Summary
هنا، ونحن نصف أساليب التلاعب البصريات لأنواع معينة من الخلايا العصبية أثناء رصد حالات النوم / اليقظة في الفئران، وتقديم عملنا الأخير على نواة السرير من المحطة الطرفية stria كمثال.
Abstract
في السنوات الأخيرة، تم استخدام علم الوراثة البصرية على نطاق واسع في العديد من مجالات البحث العلمي العصبي. في كثير من الحالات، يتم التعبير عن opsin، مثل قناة رودوبسين 2 (ChR2)، من قبل ناقلات الفيروس في نوع معين من الخلايا العصبية في مختلف الفئران سائق Cre. يتم تشغيل تفعيل هذه opsins عن طريق تطبيق النبضات الخفيفة التي يتم تسليمها عن طريق الليزر أو الصمام من خلال الكابلات البصرية، ويلاحظ تأثير التنشيط مع دقة الوقت عالية جدا. التجارب قادرة على تحفيز الخلايا العصبية بشكل حاد في حين رصد السلوك أو نتيجة فسيولوجية أخرى في الفئران. علم الوراثة البصرية يمكن أن تمكن استراتيجيات مفيدة لتقييم وظيفة الدوائر العصبية في تنظيم حالات النوم / اليقظة في الفئران. هنا نقوم بوصف تقنية لدراسة تأثير التلاعب الجيني البصري للخلايا العصبية ذات الهوية الكيميائية المحددة أثناء تخطيط الدماغ الكهربائي (EEG) ومراقبة الكهربائي (EMG) لتقييم مرحلة نوم الفئران. على سبيل المثال، نحن نصف التلاعب من الخلايا العصبية GABAergic في نواة السرير من المحطة الطرفية (BNST). الإثارة البصريات الحادة من هذه الخلايا العصبية يؤدي إلى الانتقال السريع إلى اليقظة عند تطبيقها أثناء النوم NREM. يمكن تطبيق التلاعب الجيني البصري جنبا إلى جنب مع EEG / EMG تسجيل لفك الدوائر العصبية التي تنظم حالات النوم / اليقظة.
Introduction
النوم ضروري للوظيفة المعرفية المثلى. وتشير النتائج الأخيرة أيضا إلى أن الاضطرابات في النومترتبط مع مجموعة واسعة من الأمراض 1،2،3. على الرغم من أن وظائف النوم لم يتم حلها حتى الآن إلى حد كبير، وقد أحرز تقدم كبير في الآونة الأخيرة في فهم الدوائر العصبية والآليات التي تتحكم في حالات النوم / اليقظة4. في الثدييات، هناك ثلاث حالات من اليقظة: اليقظة، وحركة العين غير السريعة (NREM) النوم، وحركة العين السريعة (REM) النوم. يتميز اليقظة بتذبذبات EEG سريعة (5-12 هرتز) من السعة المنخفضة مع النشاط الحركي الهادف والمستدام. يتم تعريف النوم NREM عن طريق التذبذبات بطيئة (1-4 هرتز) من السعة العالية (موجات دلتا)، مع عدم وجود الوعي والنشاط الحركي هادفة. يتميز النوم REM من التذبذبات سريعة نسبيا (6-12 هرتز) من السعة المنخفضة والعضلات الثنائية كاملة تقريبا atonia5.
اقترح بوربلي نظرية تنظيم النوم واليقظة المعروفة باسم نموذج العملية اثنين6،7. عملية المثلية، ويشار إليها أيضا باسم عملية S، يمثل ضغط النوم الذي يتراكم أثناء اليقظة ويتبدد أثناء النوم. وثمة عملية أخرى، يشار إليها بالعملية جيم، هي عملية سيركادية، وهو ما يفسر سبب تقلب مستويات اليقظة في دورة 24 ساعة. بالإضافة إلى هاتين العمليتين، العوامل الساكنة هي أيضا مهمة لتنظيم النوم / اليقظة8،9. وتشمل العوامل الساكنة الحالات الغذائية والعاطفة. عادة ما يصاحب الخوف والقلق زيادة في الإثارة جنبا إلى جنب مع استجابات اللاإرادي والغدد الصماء العصبية10،11،12. ويعتقد أن النظام الحوفي يلعب دورا في تنظيم الخوف والقلق، وقد درست على نطاق واسع الآليات الكامنة وراء استجابات اللاإرادي والغدد الصماء العصبية، ولكن المسار الذي يؤثر النظام الحوفي على حالات النوم / اليقظة لم تم الكشف عنها حتى الآن. وقد اقترح عدد كبير من الدراسات الحديثة باستخدام علم الوراثة البصرية والدوائية أن الخلايا العصبية والدوائر العصبية التي تنظم حالات النوم / اليقظة يتم توزيعها في جميع أنحاء الدماغ، بما في ذلك القشرية، الصدارة القاعدية، المهاد، تحت المهاد، تحت المهاد، تحت المهاد، وجذع الدماغ. وعلى وجه الخصوص، سمحت لنا التطورات الأخيرة في علم الوراثة البصرية بتحفيز أو تثبيط دوائر عصبية محددة ذاتاستبانة مكانية وزمنية عالية. هذه التقنية سوف تسمح بالتقدم في فهمنا للركائز العصبية للنوم واليقظة، وكيف يتم تنظيم حالات النوم / اليقظة من قبل العمليات circadian، ضغط النوم، والعوامل اللاوستاتيكية، بما في ذلك العاطفة. تهدف هذه الورقة إلى إدخال كيفية استخدام التلاعب الجيني البصري جنبا إلى جنب مع تسجيل النوم / الاستيقاظ، والتي يمكن أن يكون لها القدرة على تحديث فهمنا للconnectomes والآليات في الدماغ التي تلعب دورا في تنظيم النوم NREM، نوم REM، واليقظة. فهم هذه الآلية التي ينظم النظام الحوفي حالات النوم / اليقظة هو ذو أهمية قصوى للصحة، لأن الأرق يرتبط عادة مع القلق أو الخوف من عدم القدرة على النوم (الخوف من النوم).
ويعتقد أن BNST تلعب دورا أساسيا في القلق والخوف. GAD 67-التعبير عن الخلايا العصبية GABAergic هي مجموعة كبيرة من السكان من BNST12،13. بحثنا تأثير التلاعب البصري لهذه الخلايا العصبية (GABABNST)على حالات النوم / اليقظة. واحدة من أعظم التطورات في علم الأعصاب في السنوات الأخيرة كانت الأساليب التي تمكن من التلاعب في الخلايا العصبية مع هويات كيميائية معينة في الجسم الحي، مع القرارات المكانية والزمنية العالية. علم الوراثة البصرية مفيد للغاية لإظهار الروابط السببية بين النشاط العصبي والاستجابات السلوكية المحددة14. نحن نصف علم الوراثة البصرية كوسيلة لدراسة الاتصال الوظيفي للدوائر العصبية المحددة في تنظيم حالات النوم / اليقظة. من خلال الاستفادة من هذه التقنية، تم تحقيق تقدم كبير في فهم الدوائر العصبية التي تنظم حالات النوم / اليقظة15،16،17،18،19 . في كثير من الحالات، يتم إدخال opsins على وجه التحديد في الخلايا العصبية مع هويات كيميائية معينة في مناطق الدماغ الانتقائية عن طريق مزيج من الفئران سائق كري ونقل الجينات Cre-inducible AAV بوساطة. وعلاوة على ذلك، التعبير البؤري للأوبسينات الحساسة للصورة مثل channelrhodopsin 2 (ChR2)20 أو archaerhodopsin (ArchT)21 جنبا إلى جنب مع نظام Cre-loxP أو Flp-FRT يسمح لنا بالتلاعب في السكان الخلايا العصبية الانتقائية ومحددة المسار العصبي22.
نحن نصف هنا التجارب على الخلايا العصبية GABAergic في BNST كمثال. للتعبير عن opsins في السكان الخلايا العصبية المعينة، وتستخدم الفئران سائق Cre المناسبة وناقلات الفيروس تعتمد على كري في كثير من الأحيان. وراثيا أو ضرب في خطوط التي يتم التعبير عن opsins في مجموعات الخلايا العصبية خاصة هي مفيدة أيضا. في التجارب التالية، استخدمنا GAD67-Cre ضرب في الفئران23 التي فقط الخلايا العصبية GABAergic التعبير عن Cre recombinase مع خلفية وراثية C57BL/6J، وناقلات AAV الذي يحتوي على ChR2 (hChR2 H134R) تنصهر مع EYFP أو EYFP كسيطرة مع "FLEx (الوجه الختان) التبديل"24. يصف الإجراء على وجه التحديد الإثارة البصرية الوراثية للخلايا العصبية GABAergic في BNST أثناء مراقبة حالات النوم / اليقظة25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع التجارب هنا من قبل لجنة التجارب والاستخدام الحيواني ة في جامعة تسوكوبا، امتثالا للمبادئ التوجيهية للمعهد الوطني للصحة.
1. جراحة الحيوان، حقن الفيروسات، القطب الكهربائي لEEG / EMG، وزرع الألياف البصرية
تحذير: وينبغي اختيار تقنيات الحماية والمناولة المناسبة على أساس مستوى السلامة الأحيائية للفيروس الذي سيستخدم. وينبغي استخدام AAV في غرفة P1A متدرجة معزولة للحقن، ويجب تعقيم أنبوب يحمل AAV مع الأوتوكلاف بعد كل حجم يتم استخدامها. يجب أن يكون الموقع الجراحي وجميع المواد المزروعة نظيفة ومعقمة أثناء الاستخدام.
ملاحظة: انظر الشكل 1.
- تطهير المعدات الجراحية مع الأوتوكلاف.
- تخدير الفئران مع isoflurane باستخدام المرذاذ مخدر. مراقبة حتى يصل الماوس إلى العمق المطلوب من التخدير، التي تحددها فقدان الاستجابة لقرصة الذيل مع ملقط. تطبيق مرهم العيون على العينين لمنعها من التجفيف.
- تطهير المجال الجراحي مع محلول اليود أو 70٪ EtOH (3X) وجافة بما فيه الكفاية. السماح للفيروس بالذوبان على الجليد أثناء إجراء الجراحة. تغطية المنطقة الجراحية مع ورقة مقاعد البدلاء مختبر ماصة.
- إصلاح رأس الماوس في جهاز مجسمة مع قضبان الأذن وقرصة الأنف. بعد التأكد من عقد الرأس بشكل لا يطاق، وجعل شق midsagittal في فروة الرأس لضمان مواقف بريما ولامدا تقع على نفس المستوى على خط أفقي.
- لتجنب وجود فجوة في تحديد المواقع، قم بضبط مستويات قرصة الأنف وقضبان الأذن صعوداوهبوطا. تشير البريما ولامدا إلى التقاطع بين سوتورا ساغيتاليس وسوتورا الإكليلية أو سوتورا لامبويدال، على التوالي (الشكل2).
- استخدام المشابك سيرافين لعقد الجلد للحفاظ على الوصول إلى الجمجمة. بعد تعرض الجمجمة ، قم بتطهير سطح الجمجمة باليود أو 5٪ H2O2، لتمكين الغرز القحفية بما في ذلك البريما ولامدا من أن يتم تصورها بشكل أكثر وضوحا.
- إعداد حقن ناقلات AAV:
- غسل داخل حقنة 10 مل (انظر جدولالمواد) بالتتابع مع 70٪ EtOH، 100٪ EtOH، والمياه المعقمة، 5 مرات لكل منهما. تأمين الحقنة في المشبك من ذراع مضخة الحقن الدقيق وتأكد من أن يتم تفريغ جميع الحلول في المحاقن.
- يستنشق بعناية 2 ميكرولتر من الزيوت المعدنية دون فقاعات الهواء، ثم يستنشق الحجم المعين من حل الفيروس. بعد الطموح، ومعالجة زر الغطاس والتأكد من أن حل الفيروس يظهر في غيض من الإبرة.
ملاحظة: تم تحديد حجم حقن حل الفيروس في التجارب التجريبية باستخدام نفس سلالة الماوس ونفس المنتج الفيروس. وينبغي تقدير العلاقة بين حجم محلول الفيروس ومدى منطقة العدوى مسبقاً.
- حقن AAV ناقلات:
- ضبط غيض من إبرة الحقن المجهري على بريغا ونلاحظ الإحداثيات كنقطة الأصلي. نقل غيض إلى موقع الحقن المعين (لBNST: anteroposterior + 0.2 مم، mediolateral ± 1.0 ملم، دورسوفينترال - 4.2 ملم) ووضع غيض من الإبرة على الموقف. وضع علامة على الجمجمة وحفر ثقوب من حوالي 2 ملم في القطر باستخدام حفر الأسنان مع قطع كربيد 0.7 ملم. يجب الحرص على عدم تلف دورا أو أنسجة الدماغ.
- بعد إزالة الدم من حول الثقوب مع مسحة القطن، حرك الإبرة ببطء في موقف BNST. حقن ببطء الكمية المعينة من محلول الفيروس (0.07 درجة مئوية / دقيقة) مع حقن دقيق الميكانيكية. بعد الانتهاء من الحقن، وترك الإبرة لمدة 5 دقائق للسماح للحل لاختراق ما يكفي من الأنسجة BNST. أخرج الإبرة بعناية.
- للحقن الثنائي، كرر الخطوات 1.8.1-1.8.2 على الجانب الآخر. في جميع أنحاء الإجراء، والحفاظ على الجمجمة رطبة مع تطبيقات محلول ملحي معقمة.
ملاحظة: استخدمنا مخصص EEG / EMG يزرع (W: 5 مم، D: 7 ملم، H: 1 مم) مع أربعة أقطاب EEG (4 ملم)، واثنين من أقطاب EMG (2 ملم؛ وقطع القطب 4 ملم إلى 2 ملم مع المقصات) و 6 أقطاب كهربائية (4.5 ملم) (الشكل2A).
- لحام اثنين من أسلاك الفولاذ المقاوم للصدأ (انظر جدولالمواد) من الذي يتم تجريد 1 ملم من العزل قبالة كلا الطرفين إلى أقطاب EMG. ضبط مركز الأقطاب الكهربائية إلى بريجما ووضع علامة على موقف كل قطب تخطيط كهربية الدماغ (anteroposterior ± 1.5 ملم، mediolateral ± 1.0 مم)، وتحديد موقف زرع (الشكل2B).
- زرع الألياف البصرية:
- إرفاق الطويق الألياف البصرية إلى المتلاعب وتدوير الذراع المتلاعب بحيث يكون لديه زاوية ± 30 درجة ضد خط أفقي (هذه العملية مطلوبة فقط لتجنب التداخل بين الأقطاب الكهربائية والألياف البصرية، كما هو الحال في حالة التحفيز BNST). وضع طرف الألياف على bregma وتسجيل الإحداثيات.
- نقل غيض إلى خط الإدراج المستهدفة ووضع علامة على الموقف على الجمجمة. أيضا وضع علامات إضافية بالقرب من موقع الإدراج لمسامير مرساة. حفر الجمجمة على كل موقع مع حفر الأسنان لإدراج الألياف البصرية وإصلاح المسمار. إصلاح المسمار على الجمجمة. يجب الحرص على عدم كسر دورا أو تلف أي نسيج عن طريق المسمار.
- تُدخل الألياف البصرية برفق حتى تصل إلى أعلى من BNST مع متلاعب. يجب أن تقع الطويق على الجمجمة المتبقية (الشكل1B).
- تطبيق الاسمنت الأسنان فوتوكوربل (انظر جدولالمواد) لتغطية الألياف والمسمار. وينبغي تحديد وقت رد الفعل لترسيخ الغراء من قبل دليل الشركة المصنعة (المواد لدينا يحتاج التعرض للضوء لمدة 10 ثانية على الأقل مع موجة محددة طول الصورة المولد. فمن غير الضروري لتجفيف الغراء بعد هذا).
- في هذه الخطوة، تأكد من أن أي مواد (المسمار أو الغراء) تحتل مساحة تصاعد للأقطاب الكهربائية. وبالإضافة إلى ذلك، تجنب إجراء أي انقطاع في الاسمنت للطويق الاتصال بالألياف البصرية والكابلات. كرر الخطوات 1.10.1-1.10.4 على الجانب الآخر للتحفيز الثنائي.
- حفر ثقوب لأقطاب EEG / EMG. أدخل نصائح الأقطاب الكهربائية في الثقوب. عقد زرع وتطبيق لاصق ة سيانوكريلات على الفضاء بين الجمجمة والأقطاب الكهربائية. إدراج مرة أخرى مع الاهتمام بعدم التدخل في أي مواد.
- تغطية محيط الأقطاب الكهربائية والألياف البصرية مع لاصق سيانواكريلات تليها تطبيق التسارع سيانوكريلات على لاصقة. هذه الخطوة يتجنب التسبب في أي انقطاع في كابل الطويق إلى البصرية والقطب إلى الرصاص سلك ربط المنطقة (الشكل1C).
ملاحظة: لاصق ة سيانواكريلات والتسارع ضارة بالعين الماوس. إيلاء الاهتمام لعدم التسبب في انسكاب هذه المواد الكيميائية. أيضا، يجب الحرص على عدم لمس بقوة الأقطاب الكهربائية والألياف من أجل تجنب الانحراف غير متوقع مباشرة بعد التصلب لاصقة. - كشف عضلات عنق الماوس وإدراج الأسلاك لالقطب EMG تحت العضلات. ضبط طول القطب EMG بحيث يقع فقط تحت العضلات nuchal. اتصال الضوء بين طرف القطب الكهربائي وسحر العضلات يكفي للقبض على إشارة EMG.
- تطبيق لاصق ة سيانوكريلات لملء يزرع وترسيخ لاصقة مع تسارع السائل. ثم ضع الماوس على لوحة حرارة للتعافي حتى يظهر رد الفعل الوضعي. ضبط درجة حرارة وسادة الحرارة لدرجة حرارة الجسم يستريح الحيوان (36.0 درجة مئوية في ZT 0-12 في حالة الفئران C57BL6؛ لا تتجاوز 38.0 درجة مئوية).
ملاحظة: لا يلزم استخدام مضاد حيوي لإجراء جراحة معقمة. - اتبع الإرشادات المؤسسية المحلية الخاصة بك للتسكين بعد العملية الجراحية. إبقاء الفئران في قفص المنزل لفترة الانتعاش من 7 أيام على الأقل.
2. EEG / EMG الرصد مع الإثارة الصورة من الخلايا العصبية المستهدفة في حالات النوم محددة
تحذير: يتضمن هذا البروتوكول استخدام معدات الليزر من الفئة 3B أو أجهزة LED. يجب أن يكون القائمون على التجربة على علم بمعلومات السلامة. مطلوب نظارات واقية للعين.
- قبل توصيل كابل الليزر بالألياف البصرية، اضبط كثافة الليزر مع مقياس. ربط طرف كابل الليزر إلى الألياف البصرية غير المستخدمة مع الطويق والتأكد من عدم وجود مساحة في تقاطع بين الألياف والكابل.
- تشغيل التبديل الرئيسي من الليزر والانتظار 20 دقيقة حتى الاحماء.
- انبعث الليزر إلى مدقق كثافة وضبط كثافة الليزرإلى 10 مواط / مم 2. تغيير وضع الليزر إلى منطق الترانزستور والتأكد من أن النبضات الخفيفة تنبعث من الألياف التي تسيطر عليها منظم نمط الذي تم تعيينه في 10 مللي ثانية لمدة، 40 مللي ثانية للراحة، 20 مرة لدورة، و 20 مرة تكرار (وهذا هو، 20 هرتز من 10 مللي ثانية نبضات الضوء لمدة 20 ثانية).
- بعد فترة الانتعاش، نقل الفئران إلى الغرفة التجريبية لتسجيل EEG / EMG. الفئران منزل في ثابت 23 درجة مئوية مع دورة ضوء / الظلام 12 ح مع الغذاء والماء المتاحة ad libitum.
- قم بتوصيل القطب المزروع ومحول الكابلات المربوط بحلقة الانزلاق لتجنب التشابك. فمن المستحسن لتغطية تقاطع مع المواد الخفيفة غير نفاذية مثل رقائق الألومنيوم لمنع تسرب الليزر. إذا كانت هناك حاجة إلى تجربة ثنائية، استخدم حلقة زلة مع مرفق ثنائي للكابلات.
- في هذا البروتوكول، نقوم بتقييم الكمون إلى اليقظة من النوم NREM أو النوم REM، لذلك يجب أن يكون وقت التسجيل محدودة في الوقت zeitgeber الأمثل (يتم تعريف ZT0 الوقت عندما يكون الضوء على). تم إجراء هذا البروتوكول بين ZT4 - ZT10. السماح للفئران البقاء بحرية في الغرفة التجريبية لمدة 1 ساعة على الأقل كما التأقلم.
- خلال الفترة التجريبية، مراقبة إشارات EEG وEMG في نفس الشاشة وتقييم حالة الماوس كما اليقظة، نوم NREM أو نوم REM. استخدم عنصر التحكم في الكسب لكل موجة لتسهيل تمييز كل حالة.
- لقياس النوم NREM إلى الكمون اليقظة، لاحظ النوم NREM مستقرة لمدة 40 ثانية أو النوم REM مستقرة لمدة 30 ثانية، ثم تشغيل التبديل من مولد نمط لتحفيز الصور (هذا البروتوكول يولد 20 هرتز من 10 نبضات ضوء مللي ثانية لمدة 20 ثانية). تأكد من انبعاث الليزر للألياف البصرية المزروعة.
- تسجيل إشارات تخطيط كهربية الدماغ/EMG حتى تتغير حالة النوم إلى اليقظة. إذا كانت هناك حاجة إلى تجربتين تجريبيتين أو أكثر، حد من التلاعب الجيني البصري مرة واحدة في اليوم لأن التحفيز الضوئي هو تدخل اصطناعي قد يؤثر على بنية النوم/اليقظة.
- بعد التجربة، والتخدير العميق وperfuse مع المالحة المعقمة والبارافورماليد (PFA) لأخذ عينات من الدماغ كله لتحليل المناعية الكيميائية26.
3. تحليل وقت الكمون من النوم NREM إلى اليقظة
- بعد تسجيل إشارات EEG/EMG، قم بنقل بيانات الإشارة إلى جهاز كمبيوتر لتسجيل حالات النوم/اليقظة. يصف هذا البروتوكول طريقة تحليل تخطيط كهربية الدماغ مع برنامج التسجيل (انظر جدولالمواد).
- بدء تشغيل تطبيق علامة السكون ثم انقر فوق علامة التبويب ملف وحدد فتح لاختيار البيانات المسجلة (ملف.kcd). انقر فوق علامة التبويب السكون لتحديد وقت عصر لضبط الإطار الزمني لكل عصر (نستخدم 1 عصر/4 ثانية).
- درجة يدويا حالات النوم / اليقظة على أساس إشارات EEG / EMG، وفقا للمعايير التالية: اليقظة، وارتفاع EMG وانخفاض الجهد EEG مع تردد عال؛ NREM، وانخفاض لهجة EMG وارتفاع الجهد EEG مع تردد 80 (0.5-4 هرتز)؛ وREM، EMG يشير إلى أتونيا العضلات وانخفاض الجهد EEG مع ارتفاع θ (6-9 هرتز) التردد. لا يتم تعريف الدولة التي لا تستمر على التوالي لمدة 16 ق (أي 4 حقب) على أنها تغيير الدولة لأنها ليست دولة مستقرة.
- انقر مع الاستمرار على زر الماوس الأيسر في الحقبة الأولى واسحب المؤشر حتى يتم إنهاء الاتجاه المحدد لأكثر من 16 ق (4 حقب). ثم حرر زر الماوس الأيسر واختر الحالة المناسبة (اليقظة أو وضع السكون NREM أو السكون REM) في الإطار المنبثق. كرر هذا الإجراء لتسجيل كافة إشارات EEG/EMG المسجلة في الملف.
- العثور على الوقت الدقيق للتحفيز في العصر حيث يظهر EEG النوم NREM أو REM، وعصر يظهر انتقال الدولة بعد نقطة التحفيز. عد عدد العصور بين الفترات بعد التحفيز مباشرة وقبل انتقال الدولة مباشرة.
- ثم ضرب عدد من العصور عد بنسبة 4 ق (A). في عصر التحفيز، خذ لقطة شاشة وقياس العرض بين نقطة التحفيز ونهاية الحقبة. ثم، قم بتقسيم الطول المقاس على طول الحقبة بأكملها وتضاعف هُنا بمقدار 4 s (B). وبالمثل، حساب مدة نوم NREM في عصر تغيير الدولة، مما يعني الوقت بين بداية الحقبة ونقطة تغيير الدولة (C).
- مجموع A، B و C للحصول على الكمون من النوم NREM إلى اليقظة. يتم استخدام نفس الإجراء لتحليل انتقال الدولة من نوم REM إلى اليقظة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وأظهرت هذه الدراسة تأثير الإثارة البصريات من الخلايا العصبيةGABA BNST على انتقال حالة النوم. تم التعبير عن ChR2-EYFP بشكل محوري في الخلايا العصبية GABA في BNST. وأظهرت دراسة الهتوكيميائية التهجين في الموقع أن ChR2-EYFP تم توطينها في الخلايا العصبية التي تعبر عن إشارات GAD 67 mRNA، مما يشير إلى أن هذه هي الخلايا العصبية GABAergic. أكدت عينات شريحة المناعية الكيميائية موقف الألياف البصرية، التي كان غيض فقط فوق BNST25.
يظهر الشكل 3A آثار EEG/EMG التمثيلية قبل وبعد التحفيز الضوئي أثناء نوم NREM. الجهد العالي والتردد البطيء EEG مع عدم وجود إشارات EMG تمثل النوم NREM. تم تطبيق التحفيز الضوئي (10 نبضات مللي ثانية في 20 هرتز لمدة 20 ثانية) بعد نوم NREM مستقر. التحفيز يؤدي إلى الانتقال الحاد إلى اليقظة (الجهد المنخفض والتردد العالي EEG مع إشارات EMG النشطة) حوالي 2 ق بعد التحفيز في الفئران التعبير عن ChR2. الفئران التحكم (EYFP) لم تظهر الانتقال بعد التحفيز (الكمون من الاستيقاظ من NREM: EYFP, 295.39 ± 106.61 ثانية, ن = 6; ChR2: 2.71 ± 0.59 ثانية، ن = 6؛ ر10 = 2.35، ص <؛ 0.05؛ الشكل 3B،العلوي). وتشير هذه البيانات إلى أن الإثارة من الخلايا العصبيةGABA BNST أثناء النوم NREM يؤدي الحث السريع لليقظة. من ناحية أخرى، لم يكن للتحفيز الضوئي أثناء النوم REM أي تأثير (EYFP: 36.45 ± 13.08 ثانية، ن = 6؛ ChR2: 37.29 ± 15.19 ثانية، ن = 6؛ t10 = 0.04, p = 0.484; الشكل 3B،أسفل) حتى تأثير الانتقال ظهرت فقط في النوم NREM.
الشكل 1 إجراء حقن AAV، زرع الألياف البصرية ويزرع EEG / EMG. (أ) الإجراء التجريبي لحقن الفيروس. EYFP تنصهر ChR2 أو EYFP (للسيطرة) الجينات المدرجة في ناقلات AAV الذي يتم تنشيط النسخ من قبل Cre recombinase تم حقنها ثنائيا في BNST. (ب) تم إدخال الألياف البصرية نحو BNST في زاوية 30 درجة إلى الأفقي لمنع الاصطدام مع القطب الكهربائي. تم إدخال اثنين من مسامير حوله. (C) تم زرع EEG / EMG جهاز تسجيل بعد وضع آمن من الألياف البصرية. (د) في نهاية العملية، يجب أن تكون تغطي المنطقة الجراحية بأكملها مع لاصق سيانوكريلات وثابتة بقوة. تأكد من عدم تطبيق أي عامل على المنطقة التي تربط القطب والشراسة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 مخصص EEG / EMG القطب والقطب دبابيس مواقع الإدراج. (A) أعلى: من أصل 6 دبابيس القطب الكهربائي، يتم قطع دبابيس اثنين من الخارجية وصولا الى 2 ملم. (B) ثم يتم لحام هذه الأقطاب الكهربائية وأسلاك التوصيل EMG. يجب عزل منطقة الاتصال مع أي عزل مثل لاصق سيانوكريلات. مواقع الإدراج من الأقطاب الكهربائية هي نسبة إلى بريجما (anteroposterior ± 1.5mm، mediolateral ± 1.0 مم). يتم إدخال أسلاك EMG تحت عضلة الرقبة مع إزالة العزل حماية السلك في موقع الإدراج (1 مم). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3 تأثير غاباBNST: التحفيز على انتقال الدولة في النوم NREM والنوم REM. (أ) ممثل EEG وموجة EMG وطيف الطاقة EEG. تم تطبيق التحفيز الضوئي (10 نبضات مللي ثانية في 20 هرتز لمدة 20 ثانية) على الخلايا العصبيةBNST غابا التعبير عن ChR2 بعد 40 ق نوم NREM. تم حث اليقظة بسرعة بعد 2 ق. وأظهرت EEG الجهد المنخفض والتردد العالي مع انفجار EMG. كما أظهر مطياف الطاقة EEG الانتقال من التردد المنخفض إلى العالي. (B) الإثارة البصرية من الخلايا العصبيةGABA BNST أظهرت الانتقال السريع من النوم NREM إلى اليقظة (العلوي)، ولكن لم ينظر إلى هذا التأثير في حالة تطبيق نفس التلاعب في النوم REM (أسفل). *p < 0.05, ويلش t-اختبار. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
قدمنا هنا طريقة لتقييم تأثير التحفيز البصري للخلايا العصبية مع هويات كيميائية معينة على انتقالات الدولة من النوم / اليقظة وأعطى مثالا على التلاعب الخلايا العصبيةGABA BNST. وأظهرت بياناتنا أن الإثارة البصريات من الخلايا العصبيةGABA BNST النتائج في الانتقال الفوري من النوم NREM إلى اليقظة.
تتوفر تصاميم تجريبية مختلفة بسبب تطوير أنواع عديدة من الأدوات البصرية الوراثية. فمن الممكن لتنشيط أو تثبيط النشاط العصبي من الخلايا العصبية معينة باستخدام أنواع مختلفة من opsins، مثل ChR2، SSFO، halorhodopsin، ArchT، وiChloC27. ChR2 يمكن تنشيط الخلايا العصبية بضع مللي ثانية بعد تحفيز الصورة، وهذا يمكن استخدامها لاستحضار إمكانات العمل بطريقة قفل المرحلة من قبل مولد نبض لدراسة التأثير الحاد في مراحل النوم محددة. A opsin تفعيل ثابت مثل مستقرة خطوة وظيفة opsin (SSFO)، الذي يحث على إزالة استقطاب الخلايا العصبية لمدة 15 إلى 30 دقيقة بعد التحفيز، قد تكون مفيدة أيضا لبعض أنواع التجارب المصممة لمراقبة تأثير شبه مزمن28. الخلايا مزيلالاستقطاب مع SSFO قد تصبح أكثر حساسية لمختلف المدخلات العصبية الفسيولوجية ويتم تعطيلها عن طريق تطبيق ضوء الطول الموجي الطويل. وعلاوة على ذلك، يمكننا تنشيط المحاور عن طريق زرع الألياف البصرية في موقع الإسقاط axonal. يمكن أن يوفر تحفيز الألياف معلومات عن وظيفة مسار إسقاط بديهي معين.
EEG / EMG تسجيل أثناء التلاعب البصريات هو طريقة أقل الغازية لتحديد العواقب المباشرة للإثارة الانتقائية / تثبيط الدوائر العصبية على حالات النوم / اليقظة في الفئران. مع هذا الأسلوب, وقد ثبت العديد من السكان العصبية والدوائر العصبية أن تشارك في تنظيم حالات النوم / اليقظة. نحو مزيد من تطوير هذه التقنية، فمن الممكن لزرع ألياف متعددة للتعامل مع مسارات متعددة في وقت واحد، أو هذا يمكن أن تستخدم أيضا في تركيبة مع الألياف الضوئية أو مصغرة لمراقبة الأنشطة العصبية.
في الختام، من المتوقع أن علم الوراثة البصرية تسريع التقدم في فتح سر تنظيم النوم من قبل الدماغ وتطوير علاجات مبتكرة للأرق الحراري وغيرها من اضطرابات النوم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وقد تم دعم هذا المشروع جزئيا ماليا من قبل ميرك وشركاه.
Acknowledgments
وقد حظيت هذه الدراسة بدعم من برنامج دراسات المحققين في شركة ميرك (#54843)، ومنحة كاكينجي للبحوث العلمية في المجالات المبتكرة، و"ويل ديناميك" (16H06401) (T.S.)، ومنحة كاكينجي للبحوث الاستكشافية في المجالات الابتكارية (T.S.) (18H02595).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x1 Fiber-optic Rotary Joints | Doric | FRJ 1x1 FC-FC | for optogenetics |
| 6-pin header | KEL corporation | DSP02-006-431G | |
| 6-pin socket | Hirose | 21602X3GSE | |
| A/D converter | Nippon koden | N/A | Analog to digital converter |
| AAV10-EF1a-DIO-ChR2-EYFP | 3.70×1013(genomic copies/ml) | ||
| AAV10-EF1a-DIO-EYFP | 5.82×1013(genomic copies/ml) | ||
| Ampicillin | Fuji film | 014-23302 | |
| Amplifier | Nippon koden | N/A | for EEG/EMG recording |
| Anesthetic vaporizer | Muromachi | MK-AT-210D | |
| Automatic injecter | KD scientific | 780311 | |
| Carbide cutter | Minitor | B1055 | φ0.7 mm. Reffered as dental drill, used with high speed rotary micromotor |
| Cyanoacrylate adhesion (Aron alpha A) and acceleration | Konishi | #30533 | |
| Dental curing light | 3M | Elipar S10 | |
| Epoxy adhesive | Konishi | #04888 | insulation around the solder of 6-pin and shielded cable |
| Fiber optic patch cord (branching) | Doric | BFP(#)_50/125/900-0.22 | |
| Gad67-Cre mice | provided by Dr. Kenji Sakimura | Cre recombinase gene is knocked-in in the Gad67 allele | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 65461-01 | |
| High speed rotary micromotor kit | FOREDOM | K.1070 | Used with carbide cutter |
| Interconnecting sleeve | Thorlab | ADAF1 | φ2.5 mm Ceramic |
| Isoflurane | Pfizer | 871119 | |
| Laser | Rapp OptoElectronic | N/A | 473 nm wave length |
| Laser intesity checker | COHERENT | 1098293 | |
| Laser stimulator | Bio research center | STO2 | reffered as pulse generator in text |
| Optic fiber with ferrule | Thorlab | FP200URT-CANNULA-SP-JP | |
| pAAV2-rh10 | provided by PennVector Core | ||
| pAAV-EF1a-DIO-EYFP-WPRE-HGHpA | Addgene | plasimid # 20296 | |
| pAAV-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-HGHpA | provided by Dr. Karl Deisseroth | ||
| Patch cord | Doric | D202-9089-0.4 | 0.4m length, laser conductor between laser and rotary joint |
| pHelper | Stratagene | ||
| Photocurable dental cement | 3M | 56846 | |
| Serafin clamp | Stoelting | 52120-43P | |
| Shielded cable | mogami | W2780 | Soldering to 6-pin socket for EEG/EMG recording |
| Sleep recording chamber | N/A | N/A | Custum-made (21 cm× 29 cm × 19 cm) with water tank holder |
| Sleep sign software | KISSEI COMTEC | N/A | for EEG/EMG analysis |
| Slip ring | neuroscience,inc | N/A | for EEG/EMG analysis |
| Stainless screw | Yamazaki | N/A | φ1.0 x 2.0 |
| Stainless wire | Cooner wire | AS633 | 0.0130 inch diameter |
| Stereotaxic frame with digital console | Koph | N/A | Model 940 |
| Syringe needle | Hamilton | 7803-05 | |
| Vital recorder software | KISSEI COMTEC | N/A | for EEG/EMG recording |
References
- Spoormaker, V. I., Montgomery, P. Disturbed sleep in post-traumatic stress disorder: Secondary symptom or core feature? Sleep Medicine Reviews. 12 (3), 169-184 (2008).
- Dworak, M., Wiater, A., Alfer, D., Stephan, E., Hollmann, W., Struder, H. K. Increased slow wave sleep and reduced stage 2 sleep in children depending on exercise intensity. Sleep Medicine. 9 (3), 266-272 (2008).
- Mellman, T. A. Sleep and anxiety disorders. Psychiatric Clinics of North America. 29 (4), 1047-1058 (2006).
- Scammell, T. E., Arrigoni, E., Lipton, J. O. Neural circuitry of wakefulness and sleep. Neuron. 93 (4), 747-765 (2017).
- Chemelli, R. M., et al. Narcolepsy in orexin knockout mice: Molecular genetics of sleep regulation. Cell. 98 (4), 437-451 (1999).
- Borbély, A. A., Daan, S., Wirz-Justice, A., Deboer, T. The two-process model of sleep regulation: A reappraisal. Journal of Sleep Research. 25 (2), 131-143 (2016).
- Daan, S., Beersma, D. G., Borbely, A. A. Timing of human sleep: recovery process gated by a circadian pacemaker. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 246 (2), R161-R183 (1984).
- Saper, C. B., Cano, G., Scammell, T. E. Homeostatic, circadian, and emotional regulation of sleep. Journal of Comparative Neurology. 493 (1), 92-98 (2005).
- Saper, C. B., Fuller, P. M., Pedersen, N. P., Lu, J., Scammell, T. E. Sleep state switching. Neuron. 68 (6), 1023-1042 (2010).
- LeDoux, J. E. Emotion circuits in the brain. Annual Review of Neuroscience. 23, 155-184 (2000).
- Tovote, P., Fadok, J. P., Lüthi, A. Neuronal circuits for fear and anxiety. Nature Reviews Neuroscience. 16 (6), 317-331 (2015).
- Lebow, M. A., Chen, A. Overshadowed by the amygdala: the bed nucleus of the stria terminalis emerges as key to psychiatric disorders. Molecular Psychiatry. 21 (4), 450-463 (2016).
- Wu, S., et al. Tangential migration and proliferation of intermediate progenitors of GABAergic neurons in the mouse telencephalon. Development. 138 (12), 2499-2509 (2011).
- Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nature Reviews Neuroscience. 13 (4), 251-266 (2012).
- de Lecea, L., Carter, M. E., Adamantidis, A. Shining light on wakefulness and arousal. Biological Psychiatry. 71 (12), 1046-1052 (2012).
- Carter, M. E., Brill, J., Bonnavion, P., Huguenard, J. R., Huerta, R., de Lecea, L. Mechanism for hypocretin-mediated sleep-to-wake transitions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (39), E2635-E2644 (2012).
- Weber, F., Dan, Y. Circuit-based interrogation of sleep control. Nature Publishing Group. 538, 51-59 (2016).
- Weber, F., Chung, S., Beier, K. T., Xu, M., Luo, L., Dan, Y. Control of REM sleep by ventral medulla GABAergic neurons. Nature. 526, 435-438 (2015).
- Oishi, Y., et al. Slow-wave sleep is controlled by a subset of nucleus accumbens core neurons in mice. Nature Communications. 8 (1), 1-12 (2017).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Han, X., et al. A high-light sensitivity optical neural silencer: development and application to optogenetic control of non-human primate cortex. Frontiers in Systems Neuroscience. 5, 1-8 (2011).
- Kim, C. K., Adhikari, A., Deisseroth, K. Integration of optogenetics with complementary methodologies in systems neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 18 (4), 222-235 (2017).
- Saito, Y. C., et al. GABAergic neurons in the preoptic area send direct inhibitory projections to orexin neurons. Frontiers in Neural Circuits. 7 (December), 1-3 (2013).
- Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. A FLEX switch targets Channelrhodopsin-2 to multiple cell types for imaging and long-range circuit mapping. Journal of Neuroscience. 28 (28), 7025-7030 (2008).
- Kodani, S., Soya, S., Sakurai, T. Excitation of GABAergic neurons in the bed nucleus of the stria terminalis triggers immediate transition from non-rapid eye movement sleep to wakefulness in mice. Journal of Neuroscience. 37, 7174-7176 (2017).
- Lin, F., Pichard, J. Handbook of practical immunohistochemistry: frequently asked questions. , Springer. (2011).
- Wiegert, J. S., Mahn, M., Prigge, M., Printz, Y., Yizhar, O. Silencing neurons: tools, applications, and experimental constraints. Neuron. 95 (3), 504-529 (2017).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Prigge, M., Schneider, F., Davidson, T. J., O’Shea, D. J., Sohal, V. S., Goshen, I., Finkelstein, J., Paz, J. T., Stehfest, K., Fudim, R., Ramakrishnan, C., Huguenard, J. R., Hegemann, P., Deisseroth, K. Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction. Nature. 40 (6), 1301-1315 (2012).
