Summary
ここでは、協調検出およびサルモネラの quasimetagenomic シーケンスを通じてサブタイピングの食糧および環境内細菌叢解析からの DNA のサンプルを準備するためのプロトコルを提案する.併用文化濃縮、原因菌分離 (IMS)、複数の変位の増幅 (MDA) により、サルモネラ食糧および環境試料からゲノム DNA の効果的な濃度。
Abstract
準メタゲノム配列決定は、食品、環境サンプルの修正内細菌叢解析のシーケンス解析を指します。このプロトコルではマイクロバイ変更対象食品由来の病原体の汚染物質の検出を容易にするためにゲノム DNA の単一のワークフローに病原体のサブタイプの集中です。ここでは、私たちを説明する代表的な食品とアルファルファもやしを含む環境試料からのサルモネラ準メタゲノム解析の準備手順、サンプル挽き黒こしょう、牛ひき肉、鶏の胸肉を示すと環境の綿棒。サンプルは最初文化豊かなサルモネラの短縮、調節可能な期間 (4-24 h) を受けます。サルモネラ細胞は、原因菌分離 (IMS) によって濃縮文化から選択的にキャプチャされます。最後に、IMS にキャプチャされたセルからの DNA を増幅するため複数の変位増幅 (MDA) が実行されます。高スループット シーケンスのプラットフォームでは、このプロトコルの DNA 出力を配置できます。サルモネラ検出シーケンスを置換またはシーケンスの前にサルモネラDNA の濃度を評価するオプションの定量的 PCR 解析を実行できます。
Introduction
メタゲノム配列には、協調の検出および食品由来病原体のサブタイピング理論的にことができます。しかし、食品サンプルは食品マイクロバイの直接配列による病原体解析への挑戦を提示します。まず、食中毒の病原体が多い現在低レベルで食品サンプルで。市販の急速な検出方法をまだ必要と 8-48 h 培養検出レベル1に病原体細胞を豊かにします。第二に、多くの食品に含まれる豊富な微生物細胞または食品 DNA、メタゲノム配列直接によって検出およびサブタイピングのため食品メタゲノムととらえどころのないターゲットのごく一部食品由来病原体の DNA を作るします。
食品由来病原体の志賀毒素産生性大腸菌2,3とシーケンス ベースの検出を容易にする DNA の相当な集中を許可する食品内細菌叢解析の修正が報告されています。サルモネラ4。組換え食品のため内細菌叢解析はまだ別の微生物種の混合物、そのシーケンスは準メタゲノム解析4と呼ばれます。文化濃縮だけで2,3原因菌分離 (IMS) と組み合わせて、複数変位増幅 (MDA)4、5マイクロバイ変更を実行できます。IMS は、抗体をコートした磁気ビーズを介して培養から病原体細胞を選択的にキャプチャできます。MDA は、非常に効率的な ɸ29 DNA ポリメラーゼ6配列のゲノム DNA の十分な量を生成できます。IMS MDA は臨床サンプル7、文化豊かな準メタゲノム検出のための短縮と食品サンプル4でサルモネラのサブタイプからカルチャに依存しない病原体検出を許可しています。
このメソッドの全体的な目標は、サルモネラDNA とそれ以降の検出の対象となる濃度とシーケンスによるサルモネラ汚染のサブタイプを許可する食品サンプルから準 metagenomic DNA を準備することです。Quasimetagenomic アプローチが汚染された食物や環境のサンプルからの所要時間を大幅に短縮できますサルモネラ検出8,9の標準的な方法と比較制約条件およびサブタイピング10、通常 2 つの統一によって病原体の分子サブタイプは、単一のワークフローに解析を分離しました。このメソッドは、堅牢な病原体サブタイプが病原体検出に加えて必要と迅速分析が重要な他のトレース バック調査食品由来アウトブレイクの応答などのアプリケーションに特に役立ちます。
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Protocol
1. サンプル準備
注: 食品サンプルに準備されます米国部の農業食品安全・検査サービス (米国農務省食品安全検査局)11米国食品の細菌学的分析マニュアル (BAM) の前濃縮微生物学研究室ガイドブック (MLG) によると、薬剤の管理 (FDA)12。
- 無菌フィルターを内蔵した無菌試験室ミキサー バッグに黒コショウ、鶏の胸肉、牛ひき肉とアルファルファもやし環境綿棒など食品サンプルの 25 g 部分を配置します。濃縮スープ (ラパポート Vassiliadis, RV) とスポンジを潤し無菌環境の綿棒を準備します。綿棒表面全体または定義済み領域をドラッグし、研究室のミキサー バッグに入れます。
図 1: 代表的な食品と準メタゲノミクス検出およびサルモネラのサブタイピングの環境試料。サンプルは、RV スープと一緒に滅菌フィルター ストマッカー袋に配置されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
- 徹底的に各 25 g サンプル RV 濃縮の 225 ml 30 研究室ミキサーやハンド マッサージを使用してスープを混ぜる s。
注: サンプルの種類に応じて MLG と BAM によって推薦されるように RV スープのバリエーションを使用できます。 - サンプル濃縮スープ混合物 4-24 h の 42 ° C で研究室のインキュベーターで孵化させなさい。
- インキュベーション後、別の 50 mL 遠心管中のバッグのフィルター側からの濃縮スープ 50 mL サブサンプルを収集します。
- 磨砕液の固体の破片を削除する 10 分間 100 x g でチューブを遠心します。
- 慎重に、新しい 50 mL 遠心チューブ、細胞ペレットを回復する 10 分間 3,000-6,000 x g でチューブを遠心上清を回復します。
- (省略可能)上澄みを廃棄ペレットを 5 ml 緩衝ペプトン水 (BPW) の再懸濁液で洗いし、3,000-6,000 × g で 10 分間のチューブを遠心分離機します。
注: BPW できる準備ペプトン 5 g の塩化ナトリウムの溶解 10 g ナトリウム 3.5 g リン酸と 1.5 g の 1 L にリン酸二水素カリウムの蒸留水します。最終 pH は 7.2 ± 0.2 25 ° C で調整する必要があります。121 ° C で 15 分間市販 BPW でオートクレーブを使用もできます。 - 上澄みを廃棄し、再 BPW の 5 mL にペレットを中断します。
2. 原因菌分離 (IMS) と複数の変位増幅 (MDA)
注: サンプル間のクロスコンタミネーションを防ぐためには、バイオ セーフティ キャビネットの作業、各チューブのピペット チップを変更、ピペット管に触れないようにに置かないでください管近く一緒にマグネット スタンド洗濯の段階。
- サンプル バッファーと MDA キットまたは 4 ° C で氷の上から反応バッファーを事前に解凍します。
- 再浮遊細胞のミックス 1 mL を 1.5 mL 遠心チューブに抗サルモネラビーズ 20 μ BPW のペレットし、室温で 30 分間回転ミキサーの上に置きます。
注: 競争力のある植物、脂肪微粒子やペレットを再懸濁の蛋白質 IMS を妨げることができます。BPW の再懸濁細胞ペレットの希釈は手順を洗う時にマグネット スタンドからビード -サルモネラ錯体の損失を減らすために役立つ。 - マグネット スタンドにチューブを挿入し、チューブの側面にペレットにビーズを集中するラックを数回反転によるビーズの適切な回復のための 3 分を許可します。
- また、マグネット スタンドにチューブを維持します。吸引し、各チューブのキャップの残りの液体と同様、各チューブから上澄みを廃棄します。
注: 磁石に対して管の側壁に IMS ビーズのペレットを邪魔にならないように気をつけてください。 - チューブ ホルダー、マグネット スタンドから取り外しますと 1 mL の洗浄バッファー (0.05% (v/v) ポリソルベート 20 を含む PBS) を追加し、コンプレックスから非具体的バインド細菌を除去するために数回を反転します。
- 2.3 〜 2.5 の手順を 2 回繰り返します。
- 3rd洗浄手順 2.3-2.4 を繰り返すことによってビーズの最終的な磁気分離を実行します。磁気ラックからチューブを外し、1 および microfuge に置いて s ビーズをスピンダウンします。その後、任意の残留洗浄バッファーを削除する前に磁気ラック 3 分の管を配置します。
- 再サンプル バッファーの 9 μ l ビーズ -サルモネラ錯体を中断し、, 変性 3 分の 95 ° C で。
- 氷の上の 4 ° C に冷却後反応バッファーの 9 μ L を組み合わせてプラス酵素の 1 μ L 混合し、氷の上を維持します。
- サーマルサイクラー、増幅、酵素と氷に 4 ° C に涼しいを不活化する 10 分の 65 ° C で加熱することによって続いて 2 h 30 ° C でチューブをインキュベートします。
- MDA 製品の質と量を DNA 濃度・純度 (260/280 比率 > 1.8) fluorospectrometer の計測器で測定することにより評価します。
注: IMS ビーズの非特異的結合、ため、サルモネラ以外の生物由来の DNA は MDA 製品に存在する可能性がありますが、下流の分析には影響しません。 - リアルタイム PCR の使用および/または quasimetagenomics シーケンス処理用ライブラリの準備まで、-20 ° C で最終製品 (20 μ L) を格納します。
3. リアルタイム PCR
メモ: この手順は 1)、サブタイプなしサルモネラの検出オプション 2) quasimetagenomics シーケンスの前にサンプルの質を評価します。
- 普遍的な PCR マスターを含むサンプルごとの pcr の 18 μ L を準備 (10 μ L) をミックス、プライマーを転送 (2 μ L、900 nM)、逆プライマー (2 μ L、900 nM)、プローブ (2 μ L、250 nM)、および分子グレード水 (2 μ L)。
注:サルモネラ-特定のオリゴヌクレオチドのプライマー (前方: 逆 CTCACCAGGAGATTACAACATGG: AGCTCAGACCAAAAGTGACCATC) プローブ (GenBank 加盟なしttr遺伝子内の 94 bp シーケンスを増幅するように設計されました。AF 282268)13。 - 優しく上下にビーズ懸濁液を作成する液体と一緒にサルモネラ錯体ピペッティングによる手順 2.12 から MDA 製品をミックスします。Pcr の 18 μ L に懸濁液 2 μ L を追加します。
- 95 ° C の 40 のサイクルが続く 2 分 50 ° C で、もう一方は 10 分、95 ° C で 2 つの保持期間を指定するリアルタイム PCR の最適化されたリアルタイム PCR プロトコルを使用してを実行すると、15 s の 60 ° C、60 s。
- しきい値を表す線を横断する増幅された DNA から蛍光に必要なサイクル数であるしきい値サイクル (Ct) を計算します。
注: しきい値を表す線は、直線位相ベース ラインとサンプルの拡大のプロットの高原との間に設定されます。否定的な結果は 40 以上陰性対照のより高い Ct 値とサンプルの Ct 値に対応します。
4. ライブラリに備えて Quasimetagenomic シーケンス
注: 両方の短い長いの読み (ナノポア) シーケンス プラットフォームによって MDA 製品を配置できます。DNA シーケンスのプラットフォームのメーカーから提供されるライブラリ プレップ ・ キットの最新バージョンを使用します。メーカーの指示に従って DNA ライブラリの準備を実行します。長いリード シーケンス プラットフォーム5ライブラリの準備のため 2 D の低入力のゲノム DNA のプロトコルを使用します。短鎖シーケンス プラットフォーム ライブラリ準備、製造元のプロトコルにマイナーな変更を以下に示します。
- MDA 製品緩衝溶液と試薬を追加して標準ライブラリの準備方法に従ってください。準備中シーケンシング MDA 製品の 40 μ L を新しいプレートに転送し、PCR 精製ビーズの 20 μ L を各ウェルに追加します。
- 振ることがなくプレート 10 分室温で孵化させなさい。
- 80% エタノールでビーズを洗浄し、12 分のビーズを乾燥します。
- 再再懸濁バッファーの 53 μ l 乾燥ビーズを中断し、揺れなし 2 分間インキュベートします。
- 希釈し、製造元の指示に従ってライブラリをプールします。
注: は 22 をプールし、変性ライブラリはシーケンスする準備が整いました。
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Representative Results
Quasimetagenomic シーケンスの前に全体の量と IMS MDA 製品の純度は、fluorospectrometer (表 1) により評価します。
| 濃縮時間 (h) | Ct 値 | 濃度 (ng/ul) | 純度 (260/280) | |
| ブランド A | 4 | 24.71 | 812.91 | 1.89 |
| 8 | 25.80 | 900.36 | 1.87 | |
| 12 | 15.41 | 753.88 | 1.84 | |
| ブランド B | 4 | 20.63 | 872.61 | 1.87 |
| 8 | 22.61 | 993.41 | 1.87 | |
| 12 | 19.08 | 954.44 | 1.87 |
表 1: DNA の質と量の評価サンプルを準メタゲノム配列。菌接種 1 CFU/g. 接種で 2 つのブランドの生の鶏の胸肉の 25 g のサンプルが RV で 4、8、および IMS MDA の前に 12 時間の濃縮しました。
リアルタイム PCR (表 1および図 2) またサルモネラ検出のための代替としてサブタイプが必要ない場合はサルモネラDNA のターゲットを絞った量評価を実行できます。
図 2: 準メタゲノム配列のためのサルモネラ検出またはサンプル評価のためのリアルタイム PCR 。濃縮時間の 4、8、12 時間後 IMS MDA 製品のサルモネラDNA のリアルタイム PCR の増幅曲線が表示されます。2 h 濃縮のみサンプルが含まれています。サルモネラ細胞 (0.27 CFU/g) が A と B の 2 つのブランドからの生の鶏胸肉の接種 25 gこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Fluorospectrometer の測定値は、試料の初期評価を許可します。サルモネラ〜 945.86 ng/μ L、701.54 汚染された鶏の胸肉のサンプル サンプル DNA が増幅されていることを示唆しているから調製した IMS MDA 製品の濃度。製造元のガイダンスに従っては、略して読んで、長いシーケンスを読み取る最小の DNA サンプル濃度は 0.2 ng/μ L と 1 μ g がそれぞれ。1.88 (表 1) 1.85 から 〜 260/280 比率高純度 DNA サンプルの蛋白質の汚染の低レベルを示します。
低い Ct 値を示すサンプルにおけるサルモネラDNA 濃度が高い。表 1および図 2に示すように、IMS MDA 製品の Ct 値濃縮時間が増加するにつれて低下します。以前の研究4, 25、大半より Ct 値が低かったとき (> 50%) SE のゲノム シーケンスすることが当面、生シーケンス リードから血清型予測が成功しました。
失敗した文化濃縮または IMS は、図 2に示すように、最終的なサンプルにおけるサルモネラDNA の低濃度を示す比較的高い Ct 値で起因できます。これに fluorospectrometer の測定値が推奨する、IMS MDA 製品の純度・高 DNA 濃度にもかかわらず発生します。
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Discussion
しばしば低豊富,サルモネラの食品および環境試料中の存在で均一な文化濃縮 IMS MDA の前に必要がありますサルモネラ検出条件およびサブタイピング;したがって、プロトコルの重要なステップです。サンプル背景植物に対するサルモネラの豊かさを高めるための最適な条件を識別するために、特定のサンプルの異なる濃縮メディアが評価されます。MLG と BAM によると RV スープなどの選択培地とペプトン水と乳糖ブイヨンなど非選択培地は食品サンプルからサルモネラ濃縮のため使用できます。RV の 42 ° C での使用は、私たち以前研究4鶏肉、レタス、病原体の quasimetagenomic 分析を支援する黒こしょうからサルモネラの濃縮のために評価されています。FDA BAM、AOAC precollaborative8,9と共同研究14,15によると RV は高い微生物や低微生物負荷食品の分析のためお勧めします。
豊かな文化の最適な期間はサンプルの種類、サルモネラ汚染のレベルおよびサルモネラの汚染物質の生理学的状態など、複数の要因に依存します。たとえば、low レベルのとき (例えば、< 1 CFU/g) のサルモネラの細胞が肉のサンプルでは、冷凍負荷存在、濃縮時間 (例えば、> 12 h) は復活し、サルモネラ細胞を豊かに必要ことがあります。変更されたマイクロバイサルモネラの十分な豊かさは、サルモネラ汚染ゲノムひずみレベル一塩基多型 (SNP)4を入力することができるの適切なシーケンス報道に します。短い文化濃縮 (例えば、 12 h 未満) が、急速な検出5または4サルモネラの血清型検査。
サルモネラ汚染のハイレベルおよび/または汚染された食品サンプルの長い文化濃縮のサルモネラDNA 組み換え食品内細菌叢解析、Ct 値を低下させることで高濃度につながる、リアルタイム PCR 解析。Ct 値はサルモネラ汚染ゲノム4のシーケンスの範囲で負の相関関係を表示し、したがって最適化やワークフローの変更を使用できます。私たちの経験によると文化濃縮、特にそれの長さはしばしばトラブルシューティング作業の焦点であります。たとえば、生の鶏の胸肉のサンプルから IMS MDA 製品の Ct 値は 35.94 (図 1) と比較的高かった。このサンプルは 2.5 CFU/g SE 細胞接種し、培養 BPW 2 h. の 37 ° C でのこのサンプルのシーケンスは血清型予測できるように SE のゲノムの十分なカバレッジを提供していません。比較では、4 h または長い濃縮とその他のすべてのサンプル quasimetagenomic シーケンス データ (データは示されていない) から正常に 1。
シーケンス処理の後、さらにバイオインフォマティクス解析を読み取りますクラーケン16を使用してサルモネラを識別するをお勧めします。CFSAN SNP パイプライン17と SeqSero18は、SNP と生シーケンス リードから予測をそれぞれ血清学的入力に使用できます。
この quasimetagenomic の手法には、いくつかの制限があります。まず、DNA 濃度・純度測定、fluorospectrometer IMS MDA 製品は、適切なサンプル準備の予備的なインジケーターとしてのみ使用する必要があります。MDA の高効率、全ゲノム シーケンス19を十分に入力 DNA の微量を増幅することができます。したがって、菌を効果的に集中する文化濃縮または IMS が失敗した場合でも高品質・量の DNA サンプルは生成されます。省略可能なリアルタイム PCR 解析は、全体のサンプル調製ワークフローのより的確で有益な評価を提供します。第二に、培養困難なサルモネラ細胞など結果 (VBNC) 細菌が20、成長可能性がありますいない文化濃縮中。したがって、本手法はこれらの細胞は見つかりません。
要約すると、従来の方法と比較して、試料作製法、準 metogenomic 配列のアプローチできる分析納期の大幅削減サルモネラから-汚染食品と環境のサンプル堅牢なサルモネラ汚染のサブタイプ。サルモネラ、に加えてこの方法迅速かつ協調的に適用される検出および他の食品由来病原体のサブタイプをする可能性があります。
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Disclosures
著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。
Acknowledgments
著者は、マーク ・ ハリソンと細菌の系統と本研究にその他のサポートを提供する親切ジョージア大学のグウェン ハーシュに感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laboratory blender bag w/filter | VWR | 10048-886 | |
| Buffered peptone water | Oxoid Micorbiology Products | CM0509 | |
| Rappaport Vassiliadis broth | Neogen Acumedia | 7730A | |
| Polysorbate 20 | Millipore Sigma | P9416 | Tween 20 |
| Stomacher blender | Seward | 30010108 | |
| Centrifuge | Fisher Scientific | 75005194 | |
| 50 mL Centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-539-6 | |
| Thermal Cycler | Techne Prime | EW-93945-13 | |
| StepOne Real-Time Thermal cycler | Applied Biosystems | 4.76357 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | PCR purification beads; mix well before use; store at 4 °C |
| Nextera XT library prep kit | Illumina | FC-131-1024 | Store at -80 °C |
| MinIon library prep kit | Oxford Nanopore | SQK-LSK108 | Store at -80 °C |
| NanoDrop | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Dynabead Anti-Salmonella beads | Applied Biosystems | 71002 | Vortex well prior to use |
| Illustra GenomiPhi V2 DNA amplification kit (MDA kit) -Sample buffer -Reaction buffer -Enzyme mix |
GE Healthcare | 25-6600-30 | Store at -80 °C |
| HulaMixer | Invitrogen | 15920D | |
| DynaMag magnetic rack | Invitrogen | 12321D | |
| TaqMan Universal PCR mastermix | Applied Biosystems | 4304437 | Mix well before use; store at 4 °C |
| Microfuge | Fisher Scientific | 05-090-100 |
References
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