Summary
在这里, 我们提出了一个协议, 准备从食物和环境微生物群 DNA 样本, 以协同检测和子类型沙门氏菌通过 quasimetagenomic 测序。结合使用培养富集、免疫磁分离 (IMS) 和多重置换扩增 (MDA), 可有效地将沙门氏菌基因组 DNA 从食物和环境样本中浓缩。
Abstract
准宏基因组测序是指基于测序分析的食品和环境样品的改性微生物群。在本协议中, 微生物菌群的改性是为了集中于目标食源性致病菌污染物的基因组 DNA, 以便在单个工作流程中检测和子类型病原体。在这里, 我们解释并演示了样品制备步骤, 对代表性食品和环境样品中沙门氏菌起因的准宏基因组分析, 包括苜蓿芽、黑胡椒粉、地牛肉、鸡胸肉和环境拭子。样本首先受到沙门氏菌的培养富集的缩短和可调的持续时间 (4–24 h)。然后通过免疫磁分离 (IMS) 选择性地从浓缩培养中捕获沙门氏菌细胞。最后, 进行多位移扩增 (MDA), 以放大来自 IMS 捕获细胞的 DNA。该协议的 DNA 输出可以通过高通量测序平台进行排序。可进行定量 PCR 分析, 以取代沙门氏菌检测的测序, 或在测序前评估沙门氏菌DNA 浓度。
Introduction
宏基因组测序理论允许对食源性病原体进行协同检测和子类型。然而, 食品微生物群的直接测序对病原体分析提出了挑战。首先, 食源性病原体经常存在于食物样本的低水平。大多数商业上可用的快速检测方法仍然需要 8–48 h 培养, 以丰富病原细胞到可检测的1级。其次, 许多食物含有丰富的菌群细胞和/或食物 dna, 使食源性病原体 dna 成为食物宏基因组的一小部分, 并且是通过直接总体基因体测序检测和子类型的难以捉摸的目标。
据报道, 食品微生物群的改性允许大量食源性病原体 DNA 的浓度, 以方便测序检测滋贺毒素产生的大肠杆菌2、3和沙门氏菌起因4。由于改性食品微生物群仍然是不同微生物种类的混合物, 它们的测序被称为准总体基因体分析4。微生物菌群的改性可通过培养富集单独2、3或与免疫磁分离 (IMS) 和多位移扩增 (MDA)4、5相结合进行。IMS 可以通过抗体涂层磁珠选择性地从浓缩培养中捕获病原细胞。MDA 可以通过高效的ɸ29 dna 聚合酶6生成足够数量的基因组 DNA 进行测序。IMS-MDA 允许从临床样本7的独立于文化的病原体检测, 并缩短食品样本4中沙门氏菌的准总体基因体检测和子类型的培养富集。
该方法的总体目标是从食物样本中制备准总体基因体 DNA, 以使沙门氏菌基因组 dna 的靶向浓度和随后的检测和子类型沙门氏菌污染物的测序。与沙门氏菌检测8、9和子类型10的标准方法相比, quasimetagenomic 方法可以大大缩短污染食品和环境样品的周转时间, 从而病原体的分子亚型通过将两个典型的分离分析统一为一个工作流。这种方法特别适用于诸如食源性暴发反应和其他追溯调查, 在这种情况下, 除了病原体检测和快速分析周转, 还需要强健的病原体子类型。
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Protocol
1. 样品制备
注: 根据美国农业部食品安全和检验服务部 (USDA-FSIS)11的微生物学实验室指南 (MLG) 和美国食品和细菌分析手册 (BAM), 准备食品样品以进行预浓缩。药物管理局 (FDA)12。
- 无菌将 25 g 部分的食物样本, 如黑胡椒, 鸡胸肉, 牛肉, 苜蓿芽或环境拭子放入一个无菌实验室搅拌机袋与内置过滤器。无菌用浓缩汤 (拉帕波特-绿, RV) 滋润海绵, 准备环境拭子。然后, 将棉签拖到整个表面或预先确定的区域, 然后放入实验室搅拌机袋中。
图 1: 对沙门氏菌进行准宏基因组检测和子类型的代表性食品和环境样品。样品放置在无菌过滤器抹胸袋和 RV 汤。请点击这里查看这个数字的更大版本.
- 三十年代使用实验室搅拌机或手部按摩, 将每25克样品与225毫升 RV 浓缩液彻底混合。
注意: 根据样品类型的不同, MLG 和 BAM 推荐的 RV 汤的变种可能会被使用。 - 在42摄氏度的实验室培养箱中孵育样品浓缩汤混合物, 4–24 h。
- 孵化后, 收集50毫升小子的浓缩液从袋子的过滤侧在一个单独的50毫升离心管。
- 离心管在 100 x g 10 分钟, 以去除匀浆中的固体碎片。
- 仔细恢复上清液到一个新的50毫升离心管和离心管在 3,000–6,000 x g 10 分钟, 以恢复细胞颗粒。
- 可选丢弃上清液, 并在5毫升缓冲的蛋白胨水 (BPW) 中重新悬浮液洗涤颗粒, 并在 3,000–6,000 x g 离心管10分钟。
注: BPW 可以通过溶解10克的蛋白胨, 5 克氯化钠, 3.5 克磷酸二钠, 1.5 克单钾盐磷酸盐为 1 L 的蒸馏水制备。最终 pH 值应调整为7.2 ± 0.2 (25 摄氏度)。热压罐在 121 oc 15 分钟. 商业上可用的 BPW 也可以使用。 - 丢弃上清液, 并在5毫升的 BPW 中重新悬浮颗粒。
2. 免疫磁分离 (IMS) 和多位移放大 (MDA)
注意: 为了防止样品间交叉污染, 在生物安全柜中工作, 更换每个管子的移液器提示, 避免用吸管接触管子, 在洗涤步骤中不要将管放在磁性支架上。
- 在冰上或提前4摄氏度解冻样品缓冲液和反应缓冲液 (MDA 试剂盒)。
- 在 BPW 中混合1毫升的再悬浮细胞颗粒, 20 微升的1.5 毫升微量离心管中的抗沙门氏菌珠, 在室温下将其放在旋转搅拌机上30分钟。
注: 重悬颗粒中的竞争性菌群、脂肪微粒和蛋白质会干扰 IMS。在 BPW 中, 再悬浮细胞颗粒的稀释有助于在洗涤步骤中减少磁性支架上的珠子-沙门氏菌复合物的流失。 - 将管插入磁性支架, 并允许3分钟的正确恢复珠子通过反相机架几次, 以集中的珠子在管侧的颗粒。
- 把管子放在磁性支架上。从每个管子中吸出和丢弃上清液, 以及每个管帽中的剩余液体。
注意: 小心不要在管子的侧壁上对磁体干扰 IMS 珠子的颗粒。 - 从磁性支架上取下管座, 然后添加1毫升洗涤缓冲液 (PBS 包含 0.05% (a/v) 聚山梨酯 20), 并多次反转, 以去除复杂的非特异性结合细菌。
- 重复步骤2.3–2.5 两次。
- 在 3路洗涤后, 通过重复步骤2.3–2.4 执行磁珠的最终磁性分离。从磁性机架上取下管子, 将它们放在微量离心中, 1 秒即可旋转珠子。然后, 将管子放在磁性机架上3分钟, 然后取出任何残余洗涤缓冲液。
- 将9微升样品缓冲液中的珠沙门氏菌配合物重新挂起, 在95摄氏度孵育3分钟进行变性。
- 冷却至4摄氏度后, 结合9微升的反应缓冲液加1微升的酶混合物并保持在冰上。
- 在热循环仪中, 孵育管在30摄氏度为 2 h 为放大, 然后加热在65摄氏度10分钟, 以禁用酶和冷却到4摄氏度冰上。
- 通过测量 fluorospectrometer 仪器上的 DNA 浓度和纯度 (260/280 比例 > 1.8) 来评估 MDA 产品的数量和质量。
注意: 由于 IMS 磁珠的非特异性结合, 从沙门氏菌以外的生物体的基因组 DNA 很可能存在于 MDA 产品中, 但不影响下游分析。 - 将最终产品 (20 微升) 存储在-20 摄氏度, 直到用于 quasimetagenomics 测序的实时 PCR 和/或库准备。
3. 实时 PCR
注意: 此步骤是可选的 1) 检测沙门氏菌无子类型, 2) 在 quasimetagenomics 测序前评估样品质量。
- 每样制备18微升 pcr 混合物, 包含通用 pcr 主混合物 (10 微升)、正向底漆 (2 微升、900 nm)、反向底漆 (2 微升、900 nm)、探针 (2 微升、250 nm) 和分子级水 (2 微升)。
注意:沙门氏菌特异寡核苷酸引物 (向前: CTCACCAGGAGATTACAACATGG, 反转: AGCTCAGACCAAAAGTGACCATC) 和探针被设计为放大ttr基因中的 94-bp 序列 (GenBank 加入 no。AF 282268)13。 - 将 MDA 产品从步骤2.12 中混合, 轻轻移除微珠-沙门氏菌复合物和液体, 形成悬浮液。将悬浮液中的2微升加入18微升 PCR 混合物中。
- 使用优化的实时 pcr 协议运行实时 pcr, 指定两个保持期, 一个在50摄氏度2分钟, 另一个在95摄氏度10分钟, 后跟40个周期95摄氏度, 十五年代和60摄氏度六十年代。
- 计算阈值周期 (Ct), 这是所需的周期数的荧光从放大的 DNA 跨越阈值线。
注: 阈值线设置在样本的放大图的基线和高原之间的线性相位中。阴性结果对应于40以上的 ct 值或 ct 值高于阴性对照的样品。
4. Quasimetagenomic 测序的库准备
注: MDA 产品可以通过短读和长读 (纳米孔) 测序平台进行排序。使用序列化平台制造商提供的最新版本的 DNA 库准备工具包。根据制造商的指示执行 DNA 库准备工作。使用2D 低输入基因组 DNA 协议为长读测序平台5的库准备工作。对于短读测序平台的库准备, 下面提供了对制造商协议的细微修改。
- 通过向 MDA 产品添加缓冲液和试剂, 遵循标准库制备方法。将40微升的测序准备好 MDA 产品到一个新的板上, 并在每个井中添加20微克的 PCR 纯化珠。
- 在室温下孵育10分钟, 不摇晃。
- 用80% 乙醇清洗珠子, 将珠子干12分钟。
- 在53微升的再悬浮缓冲液中重新悬浮干珠子, 孵育2分钟而不摇晃。
- 根据制造商的指示稀释和池库。
注意: 下午10点汇集和变性库现在已准备好进行排序。
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Representative Results
在 quasimetagenomic 测序之前, 可通过 fluorospectrometer (表 1) 评估 IMS MDA 产品的总数量和纯度。
| 浓缩时间 (h) | Ct 值 | 浓度 (ng/ul) | 纯度 (260/280) | |
| 品牌 A | 4 | 24.71 | 812.91 | 1.89 |
| 8 | 25.80 | 900.36 | 1.87 | |
| 12 | 15.41 | 753.88 | 1.84 | |
| 品牌 B | 4 | 20.63 | 872.61 | 1.87 |
| 8 | 22.61 | 993.41 | 1.87 | |
| 12 | 19.08 | 954.44 | 1.87 |
表 1: 用于准总体基因体测序的 DNA 样本的质量和数量评估.将沙门氏菌细胞接种于两个品牌的25克生鸡胸肉中, 分别为1株/克. 接种后的样品在 RV 中富含4、8和12小时, 在 IMS-MDA 之前。
可通过实时 PCR (表 1和图 2) 对沙门氏菌DNA 进行靶向定量评估, 如果不需要子类型, 也可以作为沙门氏菌检测的替代品。
图 2: 用于沙门氏菌检测的实时 PCR 或准宏基因组测序的样本评估.显示了在4、8和 12 h 的富集时间后, IMS-MDA 产品中沙门氏菌DNA 的实时 PCR 扩增曲线。只有 2 h 浓缩的样品也包括在内。沙门氏菌细胞 (0.27 株/克) 接种了25克生鸡胸肉从两个品牌 A 和 B.请点击这里查看这个数字的更大版本.
Fluorospectrometer 读数允许对样品制备进行初步评估。由沙门氏菌污染的鸡乳房样本制备的 IMS MDA 产品的浓度从701.54 到 945.86 ng/µL, 表明样本 DNA 已被放大。根据制造商的指导, 短读和长读测序的最小 DNA 样本浓度分别为 0.2 ng/µL 和1µg。260/280 的比率从1.85 到 1.88 (表 1), 显示了高纯度的 DNA 样本, 蛋白质污染水平低。
较低的 Ct 值表明样本中沙门氏菌基因组 DNA 浓度较高。如表 1和图 2所示, 随着富集时间的增加, IMS MDA 产品的 Ct 值会降低。在我们之前的研究4中, 当 Ct 值低于25时, SE 基因组的大多数 (> 50%) 可能被测序, 从原始测序读取的血清型预测是成功的。
不成功的培养富集或 IMS 会导致相对较高的 Ct 值, 表明最终样品中沙门氏菌基因组 DNA 浓度低, 如图 2所示。尽管 fluorospectrometer 读数所建议的 IMS-MDA 产品具有较高的 DNA 浓度和纯度, 但这种情况可能会发生。
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Discussion
由于食品和环境样品中沙门氏菌的丰度和均质性存在, 在沙门氏菌检测和子类型的同时, 还需要对其进行培养;因此, 这是该议定书的一个关键步骤。为了确定最佳条件以增加沙门氏菌相对于样本背景菌群的丰度, 可以对不同的富集介质进行特定样品的评估。根据 MLG 和 BAM 的规定, 如 RV 汤和非选择性培养基, 如缓冲的蛋白胨水和乳糖汤, 可用于食品样本中的沙门氏菌浓缩。我们在上一项研究中对42摄氏度的 RV 的使用进行了评估,4用于生鸡肉、冰山生菜和黑胡椒的沙门氏菌富集, 以支持 quasimetagenomic 分析病原体。根据 FDA BAM 和 AOAC precollaborative8,9和合作研究14,15, RV 被推荐用于分析高微生物和低微生物负载食品。
培养富集的最佳时间取决于多种因素, 如样本类型、沙门氏菌污染程度和沙门氏菌污染物的生理状态。例如, 当低含量的沙门氏菌(例如, < 1 个/g) 细胞存在于肉类样品和制冷胁迫下时, 可能需要较长的浓缩时间 (如> 12 h) 来恢复和丰富沙门氏菌细胞。在改良的微生物群中, 大量的沙门氏菌会导致沙门氏菌污染物基因组的适当测序覆盖率, 从而使菌株级单核苷酸多态性 (SNP) 打字4。较短的培养浓缩 (例如,小于12小时) 是可能的快速检测5或血清分型沙门氏菌4。
更高的沙门氏菌污染和/或更长的培养富集的被污染的食物样本可能导致更高浓度的沙门氏菌基因组 DNA 在改良食品微生物群, 从而导致较低的 Ct 值从实时 PCR 分析。Ct 值与沙门氏菌污染基因组4的测序覆盖率呈负相关, 因此可用于工作流的优化和修改。根据我们的经验, 文化的充实, 特别是它的长度, 往往是故障排除工作的重点。例如, 从生鸡乳房样本中的 IMS-MDA 产品的 Ct 值相对较高, 在 35.94 (图 1)。该样本接种了2.5 株 BPW 硒细胞, 在37摄氏度下孵育2小时. 此样本的测序没有提供硒基因组的足够覆盖范围, 以允许血清型预测。相比之下, 所有其他 4 h 或更长富集的样品均成功 serotyped quasimetagenomic 测序数据 (未显示数据)。
测序后, 我们建议使用海妖16识别沙门氏菌读数, 以进一步进行生物信息学分析。CFSAN snp 管道17和 SeqSero18可用于 snp 打字和血清分型预测从原始测序读取, 分别。
这种 quasimetagenomic 技术有几个局限性。首先, fluorospectrometer 测量的 IMS-MDA 产品的 DNA 浓度和纯度应仅用作适当样品制备的初步指标。由于 MDA 的高效率, 微量的输入 DNA 可以被放大到足够完整的基因组测序19。因此, 即使培养富集或 IMS 未能有效浓缩沙门氏菌细胞, 仍能生成高质量和数量的 DNA 样本。可选的实时 PCR 分析为整个样品制备工作流程提供了更有针对性和更翔实的评估。其次, 难以培养的沙门氏菌细胞, 如存活但培养 (培养) 细菌20, 在培养富集过程中可能不会生长。因此, 我们的方法可能无法检测到这些单元格。
综上所述, 与传统方法相比, 我们的样品制备方法和准 metogenomic 测序方法可以大幅减少沙门氏菌污染食品和环境样品的分析周转, 从而沙门氏菌污染物的强健子类型。除沙门氏菌外, 该技术还可用于快速、一致地检测和子类型其他食源性病原体。
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Disclosures
作者声明他们没有竞争的经济利益。
Acknowledgments
作者希望感谢格鲁吉亚大学的马克哈里森和格温, 为这项研究提供了细菌菌株和其他支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laboratory blender bag w/filter | VWR | 10048-886 | |
| Buffered peptone water | Oxoid Micorbiology Products | CM0509 | |
| Rappaport Vassiliadis broth | Neogen Acumedia | 7730A | |
| Polysorbate 20 | Millipore Sigma | P9416 | Tween 20 |
| Stomacher blender | Seward | 30010108 | |
| Centrifuge | Fisher Scientific | 75005194 | |
| 50 mL Centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-539-6 | |
| Thermal Cycler | Techne Prime | EW-93945-13 | |
| StepOne Real-Time Thermal cycler | Applied Biosystems | 4.76357 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | PCR purification beads; mix well before use; store at 4 °C |
| Nextera XT library prep kit | Illumina | FC-131-1024 | Store at -80 °C |
| MinIon library prep kit | Oxford Nanopore | SQK-LSK108 | Store at -80 °C |
| NanoDrop | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Dynabead Anti-Salmonella beads | Applied Biosystems | 71002 | Vortex well prior to use |
| Illustra GenomiPhi V2 DNA amplification kit (MDA kit) -Sample buffer -Reaction buffer -Enzyme mix |
GE Healthcare | 25-6600-30 | Store at -80 °C |
| HulaMixer | Invitrogen | 15920D | |
| DynaMag magnetic rack | Invitrogen | 12321D | |
| TaqMan Universal PCR mastermix | Applied Biosystems | 4304437 | Mix well before use; store at 4 °C |
| Microfuge | Fisher Scientific | 05-090-100 |
References
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