Summary
Qui, presentiamo un protocollo per impiantare cellule di cancro al seno nel cuscinetto grasso mammario in modo semplice, meno invasiva e facile da maneggiare, e questo modello di cancro al seno ortotopico del topo con un ambiente adeguato cuscinetto grasso mammario può essere utilizzato per approfondire vari aspetti della cancro.
Abstract
Un modello animale adeguato è fondamentale per una migliore comprensione delle malattie. Animale modelli stabiliti dai diversi metodi (iniezioni sottocutanee, xenotrapianti, manipolazione genetica, induzione di reagenti chimici, ecc.) hanno vari caratteri patologici e svolgono un ruolo importante nell'investigare alcuni aspetti della malattie. Sebbene nessun singolo modello può imitare totalmente la progressione di malattia umana, modelli di malattia ortotopici organi con un adeguato ambiente stromale giocano un ruolo insostituibile nella comprensione delle malattie e di screening per potenziali farmaci. In questo articolo, descriviamo come impiantare cellule di cancro al seno nel cuscinetto grasso mammario in modo semplice, in modo meno invasivo e facile da maneggiare e seguire la metastasi in organi distanti. Con le funzionalità corretta della crescita del tumore primario, al seno e alterazioni patologiche del capezzolo e un alto avvenimento della metastasi in altri organi, questo modello maximumly imita la progressione del cancro al seno umano. Crescita del tumore primario in situ, metastasi a distanza lunga e microambiente tumorale di cancro al seno può essere indagate utilizzando questo modello.
Introduction
Cancro al seno è la principale causa di mortalità femminile in tutto il mondo. Con la sua incidenza progressivamente crescente, cancro al seno è diventata una seria sfida alla sanità pubblica1. Modelli murini del cancro sono buoni ponti tra studi preclinici e clinici, e un modello di buona mimica malattia murina aumenterà la precisione della ricerca sulla malattia e medicina.
Crescita del tumore primario inizia lo stato di avanzamento della malattia maligna, mentre le metastasi e le complicazioni sono le principali cause di morte e qualità di vita scarsa nella maggior parte dei malati di cancro. Diversi modelli murini sono utilizzati per simulare la patologia del cancro di seno umano2,3,4. Modelli di xenotrapianto sono ampiamente utilizzati per lo studio del cancro capire i caratteri patologici e ai farmaci di schermo per la sicurezza e l'efficacia5,6,7. Topi geneticamente modificati (GEM) vengono generati per simulare il cancro al seno umano di mira alcuni oncogeni o di geni del soppressore del tumore8. GEM hanno un background relativamente semplice e uniforme per comprendere il ruolo dei geni in corso cancerosa; Tuttavia, l'ambiente artificiale e sfondo sono limitati a studiare la patologia di metastasi e relative terapie9. Cellule tumorali umane, anche se con caratteristiche patologiche umane, possono solo essere impiantate in topi immune-carenti, e l'insufficienza dell'interazione tumore-ospite immune può portare a risultati parziale10.
Dove inizia il tumore solido ha un'influenza diretta sui caratteri biologici e patologici della malattia11,12,13. Poiché il progresso cancerosa è il risultato di complicati delle interazioni tra le cellule del tumore, le cellule stromali, immunologia cellule, cellule infiammatorie, fattori di crescita e proteasi, tumori primari impiantati in situ fornire una migliore comprensione e imitare la con più precisione i tumori indotti da agenti chimici o un'iniezione sottocutanea di tumore cellule cancerosa processo. Agenti chimici utilizzati per indurre i tumori possono essere dannosi per i ricercatori e ambiente e sono addirittura vietati in alcuni paesi. A causa dell'assenza di un ambiente di cuscinetto grasso mammario, il progresso patologico di un'iniezione sottocutanea può differire con che nei pazienti di cancro di seno reale, cui il cancro ha origine e irrita da cuscinetto grasso mammario. Gli svantaggi di iniezioni sottocutanee incoraggiano l'uso di Modelli ortotopici per studiare la crescita del tumore. In ricerche precedenti, tumori altamente metastatici di MDA-MB-231, sviluppati dopo sette trapianti ortotopici, indicato l'importanza della posizione iniezione14. Recentemente, l'impianto ortotopico di cellule di cancro al seno in cuscinetto grasso mammario con la chirurgia è stato segnalato15,16. Con l'ambiente di cuscinetto mammario, la crescita del tumore e la migrazione in organi distanti coprire l'intero processo di cancro al seno presso siti patologicamente rilevanti, che rende questo modello una miniatura del progresso delle malattie umane. Tuttavia, dopo l'intervento chirurgico, la pelle tenta automaticamente di guarire se stesso, che può portare il potenziale rischio di interferire con l'origine del cancro di seno normale e falsare i risultati.
Abbiamo confrontato alcuni modelli di cancro al seno e stabilito un modello ortotopico mininvasiva per studiare l'effetto potenziale delle droghe il seno cancro progressione17,18. In questo studio, un protocollo dei video su come orthotopically iniettare cellule di cancro al seno nel cuscinetto grasso mammario in modo semplice, modo meno invasivo è presentato. Questo metodo di iniezione di orthotopic senza chirurgia è vantaggioso in molti modi. In primo luogo, l'operazione è semplice e rapida, circa 1 minuto per topo. In secondo luogo, con i fuochi del tumore primario a partire dai siti proprio patologici, copre il processo intero cancerogeno della progressione del cancro di seno dalla crescita del tumore ad altre metastasi di organi, che fornisce un buon modello animale sperimentale per lo studio della interazione delle cellule del tumore e microambiente tumorale. Inoltre, può essere un valido modello per stimare gli effetti del trattamento in tutte le fasi del cancro al seno. L'obiettivo di questo metodo è quello di fornire un modello animale alla progressione tumorale maximumly materno mimico.
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Protocol
Gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con la fornitura e la raccomandazione generale di legislazione amministrazione cinese animali sperimentali e sono stati approvati dall'Istituto di cura degli animali e uso Comitato di Capital Medical University (Ref no. AEEI-2014-052). Sono stati utilizzati topi Balb/c femmina 6-8 settimane di età.
1. preparazione delle cellule e animali
- Un giorno prima dell'operazione, radersi i capelli intorno ai capezzoli quarto per esporre l'area operativa.
- Usare una mano per tenere saldamente il mouse sul retro per assicurarsi che il mouse non muoversi liberamente, alzare il mouse per esporre la sua pancia per l'operatore e quindi utilizzare un'altra mano per radere il pelo intorno ai capezzoli quarto con un rasoio elettronico.
- Mettere uno strato sottile di rimozione dei capelli crema intorno ai capezzoli per 30-60 s, pulire via la crema con acqua distillata e asciugare il mouse con carta morbida.
- Il giorno dell'operazione, raccogliere le cellule di carcinoma mammario murino (4T1-luc2), contare il numero di cellulare e regolare la densità delle cellule a 2 x 105 cellule/mL in tampone fosfato salino (PBS) in microcentrifuga sterile e tenerli sul ghiaccio. Per ogni mouse, 1 x 104 cellule/50 µ l in una siringa da 1 mL è preparato.
2. Orthotopic iniezione
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Anestesia di topi
- Indurre l'anestesia. Mettere i topi in un contenitore trasparente chiuso e accendere 2% isoflurane gas per anestetizzare i topi per circa 5 minuti, finche ' non mentono tutti e caduta addormentata.
- Mantenere l'anestesia. Trasferire i topi dal contenitore per maschere individuali anestesia, mettere qualche unguento veterinario sui loro occhi per evitare la secchezza, tenere i topi passivamente con i loro capezzoli esposti all'operatore e far loro continuare a inalare gas isoflurano per pochi minuti fino a quando il iniezione è stata eseguita.
- Confermano il successo dell'anestesia dalla mancanza di un riflesso di ritiro pizzico di punta.
- Applicare unguento oftalmico agli occhi dei topi per prevenire la secchezza degli occhi.
Nota: Secondo la dimensione del contenitore e il numero di singoli anestesia maschere disponibili, un gruppo di topi può essere anestetizzato insieme e iniettato uno sotto anestesia individuo.
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Prestazioni dell'iniezione
- Con una mano alla tenda la pelle intorno al capezzolo quarto con le pinzette, per impostare un "tunnel" sollevato per la siringa a seguire. Utilizzare l'altra mano per tenere la siringa con l'ago rivolto verso l'alto per entrare nella pelle per via sottocutanea a 5-10 mm dal capezzolo; quindi, seguire il "tunnel" fino a quando la punta dell'ago si avvicina il capezzolo, spostare con cautela l'ago punta su nel cuscinetto grasso mammario finché non arriva l'occhio dell'ago sotto la punta del capezzolo, scartare le pinzette e iniettare le cellule lentamente.
- Girare un po ' intorno all'ago e ritrarre la siringa lentamente; utilizzare un tampone di cotone per premere l'ago ferita per 10-20 s per assicurarsi che non vi è nessuna infiltrazione di fluidi.
- Osservare il quarto capezzolo per confermare un'iniezione di successo: una sfera piatta trasparente bianca con il capezzolo come il centro può essere osservata (Figura 1).
- Tenere i topi anestetizzati per un altro minuto per evitare che i topi recuperare e spostare troppo in fretta, che farà sì che l'iniezione della ferita per aprire e le cellule del tumore per fuoriuscire.
3. analisi della crescita del tumore e metastasi
Nota: I tumori primari sono identificati come trasparente o bolla-come dossi dopo le iniezioni e come grumi solidi sferiche o ellissoidale con il capezzolo pochi giorni dopo. Crescita del tumore viene valutata dal volume del tumore e bioluminescenza del tumore.
- Per stabilire il volume del tumore, tenere premuto il mouse con una mano. Esporre la sua pancia all'operatore e usare l'altra mano a pinza tumore lunghezza (L) e larghezza (W). Calcolare il volume del tumore (V) come segue.
V = (L x W2) / 2 - Per acquisire la bioluminescenza tumore, iniettare 150mg/kg D-luciferina nuca del mouse, 10 min prima di formazione immagine. Anestetizzare i topi con 2% isoflurane gas per 5 min e trasferirli maschere individuali anestesia per far loro inalare gas isoflurano per più di 5 min. Seguendo le istruzioni del produttore, è possibile catturare immagini di bioluminescenza del tumore primario e metastasi, con tempo di esposizione di auto, binning medie e f/stop a 1.
4. raccolta del tumore primario e metastasi organi per l'analisi
Nota: Quando il conseguimento dello scopo di questo esperimento, o raggiungere l'endpoint humane, il tumore primario può essere raccolto per ulteriore studio. In questo studio, i tumori sono rimossi a 4 a 5 settimane dopo l'iniezione, quando il volume del tumore raggiunge circa 800 mm3. I polmoni vengono rimossi alla settimana 8.
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Raccolta del tumore primario
- Eseguire l'intervento in una cappa sterile di mantenere un'atmosfera sterile. Anestetizzare gli animali da isoflurane. Confermano il successo dell'anestesia dalla mancanza di riflessi di ritiro di punta pizzico. Applicare unguento oftalmico agli occhi dei topi per impedire loro di seccarsi.
- Dissociare il tumore della pelle con le forbici, goccia a goccia antidolorifico (1 mg/mL tramadol, 1 goccia di circa 50 µ l per topo) per alleviare il dolore post-operatorio.
- Cucire la pelle con una sutura chirurgica, tagliare l'eccesso sutura, drappo fuori l'incisione.
- Tagliare il tumore primario nella metà con un bisturi, mettere 1/2 del tumore in paraformaldeide al 4% per ulteriore ematossilina ed eosina (H & E) e immunohistochemistry e congelare immediatamente l'altra 1/2 con azoto liquido per macchiarsi occidentale o un RNA Studio di isolamento più tardi.
- Dopo la sutura, caldo, i topi con una lampada fino a recuperare, mantenere i topi in gabbia singola fino a completamente recuperato. Continuamente amministrare tramadol 10 mg/kg con una sonda gastrica orale per 3 d dopo l'intervento chirurgico.
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Espianto di organi di metastasi
- Eutanasia i topi con una overdose di pentobarbital, aprire i loro forzieri con le forbici, delicatamente prendere fuori i polmoni e lavarli con PBS. Fuochi di metastasi del polmone possono essere identificati come bianco trasparente dossi che sono morfologicamente diverso e distinguibile dal tessuto polmonare normale rosa.
- Mettere i polmoni in paraformaldeide al 4% per verificare la metastasi macchiando di H & E.
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Representative Results
Dopo un'iniezione di successo, una sfera piatta trasparente bianca con il capezzolo come il fuori-superficie rotondo centro possa essere osservato (Figura 1). Crescita del tumore primario può essere misurata dal volume del tumore e tumore vivente delle cellule di bioluminescenza (Figura 2). Sia il volume del tumore e il flusso totale è aumentato durante l'esperimento prima di resezione. In una fase iniziale, non è possibile trovare metastasi perché non è accaduto nessun tumore secondario o i forti segnali bioluminescenti del tumore primario ostruiscono la rilevazione dei fuochi di piccole metastasi con segnali deboli. Dopo resezione, il segnale bioluminescente dai fuochi metastatici di organi distanti possa essere rilevato e analizzato. La morfologia delle sezioni del polmone e il tumore primario del seno sono stati studiati con H & E che macchia, mentre l'angiogenesi è stata studiata dalla macchiatura del tumore con indicatore di nave CD31 di densità del microvessel (MVD) (Figura 3).
Figura 1: foto prima e dopo l'iniezione di orthotopic presso il cuscinetto grasso mammario dei topi femminili di Balb/c. L'operazione è stata eseguita, e le foto sono state scattate mentre i topi erano sotto anestesia isoflurano. A, prima dell'iniezione, B, dopo l'iniezione.
Figura 2: Volume e flusso totale del tumore primario sono stati misurati da 7 giorni dopo l'impianto. L'impianto di sospensione cellulare generato un'aumentata del tumore primaria sia in volume, che è stata visualizzata e determinata utilizzando pinze, flusso totale, che è stata misurata con il sistema dello spettro. La figura mostra bioluminescenti immagini dei tumori primari e metastasi osservata a vari tempi dopo 7 giorno dell'impianto. p/s = fotoni al secondo. Questa figura è stata modificata da Zhang et al. 17. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: analisi dei tumori primari e metastasi del polmone di macchiatura immunohistochemical e macchiatura di H & E. Tessuti sono stati fissati in paraformaldeide al 4%, inclusi in paraffina e macchiati. (A e B) le sezioni sono state colorate con ematossilina ed eosina (H & E). (C e D) sezioni sono state macchiate con anticorpo di antiCD31. Colorazione brunastra indicato CD31 + navi. Pannelli A e C presenti tumore primario del tessuto, pannelli B e D presentano metastasi del polmone. CD = cluster di differenziazione. L'ingrandimento utilizzato = 200 X. La barra della scala = 50 µm. Questa figura è stata modificata da Zhang et al. 17. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Le celle utilizzate in questo studio sono 4T1-luc2, cellule tumorali murine al seno triplo-negativo con etichettatura luciferasi, che sono un utile strumento per investire gli effetti antitumorali e antimetastatic di farmaci a causa della loro natura altamente invasiva2,19 . Luciferasi, stabile per la prossima generazione di cellulari, vengono utilizzati per indicare il tumore di vivere cellule, entrambi presso la ghiandola mammaria e presso altri organi distanti20. In alcuni casi, ipossia e sottoalimentazione all'interno il risultato del tumore in una diminuzione del segnale bioluminescente e il volume del tumore primario non è incoerente con il segnale bioluminescente in una fase successiva della progressione del tumore. La tecnica dell'iniezione cellulare orthotopic (COI) delle sospensioni di cellule può essere eseguita anche con altri seno linee cellulari del cancro, come le cellule umane MDA-MB-231 (dati non pubblicati). In questo studio, con la ghiandola mammaria come suo ambiente, è un modello animale adeguato per studiare il microambiente tumorale, attraversando ne tra cellule tumorali e cellule stromali. Durante lo stato di avanzamento del tumore, in alcuni topi, il capezzolo può ulcerarsi, scab, crescere rosso tessuto di granulazione, appiattire o addirittura scompaiono, analogamente a quanto accade in umani capezzoli durante il cancro al seno. Topi potrebbero verificarsi disturbi con ulcerazioni; occorre un'assistenza umana. Cambiare più capezzolo è stato trovato nei topi utilizzando questa tecnica COI rispetto con la tecnica di chirurgia micro-invasiva. L'impianto chirurgico di orthotopic (SOI) del tessuto istologicamente intatte del tumore umano, confrontato con l'iniezione di orthotopic cellulare (COI) delle sospensioni di cellule, dimostra più alti cancri maligni della vescica, polmone, stomaco, rene e colon21 che imitare ciò che è visto in pazienti22.
Con un'alta incidenza di metastasi, specialmente metastasi del polmone, il modello di cancro mammario murino stabilito in questo studio è un modello di cancro syngeneic buona per esplorare la spontanea migrazione e invasione, confrontato con un modello di metastasi artificiali, come un iniezione della vena della coda. L'attività delle cellule del tumore e caratteri inoltre svolgono i ruoli importanti in metastasi. Altre linee cellulari, ad esempio delle cellule di cancro al seno umano MCF-7, anche impiantato tramite un'iniezione di orthotopic presso il cuscinetto grasso mammario dei topi Balb/c immune-carenti, hanno una bassa capacità metastatica. Con la modifica delle celle o topi, come la sovra-espressione o giù-espressione di un determinato gene, questa tecnologia può essere applicata in più campi di ricerca.
L'operazione cruciale di questa iniezione è spostarsi lentamente e con cautela verso l'alto la punta dell'ago, da sottocutaneo nel cuscinetto grasso mammario. Quando la punta della siringa si avvicina il capezzolo, l'operatore si sentirà insistenza dal tessuto. Poiché la ghiandola del mouse è molto piccola, solo un po' più di pressione è necessario far passare attraverso l'insistenza la punta della siringa. Troppa pressione comporterà la punta passa attraverso la ghiandola e rompere la pelle, che si traduce in un fallimento dell'iniezione. Logaritmico-fase cellule, una sospensione unicellulare, il protocollo di funzionamento standard (SOP) e operatori qualificati sono necessari per ridurre la variazione fra i topi. Comportamento delle cellule tumorali è importante per la formazione e la ripetibilità dei modelli del tumore. Raccogliere le cellule fase logaritmica quando crescono a circa 80% - 90% confluenza; densità troppo bassa o troppo alta delle cellule sarà interferire con il modello di tumore e si traducono in variazioni fra gli esperimenti. La sospensione unicellulare è altresì importante, in quanto cellula raggruppa i risultati in errori di calcolo del numero delle cellule. Tripsina, una soluzione di EDTA o altri metodi appropriati sono stati scelti per staccare le cellule secondo le finalità dell'esperimento e gli obiettivi il ricercatore è interessato a. Dipendente dalla densità di scala e cella di siringa, il volume di iniezione potrebbe variare da 25 a 100 µ l. La quantità di 1 x 104 a 1 x 106 celle viene comunemente utilizzata per irritare la crescita del tumore secondo diversi tipi di cellule. Colorazione blu di trypan è usato per distinguere cellule vitali da quei guasti. Più di 95% attuabilità è considerato come una buona situazione per indurre un tumore rapida crescita e la metastasi in vivo. Questi sono anche adatti per tutti gli altri modelli del tumore durante la preparazione di cellule del tumore. Per correttamente pinza le dimensioni del tumore primario e ottenere un accurato segnale bioluminescente, la pelliccia intorno al capezzolo dovrebbe essere rimosso ancora una volta che ricrescono. Quando il tumore primario si sviluppa ad una grande massa e relativo segnale bioluminescente è troppo forte per i ricercatori di osservare altre metastasi di organo (ad es., metastasi del polmone), coprire con nastro isolante nero prima di bioluminescenza immagini sono prese, o rimuoverlo dal chirurgia. Un antidolorifico può essere utilizzato per dolore post-operatorio.
Inoculazione di successo può provocare la metastasi del polmone: con un tasso di occorrenza di più del 90%, i fuochi metastatici al seno non-iniettato, osso o i linfonodi sono abbastanza comuni, mentre la metastasi celiaca è rara. I tumori secondari sono una massa traslucida e possono essere distinti dai tessuti normali circostanti. Un'applicazione imprecisa dell'iniezione può portare a errori sperimentali in luoghi di dimensioni e la forma e la metastasi del tumore. Eventuali perdite dalla sfera piatta dopo l'iniezione per ridurre le dimensioni del tumore, fuoriuscite dalla ghiandola mammaria nel "tunnel" si tradurrà in un tumore lunga cilindrico che ostruirà la determinazione del volume del tumore quando utilizziamo un calibro a corsoio digitale per misurarlo. Le iniezioni sottocutanee intorno cuscinetto grasso mammario raramente portano a metastasi del polmone e non sono adatte per lo studio associato a metastasi distante. Per rendere stabile l'inoculazione e ridurre il rischio di perdite, Matrigel può essere utilizzato quando la sospensione di cellule del tumore. Tuttavia, Matrigel non è un singolo solvente, è considerato come una sorta di matrice extracellulare (ECM) e alcuni tipi di gel contengono anche i fattori che possono interferire con gli esperimenti. Nell'esperimento finalizzato al microambiente tumorale, ECM, attraversando parlando tra le cellule del tumore o con cellule stromali, è preferibile evitare l'uso di Matrigel. Per cellule iniettate con la luciferasi tag D-luciferina, il substrato della luciferasi è iniettato per associare i vivi le cellule del tumore nei topi. In questo studio, le dinamiche della bioluminescenza in vivo ha suggerito che a 10 minuti dopo l'iniezione di D-luciferina, il segnale bioluminescente raggiungere il picco e può essere stabile per circa 10-15 minuti (che varia tra diversi topi), se con un l'iniezione intraperitoneale o un'iniezione sottocutanea. Considerando che il farmaco testato viene iniettato intraperitonealmente, per evitare l'interazione del farmaco testato con D-luciferina e per ridurre l'irritazione peritoneale, un'iniezione sottocutanea è suggerita.
In conclusione, l'iniezione di orthotopic delle cellule di cancro al seno descritte in questa carta è uno strumento molto utile e potente nello studiare la patologia e la progressione del cancro al seno. È facile da gestire e può essere eseguito rapidamente. Il tumore primario ha origine presso la ghiandola mammaria con un alto avvenimento della metastasi, che maximumly imita il processo patofisiologico di carcinoma del seno umano.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Gli autori vorrei ringraziare National Natural Science Foundation of China (grant n. 81873111, 81673924, 81774039, 81503517), la Fondazione di scienze naturali di Pechino (grant n. 7172095, 7162084, 7162083) e la Fondazione di Xia Xu dell'ospedale di Pechino Medicina tradizionale cinese (concedere no, xx201701). Ringraziamo Liu Chang-Zhen, Prof., Experimental Research Center, Cina Accademia delle scienze mediche cinese, per immagini bioluminescenti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anesthesia machine | Midmark Corporation, Dayton, OH, USA | Matrx VMS | anesthesia |
| In-Vivo Imaging System | PerkinElmer | IVIS Spectrum | used for bioluminescence detecion |
| isoflurane | Hebei yipin chemical reagents company | O21400 | anesthesia |
| 1 ml syringe | Becton,Dickinson and Company | A257 | cell injection |
| digital caliper | Shang Hai Shen Han Measuring Tools Co., Ltd. | S-H | volume measurement |
| tramadol | Mundipharma company | - | pain killer |
| D-luciferin | Gold Biotechnology Inc. | LUCK-1G | used for bioluminescence detecion |
| The primary antibody against cluster of differentiation (CD) 31 | Abcam | ab28364 | used for MVD detection |
| hematoxylin and eosin staining kit | Beijing Zhong Shan Jinqiao Biotechnology Co., Ltd. | ZLI-9615 | histology |
| hair removal cream | Veet | - | hair removal cream |
| Carbomer Eye Gel | Dr.GerhardMannChem-Pharm.FabrikGmbH | - | ophthalmic ointment |
| sewing needle | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. | 17U0302J | suture |
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