Summary
Qui, descriviamo i metodi di manipolazione optogenetica di particolari tipi di neuroni durante il monitoraggio degli stati di sonno/veglia nei topi, presentando il nostro recente lavoro sul nucleo del letto della stria terminale come esempio.
Abstract
Negli ultimi anni, l'optogenetica è stata ampiamente utilizzata in molti campi della ricerca neuroscientifica. In molti casi, un'opsina, come la rodopsina di canale 2 (ChR2), è espressa da un vettore di virus in un particolare tipo di cellule neuronali in vari topi Cre-driver. L'attivazione di queste operazioni è innescata dall'applicazione di impulsi di luce che vengono forniti da laser o LED attraverso cavi ottici, e l'effetto dell'attivazione è osservato con una risoluzione temporale molto alta. Gli sperimentatori sono in grado di stimolare acutamente i neuroni durante il monitoraggio del comportamento o di un altro risultato fisiologico nei topi. L'optogenetica può consentire strategie utili per valutare la funzione dei circuiti neuronali nella regolazione degli stati di sonno/veglia nei topi. Qui descriviamo una tecnica per esaminare l'effetto della manipolazione optogenetica dei neuroni con una specifica identità chimica durante l'elettroencefalogramma (EEG) e il monitoraggio dell'elettromiogramma (EMG) per valutare lo stadio del sonno dei topi. Ad esempio, descriviamo la manipolazione dei neuroni GABAergici nel nucleo del letto della stria terminalis (BNST). L'eccitazione optogenetica acuta di questi neuroni innesca una rapida transizione alla veglia quando applicata durante il sonno NREM. La manipolazione optogenetica insieme alla registrazione EEG/EMG può essere applicata per decifrare i circuiti neuronali che regolano gli stati di sonno/ veglia.
Introduction
Il sonno è essenziale per una funzione cognitiva ottimale. Recenti scoperte suggeriscono anche che i disturbi nel sonno sono associati a una vasta gamma di malattie1,2,3. Anche se le funzioni del sonno sono ancora in gran parte irrisolte, progressi sostanziali sono stati fatti di recente nella comprensione dei circuiti neurali e dei meccanismi che controllano il sonno / veglia stati4. Nei mammiferi, ci sono tre stati di vigilanza: veglia, sonno non rapido degli occhi (NREM), e rapido movimento degli occhi (REM) sonno. La Veglia è caratterizzata da oscillazioni EEG veloci (5-12 Hz) di bassa ampiezza con un'attività motoria mirata e sostenuta. Il sonno NREM è definito da oscillazioni lente (1-4 Hz) di alta ampiezza (onde delta), con mancanza di coscienza e attività motoria mirata. Il sonno REM è caratterizzato da oscillazioni relativamente veloci (6-12 Hz) di bassa ampiezza e atonia muscolare bilaterale quasi completa5.
Borbely ha proposto una teoria della regolazione della veglia del sonno nota come il modello di processo a due6,7. Un processo omeostatico, indicato anche come processo S, rappresenta la pressione del sonno che si accumula durante la veglia e si dissipa durante il sonno. Un altro processo, indicato come processo C, è un processo circadiano, che spiega perché i livelli di vigilanza fluttuano nel ciclo di 24 h. Oltre a questi due processi, fattori allostatici sono anche importanti per la regolazione del sonno/ veglia8,9. I fattori allostatici includono stati nutrizionali ed emozioni. La paura e l'ansia sono di solito accompagnate da un aumento dell'eccitazione insieme alle risposte autonomiche e neuroendocrine10,11,12. Si ritiene che il sistema limbico svolgi un ruolo nella regolazione della paura e dell'ansia, e i meccanismi alla base delle risposte autonome e neuroendocrine sono stati studiati ampiamente, ma il percorso attraverso il quale il sistema limbico influenza gli stati di sonno/veglia non ancora rivelato. Un gran numero di studi recenti che utilizzano opto e farmacogenetica hanno suggerito che i neuroni e i circuiti neuronali che regolano gli stati di sonno/veglia sono distribuiti in tutto il cervello, tra cui cortice, prosencefalo basale, talamo, ipotalamo, e il tronco encefalico. In particolare, i recenti progressi nell'optogenetica ci hanno permesso di stimolare o inibire specifici circuiti neurali in vivo con elevate risoluzioni spaziali e temporali. Questa tecnica permetterà di progredire nella nostra comprensione dei substrati neurali di sonno e veglia, e come gli stati di sonno / veglia sono regolati da processi circadiani, pressione del sonno, e fattori allostatici, tra cui l'emozione. Questo documento ha lo scopo di introdurre come utilizzare la manipolazione optogenetica combinata con la registrazione sonno/veglia, che potrebbe avere il potenziale per aggiornare la nostra comprensione dei connettomi e dei meccanismi nel cervello che svolgono un ruolo nella regolazione del sonno NREM, del sonno REM, e la veglia. La comprensione di questo meccanismo con cui il sistema limbico regola gli stati di sonno/veglia è di fondamentale importanza per la salute, perché l'insonnia è di solito associata all'ansia o alla paura di non riuscire a dormire (somnifobia).
Si ritiene che il BNST svolgga un ruolo essenziale nell'ansia e nella paura. GAD 67-esprimendo neuroni GABAergic sono una popolazione maggiore del BNST12,13. Abbiamo esaminato l'effetto della manipolazione optogenetica di questi neuroni (GABABNST) sugli stati di sonno/ veglia. Uno dei più grandi progressi nelle neuroscienze negli ultimi anni sono stati i metodi che consentono la manipolazione di neuroni con particolari identità chimiche in vivo, con alte risoluzioni spaziali e temporali. L'optogenetica è molto utile per dimostrare i collegamenti causali tra l'attività neurale e le risposte comportamentali specifiche14. Descriviamo l'optogenetica come un metodo per esaminare la connettività funzionale dei circuiti neurali definiti nella regolazione degli stati di sonno/veglia. Utilizzando questa tecnica, sono stati compiuti grandi progressi nella comprensione dei circuiti neuronali che regolano gli stati di sonno/veglia15,16,17,18,19 . In molti casi, gli opsin sono specificamente introdotti nei neuroni con particolari identità chimiche nelle regioni cerebrali selettive da una combinazione di topi Cre-driver e trasferimento genico mediato da Cre-inducible AAV. Inoltre, l'espressione focale di opsine fotosensibili come la channelrhodopsin 2 (ChR2)20 o l'archeerhodopsin (ArchT)21 combinata con un sistema Cre-loxP o Flp-FRT ci permette di manipolare una popolazione neuronale selettiva e specifica percorso neurale22.
Descriviamo qui esperimenti sui neuroni GABAergici nel BNST come esempio. Per esprimere le operazioni in una popolazione neuronale designata, i topi del conducente Cre appropriati e i vettori del virus dipendenti dal Cre sono più frequentemente utilizzati. Sono utili anche linee transgeniche o knock-in in cui le opsine sono espresse in particolari popolazioni neuronali. Nei seguenti esperimenti, abbiamo usato i topi Knock-in GAD67-Cre 23 in cui solo i neuroni GABAergici esprimono la Ricombinani Cre con un background genetico C57BL/6J e un vettore AAV che contiene ChR2 (hChR2 H134R) fuso con EYFP o EYFP come controllo con un interruttore "FLEx (Flip-excision)"24. La procedura descrive specificamente l'eccitazione optogenetica dei neuroni GABAergici nel BNST durante il monitoraggio degli stati di sonno/veglia25.
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Protocol
Tutti gli esperimenti qui sono stati approvati dal Comitato per l'esperimento e l'uso degli animali dell'Università di Tsukuba, nel rispetto delle linee guida NIH.
1. Chirurgia animale, iniezione di virus, elettrodo per EEG/EMG e impianto in fibra ottica
ATTENZIONE: Occorre selezionare adeguate tecniche di protezione e manipolazione in base al livello di biosicurezza del virus da utilizzare. AAV deve essere utilizzato in una stanza isolata con grado P1A per l'iniezione, e il tubo che trasporta AAV deve essere sterilizzato con un'autoclave dopo che tutto il volume è esaurito. Il sito chirurgico e tutto il materiale impiantato devono essere puliti e sterili durante l'uso.
NOT: Vedere La Figura 1.
- Disinfettare l'apparecchiatura chirurgica con l'autoclave.
- Anestetizza i topi con isoflurane utilizzando un vaporizzatore anestetico. Osservare fino a quando il mouse ha raggiunto la profondità desiderata di anestesia, determinata dalla perdita di risposta a pizzicare la coda con pinze. Applicare unguento oftalmico agli occhi per evitare che si annistringano.
- Disinfettare il campo chirurgico con soluzione di iodio o 70% EtOH (3x) e asciugare sufficientemente. Lasciare che il virus si scongeli sul ghiaccio durante l'intervento chirurgico. Coprire l'area chirurgica con carta da banco da laboratorio assorbente.
- Fissare la testa del mouse nell'apparato stereotassico con barre dell'orecchio e un pizzico naso. Dopo aver confermato che la testa è tenuta in modo stabile, fare un'incisione midsagittale nel cuoio capelluto per garantire le posizioni del bregma e lambda si trovano allo stesso livello su una linea orizzontale.
- Per evitare uno spazio di posizionamento, regolare in modo appropriato i livelli del pizzico del naso e delle barre dell'orecchio su e giù. Il bregma e la lambda si riferiscono all'intersezione tra i saggitalis sutura e sutura coronalis o sutura lambdoidal, rispettivamente (Figura 2).
- Utilizzare morsetti Serafin per tenere la pelle per mantenere l'accesso al cranio. Dopo l'esposizione del cranio, disinfettare la superficie del cranio con iodio o 5% H2O2, per consentire le suture craniche tra cui il bregma e lambda da visualizzare più chiaramente.
- Preparare l'iniezione vettoriale AAV:
- Lavare l'interno di una siringa da 10 mL (vedi Tabella deiMateriali) in sequenza con 70% EtOH, 100% EtOH e acqua sterilizzata, 5 volte ciascuna. Fissare la siringa nel morsetto di un braccio pompa di microiniezione e assicurarsi che tutta la soluzione nella siringa sia scarica.
- Aspirare con cura 2 l di olio minerale senza bolle d'aria, quindi aspirare il volume designato della soluzione del virus. Dopo l'aspirazione, manipolare il pulsante dello stantuffo e confermare che la soluzione antivirus emerge sulla punta dell'ago.
NOT: Il volume di iniezione della soluzione antivirus è stato determinato negli esperimenti pilota che utilizzano lo stesso ceppo di topo e lo stesso prodotto antivirus. La relazione tra il volume della soluzione virale e l'estensione dell'area di infezione dovrebbe essere stimata in anticipo.
- Vettore AAV iniettare:
- Regolare la punta dell'ago di microiniezione sul bregma e notare le coordinate come punto originale. Spostare la punta sul sito di iniezione designato (per il BNST: anteroposteriore , 0,2 mm, mediolaterale , 1,0 mm, dorsoventral - 4,2 mm) e posizionare la punta dell'ago sulla posizione. Mettere un segno sul cranio e fori di circa 2 mm di diametro utilizzando un trapano dentale con una fresa carbide da 0,7 mm. Fare attenzione a non danneggiare la dura o tessuto cerebrale.
- Dopo aver rimosso il sangue dai fori con un tampone di cotone, spostare lentamente l'ago nella posizione del BNST. Iniettare lentamente la quantità designata di soluzione virale (0,07 l/min) con un microiniettore meccanico. Dopo aver completato l'iniezione, lasciare l'ago per 5 min per consentire alla soluzione di infiltrarsi sufficientemente nel tessuto BNST. Estrarre con attenzione l'ago.
- Per l'iniezione bilaterale, ripetere i passaggi 1.8.1-1.8.2 sull'altro lato. Durante la procedura, mantenere il cranio umido con applicazioni di salina sterile.
NOT: Abbiamo usato impianti EEG/EMG personalizzati (W: 5 mm, D: 7 mm, H: 1 mm) con quattro elettrodi EEG (4 mm), due elettrodi EMG (2 mm; tagliare l'elettrodo da 4 mm a 2 mm con nipper) e 6 elettrodi (4,5 mm) (Figura 2A).
- Solder due fili in acciaio inox (vedi Tabella dei materiali) da cui 1 mm dell'isolamento viene rimosso da entrambe le estremità agli elettrodi EMG. Regolare il centro degli elettrodi sul bregma e contrassegnare la posizione di ogni elettrodo EEG (anteroposteriore - 1,5 mm, medio-1,0 mm) e determinare la posizione dell'impianto (Figura 2B).
- Impiantio fibre ottiche:
- Fissare un ferrule di fibra ottica al manipolatore e ruotare il braccio manipolatore in modo che abbia un angolo di 30 gradi contro una linea orizzontale (questo processo è necessario solo per evitare interferenze tra elettrodi e fibre ottiche, come nel caso della stimolazione BNST). Mettere la punta di fibra sul bregma e registrare le coordinate.
- Spostare la punta sulla riga di inserimento mirata e contrassegnare la posizione sul cranio. Posizionare anche segni aggiuntivi vicino al sito di inserimento per le viti di ancoraggio. Forare il cranio su ogni sito con un trapano dentale per inserire la fibra ottica e fissare la vite. Fissa la vite sul cranio. Fare attenzione a non rompere la dura o danneggiare qualsiasi tessuto da vite.
- Inserire delicatamente la fibra ottica fino a raggiungere sopra il BNST con un manipolatore. Il ferrule dovrebbe poggiare sul cranio rimanente (Figura 1B).
- Applicare il cemento dentale fotocurabile (vedi Tabella deimateriali) per coprire la fibra e la vite. Il tempo di reazione per solidificare la colla deve essere specificato dal manuale del produttore (il nostro materiale ha bisogno di esposizione alla luce per almeno 10 s con specifico generatore fotografico di lunghezza d'onda. Non è necessario asciugare la colla dopo questo).
- In questo passaggio, assicurarsi che nessun materiale (vite o colla) occupi lo spazio di montaggio per gli elettrodi. Inoltre, evitare di effettuare qualsiasi interruzione del cemento per il ferrule che si collega alla fibra ottica e al cavo. Ripetere i passaggi da 1.10.1-1.10.4 sul lato opposto per la stimolazione bilaterale.
- Fori di perforazione per elettrodi EEG/EMG. Inserire le punte degli elettrodi nei fori. Tenere l'impianto e applicare l'adesivo cianoacrilato nello spazio tra il cranio e gli elettrodi. Inserire di nuovo con attenzione a non interferire con alcun materiale.
- Coprire la circonferenza degli elettrodi e delle fibre ottiche con adesivo cianoacrilato seguito dall'applicazione dell'accelerante cianoacrita sull'adesivo. Questo passaggio evita di causare interruzioni nella zona di collegamento del cavo ferrule-to-optic o del filo elettrodo-a-piombo (Figura 1C).
NOT: Cianoacrylate adesivo e il suo accelerante sono dannosi per l'occhio del topo. Prestare attenzione a non causare la fuoriuscita di queste sostanze chimiche. Inoltre, fare attenzione a non toccare con forza gli elettrodi e le fibre al fine di evitare deviazioni impreviste immediatamente dopo la solidificazione adesiva. - Esporre i muscoli del collo del mouse e inserire i fili per l'elettrodo EMG sotto il muscolo. Regolare la lunghezza dell'elettrodo EMG in modo che si localizzi appena sotto i muscoli nuchi. La connessione luminosa tra la punta dell'elettrodo e la fascia muscolare è sufficiente per catturare il segnale EMG.
- Applicare l'adesivo cianoacrilato per riempire gli impianti e solidificare l'adesivo con liquido di accelerazione. Quindi, mettere il mouse su un pad di calore per il recupero fino a quando non appare il riflesso posturale. Regolare la temperatura del termoma alla temperatura corporea di riposo degli animali (36,0 gradi centigradi in T-12 nel caso di topi C57BL6; non superare i 38,0 gradi centigradi).
NOT: Non è necessario un antibiotico per la chirurgia sterile. - Segui le tue linee guida istituzionali locali per l'analgesia post-operatoria. Tenere i topi in una gabbia di casa per un periodo di recupero di almeno 7 giorni.
2. Monitoraggio EEG/EMG con foto-eccitazione di neuroni mirati in stati di sonno specifici
ATTENZIONE: Questo protocollo include l'uso di apparecchiature laser di classe 3B o dispositivi LED. Gli sperimentatori devono essere a conoscenza delle informazioni di sicurezza. Sono necessari occhiali protettivi.
- Prima di collegare il cavo laser alla fibra ottica, regolare l'intensità del laser con un scaler. Lesing la punta del cavo laser a una fibra ottica inutilizzata con un ferrule e confermare che non c'è spazio alla giunzione tra la fibra e il cavo.
- Accendere l'interruttore principale del laser e attendere 20 min per farlo riscaldare.
- Emettere il laser al controllo dell'intensità e regolare l'intensità del laser a 10 mW/mm2. Modificare la modalità laser in logica a transistor e verificare che gli impulsi di luce vengano emessi dalla fibra controllata dal regolatore di ripetizione che è impostata a 10 ms per la durata, 40 ms per il riposo, 20 volte per il ciclo e 20 volte la ripetizione (cioè 20 Hz di 10 ms impulsi di luce per 20 s).
- Dopo il periodo di recupero, spostare i topi nella camera sperimentale per la registrazione di EEG/EMG. Casa topi a una costante di 23 gradi centigradi con un ciclo di 12 h di luce / buio con cibo e acqua disponibili ad libitum.
- Collegare l'elettrodo impiantato e l'adattatore del cavo che è legato ad un anello di slittamento per evitare impigliamenti. Si raccomanda di coprire la giunzione con materiale impermeabile leggero come lamina di alluminio per evitare perdite laser. Se è necessario un esperimento bilaterale, utilizzare un anello di slittamento con un attacco biforcato per i cavi.
- In questo protocollo, valutiamo la latenza alla veglia dal sonno NREM o dal sonno REM, quindi il tempo di registrazione dovrebbe essere limitato nel tempo di zeitgeber ottimizzato (il valore di T0 è definito come il momento in cui la luce è accesa). Questo protocollo è stato condotto tra il protocollo T4 e T10. Lasciare che i topi rimangano liberamente nella camera sperimentale per almeno 1 h come acclimatazione.
- Durante il periodo sperimentale, monitorare i segnali EEG ed EMG nello stesso monitor e valutare lo stato del mouse come veglia, sonno NREM o sonno REM. Utilizzare il controllo del guadagno per ogni ondata per facilitare la distinzione di ogni stato.
- Per la misurazione della latenza di veglia del sonno NREM, osservare il sonno NREM stabile per 40 s o il sonno REM stabile per 30 s, quindi accendere l'interruttore del generatore di pattern per la fotostimolazione (questo protocollo genera 20 Hz di 10 ms impulsi di luce per 20 s). Confermare l'emissione del laser alle fibre ottiche impiantate.
- Registrare i segnali EEG/EMG fino a quando lo stato del sonno cambia in veglia. Se sono necessarie due o più sperimentazioni sperimentali, limitare la manipolazione optogenetica a una volta al giorno perché la fotostimolazione è un intervento artificiale che potrebbe influenzare l'architettura sonno/ veglia.
- Dopo l'esperimento, anestesizzare profondamente e perfemare con sterile salina e paraformaldeide (PFA) per il campionamento dell'intero cervello per l'analisi immunohistochimica26.
3. Analisi del tempo di latenza dal sonno NREM alla Veglia
- Dopo aver registrato i segnali EEG/EMG, trasferire i dati del segnale su un computer per il punteggio degli stati di sospensione/veglia. Questo protocollo descrive il metodo per l'analisi EEG con software di registrazione (vedere Tabella dei materiali).
- Avviare l'applicazione di sospensione e fare clic sulla scheda File e selezionare Apri per scegliere i dati registrati (file .kcd). Fare clic sulla scheda Sospensione per selezionare Tempo eorale per la regolazione dell'intervallo di tempo per ogni epoca (usiamo 1 epoca/4 sec).
- Segnare manualmente gli stati di sonno / veglia in base ai segnali EEG/EMG, secondo i seguenti criteri: veglia, alta tensione EMG e bassa tensione EEG con alta frequenza; NREM, basso tono EMG e alta tensione EEG con frequenza alta (0,5-4 Hz); e REM, EMG indica l'atonia muscolare e la bassa tensione EEG con un'alta frequenza di 6-9 Hz. Uno stato che non continua consecutivamente per 16 s (cioè 4 epoche) non è definito come un cambiamento di stato perché non è uno stato stabile.
- Fare clic e tenere premuto il pulsante sinistro del mouse sulla prima epoca e trascinare il cursore fino a quando la tendenza specifica di più di 16 s (4 epoche) è terminata. Quindi, rilasciare il pulsante sinistro del mouse e scegliere lo stato appropriato (veglia o sonno NREM o sonno REM) nella finestra pop-up. Ripetere questa procedura per assegnare un punteggio a tutti i segnali EEG/EMG registrati nel file.
- Trova il tempo esatto di stimolazione nell'epoca in cui l'EEG mostra il sonno NREM o REM, e l'epoca che mostra la transizione di stato dopo il punto di stimolazione. Contare il numero di epoche tra i periodi subito dopo la stimolazione e poco prima della transizione di stato.
- Quindi moltiplicare il numero contato di epoche per 4 s (A). Nell'epoca della stimolazione, scattare una schermata e misurare la larghezza tra il punto di stimolazione e la fine dell'epoca. Quindi, dividere la lunghezza misurata per l'intera lunghezza dell'epoca e moltiplicare per 4 s (B). Analogamente, calcolare la durata della sospensione NREM nell'epoca del cambiamento di stato, il che significa il tempo tra l'inizio dell'epoca e il punto di modifica dello stato (C).
- Somma A, B e C per ottenere la latenza dal sonno NREM alla veglia. La stessa procedura viene utilizzata per l'analisi della transizione di stato dal sonno REM alla veglia.
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Representative Results
Il presente studio ha mostrato l'effetto dell'eccitazione optogenetica dei neuroni GABABNST sulla transizione dello stato del sonno. ChR2-EYFP è stato espresso focalmente nei neuroni GABA nel BNST. Uno studio istochimico di ibridazione in situ ha mostrato che ChR2-EYFP è stato colocalizzato nei neuroni che esprimono segnali mRNA GAD 67, indicando che questi sono neuroni GABAergic. I campioni di fette immunoistochimiche hanno confermato la posizione della fibra ottica, la cui punta era appena sopra il BNST25.
La figura 3A mostra tracce EEG/EMG rappresentative prima e dopo la fotostimolazione durante il sonno NREM. EEG ad alta tensione e frequenza lenta senza segnali EMG rappresentano il sonno NREM. La fotostimolazione (10 ms pulses a 20 Hz per 20 sec) è stata applicata dopo un sonno NREM stabile. La stimolazione innesca una transizione acuta alla veglia (eEG ad alta tensione e ad alta frequenza con segnali EMG attivi) circa 2 s dopo la stimolazione nei topi che esprimono ChR2. I topi di controllo (EYFP) non hanno mostrato la transizione dopo la stimolazione (latenza di veglia da NREM: EYFP, 295,39 x 106,61 sec, n - 6; ChR2: 2,71 x 0,59 sec, n - 6; t10 - 2,35, p < 0,05; Figura 3B, superiore). Questi dati suggeriscono che l'eccitazione dei neuroni GABABNST durante il sonno NREM innesca una rapida induzione della veglia. D'altra parte, la fotostimolazione durante il sonno REM non ha avuto alcun effetto (EYFP: 36,45 x 13,08 sec, n - 6; ChR2: 37,29 x 15,19 sec, n - 6; t10 - 0,04, p - 0,484; Figura 3B, in modo da emersi un effetto di transizione solo nel sonno NREM.
Figura 1 : procedura per iniettare AAV, fibre ottiche impiantate e impianti EEG/EMG. (A) Procedura sperimentale di iniezione di virus. Il gene ChR2 o EYFP (per il controllo) fuso eYFP incorporato nel vettore AAV la cui trascrizione è attivata da Cre ricombinase è stata iniettata bilateralmente nel BNST. (B) Le fibre ottiche sono state inserite verso il BNST ad un angolo di 30 gradi rispetto all'orizzontale per evitare collisioni con l'elettrodo. Due viti sono state inserite intorno ad esso. (C) Il dispositivo di registrazione EEG/EMG è stato impiantato dopo il posizionamento protetto delle fibre ottiche. (D) Al termine dell'operazione, l'intera area chirurgica deve essere coperta con adesivo cianoacrilato e fortemente fissata. Assicurarsi di non applicare alcun agente alla regione che collega l'elettrodo e le ferregole. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Siti di inserimento di perni di elettrodi ed elettrodi personalizzati EEG/EMG. (A) Top: Su 6 perni elettrodi, i due perni esterni sono tagliati a 2 mm. Bottom: elettrodi EEG/EMG. (B) Questi elettrodi e fili di conduzione EMG vengono quindi saldati. La zona di collegamento deve essere isolata con qualsiasi isolamento come l'adesivo cianoacrilato. I siti di inserimento degli elettrodi sono relativi al bregma (anteroposteriore - 1,5 mm, mediolaterale - 1,0 mm). I fili EMG sono inseriti sotto il muscolo del collo con la rimozione dell'isolamento che protegge il filo nel punto di inserimento (1 mm). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Effetto del GABABNST stimolazione della transizione di stato nel sonno NREM e nel sonno REM. (A) Rappresentativo dello spettro di potenza eEG ed eMG. La fotostimolazione (10 ms pulses a 20 Hz per 20 sec) è stata applicata ai neuroni GABABNST che hanno espresso ChR2 dopo il sonno NREM di 40 s. La veglia è stata rapidamente indotta dopo un 2 s. L'EEG ha mostrato bassa tensione e alta frequenza con EMG bursting. Lo spettrogramma di potenza EEG ha anche mostrato la transizione da bassa ad alta frequenza. (B) L'eccitazione optogenetica dei neuroni GABABNST ha mostrato una rapida transizione dal sonno NREM alla veglia (superiore), ma questo effetto non è stato visto nel caso di applicare la stessa manipolazione nel sonno REM (in basso). -p < 0,05, test t-test di Welch. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Abbiamo presentato un metodo per valutare l'effetto della stimolazione optogenetica dei neuroni con particolari identità chimiche sulle transizioni di stato del sonno / veglia e ha dato un esempio di manipolazione dei neuroni GABABNST. I nostri dati hanno mostrato che l'eccitazione optogenetica dei neuroni GABABNST si traduce in transizione immediata dal sonno NREM alla veglia.
Vari progetti sperimentali sono disponibili a causa dello sviluppo di numerosi tipi di strumenti optogenetici. È possibile attivare o inibire l'attività neuronale di particolari neuroni utilizzando diversi tipi di opsina, come ChR2, SSFO, halorhodopsin, ArchT, e iChloC27. ChR2 può attivare i neuroni pochi millisecondi dopo la fotostimolazione e questo può essere utilizzato per evocare potenziali di azione in modo fase-lock da un generatore di impulsi per esaminare l'impatto acuto in fasi di sonno specifiche. Un'opsina che attiva stabilmente come l'opsina a gradino stabile (SSFO), che induce la depolarizzazione dei neuroni per 15-30 min dopo la stimolazione, potrebbe anche essere utile per alcuni tipi di esperimenti progettati per osservare un effetto semi-cronico28. Le cellule depolarizzate con SSFO potrebbero diventare più sensibili a vari input neuronali fisiologici ed essere disattivate applicando la luce a lunga lunghezza d'onda. Inoltre, possiamo attivare gli assoni con l'impianto di fibre ottiche nel sito di una proiezione assonale. La stimolazione della fibra potrebbe fornire informazioni sulla funzione di una particolare via di proiezione assonale.
La registrazione EEG/EMG durante la manipolazione optogenetica è un metodo meno invasivo per determinare le conseguenze dirette dell'eccitazione/inibizione selettiva dei circuiti neurali sugli stati di sonno/veglia nei topi. Con questo metodo, molte popolazioni neuronali e circuiti neurali hanno dimostrato di essere coinvolti nella regolazione degli stati di sonno / veglia. Verso l'ulteriore sviluppo di questa tecnica, è possibile impiantare più fibre per manipolare più percorsi contemporaneamente, o questo potrebbe essere utilizzato anche in combinazione con fibra fotometoria o miniscopi per monitorare le attività neuronali.
In conclusione, si prevede che l'optogenetica accelererà i progressi nello sblocco del mistero della regolazione del sonno da parte del cervello e lo sviluppo di terapie innovative per l'insonnia refrattaria e altri disturbi del sonno.
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Disclosures
Questo progetto è stato in parte sostenuto finanziariamente da Merck & Co.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto dal Merck Investigator Studies Program (#54843), da un KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas, "WillDynamics" (16H06401) (T.S.) e da un KAKENHI Grant-in-Aid for Exploratory Research on Innovative Areas (T.S.) (18H02595).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x1 Fiber-optic Rotary Joints | Doric | FRJ 1x1 FC-FC | for optogenetics |
| 6-pin header | KEL corporation | DSP02-006-431G | |
| 6-pin socket | Hirose | 21602X3GSE | |
| A/D converter | Nippon koden | N/A | Analog to digital converter |
| AAV10-EF1a-DIO-ChR2-EYFP | 3.70×1013(genomic copies/ml) | ||
| AAV10-EF1a-DIO-EYFP | 5.82×1013(genomic copies/ml) | ||
| Ampicillin | Fuji film | 014-23302 | |
| Amplifier | Nippon koden | N/A | for EEG/EMG recording |
| Anesthetic vaporizer | Muromachi | MK-AT-210D | |
| Automatic injecter | KD scientific | 780311 | |
| Carbide cutter | Minitor | B1055 | φ0.7 mm. Reffered as dental drill, used with high speed rotary micromotor |
| Cyanoacrylate adhesion (Aron alpha A) and acceleration | Konishi | #30533 | |
| Dental curing light | 3M | Elipar S10 | |
| Epoxy adhesive | Konishi | #04888 | insulation around the solder of 6-pin and shielded cable |
| Fiber optic patch cord (branching) | Doric | BFP(#)_50/125/900-0.22 | |
| Gad67-Cre mice | provided by Dr. Kenji Sakimura | Cre recombinase gene is knocked-in in the Gad67 allele | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 65461-01 | |
| High speed rotary micromotor kit | FOREDOM | K.1070 | Used with carbide cutter |
| Interconnecting sleeve | Thorlab | ADAF1 | φ2.5 mm Ceramic |
| Isoflurane | Pfizer | 871119 | |
| Laser | Rapp OptoElectronic | N/A | 473 nm wave length |
| Laser intesity checker | COHERENT | 1098293 | |
| Laser stimulator | Bio research center | STO2 | reffered as pulse generator in text |
| Optic fiber with ferrule | Thorlab | FP200URT-CANNULA-SP-JP | |
| pAAV2-rh10 | provided by PennVector Core | ||
| pAAV-EF1a-DIO-EYFP-WPRE-HGHpA | Addgene | plasimid # 20296 | |
| pAAV-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-HGHpA | provided by Dr. Karl Deisseroth | ||
| Patch cord | Doric | D202-9089-0.4 | 0.4m length, laser conductor between laser and rotary joint |
| pHelper | Stratagene | ||
| Photocurable dental cement | 3M | 56846 | |
| Serafin clamp | Stoelting | 52120-43P | |
| Shielded cable | mogami | W2780 | Soldering to 6-pin socket for EEG/EMG recording |
| Sleep recording chamber | N/A | N/A | Custum-made (21 cm× 29 cm × 19 cm) with water tank holder |
| Sleep sign software | KISSEI COMTEC | N/A | for EEG/EMG analysis |
| Slip ring | neuroscience,inc | N/A | for EEG/EMG analysis |
| Stainless screw | Yamazaki | N/A | φ1.0 x 2.0 |
| Stainless wire | Cooner wire | AS633 | 0.0130 inch diameter |
| Stereotaxic frame with digital console | Koph | N/A | Model 940 |
| Syringe needle | Hamilton | 7803-05 | |
| Vital recorder software | KISSEI COMTEC | N/A | for EEG/EMG recording |
References
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