤破裂, 导致注射失败。对数相细胞、单细胞悬浮液、标准操作协议 (sop) 和熟练的操作人员都需要减少小鼠之间的变异。肿瘤细胞行为对肿瘤模型的形成和可重复性很重要。当它们生长到大约 80%-90% 融合时, 收获对数相细胞;细胞密度过低或过高会干扰肿瘤模型, 并导致实验之间的差异。单细胞悬浮液也很重要, 因为细胞团块会导致细胞数的误判。根据实验目的和研究人员感兴趣的目标, 选择胰蛋白酶、edta 溶液或其他适当的方法来分离细胞。根据注射器的规模和细胞密度, 注射量可能从25μl 到100μl 不等。1 x 104至 1 x 10 6 细胞的数量通常用于根据不同的细胞类型刺激肿瘤生长。色氨酸蓝染色用于区分活细胞和死细胞。95% 以上的细胞活力被认为是诱导肿瘤在体内快速生长和转移的良好情况。这些也适用于任何其他肿瘤模型时准备肿瘤细胞。为了正确地卡钳原发肿瘤的大小 , 并获得准确的生物发光信号 , 周围的毛皮应再次被删除 , 一旦它重新生长。当原发肿瘤生长到一个大的质量, 其生物发光信号太强, 研究人员无法观察到其他器官转移 (如肺转移), 覆盖它用黑色胶带之前, 生物发光图像拍摄, 或删除它手术。止痛药可用于手术后疼痛。
成功接种可导致肺转移: 发生率超过 90%, 非注射乳房、骨骼或淋巴结转移病灶相当常见, 而腹腔转移则很少见。继发性肿瘤是一个半透明的肿块, 可以区别于周围的正常组织。注射的不精确应用会导致肿瘤大小、形状和转移部位的实验误差。注射后从平球的任何泄漏都会减少肿瘤的大小, 任何从乳腺泄漏到 "隧道" 的情况都会导致长长的圆柱形肿瘤, 当我们使用数字卡钳时, 会阻碍肿瘤体积的测定。测量它。乳腺脂肪垫周围的皮下注射很少导致肺转移, 不适合远处转移相关的研究。为了使接种稳定, 减少泄漏风险, 在悬浮肿瘤细胞时可以使用马特里格尔。然而, matrigel 不是一种单一的溶剂, 它被认为是一种细胞外基质 (ecm), 某些类型的凝胶甚至含有可能干扰实验的因素。在针对肿瘤微环境、ecm、在肿瘤细胞之间或与间质细胞之间交叉交谈的实验中, 最好避免使用马特里格尔。对于注射荧光素酶标记 d-荧光素素的细胞, 注射荧光素酶的底物以结合小鼠的活肿瘤细胞。在这项研究中,体内生物发光的动力学表明, 在 d-荧光素注射10分钟后, 生物发光信号达到峰值, 并且可以稳定大约 10-15分钟 (不同小鼠之间的差异), 无论是使用腹腔内注射或皮下注射。考虑到所测试的药物是腹腔注射, 以避免被测药物与 d-荧光素的相互作用, 并减少腹膜刺激, 建议皮下注射。
总之, 本文概述的乳腺癌细胞原位注射是研究乳腺癌病理和进展的一个非常有用和有力的工具。它易于操作, 并且可以快速执行。原发肿瘤发生在乳腺, 转移发生率较高, 最大限度地模仿了乳腺癌的病理生理过程。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢中国国家自然科学基金 (拨款编号: 8187111、81673924、81774039、81873111)、北京自然科学基金 (赠款编号: 772095、716884、7202083) 和北京医院徐霞基金会。中医药 (赠款号, xx201701)。我们感谢中国医学科学院实验研究中心的刘长珍教授提供的生物发光图像。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anesthesia machine | Midmark Corporation, Dayton, OH, USA | Matrx VMS | anesthesia |
| In-Vivo Imaging System | PerkinElmer | IVIS Spectrum | used for bioluminescence detecion |
| isoflurane | Hebei yipin chemical reagents company | O21400 | anesthesia |
| 1 ml syringe | Becton,Dickinson and Company | A257 | cell injection |
| digital caliper | Shang Hai Shen Han Measuring Tools Co., Ltd. | S-H | volume measurement |
| tramadol | Mundipharma company | - | pain killer |
| D-luciferin | Gold Biotechnology Inc. | LUCK-1G | used for bioluminescence detecion |
| The primary antibody against cluster of differentiation (CD) 31 | Abcam | ab28364 | used for MVD detection |
| hematoxylin and eosin staining kit | Beijing Zhong Shan Jinqiao Biotechnology Co., Ltd. | ZLI-9615 | histology |
| hair removal cream | Veet | - | hair removal cream |
| Carbomer Eye Gel | Dr.GerhardMannChem-Pharm.FabrikGmbH | - | ophthalmic ointment |
| sewing needle | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. | 17U0302J | suture |
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