Summary
여기에서, 우리는 마우스에 있는 잠/각성 상태의 감시 도중 뉴런의 특정 모형의 광유전학 조작의 방법을 기술합니다, 예를 들면 stria 말단의 침대 핵에 우리의 최근 일을 제시하.
Abstract
최근 몇 년 동안, 광유전학널리 신경 과학 연구의 많은 분야에서 사용되어왔다. 많은 경우에, 채널 로독신 2(ChR2)와 같은 opsin은 다양한 Cre-driver 마우스에서 특정 유형의 뉴런 세포에서 바이러스 벡터에 의해 발현된다. 이러한 opsins의 활성화는 광학 케이블을 통해 레이저 또는 LED에 의해 전달되는 광 펄스의 응용 프로그램에 의해 트리거되며, 활성화의 효과는 매우 높은 시간 해상도로 관찰된다. 실험자는 쥐에 있는 행동 또는 다른 생리적인 결과를 감시하는 동안 신경세포를 급격하게 자극할 수 있습니다. 광유전학은 마우스에 있는 잠/각성 상태의 규칙에 있는 신경 회로의 기능을 평가하는 유용한 전략을 가능하게 할 수 있습니다. 여기에서 우리는 마우스의 수면 단계를 평가하기 위하여 뇌전도 (EEG) 및 근전도 (EMG) 감시 도중 특정 화학 동일성을 가진 뉴런의 광유전학 조작의 효력을 검토하기 위한 기술을 기술합니다. 일례로, 우리는 줄무늬 말단의 침대 핵에 있는 GABAergic 뉴런의 조작을 기술합니다 (BNST). 이러한 뉴런의 급성 광유전학적 흥분은 NREM 수면 중에 적용될 때 깨어있는 것으로 급속한 전이를 유발합니다. EEG/EMG 기록과 함께 광유전학적 조작은 수면/깨어 상태를 조절하는 신경 회로를 해독하기 위해 적용될 수 있습니다.
Introduction
수면은 최적의 인지 기능에 필수적입니다. 최근 연구 결과는 또한 수면 장애가 광범위한 질병 1,2,3과관련이 있음을 시사합니다. 수면의 기능은 아직 크게 해결되지 않았지만, 수면/각성 상태를 제어하는 신경 회로 및 메커니즘을 이해하는 데 상당한진전이 최근 이루어졌다 4. 포유류에서는, 경계의 3개의 국가가 있습니다: 깨어, 비 급속한 눈 운동 (NREM) 잠 및 급속한 눈 운동 (REM) 잠. 깨어있는 것은 의도적이고 지속적인 운동 활동과 낮은 진폭의 빠른 EEG 진동 (5-12 Hz)을 특징으로합니다. NREM 수면은 의식 부족과 의도적인 운동 활동으로 높은 진폭 (델타 파)의 느린 진동 (1-4 Hz)에 의해 정의됩니다. REM 수면은 낮은 진폭과 거의 완전한 양측 근육 원반5의 비교적 빠른 진동 (6-12 Hz)을 특징으로합니다.
Borbely는 두 개의 프로세스 모델6,7로알려진 수면 - 깨어 조절의 이론을 제안했다. 프로세스 S라고도 하는 시간성 과정은 깨어 있는 동안 축적되고 수면 중에 사라지는 수면 압력을 나타냅니다. 프로세스 C라고 도하는 또 다른 프로세스는 circadian 프로세스로, 경계 수준이 24 시간 주기에서 변동하는 이유를 설명합니다. 이 두 가지 과정 이외에, 종전성 요인은 또한 수면/각성 조절에 중요하다8,9. 전압적 요인은 영양 상태와 감정을 포함한다. 공포와 불안은 일반적으로 자율 및 신경 내분비 반응과함께 각성의 증가를 동반10,11,12. 변연계는 공포와 불안의 규칙에 있는 역할을 하기 위하여 믿어지고, 자율 및 신경 내분비 반응의 근본적인 기계장치는 광범위하게 공부되었습니다, 그러나 변연계가 잠/각성 상태에 영향을 미치는 통로는 아닙니다 아직 밝혀지지 않았습니다. 광유전학 및 약리유전학을 이용한 최근 연구의 많은 수의 뉴런과 수면/깨어 상태를 조절하는 뉴런 회로가 코르티칼, 기저 전뇌, 시상 하부, 시상 하부, 뇌간. 특히, 광유전학의 최근 발전은 우리가 높은 공간 및 시간적 해상도로 특정 신경 회로 in vivo를 자극하거나 억제할 수 있게 해 주었으며, 그 중에서도 이러한 발전은 우리가 자극하거나 억제할 수 있게 해 주었으며, 그 중에서도 이러한 광유전학은 우리가 자극하거나 억제할 수 있게 해 주어있다. 이 기술은 수 면과 깨어의 신경 기판의 우리의 이해에 진행을 허용 합니다., 그리고 어떻게 수 면/깨어 상태 circadian 프로세스에 의해 조절 됩니다., 수 면 압력, 그리고 감정을 포함 하 여 allostatic 요인. 이 논문은 NREM 수면, REM 수면의 조절에 역할을하는 뇌의 커토머스 및 메커니즘에 대한 우리의 이해를 업데이트 할 수있는 수면 / 각성 기록과 결합 된 광유전학 적 조작을 사용하는 방법을 소개하는 것을 목표로합니다. 그리고 깨어. 불면증은 일반적으로 불안 또는 잠을 잘 수 없는의 두려움과 관련 되어 있기 때문에 변연 성 시스템 수 면/각 성 상태를 조절 하는이 메커니즘의 이해는 건강에 가장 중요 한, (somniphobia).
BNST는 불안과 두려움에 필수적인 역할을 할 것으로 생각됩니다. GAD67-발현 GABAergic 뉴런은 BNST12,13의주요 인구이다. 우리는 수면 / 깨어 상태에 이러한 뉴런 (GABABNST)의광유전학 적 조작의 효과를 조사했다. 최근 몇 년 동안 신경 과학에서 가장 큰 발전 중 하나는 생체 내에서 특정 화학 정체성을 가진 뉴런의 조작을 가능하게하는 방법이었다, 높은 공간 및 시간 적 해상도. 광유전학은 신경 활동과 특정 행동 반응 사이의 인과 관계를 입증하는 데 매우 유용합니다14. 우리는 수면/깨어 상태의 조절에 정의된 신경 회로의 기능적 연결을 검사하는 방법으로 광유전학을 기술합니다. 이 기술을 활용하여 수면/각성 상태를 조절하는 신경 회로를 이해하는 데 큰 진전이 이루어졌습니다15,16,17,18,19 . 많은 경우에, opsins는 Cre-driver 마우스와 Cre-유도성 AAV 매개 유전자 전송의 조합에 의해 선택적 두뇌 지구에 있는 특정 화학 정체성을 가진 뉴런에서 특히 소개됩니다. 또한, 채널로정형신 2(ChR2)20 또는 아카호도신(ArchT)21과 같은 광에 민감한 옵신의 초점 발현을 Cre-loxP 또는 Flp-FRT 시스템과 결합하여 선택적 뉴런 집단 및 특정을 조작할 수 있습니다. 신경 통로22.
우리는 예를 들어 BNST에서 GABAergic 뉴런에 여기 실험을 설명. 지정된 뉴런 집단에서 opsins를 발현하기 위해, 적절한 Cre 드라이버 마우스 및 Cre 의존성 바이러스 벡터가 가장 자주 사용된다. opsins가 특히 신경 인구에서 표현되는 형질 전환 또는 노크 인 선은 또한 유용합니다. 다음 실험에서는 GABAergic 뉴런만이 C57BL/6J 유전적 배경으로 크레조합을 발현하는 GAD67-Cre 노크인 마우스23과 EYFP 또는 EYFP와 융합된 ChR2(hChR2 H134R)를 포함하는 AAV 벡터를 대조군으로 사용했습니다. "FLEx (플립 절제)스위치"24. 절차는 특히 수 면/깨어 상태의 모니터링 하는 동안 BNST에서 GABAergic 뉴런의 optogenetic 여기를 설명25.
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Protocol
이 곳의 모든 실험은 NIH 지침을 준수하여 츠쿠바 대학의 동물 실험 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다.
1. 동물 수술, 바이러스 주입, EEG /EMG용 전극 및 광섬유 이식
주의 사항: 적절한 보호 및 취급 기술은 사용할 바이러스의 생체 안전 수준에 따라 선택되어야 합니다. AAV는 주입을 위해 격리된 P1A 등급의 방에서 사용해야 하며, AAV를 운반하는 튜브는 모든 부피가 소진된 후 오토클레이브로 멸균되어야 합니다. 수술 부위와 모든 이식 된 물질은 사용 중에 깨끗하고 멸균되어야합니다.
참고: 그림1을 참조하십시오.
- 오토클레이브로 수술 장비를 소독하십시오.
- 마취 기화기를 사용하여 이소플루란으로 마우스를 마취. 마우스가 원하는 마취 깊이에 도달 할 때까지 관찰, 집게로 꼬리를 꼬집어에 대한 응답의 손실에 의해 결정. 안과 연고를 눈에 바르면 건조하지 않도록 하십시오.
- 요오드 용액 또는 70 % EtOH (3x)로 수술 분야를 소독하고 충분히 건조하십시오. 수술이 수행되는 동안 바이러스가 얼음에 해동할 수 있도록 하십시오. 흡수성 실험실 벤치 용지로 수술 부위를 덮습니다.
- 마우스의 머리를 이어바 및 코 핀치로 입체 장치에 고정시다. 머리가 안정적으로 유지되는 것을 확인한 후, 두피에 중수분리절개를 하여 브레그마와 람다의 위치가 수평선에서 같은 수준에 위치하도록 한다.
- 위치 간격을 방지하려면 코 핀치와 이어 바의 수준을 위아래로 적절하게 조정하십시오. 브레그마와 람다각각 수투라 처기탈리스와 수투라 코로날리스 또는 수투라 람도이달 사이의 교차를 지칭한다(도 2).
- 세라핀 클램프를 사용하여 피부를 잡고 두개골에 대한 접근성을 유지하십시오. 두개골의 노출 후, 요오드 또는 5 % H2O2로 두개골표면을 소독하여 bregma 및 람다를 포함한 두개골 봉합사를 보다 명확하게 시각화 할 수 있도록합니다.
- AAV 벡터 주입 준비:
- 10 mL 주사기의 내부를 순차적으로 70% EtOH, 100% EtOH 및 멸균수로 순차적으로 5회 세척합니다. 미세 사출 펌프 암의 클램프에 주사기를 고정하고 주사기의 모든 용액이 배출되었는지 확인하십시오.
- 기포없이 미네랄 오일 2 μL을 조심스럽게 흡인 한 다음 바이러스 용액의 지정된 부피를 흡인하십시오. 포부 후 플런저 버튼을 조작하고 바늘 끝에 바이러스 용액이 나타나는지 확인하십시오.
참고: 바이러스 용액의 주입 부피는 동일한 마우스 스트레인 및 동일한 바이러스 생성물들을 이용한 파일럿 실험에서 결정되었다. 바이러스 용액의 양과 감염 영역의 정도 사이의 관계는 사전에 추정되어야한다.
- AAV 벡터 주입:
- bregma에서 미세 주입 바늘의 끝을 조정하고 좌표를 원래 점으로 기록합니다. 팁을 지정된 사출 부위로 옮기고(BNST: 전방 + 0.2 mm, 절경 ± 1.0 mm, 도르소벤탈 - 4.2 mm)에 주사부위를 놓고 바늘 의 끝을 위치에 놓습니다. 0.7mm 카바이드 커터가 있는 치과 용 드릴을 사용하여 직경 약 2mm의 두개골과 드릴 구멍에 자국을 놓습니다. 경막이나 뇌 조직을 손상시키지 않도록 주의하십시오.
- 면봉으로 구멍 주위에서 혈액을 제거 한 후 바늘을 BNST의 위치로 천천히 이동시다. 기계식 마이크로인젝터로 지정된 양의 바이러스 용액(0.07 μl/min)을 천천히 주입합니다. 주사를 완료한 후, 용액이 BNST 조직에 충분히 침투할 수 있도록 5분 동안 바늘을 둡니다. 조심스럽게 바늘을 꺼낸다.
- 양측 주입의 경우, 다른 쪽에서 1.8.1-1.8.2 단계를 반복합니다. 절차 전반에 걸쳐 멸균 식염수를 적용하여 두개골을 촉촉하게 유지하십시오.
참고: 우리는 4 개의 EEG 전극 (4mm), 2 개의 EMG 전극 (2mm; 니퍼로 4mm 전극을 잘라내기) 및 6 개의 전극 (4.5 mm)(그림 2A)을가진 맞춤형 EEG/EMG 임플란트 (W: 5 mm, D: 7 mm, H: 1mm)를 사용했습니다.
- 절연의 1mm가 EMG 전극에 양쪽 끝을 벗겨되는 두 개의 스테인레스 스틸 와이어 (재료 표참조)를 납땜. 전극의 중심을 브레그마로 조정하고 각 EEG 전극의 위치를 표시한다(전방 후방 ±1.5 mm, 측각 ±1.0 mm),임플란트의 위치를 결정한다(도 2B).
- 임플란트 광섬유:
- 광섬유 페룰을 조작기에 부착하고 조종기 암을 회전하여 수평선에 대해 ±30°의 각도를 가지도록 합니다(이 과정은 BNST 자극의 경우와 같이 전극과 광섬유 간의 간섭을 피하기 위해서만 필요합니다). 섬유 팁을 브레그마에 놓고 좌표를 기록합니다.
- 팁을 대상 삽입 선으로 이동하고 두개골의 위치를 표시합니다. 또한 앵커 나사의 삽입 부위 근처에 추가 마크를 놓습니다. 치과 드릴로 각 부위의 두개골을 드릴링하여 광섬유를 삽입하고 나사를 고정합니다. 두개골에 나사를 고정합니다. 경막이 부러지거나 나사로 조직이 손상되지 않도록 주의하십시오.
- 조작기로 BNST 위에 도달할 때까지 광섬유를 부드럽게 삽입합니다. 페룰은 나머지 두개골에 놓여야한다 (그림1B).
- 섬유와 나사를 덮기 위해 광치료성 치과 용 시멘트(재료 표참조)를 적용합니다. 접착제를 고체화하는 반응 시간은 제조업체의 설명서에 의해 지정되어야합니다 (우리의 재료는 특정 파장 사진 발생기와 적어도 10 s의 빛에 노출이 필요합니다. 이 후에 접착제를 건조 할 필요가 없습니다).
- 이 단계에서는 재료(나사 또는 접착제)가 전극의 장착 공간을 차지하지 않는지 확인하십시오. 또한, 광섬유 및 케이블에 연결되는 페룰에 대한 시멘트의 중단을 피하십시오. 양측 자극을 위해 반대쪽에서 1.10.1-1.10.4 단계를 반복합니다.
- EEG/EMG 전극용 드릴 구멍. 전극의 끝을 구멍에 삽입합니다. 임플란트를 잡고 두개골과 전극 사이의 공간에 시아노아크릴레이트를 붙입니다. 소재를 방해하지 않도록 주의하여 다시 삽입하십시오.
- 전극과 광섬유의 둘레를 시아노아크릴레이트 접착제로 덮고 접착제에 시아노아크릴레이트 가속제를 적용합니다. 이 단계는 페룰-옵티시 케이블 및 전극-리드 와이어 연결 영역(그림1C)에서중단을 방지합니다.
참고: 시아노아크릴레이트 접착제와 보조제는 마우스 눈에 유해합니다. 이러한 화학 물질의 유출을 일으키지 않도록 주의하십시오. 또한 접착 응고 직후 예기치 않은 편차를 피하기 위해 전극과 섬유를 강하게 만지지 않도록주의하십시오. - 마우스 목 근육을 노출하고 근육 아래에 EMG 전극에 대한 와이어를 삽입합니다. EMG 전극의 길이를 조정하여 근육 바로 아래에 위치되도록 합니다. 전극의 끝과 근막 사이의 가벼운 연결은 EMG 신호를 잡기에 충분합니다.
- 시아노아크릴레이트 접착제를 적용하여 임플란트를 채우고 가속 액체로 접착제를 고체화합니다. 그런 다음 자세 반사가 나타날 때까지 회복을 위해 히트 패드에 마우스를 놓습니다. 동물 휴식 체온에 열 패드 온도를 조정 (C57BL6 마우스의 경우 ZT 0-12에서 36.0 °C; 38.0 °C를 초과하지 않음).
참고: 항생제는 멸균 수술에 필요하지 않습니다. - 수술 후 진통에 대한 현지 기관 지침을 따르십시오. 적어도 7 일의 회복 기간 동안 홈 케이지에 마우스를 유지.
2. 특정 수면 상태에서 표적 뉴런의 사진 여기와 EEG / EMG 모니터링
주의 사항: 이 프로토콜에는 클래스 3B 레이저 장비 또는 LED 장치의 사용이 포함됩니다. 실험자는 안전 정보를 알고 있어야 합니다. 보호 용 눈 고글이 필요합니다.
- 레이저 케이블을 광섬유에 연결하기 전에 스케일러로 레이저 강도를 조정합니다. 레이저 케이블의 끝을 페룰이 있는 사용하지 않은 광섬유에 묶고 섬유와 케이블 사이의 접합부에 공간이 없는지 확인합니다.
- 레이저의 메인 스위치를 켜고 예열될 때까지 20분 동안 기다립니다.
- 레이저를 강도 검사기로 방출하고 레이저 강도를 10mW/mm2로조정합니다. 레이저 모드를 트랜지스터 로직으로 변경하고 지속 시간 동안 10ms, 나머지 40ms, 사이클20회, 20회 반복(즉, 20s용 10ms 광 펄스의 20Hz)으로 설정된 패턴 레귤레이터에 의해 제어되는 섬유에서 광 펄스가 방출되는지 확인합니다.
- 회복 기간 후, 마우스를 EEG/EMG 를 기록하기 위한 실험 챔버로 이동시다. 일정한 23 °C에서 집 마우스와 12 시간 빛 / 어두운 주기 음식과 물 사용 가능한 광고 리비텀.
- 이식된 전극과 케이블 어댑터를 슬립 링에 연결하여 얽히지 않도록 합니다. 레이저 누출을 방지하기 위해 알루미늄 호일과 같은 광불투과성 물질로 접합을 덮는 것이 좋습니다. 양측 실험이 필요한 경우 케이블에 분기부 부착이 있는 슬립 링을 사용하십시오.
- 이 프로토콜에서는 NREM 절전 또는 REM 절음에서 깨어있는 대기 시간을 평가하므로 기록 시간은 최적화된 zeitgeber 시간으로 제한되어야 합니다(ZT0은 라이트가 켜져 있는 시간으로 정의됩니다). 이 프로토콜은 ZT4 - ZT10 사이에서 수행되었다. 마우스를 적응화로서 적어도 1시간 동안 실험 챔버에 자유롭게 머무르게 한다.
- 실험 기간 동안, 동일한 모니터에서 EEG 및 EMG 신호를 모니터링하고 마우스의 상태를 깨어, NREM 수면 또는 REM 수면으로 평가한다. 각 웨이브에 대한 게인 컨트롤을 사용하여 각 상태를 쉽게 구분할 수 있습니다.
- 깨어 대기 시간에 NREM 수면의 측정을 위해, 40 s또는 30 s에 대한 안정적인 REM 수면에 대한 안정적인 NREM 수면을 관찰 한 다음 광 자극을위한 패턴 생성기의 스위치를 켭니다 (이 프로토콜은 20 초 동안 10 ms 광 펄스의 20 Hz를 생성합니다). 이식된 광섬유에 대한 레이저 방출을 확인합니다.
- 수면 상태가 깨어로 변할 때까지 EEG/EMG 신호를 기록합니다. 두 개 이상의 실험 실험이 필요한 경우, 광자극은 수면/각성 아키텍처에 영향을 미칠 수 있는 인공 적인 개입이기 때문에 광유전학적 조작을 하루에 한 번으로 제한하십시오.
- 실험 후, 면역성화학분석을 위해 뇌 전체를 샘플링하기 위한 멸균식염수 및 파라포름알데히드(PFA)를 깊이 마취하고 투과한다(PFA).
3. NREM 수면에서 깨어까지의 대기 시간 분석
- EEG/EMG 신호를 기록한 후 수면/깨어 상태를 채점하기 위해 신호 데이터를 컴퓨터로 전송합니다. 이 프로토콜은 기록 소프트웨어와 함께 EEG 분석을 위한 방법을 설명합니다(재료 표참조).
- 절전 기호 응용 프로그램을 시작하고 파일 탭을 클릭하고 열기를 선택하여 기록된 데이터(.kcd 파일)를 선택합니다. 절전 탭을 클릭하여 각 시대의 시간 창을 조정하기 위한 Epoch 시간을 선택합니다(1epoch/4초 사용).
- EEG/EMG 신호에 따라 수면/각성 상태를 수동으로 점수화합니다: 깨어성, 높은 EMG 및 고주파의 낮은 EEG 전압; NREM, 낮은 EMG 톤 및 높은 δ (0.5-4 Hz) 주파수와 높은 EEG 전압; 및 REM, EMG는 높은 θ (6-9 Hz) 주파수와 근육 원수 및 낮은 EEG 전압을 나타냅니다. 16s(즉, 4시대)에 대해 연속적으로 계속되지 않는 상태는 안정된 상태가 아니기 때문에 상태 변경으로 정의되지 않습니다.
- 첫 번째 에보에 왼쪽 마우스 버튼을 누르고 16 s (4 시대)의 특정 추세가 끝날 때까지 커서를 드래그합니다. 그런 다음 왼쪽 마우스 버튼을 해제하고 팝업 창에서 적절한 상태(깨어 또는 NREM 수면 또는 REM 수면)를 선택합니다. 이 절차를 반복하여 파일에 기록된 모든 EEG/EMG 신호에 점수를 매김합니다.
- EEG가 NREM 또는 REM 수면을 보여주는 시대에 자극의 정확한 시간을 찾아내고, 자극 점 다음에 상태 전이를 보여주는 epoch를 찾아낸다. 자극 직후와 상태 전환 직전의 기간 사이의 epoch 수를 계산합니다.
- 그런 다음 계산된 epoch 수를 4s(A)로 곱합니다. 자극의 시대에, 스크린 샷을 가지고 자극 지점과 시대의 끝 사이의 폭을 측정합니다. 그런 다음 측정된 길이를 전체 에포크 길이로 나누고 4s(B)를 곱합니다. 마찬가지로, 상태 변화의 시기에 NREM 수면의 지속 시간을 계산하는데, 이는 시대의 시작과 상태 변경 지점(C) 사이의 시간을 의미한다.
- 합계 A, B 및 C는 NREM 수면으로부터 깨어까지의 대기 시간을 구한다. 동일한 절차는 REM 수면에서 깨어있는 상태 전환의 분석에 사용됩니다.
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Representative Results
본 연구는 수면 상태 전환에 GABABNST 뉴런의 광유전학적 흥분의 효과를 보였다. ChR2-EYFP는 BNST에서 GABA 뉴런에서 국구적으로 발현되었다. 내부 하이브리드화 운동 화학 연구는 ChR2-EYFPGAD 67 mRNA 신호를 발현 하는 뉴런에서 동국화 했다 보여주었다, 이들은 GABAergic 뉴런을 나타내는. 면역성 화학 적 슬라이스 샘플은 BNST25바로 위에있는 광섬유의 위치를 확인했습니다.
도 3A는 NREM 수면 동안 의 사진 자극 전후의 대표적인 EEG/EMG 트레이스를 나타낸다. EMG 신호가 없는 고전압 및 저속 EEG는 NREM 수면을 나타냅니다. 광자극(20초 동안 20Hz에서 10 ms 펄스)을 안정된 NREM 수면 후 적용하였다. 자극은 ChR2 발현 마우스에서 자극 후 약 2초 후 깨어있는 (활성 EMG 신호가 있는 저전압 및 고주파 EEG)로의 급성 전이를 유발합니다. 대조군 마우스(EYFP)는 자극 후 전이를 나타내지 않았다(NREM으로부터의 깨어있는 대기 시간: EYFP, 295.39±106.61 초, n=6; ChR2: 2.71 ± 0.59 초, n = 6; t10 = 2.35, p < 0.05; 그림 3B,위). 이러한 데이터는 NREM 수 면 동안 GABABNST 뉴런의 흥분 깨어의 급속 한 유도 트리거제안. 한편, REM 수면 중 의 광자극은 효과가 없었다(EYFP: 36.45±13.08 초, n=6; ChR2: 37.29 ±15.19 초, n = 6; t10 = 0.04, p = 0.484; 도 3B,하단) 그래서 NREM 수면에서만 전이 효과가 나타났다.
그림 1 : AAV, 임플란트 광섬유 및 EEG/EMG 임플란트를 주입하는 절차. (A) 바이러스 주사의 실험 절차. EYFP 융합ChR2 또는 EYFP(제어를 위한) 유전자는 그의 전사가 Cre 재조합효소에 의해 활성화되어 BAV 벡터에 통합되어 양자간 BNST 내로 주입되었다. (B) 광섬유를 전극과의 충돌을 방지하기 위해 수평으로 30° 각도로 BNST를 향해 삽입하였다. 두 개의 나사가 그 주위에 삽입되었습니다. (C) EEG/EMG 기록 장치는 광섬유의 고정 배치 후 이식하였다. (D) 수술이 끝나면 전체 수술 부위를 시아노아크릴레이트 접착제로 덮고 강하게 고정시켜야 합니다. 전극과 페룰을 연결하는 영역에 에이전트를 적용하지 않도록 하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 맞춤형 EEG/EMG 전극 및 전극 핀 삽입 부위. (A) 상단 : 6 개의 전극 핀 중 외부 두 개의 핀이 2mm로 줄어듭니다. (B) 이러한 전극과 EMG 전도 전선은 납땜됩니다. 연결 영역은 시아노아크릴레이트 접착제와 같은 절연체로 분리되어야 합니다. 전극의 삽입 부위는 bregma (전방 ± 1.5mm, 절경 ± 1.0 mm)에 상대적이다. EMG 와이어는 삽입 부위 (1mm)에서 와이어를 보호하는 절연제거와 함께 목 근육 아래에 삽입됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : GABABNST효과 NREM 수면과 REM 수면에서 상태 전환에 자극. (a) 대표적인 EEG 및 EMG 웨이브 및 EEG 전력 스펙트럼. 광자극(20초 동안 20Hz에서 10ms 펄스)을 40초 의 NREM 수면 후 ChR2 발현 GABABNST 뉴런에 적용하였다. 깨어 있는 후 급속 하 게 유도 되었다 2 s. EEG는 EMG 파열과 낮은 전압 및 고주파를 보였다. EEG 전력 스펙트로그램은 또한 낮은 주파수에서 고주파로의 전환을 보여주었습니다. (B) GABABNST 뉴런의 광유전학적 흥분은 NREM 수면에서 깨어있는 것으로의 급속한 전환을 보였지만,이 효과는 REM 수면(아래)에서 동일한 조작을 적용하는 경우에는 보이지 않았다. *p < 0.05, 웰치의 t-테스트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
우리는 여기에서 잠/각성의 국가 전환에 특정 화학 정체성을 가진 뉴런의 광유전학 자극의 효력을 평가하는 방법을 제시하고 GABABNST 뉴런의 조작의 보기를 주었습니다. 우리의 데이터는 GABABNST 뉴런의 광유전학 적 흥분은 NREM 수면에서 깨어있는 즉각적인 전환을 초래한다는 것을 보여주었습니다.
다양한 실험 설계는 광유전학 적 도구의 수많은 유형의 개발로 인해 사용할 수 있습니다. ChR2, SSFO, 할로호도신, ArchT 및 iChloC27과같은 다양한 종류의 옵신을 사용하여 특정 뉴런의 뉴런 활동을 활성화 또는 억제할 수 있다. ChR2는 광 자극 후 몇 밀리초 동안 뉴런을 활성화할 수 있으며, 이는 펄스 발생기에 의한 위상 잠금 방식으로 동작 전위를 불러일으켜 특정 수면 단계의 급성 영향을 조사하는 데 사용될 수 있습니다. 자극 후 15 내지 30분 동안 뉴런의 탈분극을 유도하는 안정한 단계 기능 opsin(SSFO)과 같은 안정적으로 활성화되는 opsin은, 또한 반만성 효과를 관찰하도록 설계된 일부 종류의 실험에 유용할 수 있다28. SSFO를 가진 탈분극화된 세포는 각종 생리적인 신경 입력에 더 과민하게 되고 장파장 광을 적용하 여 비활성화될 수 있습니다. 또한 축색 투영 부위에 광섬유를 이식하여 축을 활성화 할 수 있습니다. 섬유 자극은 특정 축색 투영 경로의 기능에 대한 정보를 제공할 수 있었다.
광유전학 적 조작 중 EEG / EMG 기록은 마우스의 수면 / 각성 상태에 대한 신경 회로의 선택적 여기 / 억제의 직접적인 결과를 결정하는 덜 침습적 인 방법입니다. 이 방법으로, 많은 신경 인구와 신경 회로 수 면/깨어 상태의 규칙에 관여 하는 것으로 나타났습니다. 이 기술의 추가 발달을 향해, 동시에 여러 경로를 조작하기 위해 여러 섬유를 이식 할 수있다, 또는이 또한 신경 활동을 모니터링하기 위해 섬유 광합성 또는 미니 스코프와 함께 사용될 수있다.
결론적으로, 광유전학은 뇌에 의한 수면 조절의 신비와 내화성 불면증 및 기타 수면 장애에 대한 혁신적인 치료법의 개발을 가속화하는 진전을 가속화할 것으로 예상됩니다.
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Disclosures
이 프로젝트는 머크 & Co.에 의해 부분적으로 재정적으로 지원되었습니다.
Acknowledgments
이 연구는 머크 조사자 연구 프로그램 (#54843), 혁신적인 영역에 대한 과학적 연구를위한 KAKENHI 보조금 지원, "윌다이내믹스"(16H06401) (T.S.), 그리고 혁신적인 영역에 대한 탐사 연구를위한 KAKENHI 그랜트 인 에이드 (T.S.) (18H02595).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x1 Fiber-optic Rotary Joints | Doric | FRJ 1x1 FC-FC | for optogenetics |
| 6-pin header | KEL corporation | DSP02-006-431G | |
| 6-pin socket | Hirose | 21602X3GSE | |
| A/D converter | Nippon koden | N/A | Analog to digital converter |
| AAV10-EF1a-DIO-ChR2-EYFP | 3.70×1013(genomic copies/ml) | ||
| AAV10-EF1a-DIO-EYFP | 5.82×1013(genomic copies/ml) | ||
| Ampicillin | Fuji film | 014-23302 | |
| Amplifier | Nippon koden | N/A | for EEG/EMG recording |
| Anesthetic vaporizer | Muromachi | MK-AT-210D | |
| Automatic injecter | KD scientific | 780311 | |
| Carbide cutter | Minitor | B1055 | φ0.7 mm. Reffered as dental drill, used with high speed rotary micromotor |
| Cyanoacrylate adhesion (Aron alpha A) and acceleration | Konishi | #30533 | |
| Dental curing light | 3M | Elipar S10 | |
| Epoxy adhesive | Konishi | #04888 | insulation around the solder of 6-pin and shielded cable |
| Fiber optic patch cord (branching) | Doric | BFP(#)_50/125/900-0.22 | |
| Gad67-Cre mice | provided by Dr. Kenji Sakimura | Cre recombinase gene is knocked-in in the Gad67 allele | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 65461-01 | |
| High speed rotary micromotor kit | FOREDOM | K.1070 | Used with carbide cutter |
| Interconnecting sleeve | Thorlab | ADAF1 | φ2.5 mm Ceramic |
| Isoflurane | Pfizer | 871119 | |
| Laser | Rapp OptoElectronic | N/A | 473 nm wave length |
| Laser intesity checker | COHERENT | 1098293 | |
| Laser stimulator | Bio research center | STO2 | reffered as pulse generator in text |
| Optic fiber with ferrule | Thorlab | FP200URT-CANNULA-SP-JP | |
| pAAV2-rh10 | provided by PennVector Core | ||
| pAAV-EF1a-DIO-EYFP-WPRE-HGHpA | Addgene | plasimid # 20296 | |
| pAAV-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-HGHpA | provided by Dr. Karl Deisseroth | ||
| Patch cord | Doric | D202-9089-0.4 | 0.4m length, laser conductor between laser and rotary joint |
| pHelper | Stratagene | ||
| Photocurable dental cement | 3M | 56846 | |
| Serafin clamp | Stoelting | 52120-43P | |
| Shielded cable | mogami | W2780 | Soldering to 6-pin socket for EEG/EMG recording |
| Sleep recording chamber | N/A | N/A | Custum-made (21 cm× 29 cm × 19 cm) with water tank holder |
| Sleep sign software | KISSEI COMTEC | N/A | for EEG/EMG analysis |
| Slip ring | neuroscience,inc | N/A | for EEG/EMG analysis |
| Stainless screw | Yamazaki | N/A | φ1.0 x 2.0 |
| Stainless wire | Cooner wire | AS633 | 0.0130 inch diameter |
| Stereotaxic frame with digital console | Koph | N/A | Model 940 |
| Syringe needle | Hamilton | 7803-05 | |
| Vital recorder software | KISSEI COMTEC | N/A | for EEG/EMG recording |
References
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