Summary
ここでは、侵襲性、ハンドル簡単方法は、以下の単純な乳腺の脂肪パッドに乳がん細胞を注入するためのプロトコルを提案して適切な乳腺脂肪パッド環境とこのマウス実験乳房のがんモデルはの様々 な側面を調査する使用ことができます。がん。
Abstract
適切な動物モデルは、疾患の理解を深めるために重要です。動物(皮下注射、異種移植片、遺伝子操作、化学試薬誘導等)別の方法で確立されたモデルは、様々 な病的な文字の特定の側面の調査に重要な役割を果たす病気。単一のモデル模倣することが全くない全体の人間の病気の進行、病気を理解し、潜在的な薬剤のスクリーニングでかけがえのない役割を果たす適切な間質環境と同所性同種臓器疾患モデル。この記事では単純なより少ない侵襲型とハンドル簡単方法で乳腺の脂肪パッドに乳がん細胞を注入し、遠隔臓器に転移に従う方法をについて説明します。原発腫瘍の成長、乳房と乳首の病理学的変化の適切な機能と他の臓器の転移の頻度が高い、このモデルのキャビンはひと乳癌進行を模倣します。原発腫瘍の成長その場観察、長い遠隔転移、乳癌の腫瘍微小環境は、このモデルを使用して調べることができます。
Introduction
乳がんは、世界中の女性の死亡率の主要な原因です。その徐々 に増加率で乳癌公衆衛生1深刻な課題となっています。マウス癌モデルの臨床および臨床研究の良い架け橋、良い模倣マウス疾患モデルが病気や薬に関する研究の精度を向上させます。
原発腫瘍の成長は、転移と合併症死と癌患者のほとんどで貧しい生活資質の主な原因では、悪性疾患の進行状況を開始します。いくつかのマウス モデルはひと乳癌癌2,3,4の病理学を模倣する使用されます。異種移植モデル用画面薬、病理学的文字を理解する癌研究のための安全性と有効性5,6,7。遺伝子組み換えマウス (宝石) は、特定の遺伝子または腫瘍のサプレッサー遺伝子8対象にひと乳癌を模倣するように生成されます。宝石癌進行の遺伝子の役割を理解する比較的単純な制服を着た背景があります。ただし、人工環境と背景が転移の病理学の調査に限られた治療9等。ひと癌細胞人間の病理学的機能とすることができますのみに注入される免疫不全マウスと腫瘍ホストの免疫の相互作用の不全が偏った結果10につながる可能性があります。
病気11,12,13の生物学的および病理学的文字に直接影響している固形腫瘍が開始されます。癌の進行状況は、腫瘍細胞、間質細胞、免疫細胞、炎症細胞、成長因子、およびプロテアーゼ間の相互作用の複雑な結果は、上皮内腫瘍移植よりよい洞察力を提供する、模倣、癌プロセスは化学薬品または皮下腫瘍による腫瘍よりもより正確に細胞します。腫瘍を誘発する化学薬品は、研究者や環境に有害な場合があり、さらにいくつかの国で禁止されます。乳腺の脂肪パッド環境の不在のため皮下注射の病理学的進行状況は、実際の乳がん患者でが、がん発生し、乳腺の脂肪パッドから刺激すると異なる場合があります。皮下注射の欠点は、腫瘍の成長を研究する直交異方性モデルの使用をお勧めします。以前の研究では、7 つの同所性同種移植後開発、転移性の高い MDA MB 231 腫瘍は、注入場所14の重要性を示されます。最近では、手術で乳腺脂肪パッドに乳癌細胞の同所性同種移植報告15,16歳だった。乳腺パッド環境、腫瘍成長と病理関連サイトで乳がんの遠隔臓器カバー全体のプロセスに移行、ミニチュアの人間の病気の進行状況をこのモデルになります。ただし、手術後皮膚は自動的に通常の乳房癌発生との干渉の潜在的なリスクをもたらす可能性があります、結果をバイアス自体を癒すためにされます。
いくつかの乳房癌モデルを比較し、乳房癌進行17,18日薬の潜在的な影響を調査するための低侵襲の実験モデルを確立しました。この研究では、がんについてビデオ プロトコル シンプルで乳腺の脂肪パッドに乳癌細胞を注入、少ない侵襲的方法を提示します。手術をせずこの同所性同種注入法は多くの方法で有利であります。まず、操作が簡便・迅速なマウス当たり約 1 分です。第二に、原発巣は右病理学的サイトから始まる、全体性を研究するため実験動物モデルの良いを提供しています他の臓器転移腫瘍の成長から乳癌進行過程をカバー、腫瘍細胞と腫瘍微小環境との相互作用。その上、乳房癌のすべての段階で治療の効果を推定するための貴重なモデルをすることができますそれ。このメソッドの目的は、キャビンの模倣ひと乳癌進行する動物モデルを提供することです。
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Protocol
動物実験規定および中国の実験動物管理法の一般的な推奨事項に従って実施され、動物医療の機関と使用首都医科大学委員会によって承認されました (Ref ないです。AEEI-2014-052)。6 〜 8 週間を高齢者女性の Balb/c マウスが使用されました。
1. 細胞や動物の準備
- 操作の前に 1 日は、動作領域を公開する 4 番目の乳首の周りの毛を剃る。
- マウスがないに自由に移動、オペレーターにその腹を公開するのにマウスを上げるし、[別の手を使って電子シェーバーと 4 番目の乳首周りの毛を剃るように背中でしっかりとマウスを保持するのに 1 つの手を使用します。
- 30-60 s の乳首の周りの毛の取り外しの薄層をクリーム入れて、蒸留水、クリームを離れてきれいにし、柔らかい紙を使って、マウスを乾燥します。
- 操作の日、マウス乳癌細胞 (4T1-luc2) を収集、セル数をカウントして滅菌マイクロ遠心チューブ用の 2 × 105セル/ml リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) に細胞の密度を調整する氷のそれらを保ちます。各マウス用 1 mL シリンジで 1 × 104セル/50 μ L を用意しています。
2. 同所性同種注入
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マウスの麻酔
- 麻酔を誘導します。透明な密閉容器にマウスを置くし、眠っている彼らはすべて横になるまで、約 5 分間マウスを麻酔する 2% イソフルラン ガスと秋をオンにします。
- 麻酔を維持します。個々 の麻酔マスクにコンテナーからマウスを転送、乾燥を避けるため、オペレーターに露出、乳首付け葉末マウスを飼うために彼らの目にいくつかの獣医軟膏を配置してまで数分のイソフルラン麻酔ガスを吸入し続けるように、注入が行われています。
- つま先ピンチ逃避反射の欠如によって麻酔の成功を確認します。
- 目の乾燥を防ぐためにマウスの目に眼軟膏を適用します。
注: コンテナーのサイズと利用可能な個々 の麻酔マスクの数によるとマウスのグループは一緒に麻酔することができます、一つずつ個々 の麻酔注入します。
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インジェクションの性能
- 4 乳首の周りに注射器の高揚「トンネル」を設定する、ピンセットで皮膚をテントに 1 つの手を使用します。胸チラ; から 5-10 の mm の皮下皮膚を入力するが上向きになって針で注射器を保持するために他の手を使用してください。その後、針の先端が乳首に近いものまで、「トンネル」に従います、乳首先端の下、ピンセットを破棄し、セルをゆっくり注入針の目が来るまで針が乳腺の脂肪パッドにヒント慎重に移動します。
- 針を少し好転し、ゆっくりと注射器を撤回綿棒を使ってすると、傷の流体の浸透がないことを確認する 10-20 秒の針を押します。
- 成功した注入を確認する第 4 ニップルを観察: 中心として乳首の 1 つ白い透明フラット球が見られる (図 1)。
- マウス マウスを回復し、傷を開く注射原因となりますあまりにも速く移動させることを避けるために別の分の麻酔と漏れに腫瘍細胞を保ちます。
3. 腫瘍の増殖と転移の解析
注: 原発腫瘍識別されますした後に、透明またはブリスターのようなバンプとは球形または楕円体の固体塊として乳首、数日後。腫瘍の成長は、腫瘍と腫瘍生物発光によって評価されます。
- 腫瘍体積を確立するには、片方の手でマウスを保持します。オペレーターにその腹を公開し、腫瘍の長さ (L)、幅 (W) のキャリパーに他の手を使用します。腫瘍体積 (V) を次のように計算します。
V = (W2x L)/2 - 腫瘍生物発光をキャプチャするには、画像の前に 10 分、マウスの首の背面にある D-ルシフェリンを 150 mg/kg を注入します。5 分 2% イソフルラン麻酔ガスを持つマウスを麻酔し、5 分長いのイソフルラン麻酔ガスを吸入できるようにする個々 の麻酔マスクにそれらを転送します。製造元の指示に従って、1、原発巣と転移、自動露光時間、中ビンと f/停止の発光画像をキャプチャします。
4. 原発腫瘍および転移臓器の分析のための収穫
注: この実験または人道的エンドポイントに到達の目的を達成するには、原発腫瘍がさらなる研究に収穫できます。本研究では、腫瘍は、腫瘍体積約 800 mm3に達すると注入後 4 ~ 5 週間に削除されます。肺は、8 週目に削除されます。
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原発腫瘍の収穫
- 滅菌の雰囲気を維持するために無菌フードで手術を行います。イソフルランによる動物を麻酔します。つま先ピンチ撤退反射の欠如によって麻酔の成功を確認します。乾燥を防ぐためにマウスの目に眼軟膏を適用します。
- 術後の痛みを和らげるためにはさみ、滴状鎮痛剤 (1 mg/mL トラマドール、約 50 μ L/マウスの 1 滴) で皮膚から腫瘍を切り離して考えます。
- 手術用の縫合糸で皮膚をステッチ、余分な縫合糸を切断、切開をドレープします。
- 原発腫瘍はメスの半分にカット、腫瘍の 1/2 を入れてさらにヘマトキシリンとエオシン (H & E) 染色、免疫組織化学の 4% パラホルムアルデヒド、他 1/2 ウェスタンブロッティング用液体窒素または RNA をすぐにフリーズ分離後の研究。
- 縫合後、彼らが回復するまでランプとマウスを暖かい完全に回復まで 1 つのケージでマウスを維持します。手術後 10 mg/kg で 3 d の経口トラマドールを継続的に管理します。
-
転移臓器の収穫
- ペントバルビ タールの過剰摂取とマウスを安楽死させる、ハサミで胸を開く、軽く肺を取り出し、PBS で洗浄します。ホワイト透明バンプ形態別、通常ピンク肺組織から区別として、肺転移巣を識別できます。
- H & E 染色して転移を確認する 4% パラホルムアルデヒドに肺を置きます。
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Representative Results
成功した注入として乳首の 1 つ白い透明フラット球後、外表面のラウンド センター (図 1) を観察することができます。腫瘍容積と生きている腫瘍で原発腫瘍の成長を測定ことができるセルの発光 (図 2)。腫瘍体積と全光束は、切除前に実験中に増加。初期段階で二次腫瘍はなかったがあったり、原発腫瘍の強力な発光信号妨害微弱な信号と小さな転移巣の検出、転移を検出できません。術後では、遠隔臓器転移巣から発光信号を検出し、分析することができます。微小血管密度 (MVD) (図 3) の容器マーカー CD31 と腫瘍の汚損によって血管新生を調べた中乳癌腫瘍と肺セクションの両方の形態を H & E 染色で調べた。
図 1: 女性の Balb/c マウスの乳腺の脂肪パッドで同所性同種注入前後の写真です。操作が実行されたとイソフルラン麻酔下マウスがあった間、写真が撮影されました。A B、 .の注入後投与前に、
図 2: ボリュームと原発腫瘍の全光束は移植後 7 日から測定した。細胞懸濁液の注入は、ボリュームに描出し、ノギスを使用して決定とスペクトル システムで測定した全光束の両方増加原発腫瘍を生成されます。原発性腫瘍と転移移植 7 日後様々 な時点で観測された発光イメージを図に示します。p/s = 光子/秒します。この図は、張らから変更されています。17.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: H & E 染色と免疫染色の原発腫瘍と肺転移の解析。組織された 4% パラホルムアルデヒドで固定、パラフィンに埋め込まれ、ステンド グラスします。(AとB) のセクションは、ヘマトキシリンとエオシン (H & E) に染まっていた。(CとD) のセクションは antiCD31 抗体で染色しました。茶色の染色には、CD31 + 船が示されます。パネルAとC現在原発腫瘍組織、 BとDのパネルは肺転移を提示します。CD = 分化のクラスター。使用倍率 200 倍を =。スケールバー = 50 μ m。この図は、張らから変更されています。17.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
本研究で使用される細胞は 4T1-luc2 のための非常に侵略的性質2,19 薬剤の抗腫瘍および抗転移効果を投資のための有用なツールであるルシフェラーゼ付けマウスのトリプル ネガティブ乳がんの癌細胞.ルシフェラーゼ、携帯世代に安定を使用して示しますリビング腫瘍細胞、乳腺、その他の遠隔臓器20両方。いくつかのケースで低酸素と栄養の欠乏、発光信号と原発腫瘍量の減少で腫瘍の結果内で矛盾はない発光信号と腫瘍の進行の後の段階で。細胞懸濁液の細胞同所性同種注入 (COI) の技術は、その他乳房癌細胞、ひと細胞 MDA MB 231 など (未発表データ) と実行できます。腫瘍微小環境の研究に適切な動物モデルはその環境として乳腺と、本研究では腫瘍細胞と間質細胞と話を横断します。マウスによっては、腫瘍の進行中に乳首癌腫、かさぶた、赤い肉芽組織を成長、平ら、したりも消える、乳がんの中に人間の乳首で何が起こるかに似ています。マウス潰瘍; と不快感が生じる動物愛護を注意する必要があります。乳首その他の変更よりこのコイ方式マイクロ侵襲手術法を用いたマウスで発見されています。21膀胱や肺、胃、腎臓、結腸細胞懸濁液の細胞同所性同種注入 (COI) と比較して、組織学的にそのままひと腫瘍組織の外科的同所性同種移植 (SOI) 高悪性癌を示します患者22で見られるものを模倣します。
本研究でマウス乳癌癌モデルは自発的な移行とよう人工転移モデルと比較して侵略を探索する良い同系がんモデルで転移、特に肺転移の発生率が高いと、尾静脈注射。腫瘍細胞の活動と文字も転移において重要な役割を果たします。他の細胞、ひと乳癌細胞 MCF 7、免疫欠損 Balb/c マウスの乳腺の脂肪パッドで同所性同種注入も注入など低い転移能力があります。細胞やマウス、過剰発現など特定の遺伝子のダウン式の変更この技術をより多くの分野に適用できます。
この注射の重要な操作は、乳腺の脂肪パッドに皮下から針の先端を丁寧にゆっくりと移動することです。シリンジの先端に乳頭の近くになったら、オペレーターは組織からの主張を感じる。マウス腺が非常に小さいので、シリンジの先端を主張を通過させるだけは少しより多くの圧力が必要です。あまりにも多くの圧力は、腺を通過し、注入の失敗に起因する皮膚を破ってのヒントになります。対数期の細胞、単一細胞懸濁液、標準的なプロトコル (SOP)、熟練オペレーターがすべてマウスの間で変動を減らすために必要です。腫瘍細胞の挙動は、形成および腫瘍モデルの再現性が重要です。約 80%-90% に拡大したとき、対数期の細胞を収穫合流;低すぎるか高すぎるセル密度が腫瘍モデルを妨げると実験間のバリエーション。単一細胞懸濁液は、細胞塊の細胞数の誤算の結果からも重要です。実験目的に応じて細胞をデタッチするトリプシン、EDTA ソリューションまたはその他の適切な方法を選択し、ターゲット研究者に興味があります。シリンジの縮尺とセルの密度に依存して、注入量は 100 μ L に 25 から変わることができます。1 x 10 の6セルに 1 x 10 の4の量は、異なる種類の細胞によって腫瘍の成長を刺激する使用されます。トリパン ブルー染色は、死んだ物から実行可能なセルを区別するために使用されます。以上の 95% の細胞生存率は、急速な腫瘍の増殖と転移生体内で誘導するために良い状況とみなされます。腫瘍細胞を準備するとき他の腫瘍モデルに適しています。それが戻って成長したら正しく原発腫瘍サイズをキャリパーと正確な発光信号を得る、乳首周りの毛もう一度削除必要があります。主な腫瘍の成長は大きい固まりに発光信号が強すぎて他の臓器転移 (例えば、肺転移) を観察する研究者と、それをカバー黒い電気テープで発光画像撮影、またはそれを削除前に手術。鎮痛剤は、手術後の痛みに使用できます。
成功接種することができます肺転移の結果: 腹腔転移はまれですが 90% 以上の出現率、非注入乳や骨、リンパ節に転移が非常に一般的です。二次性腫瘍は半透明の質量を周辺の正常組織と区別することができます。注射の不正確な適用は腫瘍のサイズ、形状、および転移の場所に実験誤差につながります。フラットの球後注射腫瘍サイズが小さくなりますから漏れ、「トンネル」に乳腺から漏洩するデジタル ノギスを使用して腫瘍体積の定量を妨害する長い円筒状の腫瘍になりますそれを測定します。乳腺の脂肪パッドの周りの皮下注射はほとんど肺転移につながるし、遠隔転移関連研究には適していません。接種を安定させるして漏れのリスクを軽減するには、腫瘍細胞を停止する際、マトリゲルを使用できます。しかし、マトリゲルが単一溶剤ではない、それは細胞外マトリックス (ECM) の一種とみなされる、ゲルの種類によっても実験を妨げる因子が存在します。実験でマトリゲルを使用しないようにお勧め腫瘍微小環境、ECM、腫瘍細胞や間質細胞と話を横断を目指した。ルシフェラーゼの基板は生活をバインドする注入のルシフェラーゼと注入された細胞は、D-ルシフェリンをタグ、マウスの腫瘍細胞。この研究では、生体内の生物発光のダイナミクス示唆 D-ルシフェリン注射後 10 分で発光信号のピークに達するし、は、安定した (別のマウス間で変化)、約 10-15 分のためかどうかで、腹腔内投与または皮下注射します。D-ルシフェリンとテストされた薬の相互作用を避けるために、腹膜の炎症を軽減する腹腔内、テスト薬を注入を考慮した皮下注射が示唆されました。
結論として、この記事で概説した乳癌細胞の同所性同種注入は病理学と乳がんの進行の勉強に非常に便利で強力なツールです。それは簡単に処理し、迅速に実行することができます。原発腫瘍は最大限人間の乳腺癌の病態生理学的プロセスを模倣した転移の発生が高い乳腺で起きる。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
著者は中国の国家自然科学基金 (グラント号 81873111、81673924、81774039、81503517) を感謝したい北京自然科学財団 (グラント号 7172095、7162084、7162083) との北京病院の徐夏財団伝統的な中国医学 (付与なし、xx201701)。中国医学専攻、生物発光イメージの実験的研究センター、中国アカデミーの教授張鎮劉に感謝いたします。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anesthesia machine | Midmark Corporation, Dayton, OH, USA | Matrx VMS | anesthesia |
| In-Vivo Imaging System | PerkinElmer | IVIS Spectrum | used for bioluminescence detecion |
| isoflurane | Hebei yipin chemical reagents company | O21400 | anesthesia |
| 1 ml syringe | Becton,Dickinson and Company | A257 | cell injection |
| digital caliper | Shang Hai Shen Han Measuring Tools Co., Ltd. | S-H | volume measurement |
| tramadol | Mundipharma company | - | pain killer |
| D-luciferin | Gold Biotechnology Inc. | LUCK-1G | used for bioluminescence detecion |
| The primary antibody against cluster of differentiation (CD) 31 | Abcam | ab28364 | used for MVD detection |
| hematoxylin and eosin staining kit | Beijing Zhong Shan Jinqiao Biotechnology Co., Ltd. | ZLI-9615 | histology |
| hair removal cream | Veet | - | hair removal cream |
| Carbomer Eye Gel | Dr.GerhardMannChem-Pharm.FabrikGmbH | - | ophthalmic ointment |
| sewing needle | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. | 17U0302J | suture |
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