Summary
Aqui, nós descrevemos métodos da manipulação optogenética de tipos particulares de neurônios durante a monitoração de Estados do sono/wakefulness nos ratos, apresentando nosso trabalho recente no núcleo da cama do terminalis do stria como um exemplo.
Abstract
Nos últimos anos, a optogenética tem sido amplamente utilizada em muitos campos da pesquisa neurocientífica. Em muitos casos, um opsin, tal como a canaleta rodopsina 2 (ChR2), é expressado por um vetor do vírus em um tipo particular de pilhas neuronal em vários ratos do CRE-excitador. A ativação desses opsinas é desencadeada pela aplicação de pulsos leves que são entregues por laser ou LED através de cabos ópticos, e o efeito da ativação é observado com resolução de tempo muito alta. Os experimentadores são capazes de estimular agudamente os neurônios enquanto monitoram o comportamento ou outro resultado fisiológico em camundongos. A optogenética pode permitir estratégias úteis para avaliar a função dos circuitos neuronais na regulação dos Estados de sono/vigília em camundongos. Aqui nós descrevemos uma técnica para examinar o efeito da manipulação optogenética dos neurônios com uma identidade química específica durante o eletroencefalograma (EEG) e a monitoração do electromyogram (EMG) para avaliar o estágio do sono dos ratos. Como um exemplo, nós descrevemos a manipulação de neurônios GABAergic no núcleo da cama do terminalis do stria (BNST). A excitação optogenética aguda desses neurônios desencadeia uma rápida transição para a vigília quando aplicada durante o sono NREM. A manipulação optogenetic junto com a gravação de EEG/EMG pode ser aplicada para decifrar os circuitos neuronal que regulam Estados do sono/wakefulness.
Introduction
O sono é essencial para a função cognitiva ideal. Achados recentes também sugerem que distúrbios no sono estão associados a uma ampla gama de doenças1,2,3. Embora as funções do sono sejam ainda largamente não resolvidas, o progresso substancial foi feito recentemente em compreender os circuitos e os mecanismos neural que controlam Estados do sono/vigília4. Nos mamíferos, há três Estados de vigilância: vigília, sono não-rápido do movimento de olho (NREM), e sono rápido do movimento de olho (REM). A vigília é caracterizada por oscilações rápidas de EEG (5-12 Hz) de baixa amplitude com atividade motora proposital e sustentada. O sono NREM é definido por oscilações lentas (1-4 Hz) de alta amplitude (ondas delta), com falta de consciência e atividade motora proposital. O sono REM é caracterizado por oscilações relativamente rápidas (6-12 Hz) de baixa amplitude e atonia muscular bilateral quase completa5.
Borbely propôs uma teoria da regulação do sono-vigília conhecida como o modelo de dois processos6,7. Um processo homeostático, também conhecido como processo S, representa a pressão do sono que se acumula durante A vigília e se dissipa durante o sono. Outro processo, referido como processo C, é um processo circadiano, o que explica por que os níveis de vigilância flutuam no ciclo de 24 h. Além desses dois processos, fatores alopáticos também são importantes para a regulação do sono/vigília8,9. Fatores alopáticos incluem Estados nutricionais e emoção. O medo e a ansiedade geralmente são acompanhados por um aumento da excitação junto com as respostas autonômicas e neuroendócrinas10,11,12. Acredita-se que o sistema límbico desempenhe um papel na regulação do medo e da ansiedade, e os mecanismos subjacentes às respostas autonômicas e neuroendócrinas têm sido estudados extensivamente, mas o caminho pelo qual o sistema límbico influencia os Estados de sono/vigília não tem ainda foi revelado. Um grande número de estudos recentes usando opto e farmacogenética sugeriram que os neurônios e os circuitos neuronais que regulam os Estados de sono/vigília são distribuídos por todo o cérebro, incluindo os córtices, o forebrain basal, o tálamo, o hipotálamo, e tronco cerebral. Em particular, os recentes avanços na optogenética nos permitiram estimular ou inibir circuitos neurais específicos in vivo com altas resoluções espaciais e temporais. Esta técnica permitirá o progresso em nosso entendimento dos substratos neurais do sono e vigília, e como os Estados de sono/vigília são regulados por processos circadianos, pressão do sono, e fatores alopáticos, incluindo a emoção. Este artigo tem como objetivo apresentar como usar a manipulação optogenética combinada com gravação de sono/vigília, o que poderia ter o potencial de atualizar nossa compreensão dos conectomes e mecanismos no cérebro que desempenham um papel na regulação do sono NREM, sono REM, e vigília. A compreensão deste mecanismo pelo qual o sistema límbico regula os Estados de sono/vigília é de suma importância para a saúde, porque a insônia é geralmente associada com ansiedade ou medo de ser incapaz de dormir (somniphobia).
O BNST é pensado para desempenhar um papel essencial na ansiedade e no medo. Gad 67-expressar os neurônios gabaérgicos são uma grande população do BNST12,13. Nós examinamos o efeito da manipulação optogenética destes neurônios (GABABNST) em Estados do sono/wakefulness. Um dos maiores avanços na neurociência nos últimos anos tem sido métodos que possibilitam a manipulação de neurônios com identidades químicas particulares in vivo, com altas resoluções espaciais e temporais. A optogenética é altamente útil para demonstrar vínculos causais entre a atividade neural e as respostas comportamentais específicas14. Nós descrevemos o optogenetics como um método para examinar a conectividade funcional de circuitos neural definidos na regulação de Estados do sono/vigília. Utilizando essa técnica, grandes avanços foram alcançados na compreensão dos circuitos neuronais que regulam os Estados de sono/vigília15,16,17,18,19 . Em muitos casos, os opsinas são introduzidos especificamente nos neurônios com as identidades químicas particulares em regiões seletivas do cérebro por uma combinação de ratos do CRE-excitador e transferência AAV-negociada CRE-inducible do gene. Mais, a expressão focal de opsinas foto-sensíveis tais como o channelrhodopsin 2 (ChR2)20 ou o archaerhodopsin (archt)21 combinados com um sistema de CRE-Loxp ou de FLP-FRT permitem-nos de manipular uma população neuronal seletiva e um específico via neural22.
Nós descrevemos aqui experiências em neurônios GABAergic no BNST como um exemplo. Para expressar opsinas em uma população neuronal designada, os ratos apropriados do excitador de CRE e os vetores CRE-dependentes do vírus são usados o mais freqüentemente. As linhas transgénicas ou de Knock-in em que os opsinas são expressos em populações neuronal particulares são igualmente úteis. Nos experimentos a seguir, utilizamos camundongos Knock-in GAD67-CRE 23 em que apenas os neurônios gabaérgicos expressam CRE recombinase com um fundo genético C57Bl/6J, e um vetor AAV que contém ChR2 (hChR2 H134R) fundido com eyfp ou eyfp como um controle com um "interruptor FLEx (Flip-excisão)"24. O procedimento descreve especificamente a excitação optogenética de neurônios gabaergic no BNST durante a monitoração de Estados do sono/vigília25.
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Protocol
Todos os experimentos aqui foram aprovados pelo Comitê de experimentação e uso de animais da Universidade de Tsukuba, cumprindo as diretrizes da NIH.
1. cirurgia animal, injeção de vírus, eletrodo para EEG/EMG, e implante de fibra óptica
Atenção: Devem ser seleccionadas técnicas adequadas de protecção e manuseamento, com base no nível de biossegurança do vírus a ser utilizado. O AAV deve ser usado em um quarto isolado P1A classific para a injeção, e o tubo que carreg AAV deve ser sterilized com uma autoclave depois que todo o volume é usado acima. O local cirúrgico e todo o material implantado devem ser limpos e estéreis durante o uso.
Nota: Consulte a Figura 1.
- Desinfecte o equipamento cirúrgico com a autoclave.
- Anestesie os camundongos com isoflurano usando um vaporizador anestésico. Observe até que o mouse atingiu a profundidade desejada de anestesia, determinada pela perda de resposta para beliscar a cauda com fórceps. Aplique a pomada oftálmica aos olhos para impedi-los de secar.
- Desinfete o campo cirúrgico com solução de iodo ou 70% EtOH (3x) e seque suficientemente. Permita que o vírus descongele no gelo enquanto a cirurgia está sendo executada. Cubra a área cirúrgica com papel de bancada de laboratório absorvente.
- Fixar a cabeça do mouse no aparelho estereotáxica com barras de ouvido e uma pitada de nariz. Depois de confirmar a cabeça é mantida de forma estável, fazer uma incisão midsagital no couro cabeludo para garantir que as posições da Bregma e lambda estão localizados no mesmo nível em uma linha horizontal.
- Para evitar uma lacuna de posicionamento, ajuste apropriadamente os níveis da pitada de nariz e das barras de orelha para cima e para baixo. A Bregma e a lambda referem-se à interseção entre os sutura saggitalis e sutura coronalis ou sutura lambdoidal, respectivamente (Figura 2).
- Use as braçadeiras de Serafin para prender a pele para manter o acesso ao crânio. Após a exposição do crânio, desinfete a superfície do crânio com iodo ou 5% H2o2, para permitir que as suturas cranianas, incluindo a Bregma e lambda para ser visualizado mais claramente.
- Prepare a injeção do vetor de AAV:
- Lave o interior de uma seringa de 10 mL (ver tabela de materiais) sequencialmente com 70% etoh, 100% EtOH, e água esterilizada, 5 vezes cada. Fixe a seringa na braçadeira de um braço da bomba da microinjecção e certifique-se que toda a solução na seringa está descarregada.
- Aspirar com cuidado 2 μL de óleo mineral sem bolhas de ar, em seguida, aspirar o volume designado da solução de vírus. Após a aspiração, manipule o botão do êmbolo e confirme que a solução de vírus surge na ponta da agulha.
Nota: O volume de injeção da solução de vírus foi determinado em experimentos piloto usando a mesma cepa do mouse e o mesmo produto de vírus. A relação entre o volume de solução de vírus e a extensão da área de infecção deve ser estimada com antecedência.
- Injete o vetor de AAV:
- Ajuste a ponta da agulha de microinjecção na Bregma e anote as coordenadas como o ponto original. Mova a ponta para o local de injeção designado (para o BNST: anteroposterior + 0,2 mm, mediolateral ± 1,0 mm, dorsoventral-4,2 mm) e coloque a ponta da agulha sobre a posição. Coloque uma marca no crânio e faça furos de aproximadamente 2 mm de diâmetro usando uma broca odontológica com um cortador de carboneto de 0,7 mm. Tenha cuidado para não danificar a dura ou o tecido cerebral.
- Depois de remover o sangue ao redor dos furos com um cotonete, mova lentamente a agulha para a posição do BNST. Injete lentamente a quantidade designada de solução de vírus (0, 7 μl/min) com um microinjector mecânico. Depois de completar a injeção, deixe a agulha durante 5 min para permitir que a solução se infiltre suficientemente no tecido BNST. Retire cuidadosamente a agulha.
- Para a injecção bilateral, repita os passos 1.8.1-1.8.2 do outro lado. Durante todo o procedimento, mantenha o crânio úmido com aplicações de soro fisiológico estéril.
Nota: Utilizamos implantes de EEG/EMG personalizados (W: 5 mm, D: 7 mm, H: 1 mm) com quatro eletrodos de EEG (4 mm), dois eletrodos EMG (2 mm; corte o eletrodo de 4 mm a 2 mm com pinças) e 6 eletrodos (4,5 mm) (Figura 2a).
- Solda dois fios de aço inoxidável (ver tabela de materiais) a partir do qual 1 mm do isolamento é retirado ambas as extremidades para os eletrodos EMG. Ajustar o centro dos eletrodos para a Bregma e marcar a posição de cada eletrodo de EEG (anteroposterior ± 1,5 mm, mediolateral ± 1,0 mm), e determinar a posição do implante (Figura 2b).
- Implante fibras ópticas:
- Prenda uma ponteira de fibra óptica ao manipulador e gire o braço manipulador para que ele tenha um ângulo de ± 30 ° contra uma linha horizontal (este processo só é necessário para evitar interferências entre eletrodos e fibras ópticas, como no caso da estimulação BNST). Coloque a ponta de fibra na Bregma e registre as coordenadas.
- Mova a ponta para a linha de inserção direcionada e marque a posição no crânio. Também colocar marcas adicionais perto do local de inserção para os parafusos de ancoragem. Perfure o crânio em cada local com uma broca dental para inserir a fibra óptica e fixar o parafuso. Conserte o parafuso no crânio. Tenha cuidado para não quebrar a dura ou danificar qualquer tecido por parafuso.
- Insira a fibra óptica suavemente até chegar acima do BNST com um manipulador. A virola deve descansar sobre o crânio remanescente (Figura 1b).
- Aplique o cimento dental photocurable (veja a tabela dos materiais) para cobrir a fibra e o parafuso. O tempo de reação para solidificar a cola deve ser especificado pelo manual do fabricante (nosso material precisa de exposição à luz para pelo menos 10 s com comprimento de onda específico Photo-Generator. É desnecessário secar a cola depois disso).
- Nesta etapa, certifique-se de que nenhum material (parafuso ou cola) ocupe o espaço de montagem para os eletrodos. Além, evite fazer qualquer interrupção no cimento para a virola que conecta à fibra óptica e ao cabo. Repita as etapas 1.10.1-1.10.4 no lado oposto para a estimulação bilateral.
- Perfure furos para elétrodos de EEG/EMG. Insira as pontas dos eléctrodos nos orifícios. Segure o implante e aplique adesivo de cianoacrilato no espaço entre o crânio e os eletrodos. Inserir novamente com atenção para não interferir com quaisquer materiais.
- Cubra a circunferência dos eletrodos e fibras ópticas com adesivo de cianoacrilato seguido de aplicação de cianoacrilato acelerante sobre o adesivo. Esta etapa evita causar qualquer interrupção no cabo de ponteira-a-ótica e na zona de conexão do fio eletrodo-a-chumbo (Figura 1C).
Nota: Adesivo de cianoacrilato e seu acelerador são prejudiciais para o olho do mouse. Preste atenção para não causar derramamento destas substâncias químicas. Além disso, tenha cuidado para não tocar fortemente os eletrodos e as fibras, a fim de evitar o desvio inesperado imediatamente após a solidificação adesiva. - Expor os músculos do pescoço do mouse e inserir os fios para o eletrodo EMG o músculo. Ajuste o comprimento do elétrodo do EMG de modo que localize apenas os músculos nuchal. A conexão clara entre a ponta do elétrodo e a fáscia do músculo é bastante para travar o sinal do EMG.
- Aplique adesivo de cianoacrilato para encher os implantes e solidificar o adesivo com líquido de aceleração. Em seguida, coloque o mouse sobre uma almofada de calor para a recuperação até que o reflexo postural aparece. Ajuste a temperatura da almofada de calor para a temperatura corporal de repouso animal (36,0 ° c no ZT 0-12 no caso de camundongos C57BL6; não exceda 38,0 ° c).
Nota: Um antibiótico não é necessário para a cirurgia estéril. - Siga suas diretrizes institucionais locais para analgesia pós-operatória. Manter os ratos em uma gaiola de casa para um período de recuperação de pelo menos 7 dias.
2. monitoração de EEG/EMG com foto-Excitation de neurônios alvejados em Estados específicos do sono
Atenção: Este protocolo inclui o uso de equipamentos a laser classe 3B ou dispositivos LED. Os experimentadores devem estar cientes das informações de segurança. São necessários óculos de proteção para os olhos.
- Antes de conectar o cabo do laser à fibra óptica, ajuste a intensidade do laser com um scaler. Tether a ponta do cabo do laser a uma fibra ótica não utilizada com uma virola e confirme que não há nenhum espaço na junção entre a fibra e o cabo.
- Gire sobre o interruptor principal do laser e espere 20 minutos para que aqueça acima.
- Emita o laser ao verificador da intensidade e ajuste a intensidade do laser a 10 mW/mm2. Mude o modo do laser à lógica do transistor e confirme que os pulsos claros estão emitidos da fibra controlada pelo regulador do teste padrão que é ajustado em 10 ms para a duração, 40 MS para o descanso, 20 vezes para o ciclo, e 20 vezes repetem (isto é, 20 hertz de pulsos claros de 10 ms para 20 s).
- Após o período de recuperação, mova os camundongos para a câmara experimental para a gravação de EEG/EMG. Os ratos da casa em uma constante 23 ° c com um 12 h de luz/ciclo escuro com alimentos e água disponível ad libitum.
- Conecte o eletrodo implantado e o adaptador de cabo que está amarrado a um anel deslizante para evitar o emaranhamento. Recomenda-se cobrir a junção com o material Light-impermeable tal como a folha de alumínio para impedir o escapamento do laser. Se for necessário um experimento bilateral, use um anel deslizante com um acessório bifurcado para os cabos.
- Neste protocolo, avaliamos a latência para vigília de sono NREM ou sono REM, de modo que o tempo de gravação deve ser limitado em tempo de zeitgeber otimizado (ZT0 é definido como o tempo em que a luz está ligado). Este protocolo foi conduzido entre ZT4-ZT10. Deixe os camundongos permanecer livremente na câmara experimental por pelo menos 1 h como aclimatização.
- Durante o período experimental, monitore os sinais de EEG e EMG no mesmo monitor e avalie o estado do mouse como vigília, sono NREM ou sono REM. Use o controle de ganho para cada onda para facilitar a distinção de cada Estado.
- Para a medida do sono de NREM à latência do vigília, observe o sono estável de NREM para 40 s ou o sono estável do rem por 30 s, a seguir gire sobre o interruptor do gerador do teste padrão para a fotoestimulação (este protocolo gera 20 hertz de pulsos claros de 10 ms para 20 s). Confirme a emissão de laser para as fibras ópticas implantadas.
- Grave sinais de EEG/EMG até que o estado adormecido mude para a vigília. Se dois ou mais ensaios experimentais forem necessários, limite a manipulação optogenética para uma vez por dia, porque a fotoestimulação é uma intervenção artificial que pode afetar a arquitetura do sono/vigília.
- Após o experimento, profundamente anestesiado e perfuso com soro fisiológico estéril e paraformaldeído (PFA) para amostragem de todo o cérebro para análise imuno-histoquímica26.
3. análise do tempo de latência de NREM Sleep to wakefulness
- Após a gravação de sinais de EEG/EMG, transfira os dados do sinal a um computador para marcar Estados do sono/vigília. Este protocolo descreve o método para a análise de EEG com software de gravação (veja tabela de materiais).
- Inicie o aplicativo de sinal de suspensão e clique na guia arquivo e selecione abrir para escolher os dados gravados (arquivo. KCD). Clique na guia Sleep para selecionar o tempo Epoch para ajustar a janela de tempo para cada Epoch (usamos 1 Epoch/4 seg).
- Marcar manualmente Estados de sono/vigília com base em sinais de EEG/EMG, de acordo com os seguintes critérios: vigília, alta EMG e baixa tensão de EEG com alta freqüência; NREM, baixo tom do EMG e tensão elevada de EEG com δ elevado (0.5-4 hertz) freqüência; e REM, EMG indica atonia muscular e baixa tensão de EEG com frequência alta θ (6-9 Hz). Um estado que não continue consecutivamente por 16 s (ou seja, 4 epochs) não é definido como uma alteração de estado porque não é um estado estável.
- Clique e segure o botão esquerdo do mouse na primeira época e arraste o cursor até que a tendência específica de mais de 16 s (4 epochs) seja encerrada. Em seguida, solte o botão esquerdo do mouse e escolha o estado apropriado (vigília ou sono NREM ou sono REM) na janela pop-up. Repita este procedimento para marcar todos os sinais de EEG/EMG gravados no arquivo.
- Encontre a hora exata da estimulação na época onde o EEG mostra o sono de NREM ou de REM, e a época que mostra a transição do estado que segue o ponto da estimulação. Conte o número de epochs entre os períodos logo após a estimulação e pouco antes da transição do estado.
- Em seguida, multiplicar número contado de epochs por 4 s (A). Na época da estimulação, tome um tiro de tela e meça a largura entre o ponto da estimulação e a extremidade do Epoch. Então, divida o comprimento medido pelo comprimento inteiro do Epoch e multiplique por 4 s (B). Da mesma forma, calcule a duração do sono NREM na época da mudança de estado, o que significa o tempo entre o início da época e o ponto de mudança de estado (C).
- Soma a, B e C para obter a latência do sono NREM para vigília. O mesmo procedimento é usado para a análise da transição do estado do sono do REM ao wakefulness.
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Representative Results
O estudo atual mostrou o efeito da excitação optogenética de neurônios de GABABNST na transição do estado de sono. ChR2-EYFP foi expressado focal em neurônios de GABA no BNST. Um estudo Histochemical in situ da hibridação mostrou que ChR2-EYFP estêve colocalizado nos neurônios que expressam o GAD 67 sinais do mRNA, indicando que estes são os neurônios GABAergic. As amostras da fatia de immunohistochemical confirmaram a posição da fibra ótica, cuja a ponta era apenas acima do BNST25.
A Figura 3a mostra traços representativos de EEG/EMG antes e depois da fotoestimulação durante o sono NREM. A alta tensão e a freqüência lenta EEG sem sinais do EMG representam o sono de NREM. A fotoestimulação (pulsos de 10 ms a 20 Hz por 20 s) foi aplicada após o sono NREM estável. A estimulação desencadeia a transição aguda para a vigília (baixa tensão e alta freqüência EEG com sinais EMG ativos) cerca de 2 s após a estimulação em camundongos ChR2-expressando. Camundongos controle (EYFP) não mostraram transição após estimulação (latência de vigília de NREM: EYFP, 295,39 ± 106,61 seg, n = 6; ChR2:2,71 ± 0,59 seg, n = 6; t10 = 2,35, p < 0, 5; Figura 3B, superior). Estes dados sugerem que a excitação de neurônios de GABABNST durante o sono de NREM desencadeia a indução rápida do wakefulness. Por outro lado, a fotoestimulação durante o sono REM não teve efeito (EYFP: 36,45 ± 13, 8 seg, n = 6; ChR2:37,29 ± 15,19 seg, n = 6; t10 = 0, 4, p = 0,484; Figura 3B, inferior) para que um efeito de transição só surgiu no sono NREM.
Figura 1 : Procedimento para injetar AAV, fibras ópticas do implante e implantes de EEG/EMG. (A) procedimento experimental de injeção de vírus. O gene eyfp-fundido ChR2 ou eyfp (para o controle) incorporou no vetor de AAV cuja a transcrição é ativada pelo recombinase de CRE foi injetada bilateralmente no BNST. (B) as fibras ópticas foram inseridas em direção ao BNST em um ângulo de 30 ° para a horizontal para evitar a colisão com o eletrodo. Dois parafusos foram inseridos em torno dele. (C) o dispositivo de gravação de EEG/EMG foi implantado após a colocação fixada das fibras ópticas. (D) no final da operação, toda a área cirúrgica deve ser coberta com adesivo de cianoacrilato e fortemente fixada. Certifique-se de não aplicar qualquer agente para a região que liga o eletrodo e virolas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Eletrodos personalizados de EEG/EMG e eletrodos de inserção de pinos de eletrodo. (A) parte superior: fora de 6 pinos do elétrodo, os dois pinos externos são cortados para baixo a 2 milímetros. parte inferior: elétrodos de EEG/EMG. (B) estes eletrodos e os fios de condução EMG são então soldadas. A zona de conexão deve ser isolada com todo o isolamento como o adesivo de cianoacrilato. Os sítios de inserção dos eletrodos são relativos à Bregma (anteroposterior ± 1,5 mm, mediolateral ± 1,0 mm). Os fios EMG são inseridos o músculo do pescoço com a remoção de isolamento protegendo o fio no local de inserção (1 mm). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Efeito de GABABNST estimulação na transição do estado no sono de NREM e no sono do rem. (A) EEG representativo e onda EMG e espectro de potência de EEG. A fotoestimulação (pulsos de 10 ms em 20 Hertz por 20 segundos) foi aplicada aos neurônios ChR2-expressando de GABABNST que seguem o sono de nrem de 40 s. O wakefulness foi induzido ràpida após uns 2 s. O EEG mostrou a baixa tensão e a alta freqüência com o estouro do EMG. O espectrograma do poder de EEG igualmente mostrou a transição de baixo à alta freqüência. (B) a excitação de optogenetic de neurônios de GABABNST mostrou a transição rápida do sono de NREM ao vigília (superior), mas este efeito não foi considerado no caso de aplicar a mesma manipulação no sono do rem (parte inferior). *p < 0, 5, teste tde Welch. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Nós apresentamos aqui um método para avaliar o efeito da estimulação optogenética dos neurônios com as identidades químicas particulares em transições do estado do sono/vigília e deu um exemplo da manipulação de neurônios de GABABNST . Nossos dados mostraram que a excitação optogenética de neurônios de GABABNST conduz à transição imediata do sono de NREM ao wakefulness.
Os vários projetos experimentais estão disponíveis por causa do desenvolvimento de tipos numerosos de ferramentas optogenética. É possível ativar ou inibir a atividade neuronal de neurônios particulares usando diferentes tipos de opsins, como ChR2, SSFO, halorhodopsina, ArchT e iChloC27. ChR2 pode ativar os neurônios alguns milissegundos após foto-estimulação e isso pode ser usado para evocar potenciais de ação em uma forma de bloqueio de fase por um gerador de pulso para examinar o impacto agudo em estágios específicos do sono. Um opsina estàvel ativando tal como o opsina estável da função da etapa (SSFO), que induz a despolarização dos neurônios por 15 a 30 minutos após a estimulação, pôde igualmente ser útil para alguns tipos dos experimentos projetados observar um efeito semicrônico28. Células despolarizadas com SSFO podem tornar-se mais sensíveis à vária entrada neuronal fisiológica e ser desativado aplicando luz de comprimento de onda longa. Além disso, podemos ativar axônios por implante de fibras ópticas no local de uma projeção axonal. A estimulação da fibra poderia fornecer a informação na função de uma via de projeção axonal particular.
A gravação de EEG/EMG durante a manipulação optogenética é um método menos invasor para determinar as conseqüências diretas da excitação seletiva/inibição de circuitos neural em Estados do sono/vigília nos ratos. Com este método, muitas populações neuronal e circuitos neurais foram mostrados para ser involvidos na regulação de Estados do sono/wakefulness. Para o desenvolvimento mais adicional desta técnica, é possível implantar fibras múltiplas para manipular simultaneamente múltiplas vias, ou esta poderia igualmente ser usada em combinação com o photometory ou os miniscopes da fibra para monitorar atividades neuronal.
Em conclusão, prevê-se que a optogenética irá acelerar o progresso no desbloqueio do mistério da regulação do sono pelo cérebro e o desenvolvimento de terapias inovadoras para insônia refratária e outros distúrbios do sono.
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Disclosures
Este projeto foi parcialmente apoiado financeiramente pela Merck & Co.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado pelo programa de estudos do investigador da Merck (#54843), um subsídio de ajuda de KAKENHI para pesquisa científica sobre áreas inovadoras, "WillDynamics" (16H06401) (TS), e um subsídio de KAKENHI para pesquisa exploratória em áreas inovadoras (TS) (18H02595).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x1 Fiber-optic Rotary Joints | Doric | FRJ 1x1 FC-FC | for optogenetics |
| 6-pin header | KEL corporation | DSP02-006-431G | |
| 6-pin socket | Hirose | 21602X3GSE | |
| A/D converter | Nippon koden | N/A | Analog to digital converter |
| AAV10-EF1a-DIO-ChR2-EYFP | 3.70×1013(genomic copies/ml) | ||
| AAV10-EF1a-DIO-EYFP | 5.82×1013(genomic copies/ml) | ||
| Ampicillin | Fuji film | 014-23302 | |
| Amplifier | Nippon koden | N/A | for EEG/EMG recording |
| Anesthetic vaporizer | Muromachi | MK-AT-210D | |
| Automatic injecter | KD scientific | 780311 | |
| Carbide cutter | Minitor | B1055 | φ0.7 mm. Reffered as dental drill, used with high speed rotary micromotor |
| Cyanoacrylate adhesion (Aron alpha A) and acceleration | Konishi | #30533 | |
| Dental curing light | 3M | Elipar S10 | |
| Epoxy adhesive | Konishi | #04888 | insulation around the solder of 6-pin and shielded cable |
| Fiber optic patch cord (branching) | Doric | BFP(#)_50/125/900-0.22 | |
| Gad67-Cre mice | provided by Dr. Kenji Sakimura | Cre recombinase gene is knocked-in in the Gad67 allele | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 65461-01 | |
| High speed rotary micromotor kit | FOREDOM | K.1070 | Used with carbide cutter |
| Interconnecting sleeve | Thorlab | ADAF1 | φ2.5 mm Ceramic |
| Isoflurane | Pfizer | 871119 | |
| Laser | Rapp OptoElectronic | N/A | 473 nm wave length |
| Laser intesity checker | COHERENT | 1098293 | |
| Laser stimulator | Bio research center | STO2 | reffered as pulse generator in text |
| Optic fiber with ferrule | Thorlab | FP200URT-CANNULA-SP-JP | |
| pAAV2-rh10 | provided by PennVector Core | ||
| pAAV-EF1a-DIO-EYFP-WPRE-HGHpA | Addgene | plasimid # 20296 | |
| pAAV-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-HGHpA | provided by Dr. Karl Deisseroth | ||
| Patch cord | Doric | D202-9089-0.4 | 0.4m length, laser conductor between laser and rotary joint |
| pHelper | Stratagene | ||
| Photocurable dental cement | 3M | 56846 | |
| Serafin clamp | Stoelting | 52120-43P | |
| Shielded cable | mogami | W2780 | Soldering to 6-pin socket for EEG/EMG recording |
| Sleep recording chamber | N/A | N/A | Custum-made (21 cm× 29 cm × 19 cm) with water tank holder |
| Sleep sign software | KISSEI COMTEC | N/A | for EEG/EMG analysis |
| Slip ring | neuroscience,inc | N/A | for EEG/EMG analysis |
| Stainless screw | Yamazaki | N/A | φ1.0 x 2.0 |
| Stainless wire | Cooner wire | AS633 | 0.0130 inch diameter |
| Stereotaxic frame with digital console | Koph | N/A | Model 940 |
| Syringe needle | Hamilton | 7803-05 | |
| Vital recorder software | KISSEI COMTEC | N/A | for EEG/EMG recording |
References
- Spoormaker, V. I., Montgomery, P. Disturbed sleep in post-traumatic stress disorder: Secondary symptom or core feature? Sleep Medicine Reviews. 12 (3), 169-184 (2008).
- Dworak, M., Wiater, A., Alfer, D., Stephan, E., Hollmann, W., Struder, H. K. Increased slow wave sleep and reduced stage 2 sleep in children depending on exercise intensity. Sleep Medicine. 9 (3), 266-272 (2008).
- Mellman, T. A. Sleep and anxiety disorders. Psychiatric Clinics of North America. 29 (4), 1047-1058 (2006).
- Scammell, T. E., Arrigoni, E., Lipton, J. O. Neural circuitry of wakefulness and sleep. Neuron. 93 (4), 747-765 (2017).
- Chemelli, R. M., et al. Narcolepsy in orexin knockout mice: Molecular genetics of sleep regulation. Cell. 98 (4), 437-451 (1999).
- Borbély, A. A., Daan, S., Wirz-Justice, A., Deboer, T. The two-process model of sleep regulation: A reappraisal. Journal of Sleep Research. 25 (2), 131-143 (2016).
- Daan, S., Beersma, D. G., Borbely, A. A. Timing of human sleep: recovery process gated by a circadian pacemaker. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 246 (2), R161-R183 (1984).
- Saper, C. B., Cano, G., Scammell, T. E. Homeostatic, circadian, and emotional regulation of sleep. Journal of Comparative Neurology. 493 (1), 92-98 (2005).
- Saper, C. B., Fuller, P. M., Pedersen, N. P., Lu, J., Scammell, T. E. Sleep state switching. Neuron. 68 (6), 1023-1042 (2010).
- LeDoux, J. E. Emotion circuits in the brain. Annual Review of Neuroscience. 23, 155-184 (2000).
- Tovote, P., Fadok, J. P., Lüthi, A. Neuronal circuits for fear and anxiety. Nature Reviews Neuroscience. 16 (6), 317-331 (2015).
- Lebow, M. A., Chen, A. Overshadowed by the amygdala: the bed nucleus of the stria terminalis emerges as key to psychiatric disorders. Molecular Psychiatry. 21 (4), 450-463 (2016).
- Wu, S., et al. Tangential migration and proliferation of intermediate progenitors of GABAergic neurons in the mouse telencephalon. Development. 138 (12), 2499-2509 (2011).
- Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nature Reviews Neuroscience. 13 (4), 251-266 (2012).
- de Lecea, L., Carter, M. E., Adamantidis, A. Shining light on wakefulness and arousal. Biological Psychiatry. 71 (12), 1046-1052 (2012).
- Carter, M. E., Brill, J., Bonnavion, P., Huguenard, J. R., Huerta, R., de Lecea, L. Mechanism for hypocretin-mediated sleep-to-wake transitions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (39), E2635-E2644 (2012).
- Weber, F., Dan, Y. Circuit-based interrogation of sleep control. Nature Publishing Group. 538, 51-59 (2016).
- Weber, F., Chung, S., Beier, K. T., Xu, M., Luo, L., Dan, Y. Control of REM sleep by ventral medulla GABAergic neurons. Nature. 526, 435-438 (2015).
- Oishi, Y., et al. Slow-wave sleep is controlled by a subset of nucleus accumbens core neurons in mice. Nature Communications. 8 (1), 1-12 (2017).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Han, X., et al. A high-light sensitivity optical neural silencer: development and application to optogenetic control of non-human primate cortex. Frontiers in Systems Neuroscience. 5, 1-8 (2011).
- Kim, C. K., Adhikari, A., Deisseroth, K. Integration of optogenetics with complementary methodologies in systems neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 18 (4), 222-235 (2017).
- Saito, Y. C., et al. GABAergic neurons in the preoptic area send direct inhibitory projections to orexin neurons. Frontiers in Neural Circuits. 7 (December), 1-3 (2013).
- Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. A FLEX switch targets Channelrhodopsin-2 to multiple cell types for imaging and long-range circuit mapping. Journal of Neuroscience. 28 (28), 7025-7030 (2008).
- Kodani, S., Soya, S., Sakurai, T. Excitation of GABAergic neurons in the bed nucleus of the stria terminalis triggers immediate transition from non-rapid eye movement sleep to wakefulness in mice. Journal of Neuroscience. 37, 7174-7176 (2017).
- Lin, F., Pichard, J. Handbook of practical immunohistochemistry: frequently asked questions. , Springer. (2011).
- Wiegert, J. S., Mahn, M., Prigge, M., Printz, Y., Yizhar, O. Silencing neurons: tools, applications, and experimental constraints. Neuron. 95 (3), 504-529 (2017).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Prigge, M., Schneider, F., Davidson, T. J., O’Shea, D. J., Sohal, V. S., Goshen, I., Finkelstein, J., Paz, J. T., Stehfest, K., Fudim, R., Ramakrishnan, C., Huguenard, J. R., Hegemann, P., Deisseroth, K. Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction. Nature. 40 (6), 1301-1315 (2012).
