Summary
Burada, biz farelerde uyku/uyanıklık devletlerin izlenmesi sırasında nöronların belirli türlerinin optogenetik manipülasyon yöntemlerini açıklamak, bir örnek olarak stria terminalis yatak çekirdeği üzerinde son çalışma sunma.
Abstract
Son yıllarda, optogenetik yaygın nörooscientifik araştırma birçok alanda kullanılmıştır. Birçok durumda, bir opsin, kanal rodopsin 2 (ChR2) gibi, çeşitli CRE-sürücü fareler nöronal hücrelerin belirli bir tür bir virüs vektörü tarafından ifade edilir. Bu opgünahların aktivasyonu, lazer veya LED optik kablolar aracılığıyla teslim edilen ışık darbeleri uygulaması ile tetiklenir ve aktivasyon etkisi çok yüksek zaman çözünürlüğü ile görülür. Deneyler, farelerde davranışı veya başka bir fizyolojik sonucu izlerken nöronları akut uyarmak edebiliyoruz. Optogenetiği, farelerde uyku/uyanıklık devletlerinin düzenlenmesi nöronal devrelerin fonksiyonunu değerlendirmek için yararlı stratejiler olanaklı kılmak. Burada, farelerin uyku aşamasını değerlendirmek için elektroensefalogram (EEG) ve elektromiyogram (EMG) izleme sırasında belirli bir kimyasal kimliğe sahip olan nöronların optogenetik manipülasyonunun etkisini incelemek için bir teknik açıklanmaktadır. Örneğin, biz stria terminalis (BNST) yatak çekirdeğinde GABAerjik nöronların manipülasyon açıklanmaktadır. Bu nöronların akut optogenetik uyarılması NREM uyku sırasında uygulandığında uyanıklık hızlı bir geçiş tetikler. EEG/EMG kayıt ile birlikte optogenetik manipülasyon uyku/uyanıklık Devletler düzenleyen nöronal devreler deşifre için uygulanabilir.
Introduction
Optimum bilişsel fonksiyon için uyku önemlidir. Son bulgular da uyku bozuklukları çeşitli hastalıklar ile ilişkili olduğunu düşündürmektedir1,2,3. Uyku fonksiyonları henüz büyük ölçüde çözülmemiş olmasına rağmen, son zamanlarda sinir devreleri ve uyku/uyanıklık Devletler4kontrol mekanizmaları anlamada önemli ilerleme yapılmıştır. Memelilerde, uyanık üç devlet vardır: uyanıklık, hızlı olmayan göz hareketi (NREM) uyku, ve hızlı göz hareketi (REM) uyku. Uyanıklık, hızlı EEG osilasyonlarıyla (5-12 Hz), maksatlı ve sürekli motor aktivitesi ile düşük amplitüd ile karakterize edilir. NREM uyku (1-4 Hz) yüksek amplitüd (Delta dalgaları), bilinç eksikliği ve amaç motor aktivitesi ile yavaş salınımlar tarafından tanımlanır. REM uykusu nispeten hızlı salınımlar (6-12 Hz) düşük amplitüd ve neredeyse komple bilateral kas atonia5ile karakterize edilir.
Borbely, iki proses modeli6,7olarak bilinen uyku-uyanıklık Yönetmeliği teorisi önerdi. Bir homeostatik süreç, aynı zamanda işlem S olarak adlandırılır, uyanıklık sırasında birikir ve uyku sırasında dağılıyor uyku basıncını temsil eder. C süreci olarak adlandırılan bir başka süreç ise, 24 saat döngüsünde neden uyanık düzeylerinin dalgalanacağını açıklayan bir sirkadiyen süreçtir. Bu iki süreçlere ek olarak, allostatik faktörler uyku/uyanıklık8,9düzenlenmesi için de önemlidir. Allostatic faktörler beslenme durumları ve duygu içerir. Korku ve anksiyete genellikle otozik ve nöroendokrin tepkiler ile birlikte uyarılma artışı eşlik eder10,11,12. Limbik sistem korku ve anksiyete düzenlenmesi bir rol oynamaya inanılır, ve otonjik ve nöroendokrin tepkiler altta yatan mekanizmalar kapsamlı olarak incelenmiştir, ancak limbik sistem uyku/uyanıklık durumları etkileyen yol değil henüz ortaya çıktı. Opto-ve Farmakogenetik kullanan son çalışmalar çok sayıda nöronlar ve uyku/uyanıklık Devletler düzenleyen nöronal devrelerin beyin boyunca dağıtılır önerdi, korsinler dahil, bazal forebrain, talamus, hipotalamus, ve beyin kökü. Özellikle, optogenetik son gelişmeler bize uyarmak veya belirli nöral devreler in vivo yüksek uzamsal ve temporal çözünürlüklerde inhibe izin verdik. Bu teknik uyku ve uyanıklık nöral substratlar bizim anlayışımızda ilerleme sağlayacak, ve nasıl uyku/uyanıklık Devletler sirkadiyen süreçleri tarafından düzenlenir, uyku basıncı, ve allostatik faktörler, duygu dahil. Bu yazıda, NREM uyku, REM uyku düzenlenmesi bir rol oynayan beyinde konektoumunu ve mekanizmalar bizim anlayışımızı güncellemek için potansiyeli olabilir uyku/uyandırma kaydı ile birlikte optogenetik manipülasyon nasıl kullanılacağı tanıtmak amaçlamaktadır, ve uyanıklık. Hangi limbik sistem uyku/uyanıklık Devletler düzenleyen bu mekanizmanın anlayış sağlık için önemli bir önem taşımaktadır, çünkü uykusuzluk genellikle anksiyete ya da uyku mümkün olma korkusu ile ilişkilidir (somniphobia).
BNST anksiyete ve korku önemli bir rol oynamak için düşünülmektedir. Gad 67-gabaergic nöronlar ifade bnst12,13büyük bir nüfus vardır. Biz bu nöronların optogenetik manipülasyon etkisini inceledi (GABABnst) uyku/uyanıklık Devletler. Son yıllarda Nörobilim en büyük gelişmelerden biri, yüksek uzamsal ve temporal çözünürlüklerde ile, özel kimyasal kimlikleri in vivo ile nöronların manipülasyon sağlayan yöntemler olmuştur. Optogenetiği nöral aktivite ve spesifik davranışsal tepkiler14arasındaki nedensel bağlantıları göstermek için son derece yararlıdır. Biz uyku/uyanıklık devletlerin düzenlenmesi tanımlanan nöral devrelerin işlevsel bağlantı incelemek için bir yöntem olarak optogenetik tarif. Bu tekniği kullanarak, uyku/uyanıklık durumları düzenleyen nöronal devreleri anlamak için büyük bir ilerleme elde edilmiştir15,16,17,18,19 . Birçok durumda, opsins özellikle CRE-sürücü fareler ve CRE-indüklenebilir AAV aracılı gen transfer kombinasyonu ile seçici beyin bölgelerinde belirli kimyasal kimlikleri ile nöronlar tanıtıldı. Ayrıca, bir CRE-loxP veya FLP-FRT sistemi ile birlikte channelrhodopsin 2 (ChR2)20 veya archaerhodopsin (archt)21 gibi fotoğraf duyarlı opgünahların fokal ifade bize seçici bir nöronal nüfus ve spesifik manipüle sağlar nöral yol22.
Biz burada bir örnek olarak BNST içinde GABAergic nöronlar üzerinde deneyler tarif. Belirlenmiş bir nöronal nüfus opsins ifade etmek için, uygun CRE sürücü fareler ve CRE bağımlı virüs vektörler en sık kullanılır. Opgünahların özellikle nöronal nüfus içinde ifade edildiği transgenik veya Knock-in hatları da yararlıdır. Aşağıdaki deneyler, biz kullanılan GAD67-CRE Knock-in fareler23 hangi sadece gabaergic nöronlar bir C57BL/6J genetik arka plan ile CRE Rekombinaz Ifade, ve bir AAV vektörü IÇEREN ChR2 (hChR2 H134R) BIR kontrol olarak EYFP veya EYFP ile kaynama "FLEx (Flip-eksizyon) anahtarı" ile24. Prosedür özellikle uyku/uyanıklık Devletler25izlenmesi sırasında bnst Içinde gabaeroid nöronların optogenetiği uyarılma açıklanmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Buradaki tüm deneyler, NıH kurallarına uymak üzere Tsukuba Üniversitesi hayvan deneyi ve kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. hayvan cerrahisi, virüs enjeksiyonu, EEG/EMG ve optik fiber Implantasyon için elektrot
Dikkat: Kullanılacak virüsün Biyogüvenlik düzeyine göre uygun koruma ve işleme teknikleri seçilmelidir. AAV enjeksiyon için yalıtılmış bir P1A dereceli odada kullanılmalıdır, ve AAV taşıyan tüp tüm hacim kullanıldıktan sonra bir otoklav ile sterilize edilmelidir. Cerrahi site ve tüm implante malzeme kullanımı sırasında temiz ve steril olmalıdır.
Not: Bkz. Şekil 1.
- Cerrahi Ekipmanı otoklav ile dezenfekte edin.
- Anestezik bir buharlaştırıcı kullanarak Isoflurane ile fareleri anestezize. Fare, kuyruk forseps ile pinching yanıt kaybı ile belirlenen anestezinin istenilen derinliğe ulaşıncaya kadar gözlemlemek. Onları kurutmayı önlemek için gözlere oftalmik merhem uygulayın.
- Cerrahi alanı iyot çözeltisi veya% 70 EtOH (3x) ile dezenfekte edin ve yeterince kuru. Ameliyat yapıldığında virüsün buz üzerinde çözülmesine izin verin. Emici laboratuvar tezgah kağıdı ile cerrahi alanı koruyun.
- Kulak çubukları ve bir burun tutam ile stereotaktik aparat fare kafasını düzeltin. Kafa stably tutulur onayladıktan sonra, kemiğinin ve lambda konumlarını sağlamak için kafa derisi bir midsagittal kesi yapmak yatay bir çizgi üzerinde aynı seviyede yer almaktadır.
- Konumlandırma boşluğunu önlemek için, burun tutam ve kulak çubuklarının düzeylerini yukarı ve aşağı uygun şekilde ayarlayın. Kemiğinin ve lambda, sırasıyla sutura saggitalis ve sutura coronalis veya sutura lambdoidal arasındaki kesişme konusuna bakın (Şekil 2).
- Kafatası erişimi korumak için cilt tutmak için Serafin kelepçeleri kullanın. Kafatası pozlama sonra, iyot veya% 5 H2O2ile kafatası yüzeyini dezenfekte, kemiğinin ve lambda dahil olmak üzere kraniyal sütürler daha net görselleştirilmek için.
- AAV vektör enjeksiyonu hazırlayın:
- % 70 EtOH, 100% EtOH ve sterilize su, 5 kez her biri ile sıralı olarak 10 mL şırınga ( malzeme tablosunabakın) iç yıkayın. Şırıngayı bir mikroenjeksiyon pompası kolunun kelepçesi içinde koruyun ve şırıngadaki tüm çözümün boşaltılması için emin olun.
- Dikkatle hava kabarcıkları olmadan 2 μL mineral yağ Aspire, daha sonra virüs çözeltisi belirlenmiş hacmini Aspire. Aspirasyon sonra, piston düğmesini işlemek ve virüs çözeltisi iğne ucunda ortaya olduğunu onaylayın.
Not: Virüs çözeltisi enjeksiyon hacmi aynı fare gerinim ve aynı virüs ürünü kullanarak pilot deneylerde belirlendi. Virüs çözeltisi hacmi ile enfeksiyon alanının kapsamı arasındaki ilişki önceden tahmin edilmelidir.
- AAV vektör enjekte:
- Kemiğinin üzerindeki mikroenjeksiyon iğnesinin ucunu ayarlayın ve koordinatları orijinal nokta olarak not edin. Ucu belirtilen enjeksiyon sitesine taşıyın (için BNST: anteroposterior + 0,2 mm, mediolateral ± 1,0 mm, dorsoventral-4,2 mm) ve iğne ucunu pozisyon üzerine yerleştirin. 0,7 mm karbür kesici ile diş matkap kullanarak yaklaşık 2 mm çapında kafatası ve matkap delikleri bir işareti koyun. Dura veya beyin dokusuna zarar vermemek için dikkatli olun.
- Bir pamuk çubuklu deliklerin etrafında kan çıkardıktan sonra, yavaşça BNST konumuna iğne hareket ettirin. Mekanik bir mikroenjektör ile belirlenen miktarda virüs çözeltisi (0,07 μL/dak) yavaşça enjekte edilir. Enjeksiyon tamamladıktan sonra, 5 dakika için iğne bırakın çözüm yeterli BNST doku sızmak için izin. İğneyi dikkatlice çıkar.
- Bilateral enjeksiyon için, diğer tarafta 1.8.1-1.8.2 arasındaki adımları tekrarlayın. Prosedür boyunca, steril tuz uygulamaları ile kafatası nemli tutun.
Not: Özel EEG/EMG implantlar (W: 5 mm, D: 7 mm, H: 1 mm), dört EEG elektrotlar (4 mm), iki EMG elektrotları (2 mm; 4 mm elektrot ile 2 mm 'ye) ve 6 elektrot (4,5 mm) (Şekil 2a) kullandık.
- Lehim iki paslanmaz çelik teller (bkz. malzeme tablosu) hangi yalıtım 1 mm EMG elektrotlar için her iki uçları kapalı çıkardı. Elektrotların merkezini kemiğinin 'ya ayarlayın ve her bir EEG elektrot (anteroposterior ± 1,5 mm, mediolateral ± 1,0 mm) konumunu işaretleyin ve implantın konumunu belirleyin (Şekil 2B).
- Implant optik lifleri:
- Manipülatöre bir optik fiber bağlayıcıya iliştirin ve manipülatör kolunu, yatay bir çizgiyle ± 30 ° ' lik bir açı olması için döndürün (Bu işlem yalnızca BNST stimülasyon durumunda olduğu gibi elektrot ve optik liflerin müdahale edilmesini önlemek için gereklidir). Lif ucunu kemiğinin 'ya koy ve koordinatları Kaydet.
- Ucu hedeflenen ekleme çizgisine taşıyın ve kafatası konumunu işaretleyin. Ayrıca bağlantı vidaları için ekleme sitesi yakınında ek işaretler koymak. Optik fiber eklemek ve vida düzeltmek için bir diş matkap ile her sitede kafatası matkap. Kafatasındaki vidayı düzelt. Dura kırmak veya vida ile herhangi bir doku zarar için dikkatli olun.
- Bir manipülatör ile BNST yukarıda ulaşıncaya kadar hafifçe optik fiber takın. Geri kalan Kranium (Şekil 1B) üzerinde dinlenmelidir.
- Fiber ve vida kapsayacak şekilde fotokurable Dental çimento ( malzeme tablosunabakın) uygulayın. Tutkal sağlamlaştırmak için reaksiyon süresi üreticinin Kılavuzu tarafından belirtilmelidir (bizim malzeme özel dalga uzunluğu fotoğraf jeneratörü ile en az 10 s için ışığa maruz ihtiyacı. Bu sonra tutkal kurutmak için gereksiz).
- Bu adımda, elektrotlar için hiçbir malzemenin (vida veya tutkal) montaj alanını kapladığı emin olun. Buna ek olarak, optik fiber ve kablo bağlanan yüksük için çimento herhangi bir kesinti yapmadan kaçının. İkili stimülasyon için ters tarafta 1.10.1-1.10.4 adımlarını yineleyin.
- EEG/EMG elektrotları için Delme delikleri. Elektrotların ipuçlarını deliklere takın. İmplantı tutun ve kafatası ile elektrotlar arasındaki uzaya siyanoakrilat yapıştırıcı uygulayın. Herhangi bir malzeme ile müdahale değil dikkat ile tekrar takın.
- Elektrotların ve optik liflerin çevresini siyanoakrilat yapıştırıcı ile örterek, yapışkan üzerindeki siyanoakrilat hızlandırıcının uygulanması ile takip eder. Bu adım, ferrule-to-optik kablo ve elektrot-Lead tel bağlantı bölgesinde herhangi bir kesinti neden önler (Şekil 1C).
Not: Cyanoacrylate yapıştırıcı ve Hızlandırıcı fare gözü için zararlı. Bu kimyasal maddelerin dökülmesine neden olmadığından dikkat edin. Ayrıca, yapışkan katılaşma işleminden hemen sonra beklenmeyen sapmayı önlemek için elektrotlara ve liflere güçlü bir şekilde dokunmamaya dikkat edin. - Fare boyun kasları açığa ve kas altında EMG elektrot için teller takın. EMG elektrotunun uzunluğunu, sadece ense kaslarının altında bulabilmesi için ayarlayın. Elektrot ve kas fasya ucu arasındaki ışık bağlantısı EMG sinyalini yakalamak için yeterlidir.
- İmplantları doldurmak ve yapıştırıcıyı ivme sıvıyla sağlamlaştırmak için siyanoakrilat yapıştırıcı uygulayın. Sonra, postural refleks görünene kadar kurtarma için bir ısı Pad üzerine fareyi koymak. Isı pedi sıcaklığını hayvan istirahat vücut sıcaklığına ayarlayın (36,0 C57BL6 fare durumunda ZT 0-12; 38,0 °C ' ye kadar).
Not: Steril Cerrahi için bir antibiyotik gerekli değildir. - Postoperatif analjeziye yönelik yerel kurumsal yönergelerinizi takip edin. En az 7 gün süreyle bir iyileşme süresi için fareler bir ev kafesi tutun.
2. EEG/EMG fotoğraf ile Izleme-spesifik uyku durumları hedeflenen nöronların Excitation
Dikkat: Bu protokol, sınıf 3B lazer ekipmanının veya LED cihazlarının kullanımını içerir. Deneyler güvenlik bilgilerinin farkında olmalıdır. Koruyucu göz gözlükleri gereklidir.
- Lazer kablosunu optik Life bağlamadan önce lazer yoğunluğunu bir Scaler ile ayarlayın. Lazer kablosunun ucunu, kullanılmayan bir optik Life bir yüksüktir ve fiber ile kablo arasındaki kavşakta yer olmadığını onaylayın.
- Lazerin ana anahtarını açın ve ısınması için 20 dakika bekleyin.
- Lazer yoğunluğu denetleyicisi için yayma ve 10 mW/mm2lazer yoğunluğu ayarlayın. Lazer modunu transistör mantığı olarak değiştirin ve ışık darbeleri süresi için 10 MS, dinlenme için 40 ms, döngü için 20 kez ve 20 kez tekrar (20 Hz 10 MS hafif puls için 20 sn) olarak ayarlanan desen Regülatörü tarafından kontrol edilen elyaftan yayıldığı teyit edin.
- İyileşme süresinden sonra, fareleri EEG/EMG kaydını yapmak için deneysel odaya taşıyın. Ev fareler sabit 23 °c ile 12 h ışık/karanlık döngüsü ile gıda ve su mevcut reklam Isteğe bağlı.
- Yerleşmeyi önlemek için, implante edilen elektrot ve kablo adaptörünü bir slip yüzüğüne bağlayın. Lazer kaçağı önlemek için alüminyum folyo gibi ışık geçirmez malzeme ile kavşak kapsayacak şekilde önerilir. Bilateral bir deney gerekiyorsa, kablolar için bir lamda ataşmanı olan bir kayma halkası kullanın.
- Bu protokol, biz uyanıklık için gecikme NREM uyku veya REM uyku, böylece kayıt süresi optimize zeitgeber zaman sınırlı olmalıdır değerlendirmek (ZT0 ışık açık olduğu zaman olarak tanımlanır). Bu protokol ZT4-ZT10 arasında gerçekleştirildi. Farelerin deneysel odada en az 1 saat iklimlendirme olarak özgürce kalmaya izin verin.
- Deneysel dönemde, EEG ve EMG sinyallerini aynı monitörde izleyin ve farenin durumunu uyanıklık, NREM uyku veya REM uyku olarak değerlendir. Her durumu ayırt etmek daha kolay hale getirmek için her dalga için kazanç denetimini kullanın.
- Uyanıklık gecikme için NREM uyku ölçümü için, 40 s veya 30 s için kararlı REM uyku için istikrarlı NREM uyku gözlemlemek, sonra photostimulasyon için desen jeneratör anahtarı açın (Bu protokol 20 Hz 10 MS ışık puls 20 sn üretir). İmplante edilmiş optik liflere lazer emisyonunu onaylayın.
- Uyku durumu uyanıklık değişinceye kadar EEG/EMG sinyalleri kaydedin. İki veya daha fazla deneysel denemeler gerekiyorsa, photostimulasyon uyku/uyanıklık mimarisi etkileyebilir yapay bir müdahaledir, çünkü optogenetik manipülasyon günde bir kez sınırlayın.
- Deneyden sonra, immünohistokimyasal analiz için tüm beyin örnekleme için steril tuz ve paraformaldehit (PFA) ile derinden anestezize ve serpmek26.
3. NREM Sleep dan uyanıklık gecikme süresi Analizi
- EEG/EMG sinyallerini kaydettikten sonra, uyku/uyanıklık durumlarını Puanlama için sinyal verilerini bir bilgisayara aktarın. Bu protokol, kayıt yazılımı ile EEG analizinin yöntemini açıklar (bkz. malzeme tablosu).
- Uyku işareti uygulamasını başlatın ve Dosya sekmesini tıklatın ve kaydedilmiş verileri (. KCD dosyası) seçmek için Aç ' ı seçin. Her bir dönem için zaman penceresinin ayarlanması için dönem saati 'ni seçmek üzere uyku sekmesini tıklatın (1 Epoch/4 sn kullanıyoruz).
- Aşağıdaki kriterlere göre, EEG/EMG sinyallerine dayalı uyku/uyanıklık durumlarını manuel olarak puanla: uyanıklık, yüksek EMG ve yüksek frekanslı düşük EEG voltajı; NREM, düşük EMG sesi ve yüksek δ (0,5-4 Hz) frekans ile yüksek EEG voltajı; ve REM, EMG kas atonia ve yüksek θ (6-9 Hz) frekans ile düşük EEG voltajı gösterir. Ardışık olarak 16 s (yani 4 dönemler) devam etmeyen bir durum, kararlı bir durum olmadığından bir durum değişikliği olarak tanımlanmamıştır.
- Tıklayın ve ilk çağda sol fare düğmesini basılı tutun ve 16 s (4 dönemler) ' den fazla belirli eğilim sona erinceye kadar imleci sürükleyin. Ardından, sol fare düğmesini bırakın ve açılır pencerede uygun durumu (uyanıklık veya NREM uyku veya REM uyku) seçin. Dosyada kaydedilen tüm EEG/EMG sinyallerini puanlamak için bu yordamı yineleyin.
- EEG 'nin NREM veya REM uykusunun gösterdiği çağ 'da uyarımın tam zamanını ve stimülasyon noktasının ardından durum geçişi gösteren çağı bulun. Uyarıldıktan hemen sonra ve eyalet geçişinden hemen önce dönemleri arasındaki dönemler sayısını saymak.
- Daha sonra sayısı 4 s (A) ile dönemler sayılıyor çarpın. Stimülasyon dönemi içinde, bir ekran görüntüsü alın ve stimülasyon noktası ile çağın sonu arasındaki genişliği ölçün. Ardından, ölçülen uzunluğu tüm dönem uzunluğuna bölün ve 4 s (B) ile çarpın. Benzer şekilde, durum değişikinin çağında NREM uyku süresini hesaplayın, bu da dönem başlangıcı ile Devlet değişim noktası (C) arasındaki süre anlamına gelir.
- Sum A, B ve C gecikme NREM uyku için uyanıklık elde etmek için. Aynı yordam, REM uykudan uyanıklık için durum geçişi analizi için kullanılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu çalışmada GABABnst nöronların optogenetik uyarma etkisi uyku durumu geçiş gösterdi. ChR2-EYFP ekspresyonu bnst GABA nöronlar ifade edildi. Bir in situ hibridizasyon histokimyasal çalışmada ChR2-EYFP, bu GABAerjik nöronlar olduğunu gösteren, Gad 67 mRNA sinyalleri ifade nöronlar içinde kolokalize olduğunu gösterdi. İmmunohistokimyasal dilim numuneleri, ucu BNST25' in hemen üstünde olan optik lifin konumunu doğruladı.
Şekil 3A , NREM uykusunda fotostimulasyon öncesi ve sonrası temsili EEG/EMG izlerini gösterir. Yüksek voltaj ve yavaş frekans EEG hiçbir EMG sinyalleri ile NREM uyku temsil eder. Sabit NREM uykusunun ardından photostimulasyon (20 Hz 'de 10 MS darbeleri 20 sn.) uygulandı. Stimülasyon, ChR2-ifade fareler içinde uyarıldıktan sonra 2 s ile uyanıklık (düşük voltaj ve aktif EMG sinyalleri ile yüksek frekanslı EEG) Akut geçiş tetikler. Kontrol fareler (EYFP) stimülasyon sonrası geçiş göstermiyor (NREM 'den uyanma gecikmesi: EYFP, 295,39 ± 106,61 sn, n = 6; ChR2:2,71 ± 0,59 sn, n = 6; t10 = 2,35, p < 0,05; Şekil 3B, üst). Bu veriler NREM uyku sırasında GABABnst nöronların uyarma uyanıklık hızlı indüksiyon tetikler öneririz. Öte yandan, REM uykusunda fotostimülasyon etkisi yoktu (EYFP: 36,45 ± 13,08 sn, n = 6; ChR2:37,29 ± 15,19 sn, n = 6; t10 = 0,04, p = 0,484; Şekil 3B, alt) böylece bir geçiş efekti sadece NREM uykusunda ortaya çıktı.
Şekil 1 : AAV, implant optik lifleri ve EEG/EMG implantları enjekte etme prosedürü. (A) virüs enjeksiyonu deneysel prosedürü. EYFP-Fused ChR2 ya da EYFP (kontrol için) gen CRE Rekombinaz tarafından aktive edilir AAV vektör içinde entegre, bilateral bnst enjekte edildi. (B) optik lifler, elektrot ile çarpışmayı önlemek için yatay olarak 30 ° AÇıYLA bnst 'e doğru yerleştirildi. Etrafına iki vida takılmış. (C) optik liflerin güvenli bir şekilde yerleştirildikten sonra EEG/EMG kayıt cihazı implante edildi. (D) operasyonun sonunda, tüm cerrahi alan siyanoakrilat yapıştırıcı ile kaplıdır ve güçlü bir şekilde sabitlenmelidir. Elektrotlarla bağlantı kurmadan bölgeye herhangi bir ajan uygulamadan emin olun. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2 : Özel EEG/EMG elektrot ve elektrot Pins ekleme siteleri. (A) üst: 6 elektrot pimi dışında, harici iki iğne 2 mm 'ye kadar kesilir. alt: EEG/EMG elektrotları. (B) Bu elektrotlar ve EMG iletim telleri daha sonra lehimlenir. Bağlantı bölgesi, siyanoakrilat yapıştırıcı gibi herhangi bir yalıtım ile yalıtılmış olmalıdır. Elektrotların ekleme siteleri kemiğinin (anteroposterior ± 1,5 mm, mediolateral ± 1,0 mm) ile ilişkilidir. EMG telleri, yerleştirme yerinde (1 mm) teli koruyan yalıtım çıkarılması ile boyun kasının altına yerleştirilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3 : GABABnst etkisi NREM uyku ve REM uyku devlet geçiş stimülasyon. (A) temsilci EEG ve EMG dalga ve EEG güç spektrum. Fotostimulasyon (20 sn için 20 Hz 'de 10 MS darbeleri) 40 s NREM uyku aşağıdaki ChR2-ifade GABAbnst nöronlar uygulandı. Uyanıklık hızla 2 s sonra indüklenen oldu. EEG, EMG patlaması ile düşük voltaj ve yüksek frekans gösterdi. EEG güç spektrogram da düşük yüksek frekanslı geçiş gösterdi. (B) GABAbnst nöronlar optogenetic uyarma uyanıklık (üst) NREM uyku hızlı geçiş gösterdi, ama bu etkisi REM uyku (alt) aynı manipülasyon uygulanması durumunda görülmedi. *p < 0,05, Welch 's t-test. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz burada uyku/uyanıklık devlet geçişleri üzerinde belirli kimyasal kimlikleri ile nöronların optogenetik stimülasyon etkisini değerlendirmek için bir yöntem sundu ve GABABnst nöronların manipülasyon bir örnek verdi. Bizim veri gösterdi GABAbnst nöronlar optogenetic uyarılma wakefulness NREM uyku hemen geçiş sonuçları.
Çeşitli Deneysel tasarımlar, birçok türde optogenetik araç gelişimi nedeniyle mevcuttur. Etkinleştirmek ya da ChR2, SSFO, halorhodopsin, ArchT ve ıcloc27gibi opsins farklı türde kullanarak belirli nöronların nöronal etkinliğini inhibe mümkündür. ChR2 fotoğraf stimülasyon sonra birkaç milisaniye nöronlar aktive edebilir ve bu belirli uyku aşamalarında akut etkisi incelemek için bir Pulse jeneratör tarafından Faz-kilit şekilde eylem potansiyelleri uyandırmak için kullanılabilir. Kararlı adım fonksiyon opsin (SSFO) gibi istikrarlı bir şekilde aktive edilmiş opsin, uyarıldıktan sonra 15 ila 30 dakika boyunca nöronların depolarizasyonunu tetikleyen, yarı kronik bir etkiyi28gözlemlemek için tasarlanmış bazı deneyler için de yararlı olabilir. SSFO ile depolarized hücreler çeşitli fizyolojik nöronal girişe daha hassas hale gelebilir ve uzun dalga boyu ışık uygulayarak devre dışı bırakılabilir. Ayrıca, aksonları akonlu bir projeksiyon yerinde optik liflerin implantasyonu ile etkinleştirebilirsiniz. Fiber stimülasyon belirli bir aksal projeksiyon yolunun fonksiyonu hakkında bilgi verebilir.
Optogenetik manipülasyon sırasında EEG/EMG kaydı, farelerde uyku/uyanıklık Devletlerinde nöral devrelerin seçici uyarılma/inhibisyonunun doğrudan sonuçlarını belirlemek için daha az invazif bir yöntemdir. Bu yöntemle, birçok nöronal nüfus ve sinir devreleri uyku/uyanıklık devletlerin düzenlenmesi dahil olduğu gösterilmiştir. Bu tekniğin daha da gelişmesine doğru, birden fazla yolu eşzamanlı olarak manipüle etmek için birden fazla lifleri implante etmek mümkündür, ya da bu da nöronal faaliyetleri izlemek için fiber fotometri veya miniscopes ile birlikte kullanılabilir.
Sonuç olarak, optogenetik beyin tarafından uyku düzenleme gizemi ve refrakter uykusuzluk ve diğer uyku bozuklukları için yenilikçi tedavilerin geliştirilmesi kilidini ilerleme hızlandıracak beklenen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Bu proje kısmen Merck & Co tarafından mali olarak destekleniyordu.
Acknowledgments
Bu çalışmada, Merck araştırmacı çalışmalar programı (#54843), bir KAKENHI Grant-in-yardım yenilikçi alanlar üzerinde bilimsel araştırma için, "WillDynamics" (16H06401) (T.S.) ve bir KAKENHI Grant-in-yardım yenilikçi alanlar (T.S.) üzerinde keşif araştırması için destek oldu (18H02595).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x1 Fiber-optic Rotary Joints | Doric | FRJ 1x1 FC-FC | for optogenetics |
| 6-pin header | KEL corporation | DSP02-006-431G | |
| 6-pin socket | Hirose | 21602X3GSE | |
| A/D converter | Nippon koden | N/A | Analog to digital converter |
| AAV10-EF1a-DIO-ChR2-EYFP | 3.70×1013(genomic copies/ml) | ||
| AAV10-EF1a-DIO-EYFP | 5.82×1013(genomic copies/ml) | ||
| Ampicillin | Fuji film | 014-23302 | |
| Amplifier | Nippon koden | N/A | for EEG/EMG recording |
| Anesthetic vaporizer | Muromachi | MK-AT-210D | |
| Automatic injecter | KD scientific | 780311 | |
| Carbide cutter | Minitor | B1055 | φ0.7 mm. Reffered as dental drill, used with high speed rotary micromotor |
| Cyanoacrylate adhesion (Aron alpha A) and acceleration | Konishi | #30533 | |
| Dental curing light | 3M | Elipar S10 | |
| Epoxy adhesive | Konishi | #04888 | insulation around the solder of 6-pin and shielded cable |
| Fiber optic patch cord (branching) | Doric | BFP(#)_50/125/900-0.22 | |
| Gad67-Cre mice | provided by Dr. Kenji Sakimura | Cre recombinase gene is knocked-in in the Gad67 allele | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 65461-01 | |
| High speed rotary micromotor kit | FOREDOM | K.1070 | Used with carbide cutter |
| Interconnecting sleeve | Thorlab | ADAF1 | φ2.5 mm Ceramic |
| Isoflurane | Pfizer | 871119 | |
| Laser | Rapp OptoElectronic | N/A | 473 nm wave length |
| Laser intesity checker | COHERENT | 1098293 | |
| Laser stimulator | Bio research center | STO2 | reffered as pulse generator in text |
| Optic fiber with ferrule | Thorlab | FP200URT-CANNULA-SP-JP | |
| pAAV2-rh10 | provided by PennVector Core | ||
| pAAV-EF1a-DIO-EYFP-WPRE-HGHpA | Addgene | plasimid # 20296 | |
| pAAV-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-HGHpA | provided by Dr. Karl Deisseroth | ||
| Patch cord | Doric | D202-9089-0.4 | 0.4m length, laser conductor between laser and rotary joint |
| pHelper | Stratagene | ||
| Photocurable dental cement | 3M | 56846 | |
| Serafin clamp | Stoelting | 52120-43P | |
| Shielded cable | mogami | W2780 | Soldering to 6-pin socket for EEG/EMG recording |
| Sleep recording chamber | N/A | N/A | Custum-made (21 cm× 29 cm × 19 cm) with water tank holder |
| Sleep sign software | KISSEI COMTEC | N/A | for EEG/EMG analysis |
| Slip ring | neuroscience,inc | N/A | for EEG/EMG analysis |
| Stainless screw | Yamazaki | N/A | φ1.0 x 2.0 |
| Stainless wire | Cooner wire | AS633 | 0.0130 inch diameter |
| Stereotaxic frame with digital console | Koph | N/A | Model 940 |
| Syringe needle | Hamilton | 7803-05 | |
| Vital recorder software | KISSEI COMTEC | N/A | for EEG/EMG recording |
References
- Spoormaker, V. I., Montgomery, P. Disturbed sleep in post-traumatic stress disorder: Secondary symptom or core feature? Sleep Medicine Reviews. 12 (3), 169-184 (2008).
- Dworak, M., Wiater, A., Alfer, D., Stephan, E., Hollmann, W., Struder, H. K. Increased slow wave sleep and reduced stage 2 sleep in children depending on exercise intensity. Sleep Medicine. 9 (3), 266-272 (2008).
- Mellman, T. A. Sleep and anxiety disorders. Psychiatric Clinics of North America. 29 (4), 1047-1058 (2006).
- Scammell, T. E., Arrigoni, E., Lipton, J. O. Neural circuitry of wakefulness and sleep. Neuron. 93 (4), 747-765 (2017).
- Chemelli, R. M., et al. Narcolepsy in orexin knockout mice: Molecular genetics of sleep regulation. Cell. 98 (4), 437-451 (1999).
- Borbély, A. A., Daan, S., Wirz-Justice, A., Deboer, T. The two-process model of sleep regulation: A reappraisal. Journal of Sleep Research. 25 (2), 131-143 (2016).
- Daan, S., Beersma, D. G., Borbely, A. A. Timing of human sleep: recovery process gated by a circadian pacemaker. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 246 (2), R161-R183 (1984).
- Saper, C. B., Cano, G., Scammell, T. E. Homeostatic, circadian, and emotional regulation of sleep. Journal of Comparative Neurology. 493 (1), 92-98 (2005).
- Saper, C. B., Fuller, P. M., Pedersen, N. P., Lu, J., Scammell, T. E. Sleep state switching. Neuron. 68 (6), 1023-1042 (2010).
- LeDoux, J. E. Emotion circuits in the brain. Annual Review of Neuroscience. 23, 155-184 (2000).
- Tovote, P., Fadok, J. P., Lüthi, A. Neuronal circuits for fear and anxiety. Nature Reviews Neuroscience. 16 (6), 317-331 (2015).
- Lebow, M. A., Chen, A. Overshadowed by the amygdala: the bed nucleus of the stria terminalis emerges as key to psychiatric disorders. Molecular Psychiatry. 21 (4), 450-463 (2016).
- Wu, S., et al. Tangential migration and proliferation of intermediate progenitors of GABAergic neurons in the mouse telencephalon. Development. 138 (12), 2499-2509 (2011).
- Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nature Reviews Neuroscience. 13 (4), 251-266 (2012).
- de Lecea, L., Carter, M. E., Adamantidis, A. Shining light on wakefulness and arousal. Biological Psychiatry. 71 (12), 1046-1052 (2012).
- Carter, M. E., Brill, J., Bonnavion, P., Huguenard, J. R., Huerta, R., de Lecea, L. Mechanism for hypocretin-mediated sleep-to-wake transitions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (39), E2635-E2644 (2012).
- Weber, F., Dan, Y. Circuit-based interrogation of sleep control. Nature Publishing Group. 538, 51-59 (2016).
- Weber, F., Chung, S., Beier, K. T., Xu, M., Luo, L., Dan, Y. Control of REM sleep by ventral medulla GABAergic neurons. Nature. 526, 435-438 (2015).
- Oishi, Y., et al. Slow-wave sleep is controlled by a subset of nucleus accumbens core neurons in mice. Nature Communications. 8 (1), 1-12 (2017).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Han, X., et al. A high-light sensitivity optical neural silencer: development and application to optogenetic control of non-human primate cortex. Frontiers in Systems Neuroscience. 5, 1-8 (2011).
- Kim, C. K., Adhikari, A., Deisseroth, K. Integration of optogenetics with complementary methodologies in systems neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 18 (4), 222-235 (2017).
- Saito, Y. C., et al. GABAergic neurons in the preoptic area send direct inhibitory projections to orexin neurons. Frontiers in Neural Circuits. 7 (December), 1-3 (2013).
- Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. A FLEX switch targets Channelrhodopsin-2 to multiple cell types for imaging and long-range circuit mapping. Journal of Neuroscience. 28 (28), 7025-7030 (2008).
- Kodani, S., Soya, S., Sakurai, T. Excitation of GABAergic neurons in the bed nucleus of the stria terminalis triggers immediate transition from non-rapid eye movement sleep to wakefulness in mice. Journal of Neuroscience. 37, 7174-7176 (2017).
- Lin, F., Pichard, J. Handbook of practical immunohistochemistry: frequently asked questions. , Springer. (2011).
- Wiegert, J. S., Mahn, M., Prigge, M., Printz, Y., Yizhar, O. Silencing neurons: tools, applications, and experimental constraints. Neuron. 95 (3), 504-529 (2017).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Prigge, M., Schneider, F., Davidson, T. J., O’Shea, D. J., Sohal, V. S., Goshen, I., Finkelstein, J., Paz, J. T., Stehfest, K., Fudim, R., Ramakrishnan, C., Huguenard, J. R., Hegemann, P., Deisseroth, K. Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction. Nature. 40 (6), 1301-1315 (2012).
