Summary
Aquí, presentamos un protocolo para implantar las células de cáncer de mama en la almohadilla de grasa mamaria de manera sencilla, menos forma invasiva y fácil de manejar, y este modelo Murino ortotópico mama cáncer con un entorno de almohadilla de grasa mamaria adecuada puede utilizarse para investigar diversos aspectos de la cáncer.
Abstract
Un modelo animal adecuado es crucial para una mejor comprensión de las enfermedades. Animal modelos establecidos por diferentes métodos (inyecciones subcutáneas, xenoinjertos, manipulación genética, inducción de reactivos químicos, etc.) tienen varios caracteres patológicos y desempeñar un papel importante en la investigación de ciertos aspectos de enfermedades. Aunque no hay un modelo único puede mímico totalmente la progresión de la enfermedad humana toda, modelos de enfermedad de órganos ortotópico con un adecuado ambiente estromal juegan un papel insustituible en la comprensión de enfermedades y detección de posibles fármacos. En este artículo describimos cómo implantar las células de cáncer de mama en la almohadilla de grasa mamaria de manera sencilla, menos manera invasiva y fácil de manejar y siga la metástasis a órganos distantes. Con las características adecuadas de crecimiento del tumor primario, la mama y cambios patológicos en el pezón y una alta ocurrencia de metástasis de otros órganos, este modelo máximo imita la progresión del cáncer de mama humano. Crecimiento de tumor primario en situ, metástasis a larga distancia y el microambiente tumoral de cáncer de mama pueden ser investigados utilizando este modelo.
Introduction
Cáncer de mama es la principal causa de mortalidad femenina en todo el mundo. Con su incidencia progresivamente creciente, el cáncer de mama se ha convertido en un serio desafío para la salud pública1. Modelos murinos de cáncer son buenos puentes entre los estudios clínicos y preclínicos, y un modelo de buena mímica enfermedad murina aumentará la exactitud de la investigación sobre la enfermedad y la medicina.
El crecimiento del tumor primario inicia el progreso de la enfermedad maligna, metástasis y complicaciones son las principales causas de muerte y pobre vida en pacientes con cáncer la mayoría. Varios modelos murinos se utilizan para imitar la patología del cáncer de mama humano2,3,4. Modelos de xenoinjerto son ampliamente utilizados para el estudio de cáncer para entender los caracteres patológicos y a las drogas de la pantalla para la seguridad y eficacia5,6,7. Se generan ratones transgénicos (GEM) para imitar el cáncer de mama humano dirigiéndose a ciertos oncogenes o tumor supresor genes8. Gema tiene un fondo relativamente simple y uniforme para entender el papel de los genes cancerosos progreso; sin embargo, el ambiente artificial y el fondo se limitan a investigar la patología de la metástasis y terapias9. Las células cancerosas humanas, aunque con rasgos patológicos humanos, pueden solamente ser implantadas en ratones inmune deficiente, y la insuficiencia de la interacción inmune tumor-anfitrión puede conducir a resultados sesgados10.
Donde inicia el tumor sólido tiene una influencia directa en los caracteres biológicos y patológicos de la enfermedad11,12,13. Puesto que se cancerosos progreso es el resultado complejo de las interacciones entre las células tumorales, células estromales, células de Inmunología, células inflamatorias, factores de crecimiento y proteasas, tumores primarios implantados en situ proporcionará mejor comprensión e imitar el proceso canceroso, con mayor precisión que los tumores inducidos por agentes químicos o una inyección subcutánea de tumor células. Agentes químicos utilizados para inducir tumores pueden ser perjudiciales para los investigadores y el medio ambiente y están incluso prohibidos en algunos países. Debido a la ausencia de un entorno de almohadilla de grasa mamaria, puede ser diferente con la evolución patológica de una inyección subcutánea que en pacientes con cáncer de mama real, cuyo cáncer origina e irrita de la almohadilla de grasa mamaria. Las desventajas de las inyecciones subcutáneas estimulan el uso de modelos de orthotopic para el estudio de crecimiento del tumor. En investigaciones anteriores, altamente metastásicos tumores MDA-MB-231, desarrollados después de siete trasplantes ortotópico, indican la importancia de la ubicación de inyección14. Recientemente, la implantación ortotópica de las células de cáncer de mama en la almohadilla de grasa mamaria con cirugía fue reportado15,16. Con el medio ambiente botón mamario, el crecimiento del tumor y la migración hacia órganos distantes cubierta todo el proceso del cáncer de mama en sitios de interés patológico, que hace de este modelo una miniatura de la evolución de las enfermedades humanas. Sin embargo, después de la cirugía, la piel automáticamente trata de curarse a sí mismo, que puede traer el riesgo potencial de interferir con el origen del cáncer de mama normal y sesgar los resultados.
Hemos comparado algunos modelos de cáncer de mama y estableció un modelo ortotópico mínimamente invasivo para investigar el efecto potencial de fármacos en cáncer de mama progresión17,18. En este estudio, un protocolo de vídeo sobre cómo orthotopically inyectar las células de cáncer de mama en la almohadilla de grasa mamaria de manera sencilla, se presenta menos forma invasiva. Este método de inyección de orthotopic sin cirugía es ventajoso en muchos aspectos. En primer lugar, la operación es simple y rápida, aproximadamente 1 minuto por ratón. En segundo lugar, con los focos del tumor primario a partir de los sitios patológicos derecha, abarca el proceso entero tumorigenic de progresión del cáncer de mama desde el crecimiento del tumor a la metástasis de otros órganos, que proporciona un buen modelo animal experimental para el estudio de la interacción de las células tumorales y el microambiente tumoral. Además, puede ser un valioso modelo para estimar los efectos del tratamiento en todas las etapas del cáncer de mama. El objetivo de este método es proporcionar un modelo animal para la progresión del cáncer de mama humano imitan máximo.
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Protocol
Los experimentos con animales se realizaron según la prestación y la Recomendación General de legislación de administración Animal Experimental China y fueron aprobados por la institución de cuidado de animales y uso Comité Capital médica de la Universidad de (Ref no. AEEI-2014-052). Se utilizaron ratones de Balb/c hembras de 6 a 8 semanas de edad.
1. preparación de las células y animales
- Un día antes de la operación, afeitar el pelo alrededor de los pezones cuarto para exponer el área de operaciones.
- Use una mano para sostener firmemente el ratón en la parte posterior para asegurarse de que el ratón no se mueven libremente, gire el ratón para exponer su vientre al operador y luego utilizar otra mano para afeitar el pelo alrededor de los pezones cuarta con una afeitadora electrónica.
- Poner una capa fina de depilación crema alrededor de los pezones para 30-60 s, limpiar la crema con agua destilada y seque el ratón con papel suave.
- En el día de la operación, recoger las células de cáncer de mama murino (4T1-luc2), contar el número de celular y ajustar la densidad celular a 2 x 105 células/mL en tampón fosfato salino (PBS) en tubos de microcentrífuga estéril y mantener en hielo. Para cada ratón, 1 x 104 células/50 μL en una jeringa de 1 mL está preparado.
2. ortotópico inyección
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Anestesia de los ratones
- Inducir la anestesia. Pusieron los ratones en un envase transparente cerrado y encender gas isoflurano 2% para anestesiar los ratones durante unos 5 minutos, hasta que se acueste y caída dormida.
- Mantener la anestesia. Transferencia de los ratones del envase a las máscaras de anestesia individuales, poner un ungüento veterinario en sus ojos para evitar la sequedad, mantener los ratones abúlicamente con sus pezones expuestos al operador y que continúe inhalando gas isoflurano durante unos minutos hasta que la la inyección se ha realizado.
- Confirman el éxito de la anestesia por la falta de un reflejo de retirada de pellizco del dedo del pie.
- Aplicar ungüento oftálmico en los ojos de los ratones para evitar la sequedad del ojo.
Nota: Según el tamaño del envase y el número de máscaras de anestesia individuales disponibles, un grupo de ratones puede ser anestesiado juntos e inyecta uno por uno bajo anestesia individual.
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Rendimiento de la inyección
- Use una mano para tienda de la piel alrededor del pezón cuarto con pinzas, crear un "túnel" alto de la jeringa a seguir. Use la otra mano para sostener la jeringa con la aguja hacia arriba para entrar en la piel por vía subcutánea 5-10 mm de la boquilla; entonces, siga el "túnel" hasta que la punta de la aguja cerca de la entrerrosca, mueva con cuidado la aguja inclina encima en la almohadilla de grasa mamaria hasta el ojo de la aguja viene debajo de la punta del pezón, deseche las pinzas e inyectar las células lentamente.
- Gire alrededor de la aguja un poco y retraiga la jeringa lentamente; Use un hisopo de algodón para presionar la aguja por 10-20 s para asegurarse de que no hay ninguna filtración de líquido de la herida.
- Observar el cuarto pezón para confirmar una inyección exitosa: una esfera plana transparente blanco con el pezón el centro puede observarse (figura 1).
- Mantener los ratones anestesiados por un minuto evitar que los ratones recuperar y mover demasiado rápido, que hará que la inyección para abrir la herida y las células del tumor se escape hacia fuera.
3. análisis del crecimiento tumoral y metástasis
Nota: Los tumores primarios se identifican como transparentes o ampolla-como golpes después de las inyecciones y como tumores sólidos esféricos o elipsoidales con el pezón unos días más tarde. El crecimiento del tumor se evalúa por el volumen del tumor y bioluminiscencia de tumor.
- Para establecer el volumen del tumor, sujete el mouse con una mano. Exponer su vientre al operador y con la otra pinza el tumor largo (L) y ancho (W). Calcular el volumen del tumor (V) como sigue.
V = (L x W2) / 2 - Para capturar la bioluminiscencia de tumor, inyectar 150 mg/kg D luciferin en nuca de ratón, 10 minutos antes de la proyección de imagen. Anestesiar los ratones con gas de isoflurano de 2% por 5 min y transferir a las máscaras de anestesia individuales para hacerles inhalar gas isoflurano durante 5 minutos más. Siguiendo las instrucciones del fabricante, capturar imágenes de bioluminiscencia del tumor primario y metástasis, con tiempo de exposición auto, medio binning y f/stop en 1.
4. recolección del Tumor primario y metástasis órganos para análisis
Nota: Cuando alcanzar el propósito de este experimento, o llegar a la meta humana, el tumor primario puede ser cosechado para continuar los estudios. En este estudio, los tumores se extirpan en 4 a 5 semanas después de la inyección, cuando el volumen del tumor llega a unos 800 mm3. Los pulmones se quitan en la semana 8.
-
Cosecha del tumor primario
- Realizar la cirugía en una campana estéril para mantener un ambiente estéril. Anestesiar los animales por isoflurano. Confirman el éxito de la anestesia por la falta de reflejos de retirada de pellizco del dedo del pie. Aplicar ungüento oftálmico en los ojos de los ratones para evitar que se sequen.
- Disociar el tumor de la piel con las tijeras, gota a gota analgésicos (tramadol 1 mg/mL, 1 gota de 50 μL por ratón) para aliviar el dolor postoperatorio.
- La piel con una sutura quirúrgica de la puntada, corte exceso sutura, cuelgue fuera de la incisión.
- Cortar el tumor primario en medio con un bisturí, poner 1/2 del tumor en paraformaldehído al 4% para otros hematoxilina y eosina (H & E) tinción e immunohistochemistry y congelar inmediatamente el 1/2 con nitrógeno líquido para borrar occidental o un ARN estudio de aislamiento más adelante.
- Después de la sutura, caliente los ratones con una lámpara hasta que se recuperen, mantener los ratones en jaulas individuales hasta que se recuperó completamente. Continuamente, administrar 10 mg/kg tramadol con un oral por sonda nasogástrica para 3 d después de la cirugía.
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Cosecha de órganos de metástasis
- Eutanasia a los ratones con una sobredosis de pentobarbital, abrir sus cofres con tijeras, suavemente sacar los pulmones y lavar con PBS. Focos de metástasis de pulmón pueden ser identificados como blanco transparente protuberancias que son morfológicamente diferentes y distinguibles del tejido pulmonar normal de color rosa.
- Poner los pulmones en paraformaldehído al 4% para verificar la metástasis mediante tinción H & E.
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Representative Results
Después de una inyección exitosa, una esfera plana transparente blanco con el pezón como la hacia fuera-de la superficie todo el centro puede observarse (figura 1). El crecimiento del tumor primario puede medirse por el volumen del tumor y el tumor de la vida celular bioluminiscencia (figura 2). El volumen del tumor y el flujo total aumentaron durante el experimento antes de la resección. En una etapa temprana, la metástasis no se encuentra porque no ha sucedido ningún tumor secundario o las fuertes señales bioluminiscentes del tumor primario obstruyan la detección de focos de metástasis pequeñas con señales débiles. Después de la resección, la señal bioluminiscente de los focos metastáticos de órganos distantes puede ser detectada y analizada. La morfología del tumor primario de mama y las secciones de pulmón fueron estudiados con tinción H & E, mientras que la angiogénesis fue investigada por tinción del tumor con marcador CD31 de buque para la densidad de microvasos (MVD) (figura 3).
Figura 1: fotos antes y después de la inyección de orthotopic en la almohadilla de grasa mamaria de ratones Balb/c mujer. La operación fue realizada, y las fotos fueron tomadas mientras que los ratones estaban bajo anestesia isoflurano. A, antes de la inyección, B, después de la inyección.
Figura 2: volumen y el flujo total del tumor primario se midieron de 7 días después de la implantación. La implantación de células suspensión genera un tumor primario creciente tanto en volumen, que fue visualizado usando pinzas, flujo total, que fue medido por el sistema de espectro. La figura muestra imágenes bioluminiscentes de tumores primarios y metástasis observados en varios puntos del tiempo después de 7 días de la implantación. p/s = fotones/segundo. Esta figura ha sido modificada de Zhang et al. 17. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: H & E tinción y análisis de los tumores primarios y metástasis del pulmón de coloración immunohistochemical. Tejidos se fija en paraformaldehído al 4%, embebidos en parafina y teñidos. (A y B) las secciones fueron teñidas con hematoxilina y eosina (H & E). (C y D) las secciones fueron teñidas con anticuerpos antiCD31. Coloración marrón indica CD31 + vasos. Paneles A y C presente tejido de tumor primario, los paneles B y D presentan metástasis del pulmón. CD = racimo de la diferenciación. El aumento utilizado = 200 X. La barra de escala = 50 μm. Esta figura ha sido modificada de Zhang et al. 17. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Las células utilizadas en este estudio son 4T1-luc2, murinos triple negativo células cancerosas del pecho con etiqueta de la luciferasa, que son una herramienta útil para invertir efectos antitumorales y antimetastásicas de drogas debido a su naturaleza altamente invasiva2,19 . Luciferasas, estables a la siguiente generación de células, se utilizan para indicar que el tumor de la vida de las células, tanto en la glándula mamaria y en otros órganos distantes20. En algunos casos, hipoxia y deficiencia de nutrientes en el resultado del tumor en una disminución en la señal bioluminiscente y el volumen del tumor primario no es incompatible con la señal bioluminiscente en una etapa posterior de progresión del tumor. La técnica de la inyección celular ortotópico (COI) de suspensiones celulares se puede realizar también con otras mamas líneas celulares de cáncer, como las células humanas MDA-MB-231 (datos no publicados). En este estudio, con la glándula mamaria como su entorno, es un modelo animal adecuado para el estudio de microambiente tumoral, cruce hablando entre células tumorales y células del estroma. Durante el desarrollo del tumor, en algunos ratones, el pezón puede ulcerarse, costra, crecer tejido de granulación rojo, aplanar o incluso desaparecer, similar a lo que sucede en humanos pezones durante el cáncer de mama. Ratones pueden experimentar incomodidad con ulceraciones; humano debe ser cuidado. Más cambios del pezón se ha encontrado en ratones usando esta técnica COI que con la técnica de cirugía micro-invasiva. La implantación quirúrgica ortotópico (SOI) de tejido del tumor humano histológico intactos, en comparación con la inyección celular ortotópico (COI) de suspensiones celulares, muestra cánceres malignos más altos en la vejiga, pulmón, estómago, riñón y colon21 que imitar lo que se ve en pacientes22.
Con una alta incidencia de metástasis, especialmente metástasis de pulmón, el modelo de cáncer de mama murino establecido en el presente estudio es un modelo de cáncer syngeneic buena para explorar la migración espontánea y la invasión, en comparación con un modelo de metástasis artificial, como un inyección de la vena de la cola. Las actividades de la célula del tumor y los personajes también desempeñan papeles importantes en metástasis. Otras líneas celulares, como la célula de cáncer de mama humano MCF-7, incluso implantado por una inyección de orthotopic en la almohadilla de grasa mamaria de ratones Balb/c de deficiencia inmune, tienen una baja capacidad metastásica. Con la modificación de las células o los ratones, como la sobreexpresión o abajo-expresión de un cierto gen, esta tecnología puede aplicarse en más campos de investigación.
La operación crucial de esta inyección es moverse con cuidado y lentamente hasta la punta de la aguja, del subcutáneo en la almohadilla de grasa mamaria. La hora punta de la jeringa cerca del pezón, el operador sentirá insistencia del tejido. Puesto que el ratón es muy pequeño, sólo un poco más de presión es necesario pase la punta de la jeringa a través de la insistencia. Demasiada presión resultará en la punta pasa a través de la glándula y romper la piel, que resulta en una falla de la inyección. Células en fase logarítmica, una suspensión unicelular, el protocolo de operación estándar (SOP) y calificados operadores son necesarios para reducir la variación entre ratones. Comportamiento de la célula del tumor es importante para la formación y la repetición de modelos de tumores. Cosecha de células en fase logarítmica cuando crecen a unos 80-90% confluencia; densidades de células demasiado bajo o demasiado alto se interfieren con el modelo de tumor y resultan en variaciones entre experimentos. La suspensión unicelular también es importante ya que la célula produce resultado en errores de cálculo del número de células. Tripsina, una solución de EDTA u otros métodos apropiados son elegidos para separar las células según los objetivos del experimento y los objetivos el investigador está interesado en. Depende de la densidad de célula y la escala de jeringa, el volumen de inyección puede variar de 25 a 100 μl. La cantidad de 1 x 104 1 x 106 células se utiliza comúnmente para irritar el crecimiento del tumor según diferentes tipos de células. Tinción Trypan azul se utiliza para distinguir las células viables de los muertos. Más de viabilidad celular de 95% se considera como una buena situación para inducir un tumor rápido crecimiento y metástasis en vivo. También son apropiadas para otros modelos de tumor durante la preparación de las células del tumor. Para correctamente el tamaño del tumor primario del calibrador y obtener una precisa señal bioluminiscente, la piel alrededor del pezón se debe retirar otra vez cuando crece hacia atrás. Cuando el tumor primario crece a una gran masa y su señal bioluminiscente es demasiado fuerte para los investigadores observar otras metástasis de órganos (p. ej., metástasis del pulmón), cubrirla con cinta aislante negra antes de que se toman imágenes de bioluminiscencia o quitarlo por cirugía. Puede utilizarse un analgésico para el dolor post-surgical.
Inoculación exitosa puede dar lugar a metástasis del pulmón: con una tasa de ocurrencia de más del 90%, focos metastáticos en los senos no, ósea o los ganglios linfáticos son muy comunes, mientras que celiacos metástasis es rara. Los tumores secundarios son una masa transparente y pueden ser distinguidos de los tejidos normales circundantes. Una aplicación precisa de la inyección puede conducir a errores experimentales en localidades de tamaño y forma y metástasis de tumor. Cualquier salida de la esfera plana después de la inyección reduce el tamaño del tumor, cualquier salida de la glándula mamaria en el "túnel" dará como resultado un tumor cilíndrico largo que obstruirá la determinación del volumen del tumor cuando utilizamos un calibrador digital para medirlo. Inyecciones subcutáneas alrededor de la almohadilla de grasa mamaria rara vez conducen a la metástasis del pulmón y no son aptos para estudio asociada a metástasis distante. Para realizar la inoculación estable y reducir el riesgo de fuga, Matrigel se puede usar cuando suspender las células del tumor. Sin embargo, Matrigel no es un solvente único, es considerado como una especie de matriz extracelular (ECM), y algunos tipos de gel incluso contienen factores que pueden interferir con los experimentos. En el experimento dirigido en el microambiente tumoral, ECM, cruce hablando entre las células tumorales o con células estromales, es mejor evitar el uso de Matrigel. Para las células inyectadas con la luciferasa de la etiqueta D luciferin, el sustrato de la luciferasa se inyecta para enlazar la vida las células del tumor en ratones. En este estudio, la dinámica de la bioluminiscencia en vivo sugirió que a los 10 minutos después de la inyección D luciferin, la señal bioluminiscente alcanzar el pico y puede ser estable durante unos 10-15 minutos (variando entre ratones diferentes), si con un inyección intraperitoneal o una inyección subcutánea. Teniendo en cuenta que el fármaco probado se inyecta por vía intraperitoneal, para evitar la interacción del fármaco probado con luciferin D y para reducir la irritación peritoneal, se recomienda una inyección subcutánea.
En conclusión, la inyección de orthotopic de las células de cáncer de mama que se describe en este documento es una herramienta muy útil en el estudio de la patología y la progresión del cáncer de mama. Es fácil de manejar y puede realizarse rápidamente. El tumor primario se origina en la glándula mamaria con una alta ocurrencia de la metástasis, que máximo imita el proceso fisiopatológico de carcinoma de mama humano.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (grant no. 81873111, 81673924, 81774039, 81503517), la Fundación de Ciencias naturales Beijing (grant no. 7172095, 7162084, 7162083) y la Fundación de Xia Xu del Hospital de Beijing La medicina tradicional China (subsidio no, xx201701). Agradecemos a Prof. Chang Zhen Liu, del centro de Investigación Experimental, China Academia de ciencias médicas chinas, imágenes bioluminiscentes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anesthesia machine | Midmark Corporation, Dayton, OH, USA | Matrx VMS | anesthesia |
| In-Vivo Imaging System | PerkinElmer | IVIS Spectrum | used for bioluminescence detecion |
| isoflurane | Hebei yipin chemical reagents company | O21400 | anesthesia |
| 1 ml syringe | Becton,Dickinson and Company | A257 | cell injection |
| digital caliper | Shang Hai Shen Han Measuring Tools Co., Ltd. | S-H | volume measurement |
| tramadol | Mundipharma company | - | pain killer |
| D-luciferin | Gold Biotechnology Inc. | LUCK-1G | used for bioluminescence detecion |
| The primary antibody against cluster of differentiation (CD) 31 | Abcam | ab28364 | used for MVD detection |
| hematoxylin and eosin staining kit | Beijing Zhong Shan Jinqiao Biotechnology Co., Ltd. | ZLI-9615 | histology |
| hair removal cream | Veet | - | hair removal cream |
| Carbomer Eye Gel | Dr.GerhardMannChem-Pharm.FabrikGmbH | - | ophthalmic ointment |
| sewing needle | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. | 17U0302J | suture |
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