Summary
Hier beschrijven we methoden van optogenetische manipulatie van bepaalde soorten neuronen tijdens het monitoren van de slaap/wakkerheid toestanden in muizen, het presenteren van onze recente werk op de bed kern van de Stria terminalis als voorbeeld.
Abstract
In de afgelopen jaren, optogenetics is op grote schaal gebruikt in vele gebieden van neurowetenschappelijk onderzoek. In veel gevallen, een opsin, zoals kanaal rhodopsine 2 (ChR2), wordt uitgedrukt door een virus vector in een bepaald type van neuronale cellen in verschillende CRE-driver muizen. Activering van deze opsins wordt veroorzaakt door de toepassing van lichtflitsen die worden geleverd door laser of geleid door optische kabels, en het effect van activering wordt waargenomen met zeer hoge tijdresolutie. Experimenteurs zijn in staat om acuut neuronen te stimuleren tijdens het monitoren van gedrag of een andere fysiologische uitkomst bij muizen. Optogenetics kan nuttige strategieën om te evalueren van de functie van neuronale circuits in de regulering van de slaap/wakkerheid toestanden in muizen mogelijk te maken. Hier beschrijven we een techniek voor het onderzoeken van het effect van optogenetische manipulatie van neuronen met een specifieke chemische identiteit tijdens elektro-encefalogram (EEG) en electromyogram (EMG) monitoring om de slaap fase van muizen te evalueren. Als voorbeeld beschrijven we manipulatie van GABAergic neuronen in de bed kern van de Stria terminalis (BNST). Acute optogenetische excitatie van deze neuronen activeert een snelle overgang naar wakkerheid wanneer toegepast tijdens de NREM-slaap. Optogenetische manipulatie samen met EEG/EMG opname kan worden toegepast om te ontcijferen van de neuronale circuits die slaap/wakkerheid staten reguleren.
Introduction
Slaap is essentieel voor een optimale cognitieve functie. Recente bevindingen suggereren ook dat verstoringen in de slaap worden geassocieerd met een breed scala aan ziekten1,2,3. Hoewel de functies van de slaap zijn nog grotendeels onopgeloste, substantiële vooruitgang is onlangs gemaakt in het begrijpen van de neurale circuits en mechanismen die controle slaap/wakkerheid Staten4. In zoogdieren, er zijn drie staten van waakzaamheid: wakkerheid, non-Rapid Eye Movement (NREM) slaap, en Rapid Eye Movement (REM) slaap. Wakkerheid wordt gekenmerkt door snelle EEG-oscillaties (5-12 Hz) van lage amplitude met doelbewuste en aanhoudende motorische activiteit. NREM-slaap wordt gedefinieerd door langzame oscillaties (1-4 Hz) van hoge amplitude (delta golven), met gebrek aan bewustzijn en doelbewuste motorische activiteit. REM-slaap wordt gekenmerkt door relatief snelle oscillaties (6-12 Hz) van lage amplitude en bijna volledige bilaterale spier atonia5.
Borbely stelde een theorie van slaap-wakkerheid verordening voor, bekend als de twee procesmodel6,7. Een homeostatisch proces, ook wel proces S genoemd, vertegenwoordigt slaap druk die zich ophoteert tijdens wakkerheid en verdwijnt tijdens de slaap. Een ander proces, aangeduid als proces C, is een circadiane proces, die verklaart waarom waakzaamheid niveaus fluctueren in de 24 h cyclus. Naast deze twee processen, allostatische factoren zijn ook belangrijk voor de regulering van de slaap/wakkerheid8,9. Allostatische factoren omvatten voedings toestanden en emotie. Angst en angst gaan meestal gepaard met een toename van de opwinding samen met autonome en neuro-endocriene reacties10,11,12. Het limbisch systeem wordt verondersteld om een rol te spelen in de regulering van angst en angst, en mechanismen die onderliggende autonome en neuro-endocriene reacties zijn uitgebreid bestudeerd, maar het pad waardoor het limbisch systeem beïnvloedt slaap/wakkerheid Staten heeft niet nog niet is onthuld. Een groot aantal recente studies met behulp van opto-en farmacogenetica hebben gesuggereerd dat neuronen en neuronale circuits die reguleren van slaap/wakkerheid Staten zijn verdeeld over de hersenen, met inbegrip van de cortices, basale forebrain, thalamus, hypothalamus, en hersenstam. In het bijzonder, recente ontwikkelingen in optogenetics hebben ons toegestaan om te stimuleren of te remmen specifieke neurale circuits in vivo met hoge ruimtelijke en tijdelijke resoluties. Deze techniek zal leiden tot vooruitgang in ons begrip van de neurale substraten van slaap en wakkerheid, en hoe slaap/wakkerheid Staten worden gereguleerd door circadiane processen, slaap druk, en allostatische factoren, met inbegrip van emotie. Dit artikel is bedoeld om te introduceren hoe optogenetische manipulatie gecombineerd met slaap/waak opname, die het potentieel hebben om ons begrip van de connectomes en mechanismen in de hersenen die een rol spelen in de regulering van NREM slaap, REM slaap, en wakkerheid. Begrip van dit mechanisme waardoor het limbisch systeem slaap/wakkerheid regelt is van het allergrootste belang voor de gezondheid, omdat slapeloosheid meestal wordt geassocieerd met angst of angst om niet in staat om te slapen (somniphobia).
De BNST wordt verondersteld een essentiële rol te spelen in angst en vrees. Gad 67-het uitdrukken van GABAergic neuronen zijn een grote populatie van de bnst12,13. We onderzochten het effect van optogenetische manipulatie van deze neuronen (GABABnst) op slaap/wakkerheid Staten. Een van de grootste vooruitgang in de neurowetenschappen in de afgelopen jaren is methoden die manipulatie van neuronen met bepaalde chemische identiteiten in vivo mogelijk maken, met hoge ruimtelijke en temporele resoluties. Optogenetics is zeer nuttig voor het aantonen van causale verbanden tussen neurale activiteit en specifieke gedrags responsen14. We beschrijven optogenetics als een methode voor het onderzoeken van de functionele connectiviteit van gedefinieerde neurale circuits in de regulering van de slaap/wakkerheid Staten. Door gebruik te maken van deze techniek, grote vooruitgang is bereikt in het begrijpen van de neuronale circuits die slaap/wakkerheid staten reguleren15,16,17,18,19 . In veel gevallen worden opsins specifiek geïntroduceerd in neuronen met specifieke chemische identiteiten in selectieve hersengebieden door een combinatie van CRE-driver muizen en CRE-inducible AAV-gemedieerde genoverdracht. Verder, focale uitdrukking van foto-gevoelige opsins zoals channelrhodopsin 2 (ChR2)20 of archaerhodopsin (archt)21 in combinatie met een CRE-Loxp of FLP-FRT-systeem stelt ons in staat om een selectieve neuronale populatie te manipuleren en specifieke Neural pathway22.
We beschrijven hier experimenten op GABAergic neuronen in de BNST als voorbeeld. Om opzonden in een aangewezen neuronale populatie uit te drukken, worden geschikte CRE driver muizen en CRE-afhankelijke virus vectoren het vaakst gebruikt. Transgene of knock-in lijnen waarin opsins worden uitgedrukt in het bijzonder neuronale populaties zijn ook nuttig. In de volgende experimenten gebruikten we GAD67-CRE knock-in muizen23 waarin alleen GABAergic neuronen Express CRE of met een C57BL/6j genetische achtergrond, en een Aav vector die CHR2 bevat (hChR2 H134R) gesmolten met eyfp of eyfp als een controle met een "FLEx (Flip-excision) schakelaar"24. De procedure specifiek beschrijft optogenetische excitatie van GABAergic neuronen in de BNST tijdens het monitoren van de slaap/wakkerheid Staten25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten hier werden goedgekeurd door het dier experiment en het gebruik Comité van de Universiteit van Tsukuba, die voldoen aan de NIH richtlijnen.
1. dieren chirurgie, virus injectie, elektrode voor EEG/EMG en implantatie van optische vezels
Let op: Er moeten passende beschermings-en behandelingstechnieken worden gekozen op basis van het bioveiligheidsniveau van het te gebruiken virus. AAV moet worden gebruikt in een geïsoleerde P1A gegradeerde ruimte voor injectie, en de buis met AAV moet worden gesteriliseerd met een autoclaaf nadat al het volume is opgebruikt. De chirurgische plaats en alle geïmplanteerde materialen moeten tijdens het gebruik schoon en steriel zijn.
Opmerking: Zie Figuur 1.
- Desinfecteer de chirurgische apparatuur met de autoclaaf.
- Anesthetiseer muizen met Isofluraan met behulp van een anestheticum vaporizer. Observeer tot de muis de gewenste diepte van anesthesie heeft bereikt, bepaald door een verlies van respons om de staart met een tang te knijpen. Breng oftalmische zalf aan op de ogen om te voorkomen dat ze drogen.
- Desinfecteer het chirurgische veld met jodiumoplossing of 70% EtOH (3x) en voldoende droog. Laat het virus ontdooien op ijs als de operatie wordt uitgevoerd. Bedek het chirurgische gebied met een absorberend laboratorium Bank papier.
- Bevestig het hoofd van de muis in het stereotactische apparaat met oorstangen en een neus knijp. Na bevestiging van het hoofd stabiel wordt gehouden, maak een midsagittale incisie in de hoofdhuid om ervoor te zorgen dat de posities van de bregma en Lambda bevinden zich op hetzelfde niveau op een horizontale lijn.
- Om te voorkomen dat een positionering Gap, op de juiste wijze de niveaus van de neus knijpen en oor balken op en neer aanpassen. De bregma en Lambda verwijzen naar de kruising tussen de sutura saggitalis en sutura coronalis of sutura lambdoidal, respectievelijk (Figuur 2).
- Gebruik de Serafin klemmen om de huid te houden om de toegang tot de cranium te behouden. Desinfecteer na blootstelling van de schedel het oppervlak van de schedel met jodium of 5% H2O2, zodat de craniale hechtingen, inclusief de bregma en lambda, duidelijker kunnen worden gevisualiseerd.
- AAV vector injectie voorbereiden:
- Was de binnenkant van een 10 mL spuit (Zie tabel van de materialen) opeenvolgend met 70% etoh, 100% EtOH, en gesteriliseerd water, 5 keer per stuk. Bevestig de spuit in de klem van een microinjectiearm en zorg ervoor dat alle oplossing in de spuit ontladen is.
- Zuig voorzichtig 2 μL minerale olie op zonder luchtbellen en zuig vervolgens het aangewezen volume van de virusoplossing op. Na de aspiratie manipuleer je de zuiger knop en bevestig je dat de virusoplossing aan de punt van de naald verschijnt.
Opmerking: Het injectievolume van de virusoplossing werd bepaald in proef experimenten met dezelfde muis stam en hetzelfde virus product. De verhouding tussen het volume van de virusoplossing en de omvang van het infectie gebied moet vooraf worden geschat.
- Injecteer AAV vector:
- Stel de punt van de microinjectienaald op de bregma in en noteer de coördinaten als het oorspronkelijke punt. Beweeg de punt naar de aangewezen injectieplaats (voor de bnst: anteroposterieure + 0,2 mm, Mediolaterale ± 1,0 mm, dorsoventral-4,2 mm) en plaats de punt van de naald op de positie. Zet een merkteken op de schedel en boorgaten van ongeveer 2 mm in diameter met behulp van een tandheelkundige boor met een 0,7 mm Carbide frees. Wees voorzichtig niet te beschadigen de Dura of hersenweefsel.
- Na het verwijderen van bloed uit rond de gaten met een wattenstaafje, beweeg de naald langzaam in de positie van de BNST. Injecteer de aangewezen hoeveelheid virusoplossing (0,07 μl/min) langzaam met een mechanische micro injector. Na het voltooien van de injectie, laat de naald 5 min om de oplossing voldoende infiltreren het BNST weefsel. Verwijder voorzichtig de naald.
- Voor bilaterale injectie herhaalt u de stappen 1.8.1-1.8.2 aan de andere kant. Houd de schedel gedurende de hele procedure vochtig met toepassingen van steriele zoutoplossing.
Opmerking: We gebruikten aangepaste EEG/EMG implantaten (W: 5 mm, D: 7 mm, H: 1 mm) met vier EEG elektroden (4 mm), twee EMG elektroden (2 mm; Knip de 4 mm-elektrode op 2 mm met Nippers) en 6 elektroden (4,5 mm) (Figuur 2a).
- Soldeer twee RVS draden (Zie tabel van materialen) waarvan 1 mm van de isolatie is ontdaan van beide uiteinden aan de EMG-elektroden. Pas het midden van de elektroden aan de bregma en markeer de positie van elke EEG-elektrode (anteroposterior ± 1,5 mm, Mediolaterale ± 1,0 mm), en bepaal de positie van het implantaat (Figuur 2b).
- Optische vezels voor implantaten:
- Bevestig een glasvezel-Ferrule aan de manipulator en draai aan de manipulator-arm zodat deze een hoek van ± 30 ° heeft tegen een horizontale lijn (dit proces is alleen nodig om interferentie tussen elektroden en optische vezels te voorkomen, zoals in het geval van BNST-stimulatie). Plaats de vezel punt op de bregma en noteer de coördinaten.
- Verplaats de punt naar de beoogde plaatsings lijn en markeer de positie op de schedel. Plaats ook extra markeringen in de buurt van de plaatsings plaats voor de anker schroeven. Boor de schedel op elke plaats met een tandheelkundige boor om de glasvezel in te voegen en bevestig de schroef. Bevestig de schroef op de schedel. Wees voorzichtig niet te breken de Dura of beschadigen van een weefsel door schroef.
- Plaats de glasvezel zachtjes totdat u boven de BNST met een manipulator bereikt. De Ferrule moet op de overgebleven cranium rusten (Figuur 1b).
- Breng fotocurable Dental cement (Zie tabel van de materialen) om de vezels en de schroef te bedekken. De reactietijd voor het stollen van de lijm moet worden gespecificeerd door de handleiding van de fabrikant (ons materiaal moet blootstelling aan licht voor ten minste 10 s met een specifieke golflengte foto generator. Het is niet nodig om de lijm na deze te drogen).
- In deze stap, zorg ervoor dat er geen materialen (schroef of lijm) bezetten de montageruimte voor de elektroden. Bovendien, Vermijd het maken van een onderbreking in het cement voor de Ferrule aansluiten op de glasvezel en kabel. Herhaal stap 1.10.1-1.10.4 aan de andere kant voor bilaterale stimulatie.
- Boorgaten voor EEG/EMG elektroden. Steek de uiteinden van de elektroden in de gaten. Houd het implantaat en breng Cyanoacrylaat lijm aan op de ruimte tussen de schedel en de elektroden. Plaats opnieuw met de aandacht om niet te interfereren met alle materialen.
- Bedek de omtrek van de elektroden en optische vezels met Cyanoacrylaat lijm gevolgd door toepassing van cyanoacrylaat katalysator op de lijm. Deze stap vermijdt het veroorzaken van enige onderbreking bij de Ferrule-to-Optic kabel en elektrode-to-lead draad verbindingszone (figuur 1c).
Opmerking: Cyanoacrylaat lijm en zijn katalysator zijn schadelijk voor het oog van de muis. Let op dat deze chemische stoffen niet morsen. Ook, wees voorzichtig niet te sterk aanraken van de elektroden en de vezels om onverwachte afwijking onmiddellijk na lijm stollen te voorkomen. - Stel de muis nekspieren bloot en steek de draden voor de EMG-elektrode onder de spier. Pas de lengte van de EMG-elektrode aan zodat deze net onder de dwarskam-spieren lokaliseert. Licht verbinding tussen de punt van de elektrode en de spier fascia is genoeg om het EMG-signaal te vangen.
- Breng Cyanoacrylaat lijm aan om de implantaten te vullen en de lijm met acceleratie vloeistof stollen. Plaats vervolgens de muis op een warmte pad voor herstel totdat de houdings reflex verschijnt. Pas de warmte pad temperatuur aan de dierlijke rust lichaamstemperatuur (36,0 °C in ZT 0-12 in het geval van C57BL6 muizen; niet meer dan 38,0 °C).
Opmerking: Een antibioticum is niet vereist voor steriele chirurgie. - Volg uw lokale institutionele richtlijnen voor postoperatieve analgesie. Houd de muizen in een huis kooi voor een herstelperiode van ten minste 7 dagen.
2. EEG/EMG monitoring met foto-excitatie van gerichte neuronen in specifieke slaap toestanden
Let op: Dit protocol omvat het gebruik van klasse 3B-laserapparatuur of LED-apparaten. Experimenteurs moeten zich bewust zijn van veiligheidsinformatie. Een beschermende oogbril is vereist.
- Voordat u de laser kabel aansluit op de optische vezel, past u de laserintensiteit aan met een Scaler. Tether de punt van de laser kabel aan een ongebruikte glasvezel met een Ferrule en bevestig dat er geen ruimte op de kruising tussen de vezel en de kabel.
- Zet de hoofdschakelaar van de laser aan en wacht 20 minuten om op te warmen.
- Stoot de laser uit naar de intensiteits Checker en pas de laserintensiteit aan op 10 mW/mm2. Verander de laser modus naar transistor logica en bevestig dat lichtpulsen worden uitgezonden uit de vezel gecontroleerd door de patroon regulator die is ingesteld op 10 MS voor duur, 40 MS voor rust, 20 tijden voor cyclus, en 20 keer herhalen (dat wil doen, 20 Hz van 10 MS lichtpulsen voor 20 s).
- Beweeg na de herstelperiode de muizen naar de experimentele kamer voor het opnemen van EEG/EMG. Huis muizen op een constante 23 ° c met een 12 h licht/donker cyclus met voedsel en water beschikbaar ad libitum.
- Sluit de geïmplanteerde elektrode en kabel adapter aan die aan een slip ring is vastgebonden om verstrikking te voorkomen. Het wordt aanbevolen om de kruising te bedekken met lichtdoorlatbaar materiaal zoals aluminiumfolie om laser lekkage te voorkomen. Als een bilateraal experiment vereist is, gebruik dan een slip ring met een bifurcate-bevestiging voor de kabels.
- In dit protocol, we beoordelen latentie tot wakkerheid van NREM-slaap of REM-slaap, zodat de opnametijd moet worden beperkt in geoptimaliseerde zeitgeber tijd (ZT0 wordt gedefinieerd als de tijd wanneer het lampje brandt). Dit protocol werd uitgevoerd tussen ZT4-ZT10. Laat de muizen gedurende ten minste 1 uur vrij in de experimentele kamer blijven als acclimatisatie.
- Bewaak tijdens de experimentele periode EEG-en EMG-signalen in dezelfde monitor en evalueer de toestand van de muis als wakkerheid, NREM-slaap of REM-slaap. Gebruik de versterkingsregeling voor elke golf om het onderscheid tussen elke status te vereenvoudigen.
- Voor het meten van de NREM-slaap tot wakkerheid latentie, observeren stabiele NREM-slaap voor 40 s of stabiele REM-slaap voor 30 s, dan zet de schakelaar van de patroon Generator voor photostimulatie (dit protocol genereert 20 Hz van 10 MS lichtpulsen voor 20 s). Bevestig de laser emissie aan de geïmplanteerde optische vezels.
- Record EEG/EMG signalen totdat de slapende toestand verandert in wakkerheid. Als twee of meer experimentele proeven nodig zijn, beperk optogenetische manipulatie tot één keer per dag, omdat foto stimulatie een kunstmatige ingreep is die de architectuur van slaap/wakkerheid kan beïnvloeden.
- Na het experiment, diep anesthetiseren en parfuseren met steriele zout en Paraformaldehyde (PFA) voor het bemonsteren van de hele hersenen voor immunohistochemische analyse26.
3. analyse van latentie tijd van NREM-slaap naar wakkerheid
- Na het opnemen van EEG/EMG signalen, overdracht van de signaal gegevens naar een computer voor het scoren van slaap/wakkerheid Staten. Dit protocol beschrijft de methode voor EEG-analyse met opname software (Zie tabel met materialen).
- Start de toepassing Sleep Sign en klik op het tabblad bestand en selecteer openen om de opgenomen gegevens (. kcd-bestand) te kiezen. Klik op het tabblad slaapstand om Epoch time te selecteren voor het aanpassen van het tijdvenster voor elk Epoch (we gebruiken 1 Epoch/4 sec).
- Handmatig Score slaap/wakkerheid Staten op basis van EEG/EMG signalen, volgens de volgende criteria: wakkerheid, hoge EMG en lage EEG spanning met hoge frequentie; NREM, lage EMG Toon en hoge EEG spanning met hoge δ (0.5-4 Hz) frequentie; en REM, EMG geeft spier atonia en lage EEG spanning met hoge θ (6-9 Hz) frequentie. Een staat die niet opeenvolgend doorgaat voor 16 sec. (d.w.z. 4 tijdperken) wordt niet gedefinieerd als een statuswijziging omdat het geen stabiele staat is.
- Klik en houd de linker muisknop op de eerste Epoch en sleep de cursor totdat de specifieke trend van meer dan 16 s (4 tijdperken) is beëindigd. Laat vervolgens de linker muisknop los en kies de juiste status (wakkerheid of NREM-slaap of REM-slaap) in het pop-upvenster. Herhaal deze procedure om alle EEG/EMG-signalen te scoren die in het bestand zijn opgenomen.
- Zoek het exacte tijdstip van de stimulatie in het tijdperk waar het EEG NREM of REM-slaap toont, en de epoche die de status overgang weergeeft na het stimulatie punt. Tel het aantal tijdperken tussen de perioden net na de stimulatie en vlak voor de overgang van de staat.
- Vermenigvuldig dan het getelde aantal tijdperken met 4 s (A). In het tijdperk van stimulatie neemt u een schermopname en meet u de breedte tussen het stimulatie punt en het einde van de epoche. Verdeel vervolgens de gemeten lengte door de gehele Epoch-lengte en vermenigvuldig deze met 4 s (B). Op dezelfde manier, bereken de duur van de NREM-slaap in het tijdperk van de statuswijziging, wat betekent dat de periode tussen het begin van de Epoch en de status wijzigen punt (C).
- Som A, B en C om de latentie van NREM-slaap te verkrijgen tot wakkerheid. Dezelfde procedure wordt gebruikt voor de analyse van de status overgang van REM-slaap naar wakkerheid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De huidige studie toonde het effect van optogenetische excitatie van GABABnst neuronen op slaaptoestand overgang. ChR2-EYFP werd focaal uitgedrukt in GABA neuronen in de BNST. Een in situ hybridisatie histochemische studie toonde aan dat ChR2-EYFP werd gelokaliseerd in neuronen die de GAD 67 mRNA signalen uitdrukken, wat aangeeft dat dit GABAergic neuronen zijn. Immunohistochemical slice samples bevestigden de positie van de optische vezel, waarvan de punt net boven de BNST25lag.
Figuur 3a toont representatieve EEG/EMG-sporen voor en na foto stimulatie tijdens de NREM-slaap. Hoge spanning en langzame frequentie EEG zonder EMG-signalen vertegenwoordigen de NREM-slaap. Foto stimulatie (10 MS pulsen bij 20 Hz gedurende 20 sec) werd toegepast na stabiele NREM-slaap. Stimulatie activeert acute overgang naar wakkerheid (lage spanning en hoge frequentie EEG met actieve EMG-signalen) over 2 s na stimulatie in ChR2-uitdrukken van muizen. Control muizen (EYFP) niet weergeven overgang na stimulatie (latentie van het ontwaken van NREM: EYFP, 295,39 ± 106,61 sec, n = 6; ChR2:2,71 ± 0,59 sec, n = 6; t10 = 2,35, p < 0,05; Figuur 3b, boven). Deze gegevens suggereren dat excitatie van GABABnst neuronen tijdens NREM slaap triggers snelle inductie van wakkerheid. Aan de andere kant had foto stimulatie tijdens de REM-slaap geen effect (EYFP: 36,45 ± 13,08 sec, n = 6; ChR2:37,29 ± 15,19 sec, n = 6; t10 = 0,04, p = 0,484; Afbeelding 3B, onder) dus een overgangseffect ontstond alleen in NREM-slaap.
Figuur 1 : Procedure voor het injecteren van AAV, implantaat optische vezels en EEG/EMG implantaten. A) experimentele procedure voor virus injectie. EYFP-Fused ChR2 of EYFP (voor controle) gen opgenomen in AAV vector wiens transcriptie wordt geactiveerd door CRE of werd bilateraal geïnjecteerd in de BNST. B) optische vezels werden in de richting van de bnst in een hoek van 30 ° naar het horizontale vlak ingebracht om botsingen met de elektrode te voorkomen. Er werden twee schroeven omheen gestoken. C) het EEG/EMG-opnameapparaat werd geïmplanteerd na een beveiligde plaatsing van de optische vezels. D) aan het einde van de operatie moet het gehele chirurgische gebied bedekt zijn met Cyanoacrylaat lijm en sterk bevestigd. Zorg ervoor dat u geen enkele agent toepast op de regio die de elektrode en Ferrules verbindt. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 : Aangepaste EEG/EMG elektrode en elektrode pinnen insertion sites. (A) boven: uit 6 elektrodepennen worden de externe twee pinnen tot 2 mm afgesneden. bodem: EEG/EMG elektroden. B) Deze elektroden en EMG geleidings draden worden vervolgens gesoldeerd. De verbindingszone moet worden geïsoleerd met elke isolatie zoals Cyanoacrylaat lijm. Insertie plaatsen van elektroden zijn relatief ten opzichte van de bregma (anteroposterior ± 1.5 mm, Mediolaterale ± 1,0 mm). EMG draden worden onder de nekspier geplaatst met verwijdering van de isolatie die de draad op de plaats van plaatsing (1 mm) beschermt. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3 : Effect van Gababnst stimulatie van de status overgang in NREM-slaap en REM-slaap. A) representatief EEG-en EMG-Golf en EEG-energie spectrum. Foto stimulatie (10 MS pulsen bij 20 Hz voor 20 sec) werd toegepast op ChR2-uitdrukken van GABABnst neuronen na 40 s NREM slaap. Wakkerheid werd snel geïnduceerd na een 2 s. Het EEG toonde lage spanning en hoge frequentie met EMG barsten. Het EEG Power Spectrogram toonde ook de overgang van lage naar hoge frequentie. (B) optogenetische EXCITATIE van Gababnst neuronen toonde een snelle overgang van NREM slaap naar wakkerheid (Upper), maar dit effect werd niet gezien in het geval van het toepassen van dezelfde manipulatie in REM-slaap (bodem). *p < 0,05, de t-toets van Welch. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We hier presenteerde een methode voor het evalueren van het effect van optogenetische stimulatie van neuronen met bepaalde chemische identiteiten op staat overgangen van slaap/wakkerheid en gaf een voorbeeld van manipulatie van GABABnst neuronen. Onze gegevens toonden aan dat optogenetische excitatie van GABABnst neuronen resulteert in onmiddellijke overgang van NREM slaap naar wakkerheid.
Verschillende experimentele ontwerpen zijn beschikbaar vanwege de ontwikkeling van talrijke soorten optogenetische gereedschappen. Het is mogelijk om te activeren of remmen Neuronale activiteit van bepaalde neuronen met behulp van verschillende soorten van opsins, zoals ChR2, SSFO, halorhodopsin, ArchT, en iChloC27. ChR2 kan neuronen activeren een paar milliseconden na foto-stimulatie en dit kan worden gebruikt om op te roepen actie potentialen in een fase-Lock manier door een puls generator om te onderzoeken van de acute impact in specifieke slaap stadia. Een stabiel activerende opsin zoals stabiele stapfunctie opsin (SSFO), die depolarisatie van neuronen gedurende 15 tot 30 minuten na stimulatie induceert, kan ook nuttig zijn voor sommige soorten experimenten die zijn ontworpen om een semi-chronisch effect te observeren28. Gedepolariseerde cellen met SSFO kunnen gevoeliger worden voor verschillende fysiologische neuronale input en worden gedeactiveerd door het toepassen van lange golflengte licht. Bovendien kunnen we axonen activeren door implantatie van optische vezels op de plaats van een axonale projectie. Vezel stimulatie kan informatie verschaffen over de functie van een bepaalde axonale projectie route.
EEG/EMG opname tijdens optogenetische manipulatie is een minder invasieve methode om de directe gevolgen van selectieve excitatie/remming van neurale circuits op slaap/wakkerheid toestanden in muizen te bepalen. Met deze methode, veel neuronale populaties en neurale circuits is aangetoond dat ze betrokken zijn bij de regulering van de slaap/wakkerheid Staten. Naar verdere ontwikkeling van deze techniek, is het mogelijk om meerdere vezels te implanteren om meerdere trajecten tegelijkertijd te manipuleren, of dit kan ook worden gebruikt in combinatie met glasvezel fotometory of miniscopes om neuronale activiteiten te bewaken.
Concluderend, er wordt verwacht dat optogenetics zal versnellen vooruitgang in het ontsluiten van het mysterie van slaap regulering door de hersenen en de ontwikkeling van innovatieve therapieën voor Refractaire slapeloosheid en andere slaapstoornissen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dit project werd deels financieel ondersteund door Merck & Co.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door het Merck Investigator studies-programma (#54843), een KAKENHI-subsidie voor wetenschappelijk onderzoek op innovatieve gebieden, "WillDynamics" (16H06401) (T.S.), en een KAKENHI-subsidie voor verkennend onderzoek naar innovatieve gebieden (T.S.) (18H02595).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x1 Fiber-optic Rotary Joints | Doric | FRJ 1x1 FC-FC | for optogenetics |
| 6-pin header | KEL corporation | DSP02-006-431G | |
| 6-pin socket | Hirose | 21602X3GSE | |
| A/D converter | Nippon koden | N/A | Analog to digital converter |
| AAV10-EF1a-DIO-ChR2-EYFP | 3.70×1013(genomic copies/ml) | ||
| AAV10-EF1a-DIO-EYFP | 5.82×1013(genomic copies/ml) | ||
| Ampicillin | Fuji film | 014-23302 | |
| Amplifier | Nippon koden | N/A | for EEG/EMG recording |
| Anesthetic vaporizer | Muromachi | MK-AT-210D | |
| Automatic injecter | KD scientific | 780311 | |
| Carbide cutter | Minitor | B1055 | φ0.7 mm. Reffered as dental drill, used with high speed rotary micromotor |
| Cyanoacrylate adhesion (Aron alpha A) and acceleration | Konishi | #30533 | |
| Dental curing light | 3M | Elipar S10 | |
| Epoxy adhesive | Konishi | #04888 | insulation around the solder of 6-pin and shielded cable |
| Fiber optic patch cord (branching) | Doric | BFP(#)_50/125/900-0.22 | |
| Gad67-Cre mice | provided by Dr. Kenji Sakimura | Cre recombinase gene is knocked-in in the Gad67 allele | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 65461-01 | |
| High speed rotary micromotor kit | FOREDOM | K.1070 | Used with carbide cutter |
| Interconnecting sleeve | Thorlab | ADAF1 | φ2.5 mm Ceramic |
| Isoflurane | Pfizer | 871119 | |
| Laser | Rapp OptoElectronic | N/A | 473 nm wave length |
| Laser intesity checker | COHERENT | 1098293 | |
| Laser stimulator | Bio research center | STO2 | reffered as pulse generator in text |
| Optic fiber with ferrule | Thorlab | FP200URT-CANNULA-SP-JP | |
| pAAV2-rh10 | provided by PennVector Core | ||
| pAAV-EF1a-DIO-EYFP-WPRE-HGHpA | Addgene | plasimid # 20296 | |
| pAAV-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-HGHpA | provided by Dr. Karl Deisseroth | ||
| Patch cord | Doric | D202-9089-0.4 | 0.4m length, laser conductor between laser and rotary joint |
| pHelper | Stratagene | ||
| Photocurable dental cement | 3M | 56846 | |
| Serafin clamp | Stoelting | 52120-43P | |
| Shielded cable | mogami | W2780 | Soldering to 6-pin socket for EEG/EMG recording |
| Sleep recording chamber | N/A | N/A | Custum-made (21 cm× 29 cm × 19 cm) with water tank holder |
| Sleep sign software | KISSEI COMTEC | N/A | for EEG/EMG analysis |
| Slip ring | neuroscience,inc | N/A | for EEG/EMG analysis |
| Stainless screw | Yamazaki | N/A | φ1.0 x 2.0 |
| Stainless wire | Cooner wire | AS633 | 0.0130 inch diameter |
| Stereotaxic frame with digital console | Koph | N/A | Model 940 |
| Syringe needle | Hamilton | 7803-05 | |
| Vital recorder software | KISSEI COMTEC | N/A | for EEG/EMG recording |
References
- Spoormaker, V. I., Montgomery, P. Disturbed sleep in post-traumatic stress disorder: Secondary symptom or core feature? Sleep Medicine Reviews. 12 (3), 169-184 (2008).
- Dworak, M., Wiater, A., Alfer, D., Stephan, E., Hollmann, W., Struder, H. K. Increased slow wave sleep and reduced stage 2 sleep in children depending on exercise intensity. Sleep Medicine. 9 (3), 266-272 (2008).
- Mellman, T. A. Sleep and anxiety disorders. Psychiatric Clinics of North America. 29 (4), 1047-1058 (2006).
- Scammell, T. E., Arrigoni, E., Lipton, J. O. Neural circuitry of wakefulness and sleep. Neuron. 93 (4), 747-765 (2017).
- Chemelli, R. M., et al. Narcolepsy in orexin knockout mice: Molecular genetics of sleep regulation. Cell. 98 (4), 437-451 (1999).
- Borbély, A. A., Daan, S., Wirz-Justice, A., Deboer, T. The two-process model of sleep regulation: A reappraisal. Journal of Sleep Research. 25 (2), 131-143 (2016).
- Daan, S., Beersma, D. G., Borbely, A. A. Timing of human sleep: recovery process gated by a circadian pacemaker. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 246 (2), R161-R183 (1984).
- Saper, C. B., Cano, G., Scammell, T. E. Homeostatic, circadian, and emotional regulation of sleep. Journal of Comparative Neurology. 493 (1), 92-98 (2005).
- Saper, C. B., Fuller, P. M., Pedersen, N. P., Lu, J., Scammell, T. E. Sleep state switching. Neuron. 68 (6), 1023-1042 (2010).
- LeDoux, J. E. Emotion circuits in the brain. Annual Review of Neuroscience. 23, 155-184 (2000).
- Tovote, P., Fadok, J. P., Lüthi, A. Neuronal circuits for fear and anxiety. Nature Reviews Neuroscience. 16 (6), 317-331 (2015).
- Lebow, M. A., Chen, A. Overshadowed by the amygdala: the bed nucleus of the stria terminalis emerges as key to psychiatric disorders. Molecular Psychiatry. 21 (4), 450-463 (2016).
- Wu, S., et al. Tangential migration and proliferation of intermediate progenitors of GABAergic neurons in the mouse telencephalon. Development. 138 (12), 2499-2509 (2011).
- Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nature Reviews Neuroscience. 13 (4), 251-266 (2012).
- de Lecea, L., Carter, M. E., Adamantidis, A. Shining light on wakefulness and arousal. Biological Psychiatry. 71 (12), 1046-1052 (2012).
- Carter, M. E., Brill, J., Bonnavion, P., Huguenard, J. R., Huerta, R., de Lecea, L. Mechanism for hypocretin-mediated sleep-to-wake transitions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (39), E2635-E2644 (2012).
- Weber, F., Dan, Y. Circuit-based interrogation of sleep control. Nature Publishing Group. 538, 51-59 (2016).
- Weber, F., Chung, S., Beier, K. T., Xu, M., Luo, L., Dan, Y. Control of REM sleep by ventral medulla GABAergic neurons. Nature. 526, 435-438 (2015).
- Oishi, Y., et al. Slow-wave sleep is controlled by a subset of nucleus accumbens core neurons in mice. Nature Communications. 8 (1), 1-12 (2017).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Han, X., et al. A high-light sensitivity optical neural silencer: development and application to optogenetic control of non-human primate cortex. Frontiers in Systems Neuroscience. 5, 1-8 (2011).
- Kim, C. K., Adhikari, A., Deisseroth, K. Integration of optogenetics with complementary methodologies in systems neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 18 (4), 222-235 (2017).
- Saito, Y. C., et al. GABAergic neurons in the preoptic area send direct inhibitory projections to orexin neurons. Frontiers in Neural Circuits. 7 (December), 1-3 (2013).
- Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. A FLEX switch targets Channelrhodopsin-2 to multiple cell types for imaging and long-range circuit mapping. Journal of Neuroscience. 28 (28), 7025-7030 (2008).
- Kodani, S., Soya, S., Sakurai, T. Excitation of GABAergic neurons in the bed nucleus of the stria terminalis triggers immediate transition from non-rapid eye movement sleep to wakefulness in mice. Journal of Neuroscience. 37, 7174-7176 (2017).
- Lin, F., Pichard, J. Handbook of practical immunohistochemistry: frequently asked questions. , Springer. (2011).
- Wiegert, J. S., Mahn, M., Prigge, M., Printz, Y., Yizhar, O. Silencing neurons: tools, applications, and experimental constraints. Neuron. 95 (3), 504-529 (2017).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Prigge, M., Schneider, F., Davidson, T. J., O’Shea, D. J., Sohal, V. S., Goshen, I., Finkelstein, J., Paz, J. T., Stehfest, K., Fudim, R., Ramakrishnan, C., Huguenard, J. R., Hegemann, P., Deisseroth, K. Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction. Nature. 40 (6), 1301-1315 (2012).
