Summary
Hier beschreiben wir Methoden der optogenetischen Manipulation bestimmter Arten von Neuronen bei der Überwachung von Schlaf-/Wachzustanden bei Mäusen und stellen unsere jüngsten Arbeiten am Bettkern der Stria terminalis als Beispiel vor.
Abstract
In den letzten Jahren wurde die Optogenetik in vielen Bereichen der neurowissenschaftlichen Forschung weit verbreitet. In vielen Fällen wird ein Opsin, wie Kanal Rhodopsin 2 (ChR2), durch einen Virusvektor in einer bestimmten Art von neuronalen Zellen in verschiedenen Cre-Driver-Mäusen exprimiert. Die Aktivierung dieser Opsine wird durch die Anwendung von Lichtimpulsen ausgelöst, die per Laser oder LED über optische Kabel geliefert werden, und die Wirkung der Aktivierung wird mit sehr hoher Zeitauflösung beobachtet. Experimentatoren sind in der Lage, Neuronen akut zu stimulieren, während sie das Verhalten oder ein anderes physiologisches Ergebnis bei Mäusen überwachen. Optogenetik kann nützliche Strategien ermöglichen, um die Funktion neuronaler Schaltkreise bei der Regulierung von Schlaf-/Wachzustanden bei Mäusen zu bewerten. Hier beschreiben wir eine Technik zur Untersuchung der Wirkung der optogenetischen Manipulation von Neuronen mit einer spezifischen chemischen Identität während der Elektroenzephalogramm- (EEG) und Elektromyogramm-Überwachung (EMG) zur Bewertung des Schlafstadiums von Mäusen. Als Beispiel beschreiben wir die Manipulation von GABAergen Neuronen im Bettkern der Stria terminalis (BNST). Akute optogenetische Erregung dieser Neuronen löst einen schnellen Übergang zur Wachheit aus, wenn sie während des NREM-Schlafes angewendet wird. Optogenetische Manipulation zusammen mit EEG/EMG-Aufzeichnung kann angewendet werden, um die neuronalen Schaltkreise zu entschlüsseln, die Schlaf-/Wachzustand regulieren.
Introduction
Schlaf ist wichtig für eine optimale kognitive Funktion. Jüngste Ergebnisse deuten auch darauf hin, dass Schlafstörungen mit einer Vielzahl von Krankheiten verbunden sind1,2,3. Obwohl die Funktionen des Schlafes noch weitgehend ungelöst sind, wurden in letzter Zeit wesentliche Fortschritte beim Verständnis der neuronalen Schaltkreise und Mechanismen erzielt, die Schlaf-/Wachzustande steuern4. Bei Säugetieren gibt es drei Zustände der Wachsamkeit: Wachheit, Nicht-schnelle Augenbewegung (NREM) Schlaf, und schnelle Augenbewegung (REM) Schlaf. Wachheit zeichnet sich durch schnelle EEG-Oszillationen (5-12 Hz) niedriger Amplitude mit gezielter und anhaltender motorischer Aktivität aus. NREM-Schlaf wird durch langsame Schwingungen (1-4 Hz) hoher Amplitude (Deltawellen) mit Bewusstseinsmangel und zielgerichteter motorischer Aktivität definiert. REM-Schlaf zeichnet sich durch relativ schnelle Schwingungen (6-12 Hz) niedriger Amplitude und fast vollständiger bilateraler Muskulatur5aus.
Borbely schlug eine Theorie der Schlaf-Wachigkeit-Regulierung bekannt als die beiden Prozessmodell6,7. Ein atostatischer Prozess, auch Prozess S genannt, stellt Schlafdruck dar, der sich während der Wachheit ansammelt und sich während des Schlafes auflöst. Ein weiterer Prozess, der als Prozess C bezeichnet wird, ist ein zirkadianer Prozess, der erklärt, warum die Wachsamkeit im 24-Stunden-Zyklus schwankt. Zusätzlich zu diesen beiden Prozessen sind allostatische Faktoren auch wichtig für die Regulierung von Schlaf/Wachheit8,9. Allostatische Faktoren sind Ernährungszustände und Emotionen. Angst und Angst werden in der Regel von einer Zunahme der Erregung zusammen mit autonomen und neuroendokrinen Reaktionen10,11,12begleitet. Es wird angenommen, dass das limbische System eine Rolle bei der Regulierung von Angst und Angst spielt, und Mechanismen, die autonomen und neuroendokrinen Reaktionen zugrunde liegen, wurden ausgiebig untersucht, aber der Weg, durch den das limbische System Schlaf-/Wachzustande beeinflusst, hat noch enthüllt. Eine große Anzahl neuerer Studien mit Opto- und Pharmakogenetik haben gezeigt, dass Neuronen und neuronale Schaltkreise, die Schlaf-/Wachzustande regulieren, im gesamten Gehirn verteilt sind, einschließlich der Kortiken, Basalvorhirn, Thalamus, Hypothalamus, und Hirnstamm. Insbesondere die jüngsten Fortschritte in der Optogenetik haben es uns ermöglicht, bestimmte neuronale Schaltkreise in vivo mit hohen räumlichen und zeitlichen Auflösungen zu stimulieren oder zu hemmen. Diese Technik ermöglicht Fortschritte in unserem Verständnis der neuronalen Substrate von Schlaf und Wachheit, und wie Schlaf / Wachheit Zustände durch zirkadiane Prozesse reguliert werden, Schlafdruck, und allostatische Faktoren, einschließlich Emotionen. Dieses Papier zielt darauf ab, einzuführen, wie optogenetische Manipulation kombiniert mit Schlaf/Wach-Aufzeichnung verwendet werden kann, die das Potenzial haben könnte, unser Verständnis der Verbindungen und Mechanismen im Gehirn zu aktualisieren, die eine Rolle bei der Regulierung von NREM-Schlaf, REM-Schlaf, und Wachheit. Das Verständnis dieses Mechanismus, durch den das limbische System Schlaf-/Wachzustandreguliert, ist von größter Bedeutung für die Gesundheit, da Schlaflosigkeit in der Regel mit Angst oder Angst verbunden ist, nicht schlafen zu können (Somniphobie).
Die BNST wird gedacht, um eine wesentliche Rolle in Angst und Angst zu spielen. GAD 67-exeziniert GABAerge Neuronen sind eine Hauptpopulation der BNST12,13. Wir untersuchten die Wirkung der optogenetischen Manipulation dieser Neuronen (GABABNST) auf Schlaf/Wachheit Zustände. Einer der größten Fortschritte in der Neurowissenschaft in den letzten Jahren waren Methoden, die die Manipulation von Neuronen mit bestimmten chemischen Identitäten in vivo mit hohen räumlichen und zeitlichen Auflösungen ermöglichen. Optogenetik ist sehr nützlich, um kausale Zusammenhänge zwischen neuronaler Aktivität und spezifischen Verhaltensreaktionen zu demonstrieren14. Wir beschreiben die Optogenetik als eine Methode, um die funktionelle Konnektivität definierter neuronaler Schaltkreise bei der Regulierung von Schlaf-/Wachzustanden zu untersuchen. Durch die Verwendung dieser Technik, große Fortschritte wurden beim Verständnis der neuronalen Schaltkreise, die Schlaf / Wachheit Zustände regulieren15,16,17,18,19 . In vielen Fällen werden Opsine speziell in Neuronen mit besonderen chemischen Identitäten in selektiven Hirnregionen durch eine Kombination von Cre-Driver-Mäusen und Cre-induzierbarem AAV-vermitteltem Gentransfer eingeführt. Darüber hinaus ermöglicht die fokale Expression von lichtempfindlichen Opsinen wie Channelrhodopsin 2 (ChR2)20 oder Archaerhodopsin (ArchT)21 in Kombination mit einem Cre-loxP- oder Flp-FRT-System neuronalen Weg22.
Wir beschreiben hier Experimente an GABAergen Neuronen im BNST als Beispiel. Um Opsine in einer bestimmten neuronalen Population auszudrücken, werden am häufigsten geeignete Cre-Treibermäuse und Cre-abhängige Virusvektoren verwendet. Transgene oder Knock-in-Linien, in denen Opsine in bestimmten neuronalen Populationen exprimiert werden, sind ebenfalls nützlich. In den folgenden Experimenten verwendeten wir GAD67-Cre-Knock-in-Mäuse23, bei denen nur GABAerge Neuronen Cre-Rekombination mit einem c57BL/6J genetischen Hintergrund und einen AAV-Vektor, der ChR2 (hChR2 H134R) enthält, mit EYFP oder EYFP als Kontrolle verschmelzen mit einem "FLEx (Flip-Excision) Schalter"24. Das Verfahren beschreibt speziell optogenetische Anregung von GABAergen Neuronen im BNST während der Überwachung von Schlaf / Wachheit Zustände25.
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Protocol
Alle Experimente hier wurden vom Animal Experiment and Use Committee der Universität Tsukuba genehmigt, das den NIH-Richtlinien entspricht.
1. Tierchirurgie, Virusinjektion, Elektrode für EEG/EMG und optische Faserimplantation
ACHTUNG: Geeignete Schutz- und Handhabungstechniken sollten auf der Grundlage des Biosicherheitsniveaus des zu verwendenden Virus ausgewählt werden. AAV sollte in einem isolierten P1A-Zertifizierten Injektionsraum verwendet werden, und das Rohr, das AAV trägt, muss mit einem Autoklaven sterilisiert werden, nachdem das gesamte Volumen aufgebraucht ist. Die chirurgische Stelle und das gesamte implantierte Material sollten während des Gebrauchs sauber und steril sein.
HINWEIS: Siehe Abbildung 1.
- Desinfizieren Sie die chirurgischen Geräte mit dem Autoklaven.
- Anästhesisieren Sie Mäuse mit Isofluran emit einem Anästhetikum Verdampfer. Beobachten Sie, bis die Maus die gewünschte Tiefe der Anästhesie erreicht hat, bestimmt durch den Verlust der Reaktion auf das Kneifen des Schwanzes mit Zangen. Tragen Sie die ophthalmologische Salbe auf die Augen auf, um zu verhindern, dass sie trocknen.
- Desinfizieren Sie das Operationsfeld mit Jodlösung oder 70% EtOH (3x) und trocknen Sie ausreichend. Lassen Sie das Virus auf Eis auftauen, während die Operation durchgeführt wird. Bedecken Sie den operationsfolgenden Bereich mit saugfähigem Laborbankpapier.
- Fixieren Sie den Kopf der Maus im stereotaktischen Gerät mit Ohrbügeln und einer Nasenprise. Nach der Bestätigung des Kopfes stabil gehalten wird, machen Sie einen midsagittalen Schnitt in der Kopfhaut, um sicherzustellen, dass die Positionen des Bregma und Lambda auf der gleichen Ebene auf einer horizontalen Linie befinden.
- Um eine Positionierlücke zu vermeiden, passen Sie die Ebenen der Nasenkneife und Der Ohrbügel nach oben und unten an. Bregma und Lambda beziehen sich auf die Schnittmenge zwischen sutura saggitalis und sutura coronalis bzw. sutura lambdoidal (Abbildung 2).
- Verwenden Sie Serafin-Klemmen, um die Haut zu halten, um den Zugang zum Schädel zu erhalten. Nach der Exposition des Schädels, desinfizieren Sie dieOberfläche des Schädels mit Jod oder 5% H2 O2 , damit die Schädelnähte einschließlich Bregma und Lambda klarer visualisiert werden können.
- AAV-Vektorinjektion vorbereiten:
- Waschen Sie das Innere einer 10 ml Spritze (siehe Materialtabelle)sequenziell mit 70% EtOH, 100% EtOH und sterilisiertem Wasser, jeweils 5 mal. Befesten Sie die Spritze in der Klemme eines Mikroinjektionspumpenarms und stellen Sie sicher, dass alle Lösungen in der Spritze entladen werden.
- Saugen Sie vorsichtig 2 l Mineralöl ohne Luftblasen an, dann das angegebene Volumen der Viruslösung ansaugen. Nach dem Absieren den Kolbenknopf manipulieren und bestätigen, dass die Viruslösung an der Spitze der Nadel entsteht.
HINWEIS: Das Injektionsvolumen der Viruslösung wurde in Pilotversuchen mit demselben Mausstamm und demselben Virusprodukt ermittelt. Der Zusammenhang zwischen dem Volumen der Viruslösung und dem Ausmaß des Infektionsgebiets sollte im Voraus geschätzt werden.
- AAV-Vektor injizieren:
- Passen Sie die Spitze der Mikroinjektionsnadel auf dem Bregma an und notieren Sie die Koordinaten als ursprünglichen Punkt. Bewegen Sie die Spitze an die vorgesehene Injektionsstelle (für den BNST: anteroposterior + 0,2 mm, mediolateral bei 1,0 mm, dorsoventral - 4,2 mm) und legen Sie die Spitze der Nadel auf die Position. Setzen Sie mit einem Zahnbohrer mit einem 0,7 mm Hartmetallschneider eine Markierung auf den Schädel und bohren Sie Löcher mit einem Durchmesser von ca. 2 mm. Achten Sie darauf, die Dura oder das Hirngewebe nicht zu beschädigen.
- Nachdem Sie blutumfeiner aus den Löchern mit einem Wattestäbchen entfernt haben, bewegen Sie die Nadel langsam in die Position des BNST. Injizieren Sie die vorgesehene Viruslösungsmenge (0,07 l/min) langsam mit einem mechanischen Mikroinjektor. Nach Abschluss der Injektion die Nadel 5 min lassen, damit die Lösung das BNST-Gewebe ausreichend infiltrieren kann. Nehmen Sie die Nadel vorsichtig heraus.
- Bei der bilateralen Injektion die Schritte 1.8.1-1.8.2 auf der anderen Seite wiederholen. Während des gesamten Verfahrens, halten Sie den Schädel feucht mit Anwendungen von steriler Saline.
HINWEIS: Wir verwendeten kundenspezifische EEG/EMG Implantate (B: 5 mm, D: 7 mm, H: 1 mm) mit vier EEG-Elektroden (4 mm), zwei EMG-Elektroden (2 mm; schneiden Sie die 4 mm Elektrode auf 2 mm mit Nippern) und 6 Elektroden (4,5 mm) (Abbildung2A).
- Löten Sie zwei Edelstahldrähte (siehe Materialtabelle), von denen 1 mm der Isolierung an beiden Enden zu den EMG-Elektroden abgezogen werden. Stellen Sie die Mitte der Elektroden an die Bregma ein und markieren Sie die Position jeder EEG-Elektrode (Anteroposterior bei 1,5 mm, mediolateral 1,0 mm), und bestimmen Sie die Position des Implantats (Abbildung 2B).
- Optische Fasern im Implantat:
- Befestigen Sie eine Glasfaser-Ferrule am Manipulator und drehen Sie den Manipulatorarm so, dass er einen Winkel von 30° gegen eine horizontale Linie hat (dieser Prozess wird nur benötigt, um Interferenzen zwischen Elektroden und Optischen Fasern zu vermeiden, wie im Fall der BNST-Stimulation). Setzen Sie die Faserspitze auf das Bregma und notieren Sie die Koordinaten.
- Bewegen Sie die Spitze zur gezielten Einfügelinie und markieren Sie die Position auf dem Schädel. Setzen Sie auch zusätzliche Markierungen in der Nähe der Einsteckstelle für die Ankerschrauben. Bohren Sie den Schädel an jeder Stelle mit einem Zahnbohrer, um die Glasfaser einzufügen und die Schraube zu fixieren. Befestigen Sie die Schraube am Schädel. Achten Sie darauf, die Dura nicht zu brechen oder Gewebe durch Schraube zu beschädigen.
- Legen Sie die Glasfaser vorsichtig ein, bis sie mit einem Manipulator über den BNST gelangt. Die Ferrule sollte auf dem verbleibenden Schädel ruhen (Abbildung 1B).
- Tragen Sie photoheilbaren Zahnzement (siehe Materialtabelle) auf, um die Faser und die Schraube zu bedecken. Die Reaktionszeit zur Verfestigung des Klebers sollte im Herstellerhandbuch angegeben werden (Unser Material benötigt Lichtbelichtung für mindestens 10 s mit spezifischem Wellenlängen-Fotogenerator. Es ist unnötig, den Kleber danach zu trocknen).
- Stellen Sie in diesem Schritt sicher, dass keine Materialien (Schraube oder Kleber) den Montageraum für die Elektroden einnehmen. Vermeiden Sie außerdem eine Unterbrechung des Zements für den Ferrule-Anschluss an die Glasfaser und das Kabel. Wiederholen Sie die Schritte 1.10.1-1.10.4 auf der gegenüberliegenden Seite für die bilaterale Stimulation.
- Bohrlöcher für EEG/EMG Elektroden. Setzen Sie die Spitzen der Elektroden in die Löcher ein. Halten Sie das Implantat und wenden Sie Cyanoacrylat-Klebstoff auf den Raum zwischen dem Schädel und den Elektroden an. Wieder einfügen mit Aufmerksamkeit, um keine Materialien zu stören.
- Bedecken Sie den Umfang der Elektroden und Glasfasern mit Cyanoacrylat-Klebstoff gefolgt von der Anwendung von Cyanoacrylat-Beschleuniger auf den Klebstoff. Dieser Schritt vermeidet Unterbrechungen am Ferrule-to-Optik-Kabel und der Elektroden-zu-Blei-Drahtverbindungszone (Abbildung 1C).
HINWEIS: Cyanoacrylat-Klebstoff und sein Beschleuniger sind schädlich für das Mausauge. Achten Sie darauf, diese chemischen Substanzen nicht auslaufen zu lassen. Achten Sie auch darauf, die Elektroden und Fasern nicht stark zu berühren, um unerwartete Abweichungen unmittelbar nach der Klebeerstarrung zu vermeiden. - Setzen Sie die Maushalsmuskulatur aus und legen Sie die Drähte für die EMG-Elektrode unter den Muskel ein. Stellen Sie die Länge der EMG-Elektrode so ein, dass sie sich knapp unter den Nuchalmuskeln befindet. Lichtverbindung zwischen Elektrodenspitze und Muskelfaszie reicht aus, um das EMG-Signal zu fangen.
- Cyanoacrylat-Klebstoff auftragen, um die Implantate zu füllen und den Klebstoff mit Beschleunigungsflüssigkeit zu verfestigen. Legen Sie dann die Maus auf ein Heatpad für die Erholung, bis der Haltungsreflex erscheint. Einstellung der Wärmepolstertemperatur auf die körperbelastete Körpertemperatur der Tiere (36,0 °C in ZT 0-12 bei C57BL6-Mäusen; nicht mehr als 38,0 °C).
HINWEIS: Ein Antibiotikum ist für sterile Operationen nicht erforderlich. - Befolgen Sie Ihre lokalen institutionellen Richtlinien für postoperative Analgesie. Halten Sie die Mäuse in einem Hauskäfig für eine Erholungsphase von mindestens 7 Tagen.
2. EEG/EMG Monitoring mit Photo-Erregung von gezielten Neuronen in bestimmten Schlafzuständen
ACHTUNG: Dieses Protokoll umfasst die Verwendung von Lasergeräten der Klasse 3B oder LED-Geräten. Die Experimentatoren sollten sich der Sicherheitsinformationen bewusst sein. Schutzbrillen sind erforderlich.
- Bevor Sie das Laserkabel mit der Glasfaser verbinden, stellen Sie die Laserintensität mit einem Scaler ein. Die Spitze des Laserkabels an eine ungenutzte Glasfaser mit einer Ferrule und bestätigen, dass an der Kreuzung zwischen Faser und Kabel kein Platz vorhanden ist.
- Schalten Sie den Hauptschalter des Lasers ein und warten Sie 20 min, bis er sich erwärmt.
- Emittieren Sie den Laser an den Intensitätsprüfer und passen Sie die Laserintensität auf 10 mW/mm2an. Ändern Sie den Lasermodus in Transistorlogik und bestätigen Sie, dass Lichtimpulse von der fasergesteuerten Faser emittiert werden, die vom Musterregler gesteuert wird, der auf 10 ms für die Dauer, 40 ms für ruhe, 20-mal für den Zyklus und 20-fache Wiederholung (d. h. 20 Hz von 10 ms Lichtimpulsen für 20 s) eingestellt ist.
- Nach der Erholungsphase die Mäuse zur Aufnahme von EEG/EMG in die Versuchskammer bringen. Hausmäuse bei konstanten 23 °C mit einem 12 h Hell/Dunkel-Zyklus mit Nahrung und Wasser verfügbar ad libitum.
- Schließen Sie die implantierte Elektrode und den Kabeladapter an, der an einen Schlupfring gebunden ist, um Verwicklungen zu vermeiden. Es wird empfohlen, die Kreuzung mit lichtundurchlässigem Material wie Aluminiumfolie zu bedecken, um Laserlecks zu verhindern. Wenn ein bilaterales Experiment erforderlich ist, verwenden Sie einen Schlupfring mit einer Bifurkonfürsaufsatz für die Kabel.
- In diesem Protokoll bewerten wir die Latenz bis zur Wachheit aus NREM-Schlaf oder REM-Schlaf, so dass die Aufnahmezeit in optimierter Zeitgeberzeit begrenzt werden sollte (ZT0 ist definiert als die Zeit, in der das Licht eingeschaltet ist). Dieses Protokoll wurde zwischen ZT4 - ZT10 durchgeführt. Lassen Sie die Mäuse als Akklimatisierung mindestens 1 h frei in der Versuchskammer bleiben.
- Überwachen Sie während des Versuchszeitraums EEG- und EMG-Signale im selben Monitor und bewerten Sie den Zustand der Maus als Wachheit, NREM-Schlaf oder REM-Schlaf. Verwenden Sie die Verstärkungssteuerung für jede Welle, um die Unterscheidung der einzelnen Zusteine zu erleichtern.
- Zur Messung des NREM-Schlafes bis zur Wachzeit latenz, beobachten Sie stabilen NREM-Schlaf für 40 s oder stabilen REM-Schlaf für 30 s, dann schalten Sie den Schalter des Mustergenerators für Photostimulation (dieses Protokoll erzeugt 20 Hz von 10 ms Lichtimpulse für 20 s). Bestätigen Sie die Laseremission auf die implantierten Glasfasern.
- EEG/EMG-Signale aufzeichnen, bis sich der Schlafzustand in Wachheit ändert. Wenn zwei oder mehr experimentelle Versuche erforderlich sind, beschränken Sie die optogenetische Manipulation auf einmal täglich, da Photostimulation eine künstliche Intervention ist, die die Schlaf-Wach-Architektur beeinflussen könnte.
- Nach dem Experiment, tief anästhesisieren und durchdringen mit sterilem Saline und Paraformaldehyd (PFA) für die Probenahme des gesamten Gehirns für immunhistochemische Analyse26.
3. Analyse der Latenzzeit von NREM Sleep bis Wakefulness
- Übertragen Sie nach der Aufzeichnung von EEG/EMG-Signalen die Signaldaten an einen Computer, um Schlaf-/Wachzustande zu erfassen. Dieses Protokoll beschreibt die Methode zur EEG-Analyse mit Aufzeichnungssoftware (siehe Materialtabelle).
- Starten Sie die Sleep Sign-Anwendung, und klicken Sie auf die Registerkarte Datei und wählen Sie Öffnen aus, um die aufgezeichneten Daten (.kcd-Datei) auszuwählen. Klicken Sie auf die Registerkarte Schlaf, um Epoche zum Anpassen des Zeitfensters für jede Epoche auszuwählen (wir verwenden 1 Epoche/4 Sek.).
- Bewertung von Schlaf-/Wachzuständen auf Basis von EEG/EMG-Signalen nach folgenden Kriterien: Wachheit, hohe EMG- und Niedrige EEG-Spannung mit hoher Frequenz; NREM, niedriger EMG-Ton und hohe EEG-Spannung mit hoher Frequenz von 0,5-4 Hz; und REM, EMG zeigt Muskelatonia und niedrige EEG-Spannung mit hoher (6-9 Hz) Frequenz. Ein Zustand, der nicht nacheinander für 16 s (d. h. 4 Epochen) fortbesteht, wird nicht als Zustandsänderung definiert, da er kein stabiler Zustand ist.
- Klicken und halten Sie die linke Maustaste auf die erste Epoche und ziehen Sie den Cursor, bis der spezifische Trend von mehr als 16 s (4 Epochen) beendet ist. Lassen Sie dann die linke Maustaste los und wählen Sie den entsprechenden Zustand (Wachheit oder NREM-Schlaf oder REM-Schlaf) im Pop-up-Fenster aus. Wiederholen Sie diesen Vorgang, um alle in der Datei aufgezeichneten EEG/EMG-Signale zu bewerten.
- Finden Sie den genauen Zeitpunkt der Stimulation in der Epoche, in der das EEG NREM- oder REM-Schlaf zeigt, und die Epoche, die den Zustandsübergang nach dem Stimulationspunkt zeigt. Zählen Sie die Anzahl der Epochen zwischen den Perioden kurz nach der Stimulation und kurz vor dem Übergang zum Zustand.
- Dann multiplizieren gezählte Anzahl der Epochen mit 4 s (A). In der Epoche der Stimulation, nehmen Sie einen Screenshot und messen Sie die Breite zwischen dem Stimulationspunkt und dem Ende der Epoche. Dividieren Sie dann die gemessene Länge durch die gesamte Epochenlänge und multiplizieren Sie sie mit 4 s (B). In ähnlicher Weise berechnen Sie die Dauer des NREM-Schlafs in der Epoche der Zustandsänderung, d. h. die Zeit zwischen dem Beginn der Epoche und dem Zustandsänderungspunkt (C).
- Sum A, B und C, um die Latenz vom NREM-Schlaf bis zur Wachheit zu erhalten. Das gleiche Verfahren wird für die Analyse des Zustandsübergangs vom REM-Schlaf zur Wachheit verwendet.
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Representative Results
Die vorliegende Studie zeigte die Wirkung der optogenetischen Erregung von GABABNST Neuronen auf schlafzustandübergang. ChR2-EYFP wurde in GABA-Neuronen im BNST fokal exprimiert. Eine histochemische In-situ-Hybridisierung zeigte, dass ChR2-EYFP in Neuronen kolokalisiert wurde, die GAD 67 mRNA-Signale exdrücken, was darauf hindeutet, dass es sich um GABAerge Neuronen handelt. Immunhistochemische Scheibenproben bestätigten die Position der Glasfaser, deren Spitze knapp über dem BNST25lag.
Abbildung 3A zeigt repräsentative EEG/EMG-Spuren vor und nach der Photostimulation während des NREM-Schlafs. Hochspannungs- und Langsamfrequenz-EEG ohne EMG-Signale stellen NREM-Schlaf dar. Photostimulation (10 ms Impulse bei 20 Hz für 20 Sek.) wurde nach stabilem NREM-Schlaf angewendet. Die Stimulation löst nach der Stimulation bei ChR2-exemitten Mäusen einen akuten Übergang zur Wachheit (Niederspannung und Hochfrequenz-EEG mit aktiven EMG-Signalen) aus. Kontrollmäuse (EYFP) zeigten keinen Übergang nach stimulation (Latenz des Aufwachens von NREM: EYFP, 295,39 x 106,61 Sek., n = 6; ChR2: 2,71 x 0,59 Sek., n = 6; t10 = 2,35, p < 0,05; Abbildung 3B, oben). Diese Daten deuten darauf hin, dass die Anregung von GABABNST Neuronen während NREM Schlaf löst schnelle Induktion der Wachheit. Auf der anderen Seite hatte die Photostimulation während des REM-Schlafs keine Wirkung (EYFP: 36,45 x 13,08 Sek., n = 6; ChR2: 37,29 x 15,19 Sek., n = 6; t10 = 0,04, p = 0,484; Abbildung 3B, unten), so dass ein Übergangseffekt nur im NREM-Schlaf auftauchte.
Abbildung 1 : Verfahren zur Injektion von AAV-, Implantat-Optikfasern und EEG/EMG-Implantaten. (A) Experimentelles Verfahren der Virusinjektion. EYFP-fused ChR2 oder EYFP (for control) Gen in AAV-Vektor integriert, deren Transkription durch Cre Recombinase aktiviert wurde bilateral in den BNST injiziert. (B) Optische Fasern wurden in einem 30°-Winkel zur Horizontalen in Richtung BNST eingesetzt, um eine Kollision mit der Elektrode zu verhindern. Zwei Schrauben wurden um sie herum eingesetzt. (C) EEG/EMG-Aufnahmegerät wurde nach gesicherter Platzierung der Glasfasern implantiert. (D) Am Ende der Operation sollte der gesamte Operationsbereich mit Cyanoacrylatkleber bedeckt und stark fixiert werden. Achten Sie darauf, kein Mittel auf die Region zu verwenden, die die Elektrode und ferrules verbindet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2 : Benutzerdefinierte EEG/EMG Elektroden- und Elektrodenstifte Einsteckstellen. (A) Oben: Von 6 Elektrodenstiften werden die beiden externen Stifte auf 2 mm reduziert. Unten: EEG/EMG-Elektroden. (B) Diese Elektroden und EMG Leitungsdrähte werden dann gelötet. Die Verbindungszone sollte mit jeder Isolierung wie Cyanoacrylat-Klebstoff isoliert werden. Die Einfügestellen der Elektroden sind relativ zum Bregma (Anteroposterior bei 1,5 mm, mediolateral 1,0 mm). EMG-Drähte werden unter den Nackenmuskel mit Entfernung der Isolierung zum Schutz des Drahtes an der Einsteckstelle (1 mm) eingesetzt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3 : Wirkung von GABABNST Stimulation des Zustandsübergangs im NREM-Schlaf und REM-Schlaf. (A) Vertreter EEG und EMG-Wellen- und EEG-Leistungsspektrum. Photostimulation (10 ms Pulse bei 20 Hz für 20 Sek.) wurde nach 40 s NREM-Schlaf auf ChR2-exzessive GABABNST Neuronen angewendet. Wachheit wurde schnell nach einem 2 s induziert. Das EEG zeigte Niederspannung und hohe Frequenz mit EMG Berstung. Das EEG-Leistungsspektrogramm zeigte auch den Übergang von nieder- zur hochfrequenten. (B) Optogenetische Anregung von GABABNST Neuronen zeigte schnellen Übergang von NREM Schlaf zu Wachheit (oben), aber dieser Effekt wurde nicht im Falle der Anwendung der gleichen Manipulation im REM-Schlaf (unten) gesehen. *p < 0.05, Welch es t-test. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Wir stellten hier eine Methode vor, um die Wirkung der optogenetischen Stimulation von Neuronen mit bestimmten chemischen Identitäten auf Zustandsübergänge von Schlaf/Wachheit zu bewerten und gaben ein Beispiel für die Manipulation von GABABNST Neuronen. Unsere Daten zeigten, dass optogenetische Anregung von GABABNST Neuronen führt zu sofortigen Übergang von NREM Schlaf zu Wachheit.
Verschiedene experimentelle Designs sind aufgrund der Entwicklung von zahlreichen Arten von optogenetischen Werkzeugen verfügbar. Es ist möglich, neuronale Aktivität bestimmter Neuronen mit verschiedenen Arten von Opsinen zu aktivieren oder zu hemmen, wie ChR2, SSFO, Halorhodopsin, ArchT und iChloC27. ChR2 kann Neuronen ein paar Millisekunden nach der Photostimulation aktivieren und dies kann verwendet werden, um Aktionspotenziale in einer Phase-Lock-Manier durch einen Impulsgenerator zu evozieren, um die akuteN Auswirkungen in bestimmten Schlafstadien zu untersuchen. Ein stabil aktivierendes Opsin wie Stable Step Function Opsin (SSFO), das eine Depolarisation von Neuronen für 15 bis 30 min nach der Stimulation induziert, könnte auch für einige Arten von Experimenten nützlich sein, die entwickelt wurden, um eine semichronische Wirkung zu beobachten28. Depolarisierte Zellen mit SSFO könnten empfindlicher auf verschiedene physiologische neuronale Eingaben reagieren und durch Anwendung von langwelligem Licht deaktiviert werden. Darüber hinaus können wir Axone durch Implantation von Optischen Fasern an der Stelle einer axonalen Projektion aktivieren. Die Faserstimulation könnte Informationen über die Funktion eines bestimmten axonalen Projektionswegs liefern.
EEG/EMG-Aufzeichnung während der optogenetischen Manipulation ist eine weniger invasive Methode, um die direkten Folgen der selektiven Anregung/Hemmung von neuronalen Schaltkreisen auf Schlaf-/Wachfähigkeitszustände bei Mäusen zu bestimmen. Mit dieser Methode, viele neuronale Populationen und neuronale Schaltkreise haben gezeigt, dass in der Regulierung von Schlaf / Wachheit Zustände beteiligt sind. Zur Weiterentwicklung dieser Technik ist es möglich, mehrere Fasern zu implantieren, um mehrere Bahnen gleichzeitig zu manipulieren, oder dies könnte auch in Kombination mit Faserphotometorium oder Miniskopen verwendet werden, um neuronale Aktivitäten zu überwachen.
Abschließend wird erwartet, dass die Optogenetik den Fortschritt bei der Entschlüsselung des Geheimnisses der Schlafregulierung durch das Gehirn und die Entwicklung innovativer Therapien für feuerfeste Schlaflosigkeit und andere Schlafstörungen beschleunigen wird.
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Disclosures
Dieses Projekt wurde teilweise von Merck & Co. finanziell unterstützt.
Acknowledgments
Diese Studie wurde unterstützt durch das Merck Investigator Studies Program (#54843), ein KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas, "WillDynamics" (16H06401) (T.S.) und ein KAKENHI Grant-in-Aid for Exploratory Research on Innovative Areas (T.S.) (18H02595).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x1 Fiber-optic Rotary Joints | Doric | FRJ 1x1 FC-FC | for optogenetics |
| 6-pin header | KEL corporation | DSP02-006-431G | |
| 6-pin socket | Hirose | 21602X3GSE | |
| A/D converter | Nippon koden | N/A | Analog to digital converter |
| AAV10-EF1a-DIO-ChR2-EYFP | 3.70×1013(genomic copies/ml) | ||
| AAV10-EF1a-DIO-EYFP | 5.82×1013(genomic copies/ml) | ||
| Ampicillin | Fuji film | 014-23302 | |
| Amplifier | Nippon koden | N/A | for EEG/EMG recording |
| Anesthetic vaporizer | Muromachi | MK-AT-210D | |
| Automatic injecter | KD scientific | 780311 | |
| Carbide cutter | Minitor | B1055 | φ0.7 mm. Reffered as dental drill, used with high speed rotary micromotor |
| Cyanoacrylate adhesion (Aron alpha A) and acceleration | Konishi | #30533 | |
| Dental curing light | 3M | Elipar S10 | |
| Epoxy adhesive | Konishi | #04888 | insulation around the solder of 6-pin and shielded cable |
| Fiber optic patch cord (branching) | Doric | BFP(#)_50/125/900-0.22 | |
| Gad67-Cre mice | provided by Dr. Kenji Sakimura | Cre recombinase gene is knocked-in in the Gad67 allele | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 65461-01 | |
| High speed rotary micromotor kit | FOREDOM | K.1070 | Used with carbide cutter |
| Interconnecting sleeve | Thorlab | ADAF1 | φ2.5 mm Ceramic |
| Isoflurane | Pfizer | 871119 | |
| Laser | Rapp OptoElectronic | N/A | 473 nm wave length |
| Laser intesity checker | COHERENT | 1098293 | |
| Laser stimulator | Bio research center | STO2 | reffered as pulse generator in text |
| Optic fiber with ferrule | Thorlab | FP200URT-CANNULA-SP-JP | |
| pAAV2-rh10 | provided by PennVector Core | ||
| pAAV-EF1a-DIO-EYFP-WPRE-HGHpA | Addgene | plasimid # 20296 | |
| pAAV-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-HGHpA | provided by Dr. Karl Deisseroth | ||
| Patch cord | Doric | D202-9089-0.4 | 0.4m length, laser conductor between laser and rotary joint |
| pHelper | Stratagene | ||
| Photocurable dental cement | 3M | 56846 | |
| Serafin clamp | Stoelting | 52120-43P | |
| Shielded cable | mogami | W2780 | Soldering to 6-pin socket for EEG/EMG recording |
| Sleep recording chamber | N/A | N/A | Custum-made (21 cm× 29 cm × 19 cm) with water tank holder |
| Sleep sign software | KISSEI COMTEC | N/A | for EEG/EMG analysis |
| Slip ring | neuroscience,inc | N/A | for EEG/EMG analysis |
| Stainless screw | Yamazaki | N/A | φ1.0 x 2.0 |
| Stainless wire | Cooner wire | AS633 | 0.0130 inch diameter |
| Stereotaxic frame with digital console | Koph | N/A | Model 940 |
| Syringe needle | Hamilton | 7803-05 | |
| Vital recorder software | KISSEI COMTEC | N/A | for EEG/EMG recording |
References
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