Summary
כאן, אנו מתארים שיטות של מניפולציה אלקטרואופטיקה של סוגים מסוימים של נוירונים במהלך ניטור של שינה/ערנות מדינות בעכברים, הצגת העבודה האחרונה שלנו על גרעין המיטה של מסוף הניסטריה כדוגמה.
Abstract
בשנים האחרונות, אלקטרואופטיקה היתה בשימוש נרחב בתחומים רבים של מחקר נוירודעי. במקרים רבים, opsin, כמו ערוץ הרודוסין 2 (ChR2), מבוטא על ידי וקטור וירוס בסוג מסוים של תאים עצביים בעכברים שונים של מנהלי התקנים. ההפעלה של opsins אלה מופעלת על ידי יישום של פולסים אור אשר מועברים על ידי לייזר או LED באמצעות כבלים אופטיים, ואת ההשפעה של ההפעלה היא נצפתה עם רזולוציה גבוהה מאוד. ניסויים מסוגלים לעורר בחריפות את הנוירונים תוך ניטור התנהגות או תוצאה פיזיולוגית אחרת בעכברים. אלקטרואופטיקה יכולה לאפשר אסטרטגיות שימושיות להערכת תפקוד של מעגלים עצביים בוויסות מצבי שינה/ערנות בעכברים. כאן אנו מתארים טכניקה לבדיקת ההשפעה של מניפולציה אלקטרואופטיקה של נוירונים עם זהות כימית ספציפית במהלך אלקטרונצלגרם (EEG) ו אלקטרומגנט (EMG) ניטור כדי להעריך את שלב השינה של עכברים. כדוגמה, אנו מתארים מניפולציה של הנוירונים GABAergic בגרעין המיטה של מסוף הניסטריה (BNST). הריגוש האופגנטי אקוטי של נוירונים אלה מעורר מעבר מהיר לערות כאשר מיושם במהלך שינה NREM. מניפולציה אלקטרואופטיקה יחד עם הקלטת EEG/EMG יכול להיות מיושם כדי לפענח את המעגלים העצביים כי להסדיר שינה/ערות מדינות.
Introduction
שינה חיונית לתפקוד קוגניטיבי אופטימלי. הממצאים האחרונים גם מראים כי הפרעות בשינה משויכים מגוון רחב של מחלות1,2,3. למרות שפונקציות השינה הן עדיין לא פתורות, התקדמות משמעותית נעשתה לאחרונה בהבנת מעגלים עצביים ומנגנונים השולטים שינה/ערנות מדינות4. ביונקים, ישנם שלושה מצבי דריכות: ערות, התנועה לא מהירה העין (NREM) לישון, ואת העין מהירה תנועה (REM) לישון. ערות מאופיין בתנודות מהירות של EEG (5-12 Hz) של משרעת נמוכה עם פעילות מוטורית מהירה ומתמשכת. שינה NREM מוגדר על ידי תנודות איטיות (1-4 Hz) של משרעת גבוהה (גלי דלתא), עם חוסר הכרה ופעילות מוטורית תכליתי. שינה REM מתאפיינת בתנודות מהירות יחסית (6-12 Hz) של משרעת נמוכה וכמעט מוחלטת של שריר דו צדדי atonia5.
Borbely הציע תאוריה של התקנה שינה-ערות המכונה 2 תהליך הדגם6,7. תהליך הומסטטי, המכונה גם תהליך S, מייצג לחץ שינה המצטבר במהלך הערות ומתמוסס במהלך השינה. תהליך נוסף, המכונה תהליך C, הוא תהליך מעגלי, מה שמסביר מדוע רמות הדריכות משתנים במחזוריות של 24 שעות. בנוסף לשני תהליכים אלה, גורמים allostatic חשובים גם לוויסות שינה/ערות8,9. גורמים אלוסטטיים כוללים מצבים תזונתיים ורגשות. פחד וחרדה מלווים בדרך כלל על ידי עלייה בהתעוררות יחד עם תגובות אוטונומיות ונוירואנדוקרינים10,11,12. המערכת הלימבית הוא האמין לשחק תפקיד בוויסות של פחד וחרדה, ומנגנונים בבסיס התגובות האוטונומית האנדוקריניים נחקרו בהרחבה, אבל את השביל שבו המערכת הלימבית משפיע שינה/ערנות מדינות לא עדיין נחשף. מספר רב של מחקרים שנעשו לאחרונה באמצעות opto-ו פרמקוגנטיקה הציעו כי נוירונים ומעגלים עצביים להסדיר שינה/ערות מדינות מופצים ברחבי המוח, כולל את מערבולות, בסיס המוח הקדמי, תלמוס, ההיפותלמוס, וגזע המוח. בפרט, פיתוחים אחרונים באלקטרואופטיקה אפשרו לנו לעורר או לעכב מעגלים עצביים ספציפיים in vivo עם רזולוציות מרחבית וזמני גבוהה. טכניקה זו תאפשר התקדמות ההבנה שלנו של מצעים עצביים של שינה וערות, וכיצד שינה/הערות מדינות מוסדר על ידי תהליכים מעגליות, לחץ שינה, וגורמים allostatic, כולל רגש. נייר זה נועד להציג כיצד להשתמש מניפולציה אלקטרואופטיקה בשילוב עם הקלטת שינה/התעוררות, אשר יכול להיות הפוטנציאל לעדכן את ההבנה שלנו של התחברות ומנגנונים במוח כי לשחק תפקיד בוויסות NREM לישון, ראם לישון, וערות. הבנה של מנגנון זה שבו המערכת הלימבית מסדיר מדינות שינה/ערנות היא בעלת חשיבות עליונה לבריאות, כי נדודי שינה קשורה בדרך כלל עם חרדה או פחד להיות מסוגל לישון (somniphobia).
הוא נחשב לתפקיד חיוני בחרדה ובפחד. גד 67-הבעת הנוירונים הם אוכלוסייה מרכזית של הבנסט12,13. בדקנו את ההשפעה של מניפולציה אלקטרואופטיקה של הנוירונים האלה (נגבה בידיndt) על מדינות שינה/ערות. אחת ההתקדמות הגדולה ביותר במדעי המוח בשנים האחרונות הייתה שיטות המאפשרות מניפולציה של נוירונים עם זהויות כימיות מסוימות בvivo, עם רזולוציות מרחבית וזמני גבוהות. אלקטרואופטיקה היא שימושית מאוד להפגין קשרים סיבתי בין פעילות עצבית ותגובות התנהגותיות מסוימות14. אנו מתארים אלקטרואופטיקה כשיטה לבחון את הקישוריות הפונקציונלית של מעגלים עצביים מוגדרים בוויסות מצבי שינה/ערנות. באמצעות שימוש בטכניקה זו, הושגה התקדמות רבה בהבנת המעגלים העצביים המוסתים שינה/ערות מדינות15,16,17,18,19 . במקרים רבים, opsins מוצגים במיוחד נוירונים עם זהויות כימיות מסוימות באזורי המוח סלקטיבי על ידי שילוב של עכברים מנהל ההתקן והמין-inducible AAV-תיווך העברה גנטית. יתרה מזאת, ביטוי ממוקד של האופינים הרגישים לתמונה כגון המתקשרים 2 (ChR2)20 או הארכדופסין (archt)21 בשילוב עם מערכת מסוג-loxp או Flp-frt מאפשר לנו לתמרן אוכלוסיה עצבית סלקטיבית וספציפית . מסלול עצבי22
אנו מתארים כאן ניסויים על הנוירונים... כדי לבטא את האופינים באוכלוסיה עצבית ייעודית, עכברים מתאימים למנהלי התקנים של מנהלי ההתקנים ודרכי הווירוסים תלויי-היצור שבשימוש תכוף ביותר. שורות העברה או הקפאה, שבהן מתבטאת האופשות באוכלוסיות נוירואליות מסוימות, הן גם שימושיות. בניסויים הבאים, השתמשנו GAD67-יצורים טוק-in עכברים23 שבו רק gabaergic הנוירונים אקספרס היצורים RECOMBINASE עם רקע גנטי C57BL/6j, ו וקטור aav אשר מכיל ChR2 (hChR2 H134R) התמזגו עם eyfp או eyfp כפקד בבורר "FLEx (היפוך כריתה)"24. הנוהל מתאר במפורש את העירור האפגנטי של הנוירונים האחרים ב-BNST במהלך הניטור של מדינות שינה/ערות25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים כאן אושרו על ידי ועדת ניסוי בעלי חיים של אוניברסיטת טסוקובה, הציות להנחיות של NIH.
1. כירורגיה של בעלי חיים, הזרקת וירוס, אלקטרודה עבור EEG/EMG, ו סיבים אופטיים השרשה
זהירות: הגנה מתאימה וטכניקות טיפול יש לבחור מבוסס על רמת בטיחות של הווירוס לשימוש. AAV צריך לשמש בחדר P1A מבודדים מדורגים להזרקה, ואת הצינור נושאת AAV חייב להיות מעוקר עם החיטוי לאחר כל אמצעי האחסון משמש למעלה. האתר כירורגי וכל חומר מושתל צריך להיות נקי וסטרילי במהלך השימוש.
הערה: ראה איור 1.
- לחטא את הציוד הכירורגי עם החיטוי.
- . בעזרת מכשיר הרדמה לצפות עד העכבר הגיע לעומק הרצוי של הרדמה, נקבע על ידי אובדן של תגובה צובט את הזנב עם מלקחיים. החלת משחה אופטלמולוגית על העיניים כדי למנוע מהם להתייבש.
- לחטא את השדה כירורגי עם יוד פתרון או 70% אטוח (3x) ו יבש מספיק. לאפשר וירוס להפשיר על הקרח כמו הניתוח מבוצע. כסו את האזור הכירורגי עם נייר מעבדה סופג.
- תקן את ראש העכבר במנגנון הסטרטקטיקה עם פסי האוזן וצביטה באף. לאחר אישור הראש מוחזק באופן בלתי נשכח, לבצע חתך midsagittal בקרקפת כדי להבטיח את המיקומים של ברז ו למדא ממוקמים באותה רמה על קו אופקי.
- כדי למנוע הפער מיקום, כראוי להתאים את רמות הצביטה האף והאוזניים למעלה ולמטה. הברגמה ולמדא מתייחסים לצומת שבין הסוטורה סאגגיוציס וסוטורה קורוליס או סוטורה, בהתאמה (איור 2).
- השתמש בתפסים Serafin כדי להחזיק את העור כדי לשמור על הגישה הגולגולת. לאחר חשיפת הגולגולת, לחטא את פני השטח של הגולגולת עם יוד או 5% H2O2, כדי לאפשר את התפרים הגולגולת כולל ברז ו למדא להיות דמיינו יותר בבהירות.
- הכנת הזרקת וקטור AAV:
- שטוף את החלק הפנימי של מזרק 10 מ ל (ראה טבלת חומרים) ברצף עם 70% אטוח, 100% אטואה ו מים מעוקרים, 5 פעמים כל אחד. אבטח את המזרק בתפס של זרוע משאבת מיקרוהזרקה וודא שכל הפתרונות במזרק משוחררים.
- מוחדרים בזהירות 2 μL של שמן מינרלי ללא בועות אוויר, ולאחר מכן מוחלק את הנפח המיועד של פתרון וירוס. לאחר השאיפה, לתמרן את כפתור הבוכנה ולוודא כי פתרון וירוס מתגלה בקצה של המחט.
הערה: נפח ההזרקה של פתרון הווירוס נקבע בניסויים פיילוט באמצעות אותו להתאמץ העכבר ואותו מוצר וירוס. יש להעריך מראש את הקשר בין נפח פתרון הווירוסים לבין היקף אזור הזיהום.
- הכנס וקטור AAV:
- התאימו את קצה המחט המיקרוזרקת על הברגמה ושימו לב לקואורדינטות כנקודה המקורית. העבר את העצה לאתר ההזרקה המיועד (עבור ה-BNST: anteroposterior + 0.2 מ"מ, מדיה הצלעות ± 1.0 mm, dorsoventral-4.2 מ"מ) ומניחים את קצה המחט על המיקום. לשים סימן על הגולגולת ולקדוח חורים של כ 2 מ"מ בקוטר באמצעות מקדחה שיניים עם חותך 0.7 מילימטר קרביד. יש להיזהר שלא לפגוע ברקמת המוח או ברקמה המוחית.
- לאחר הסרת דם מסביב החורים בספוגית כותנה, הזיזו לאט את המחט לתנוחת ה-BNST. לאט להזריק את הכמות המיועדת של פתרון וירוס (0.07 μl/min) עם מיקרו מזרק מכני. לאחר השלמת הזריקה, להשאיר את המחט 5 דקות כדי לאפשר את הפתרון כדי לחדור מספיק את רקמת BNST. . תוציא בזהירות את המחט
- לקבלת הזרקה דו-צדדית, חזור על שלבים 1.8.1-1.8.2 בצד השני. במהלך ההליך, לשמור על הגולגולת לח עם יישומים של תמיסת מלח סטרילי.
הערה: השתמשנו שתלים מותאמים אישית EEG/EMG (W: 5 מ"מ, D: 7 מ"מ, H: 1 מ"מ) עם ארבעה אלקטרודות EEG (4 מ"מ), שני אלקטרודות EMG (2 מ"מ; לחתוך את האלקטרודה 4 מ"מ 2 מ"מ עם מצבתים) ו 6 אלקטרודות (4.5 מ"מ) (איור 2A).
- הלחמה שני חוטי נירוסטה (ראה טבלת חומרים) שממנה 1 מ"מ של הבידוד מופשט משני הקצוות לאלקטרודות emg. להתאים את מרכז האלקטרודות אל ברז ולסמן את המיקום של כל אלקטרודה EEG (anteroposterior ± 1.5 mm, mediolateral ± 1.0 מ"מ), ולקבוע את המיקום של השתל (איור 2B).
- סיבים אופטיים השתל:
- לצרף סיבים אופטיים שלטון מניפולטור ולסובב את הזרוע מניפולטור כך שיש לו זווית של ± 30 ° נגד קו אופקי (תהליך זה צריך רק כדי למנוע הפרעות בין אלקטרודות סיבים אופטיים, כגון במקרה של גירוי BNST). שים את קצה החוט על הברז. ותעד את נקודות הציון
- הזז את הקצה לשורת ההכנסה הייעודית וסמן את המיקום על הגולגולת. שים גם סימנים נוספים ליד אתר הכניסה עבור בורגי העוגן. לקדוח את הגולגולת על כל אתר עם מקדחה שיניים כדי להכניס את סיבים אופטיים ולתקן את הבורג. . תתקן את הבורג על הגולגולת היזהרו לא לשבור את הדורה או נזק רקמות על ידי בורג.
- הכנס את סיבי הראיה בעדינות עד שהגיע מעל ל-BNST עם מניפולטור. הפרשול צריך לנוח על הגולגולת שנותרה (איור 1B).
- החלת מלט שיניים פוטולריפוי (ראה טבלת חומרים) כדי לכסות את הסיבים ואת הבורג. זמן התגובה כדי לחזק את הדבק צריך להיות מצוין על ידי המדריך של היצרן (החומר שלנו זקוקה לחשיפה לאור עבור לפחות 10 s עם התמונה באורך גל ספציפי-גנרטור. אין צורך לייבש את הדבק אחרי זה.
- בשלב זה, ודא שאין חומרים (בורג או דבק) תופסים את השטח הגובר עבור האלקטרודות. בנוסף, להימנע מלעשות כל הפרעה בבטון עבור חזיות חיבור סיבים אופטיים וכבלים. חזור על הצעדים 1.10.1-1.10.4 בצד הנגדי של גירוי דו-כיווני.
- מקדחים לאלקטרודות של EEG/EMG. הכנס את קצות האלקטרודות לתוך החורים. החזיקו את השתל והחילו דבק ציאנואקרילי לחלל שבין הגולגולת לאלקטרודות. הוסף שוב עם תשומת לב לא להתערב בחומרים כלשהם.
- לכסות את ההיקף של אלקטרודות וסיבים אופטיים עם דבק ציאנואקרילי ואחריו יישום של מאיץ ציאנואקריאקרילי על דבק. שלב זה נמנע מגרימת הפרעה בכבל הפרכלל-לאופטי ובאזור חיבור התיל-אל-מוביל (איור 1C).
הערה: דבק ציאנואקרילי והמאיץ שלו. מזיקים לעין העכבר שים לב לא לגרום לניקוז של חומרים כימיים אלה. כמו כן, להיזהר לא לגעת מאוד אלקטרודות וסיבים כדי למנוע סטייה בלתי צפויה מיד לאחר מיצוק דבק. - לחשוף את שרירי הצוואר העכבר ולהכניס את החוטים של האלקטרודה EMG מתחת לשריר. התאימו את אורך האלקטרודה EMG כך שהיא מאתרת רק מתחת לשרירי הזמן. חיבור אור בין קצה של אלקטרודה fascia שרירים הוא מספיק כדי לתפוס את האות EMG.
- החלת דבק ציאנואקרילי כדי למלא את השתלים ולחזק את הדבק עם נוזל האצה. לאחר מכן, הניחו את העכבר על משטח חום להתאוששות עד שיופיע רפלקס הפוסט-אורל. כוונן את טמפרטורת משטח החום לטמפרטורת הגוף למנוחה בעלי חיים (36.0 ° צ' ב-ZT 0-12 במקרה של עכברים C57BL6; לא יעלה על 38.0 ° c).
הערה: אנטיביוטיקה אינה נדרשת לניתוח סטרילי. - בצע את ההנחיות המוסדיות המקומיות שלך לחוסר כאבים שלאחר הניתוח. לשמור את העכברים בכלוב הבית לתקופת התאוששות של לפחות 7 ימים.
2. מעקב EEG/EMG עם העירור התמונה של נוירונים ממוקדים במצבי שינה ספציפיים
זהירות: פרוטוקול זה כולל שימוש בציוד לייזר מסוג class 3B או בהתקני LED. יש לשים לב למידע על בטיחות. משקפי העין המגן נדרשים.
- לפני חיבור כבל הלייזר לסיבים אופטיים, להתאים את עוצמת הלייזר עם scaler. לקשור את קצה כבל הלייזר לסיבים אופטיים שאינם בשימוש עם כלל ולוודא כי אין מקום בצומת בין סיבים לכבל.
- הפעל את המתג הראשי של הלייזר והמתן 20 דקות לחימום.
- לפלוט את הלייזר לבודק האינטנסיביות ולהתאים את עוצמת הלייזר ל 10 mW/mm2. לשנות את מצב הלייזר כדי ההיגיון טרנזיסטור ולאשר כי פולסים אור נפלטים סיבים מבוקרת על ידי הרגולטור דפוס אשר מוגדר ב 10 ms למשך, 40 ms עבור מנוחה, 20 פעמים עבור מחזור, ו 20 פעמים חוזר (כלומר, 20 הרץ של 10 הפולסים האור עבור 20 s).
- לאחר תקופת ההחלמה, להעביר את העכברים לחדר ניסיוני עבור הקלטת EEG/EMG. עכברים בבית באופן קבוע 23 ° צ' עם מחזור 12 שעות אור/כהה עם מזון ומים זמין ad libitum.
- לחבר את האלקטרודה מושתל מתאם כבל אשר קשור לטבעת התגית כדי למנוע שזירה. מומלץ לכסות את הצומת עם חומרים בלתי מסוגלים לאור כגון רדיד אלומיניום כדי למנוע דליפת לייזר. אם נדרש ניסוי דו-כיווני, השתמש בטבעת הצמדה עם קובץ מצורף של bifurcate עבור הכבלים.
- בפרוטוקול זה, אנו להעריך את ההשהיה לערות מ-NREM שינה או שינה REM, כך זמן ההקלטה צריך להיות מוגבל בזמן האופטימיזציה ממוטבת (ZT0 מוגדר כשעה כאשר האור הוא על). פרוטוקול זה נערך בין ZT4-ZT10. תנו לעכברים להישאר בחופשיות בחדר הניסיוני לפחות 1 h כהאקטיזציה.
- במהלך התקופה הניסיונית, לפקח EEG ו-EMG אותות באותו צג ולהעריך את מצב העכבר כמו ערות, NREM לישון או לישון ראם. השתמש בבקרת הרווח עבור כל גל כדי להקל על ההבחנה בין כל מדינה.
- למדידת שינה NREM כדי השהיה ערות, להתבונן יציב NREM שינה עבור 40 s או יציב REM לישון עבור 30 s, ואז להפעיל את הבורר של מחולל דפוס עבור פוטוגריית (פרוטוקול זה יוצר 20 הרץ של 10 אלפיות התשעים של האור עבור 20 s). תאשר פליטת לייזר. לסיבים האופטיים המושתל
- הקלטה של אותות EEG/EMG עד שמצב השינה משתנה לערות. אם יש צורך בשני מבחנים ניסיוניים או יותר, יש להגביל את המניפולציה האופגנטית פעם ביום משום שהגירוי בתמונה הוא התערבות מלאכותית שעלולה להשפיע על אדריכלות השינה/הערות.
- לאחר הניסוי, מורדם מאוד ומעשה עם תמיסת מלח סטרילי ופאראפורמלדהיד (בכיוון ההוא) לדגימת המוח כולו עבור ניתוח אימונוהיסטוכימיה26.
3. ניתוח זמן ההשהיה מ NREM שינה לערות
- לאחר הקלטת אותות EEG/EMG, להעביר את נתוני האות למחשב עבור הבקיע שינה/מצבי ערות. פרוטוקול זה מתאר את השיטה לניתוח EEG עם תוכנת הקלטה (ראה טבלת חומרים).
- הפעל את יישום סימן השינה ולחץ על כרטיסיית הקובץ ובחר באפשרות פתיחה כדי לבחור את הנתונים המוקלטת (קובץ. kcd). לחץ על הכרטיסיה שינה כדי לבחור זמן תקופה להתאמת חלון הזמן עבור כל תקופה (אנו משתמשים ב-1 תקופה/4 שניות).
- באופן ידני הציון שינה/ערות מדינות המבוססות על אותות EEG/EMG, על פי הקריטריונים הבאים: עירות, EMG גבוהה ומתח EEG נמוך עם תדר גבוה; NREM, בטון נמוך EMG ובמתח EEG גבוה עם δ גבוהה (0.5-4 Hz) תדר; ו REM, EMG מציין שריר atonia ומתח EEG נמוך עם high θ (6-9 Hz) תדר. מדינה שאינה נמשכת ברציפות עבור 16 s (כלומר 4 מנות) אינה מוגדרת כשינוי מדינה משום שהיא אינה מצב יציב.
- לחץ והחזק את לחצן העכבר השמאלי בתקופה הראשונה וגרור את הסמן עד המגמה הספציפית של יותר מ -16 (4 מנות) הוא הסתיים. לאחר מכן, שחרר את לחצן העכבר השמאלי ובחר את המצב המתאים (ערות או שינה NREM או שינה REM) בחלון המוקפץ. חזור על הליך זה כדי להבקיע כל אותות EEG/EMG שנרשמו בקובץ.
- מצא את הזמן המדויק של גירוי בתקופה שבה EEG מראה NREM או ראם שינה, ואת התקופה מראה מעבר המדינה בעקבות נקודת גירוי. ספור את מספר הנקודות בין התקופות שלאחר הגירוי ובדיוק לפני מעבר המדינה.
- לאחר מכן הכפל את מספר האפוקסי הנספר ב -4 s (א). בעידן הגירוי, קחו צילום מסך ומדדו את הרוחב בין נקודת הגירוי לסוף התקופה. לאחר מכן, חלק את האורך הנמדד על-ידי אורך התקופה כולה והכפל ב -4 s (ב). באופן דומה, לחשב את משך שינה NREM בתקופה של שינוי המדינה, מה שאומר את הזמן בין תחילת התקופה ואת נקודת שינוי המדינה (ג).
- Sum A, B ו-C כדי לקבל את ההשהיה מ-NREM לישון לערות. אותו הליך משמש לניתוח של מעבר המדינה מ REM שינה לערות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
המחקר הנוכחי הראה את ההשפעה של השפעת האופגנטיות של הנוירונים בתוך המדינה במצב שינה. ChR2-EYFP הביע באופן מידי ביטוי בנוירונים. An באתרו היברידיכימית מחקר היסטכימיות הראה כי ChR2-EYFP היה מקומי בנוירונים המבטא גד 67 mRNA אותות, המציין כי אלה הם נוירונים GABAergic. הסיבים האימונוהיסטוכימיים אישרו את מיקומו של הסיב האופטי, שקצהו היה בדיוק מעל ל-25.
איור 3A מראה נציג EEG/emg עקבות לפני ואחרי פוטוגירוי במהלך שינה nrem. במתח גבוה ובתדירות גבוהה EEG ללא אותות EMG מייצגים שינה NREM. גירוי (10 אלפיות השנייה ב -20 הרץ עבור 20 שניות) הוחל בעקבות שינה יציבה של NREM. גירוי מעורר מעבר אקוטי לערות (מתח נמוך EEG בתדר גבוה עם אותות EMG פעיל) על 2 s לאחר גירוי ב ChR2-הביע עכברים. עכברים בקרה (EYFP) לא הראו מעבר לאחר גירוי (השהיה של התעוררות NREM: EYFP, 295.39 ± 106.61 שניות, n = 6; ChR2:2.71 ± 0.59 שניות, n = 6; t10 = 2.35, p < 0.05; איור 3B, העליון). נתונים אלה מראים כי עירור של הנוירונים בע במהלך שינה nrem מעורר אינדוקציה מהירה של הערות. מצד שני, גירוי פוטואלקטרי במהלך השינה REM לא היתה השפעה (EYFP: 36.45 ± 13.08 שניות, n = 6; ChR2:37.29 ± 15.19 שניות, n = 6; t10 = 0.04, p = 0.484; איור 3B, למטה) כך אפקט מעבר התפתחה רק ב-nrem שינה.
איור 1 : נוהל להזריק AAV, סיבים אופטיים השתל ו-EEG/EMG שתלים. (א) הליך ניסיוני של הזרקת וירוס. EYFP-התמזגו ChR2 או EYFP (עבור שליטה) גנים משולבים וקטור AAV אשר שעתוק מופעל על ידי recombinase היתה בקיעים הוזרק ל-BNST. (ב) סיבים אופטיים הוכנסו לכיוון bnst בזווית 30 ° כדי האופקי כדי למנוע התנגשות עם האלקטרודה. הוכנס סביבו שני ברגים. (ג) EEG/emg התקן הקלטה הושתל לאחר מיקום מאובטח של סיבים אופטיים. (ד) בסוף המבצע יש לכסות את השטח הכירורגי כולו בדבק ציאנואקרילי ומתוקן בחוזקה. הקפד לא להחיל כל סוכן על האזור המחבר את האלקטרודה ואת ferrules. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2 : EEG/EMG מותאם אישית אלקטרודה ו סיכות ההכנסה אתרים. (א) למעלה: מתוך 6 פינים אלקטרודה, שני הפינים החיצוניים מנותקים ל-2 מ"מ. למטה: אלקטרודות EEG/emg. (ב) אלקטרודות אלה וחוטי הולכה emg הם לאחר מכן מולחמים. אזור החיבור צריך להיות מבודד עם כל בידוד כמו דבק ציאנואקרילי. אתרי הכניסה של אלקטרודות הם יחסיים לברגמה (anteroposterior ± 1.5 מ"מ, מדיאולםצלעות ± 1.0 מ"מ). חוטי EMG מוכנסים תחת שריר הצוואר עם הסרת בידוד הגנה על התיל באתר הכניסה (1 מ"מ). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3 : השפעת הנגבה גירוי על מעבר המדינה ב NREM לישון ו rem שינה. (א) מייצג eeg ו-emg גל וקשת כוח EEG. גירוי (10 אלפיות השנייה ב -20 הרץ עבור 20 שניות) הוחל על ChR2-ביטוי בנוירונים בעלי הבית בעקבות 40 NREM שינה. ערות המושרה במהירות לאחר 2 ס. EEG הראה מתח נמוך ותדר גבוה עם EMG התפרץ. ספקטרוגרמה של כוח EEG גם הראה מעבר מתדר נמוך עד גבוה. (ב) העירור הגנטי של נגבה בנוירונים באופן מהיר הראה המעבר המהיר nrem לישון לערות (העליון), אבל אפקט זה לא נראה במקרה של החלת מניפולציה זהה ב REM שינה (למטה). *p < 0.05, מבחן ה- tשל וולש. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אנו כאן הציגו שיטה כדי להעריך את ההשפעה של גירוי אלקטרואופטיקה של נוירונים עם זהויות כימיות מסוימות על מעברים מדינה של שינה/ערות והעניק דוגמה של מניפולציה של הנוירונים בע. הנתונים שלנו הראו כי השפעת השפעת הנוירונים באופן מיידי על ידי הנירע באמצעות מעבר מיידית מ-nrem לישון לערות.
עיצובים ניסיוניים שונים זמינים בגלל התפתחות של סוגים רבים של כלים אלקטרואופטיקה. ניתן להפעיל או לעכב את הפעילות העצבית של נוירונים מסוימים באמצעות סוגים שונים של האופינים, כגון ChR2, SSFO, halorhodopsin, ArchT, ו-Iקלואה c27. ChR2 יכול להפעיל נוירונים כמה אלפיות שניה לאחר גירוי התמונה וזה יכול לשמש כדי לעורר פוטנציאל הפעולה באופן שלב נעילה על ידי גנרטור הדופק כדי לבחון את ההשפעה החריפה בשלבי שינה ספציפיים. הפעלת אופסין באופן בלתי נשכח כגון פונקציית צעד יציבה אופסין (ssfo), אשר משרה depolarization של נוירונים עבור 15 עד 30 דקות לאחר גירוי, יכול להיות גם שימושי עבור סוגים מסוימים של ניסויים שנועדו להתבונן השפעה חצי כרונית28. תאים מקוטב עם SSFO עשוי להיות רגיש יותר לקלט נוירואליות שונים ולהיות מנוטרל על ידי החלת אור באורך הגל הארוך. יתר על כן, אנו יכולים להפעיל אקסונים על ידי השרשה של סיבים אופטיים באתר של הקרנה אקסונים. גירוי סיבים יכול לספק מידע על הפונקציה של מסלול הקרנה מסוים סיבי.
EEG/EMG הקלטה במהלך מניפולציה אלקטרואופטיקה היא שיטה פחות פולשנית כדי לקבוע את ההשלכות הישירות של עירור סלקטיבי/עיכוב של מעגלים עצביים על שינה/ערות מדינות בעכברים. בשיטה זו הוצגו אוכלוסיות עצביות ומעגלים עצביים רבים המעורבים בוויסות מצבי השינה/הערות. לקראת פיתוח נוסף של טכניקה זו, ניתן להשתיל סיבים מרובים כדי לתמרן מסלולים מרובים בו, או זה יכול להיות גם בשימוש בשילוב עם פואפטורי סיבים או מיניקוחים כדי לפקח על פעילויות נוירואליות.
לסיכום, הוא צפוי כי אלקטרואופטיקה יהיה להאיץ את ההתקדמות בפתיחת המסתורין של רגולציה שינה על ידי המוח ופיתוח של טיפולים חדשניים עבור נדודי שינה עקשן והפרעות שינה אחרות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
פרויקט זה היה נתמך באופן חלקי כספית על ידי מרק & Co.
Acknowledgments
מחקר זה היה נתמך על ידי התוכנית לימודים לחוקר מרק (54843), KAKENHI גרנט-עזרה עבור מחקר מדעי על אזורים חדשניים, "WillDynamics" (16H06401) (ט), ו KAKENHI גרנט ב-עזרה למחקר מחקרי בתחומים חדשניים (ט) (18H02595).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x1 Fiber-optic Rotary Joints | Doric | FRJ 1x1 FC-FC | for optogenetics |
| 6-pin header | KEL corporation | DSP02-006-431G | |
| 6-pin socket | Hirose | 21602X3GSE | |
| A/D converter | Nippon koden | N/A | Analog to digital converter |
| AAV10-EF1a-DIO-ChR2-EYFP | 3.70×1013(genomic copies/ml) | ||
| AAV10-EF1a-DIO-EYFP | 5.82×1013(genomic copies/ml) | ||
| Ampicillin | Fuji film | 014-23302 | |
| Amplifier | Nippon koden | N/A | for EEG/EMG recording |
| Anesthetic vaporizer | Muromachi | MK-AT-210D | |
| Automatic injecter | KD scientific | 780311 | |
| Carbide cutter | Minitor | B1055 | φ0.7 mm. Reffered as dental drill, used with high speed rotary micromotor |
| Cyanoacrylate adhesion (Aron alpha A) and acceleration | Konishi | #30533 | |
| Dental curing light | 3M | Elipar S10 | |
| Epoxy adhesive | Konishi | #04888 | insulation around the solder of 6-pin and shielded cable |
| Fiber optic patch cord (branching) | Doric | BFP(#)_50/125/900-0.22 | |
| Gad67-Cre mice | provided by Dr. Kenji Sakimura | Cre recombinase gene is knocked-in in the Gad67 allele | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 65461-01 | |
| High speed rotary micromotor kit | FOREDOM | K.1070 | Used with carbide cutter |
| Interconnecting sleeve | Thorlab | ADAF1 | φ2.5 mm Ceramic |
| Isoflurane | Pfizer | 871119 | |
| Laser | Rapp OptoElectronic | N/A | 473 nm wave length |
| Laser intesity checker | COHERENT | 1098293 | |
| Laser stimulator | Bio research center | STO2 | reffered as pulse generator in text |
| Optic fiber with ferrule | Thorlab | FP200URT-CANNULA-SP-JP | |
| pAAV2-rh10 | provided by PennVector Core | ||
| pAAV-EF1a-DIO-EYFP-WPRE-HGHpA | Addgene | plasimid # 20296 | |
| pAAV-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-HGHpA | provided by Dr. Karl Deisseroth | ||
| Patch cord | Doric | D202-9089-0.4 | 0.4m length, laser conductor between laser and rotary joint |
| pHelper | Stratagene | ||
| Photocurable dental cement | 3M | 56846 | |
| Serafin clamp | Stoelting | 52120-43P | |
| Shielded cable | mogami | W2780 | Soldering to 6-pin socket for EEG/EMG recording |
| Sleep recording chamber | N/A | N/A | Custum-made (21 cm× 29 cm × 19 cm) with water tank holder |
| Sleep sign software | KISSEI COMTEC | N/A | for EEG/EMG analysis |
| Slip ring | neuroscience,inc | N/A | for EEG/EMG analysis |
| Stainless screw | Yamazaki | N/A | φ1.0 x 2.0 |
| Stainless wire | Cooner wire | AS633 | 0.0130 inch diameter |
| Stereotaxic frame with digital console | Koph | N/A | Model 940 |
| Syringe needle | Hamilton | 7803-05 | |
| Vital recorder software | KISSEI COMTEC | N/A | for EEG/EMG recording |
References
- Spoormaker, V. I., Montgomery, P. Disturbed sleep in post-traumatic stress disorder: Secondary symptom or core feature? Sleep Medicine Reviews. 12 (3), 169-184 (2008).
- Dworak, M., Wiater, A., Alfer, D., Stephan, E., Hollmann, W., Struder, H. K. Increased slow wave sleep and reduced stage 2 sleep in children depending on exercise intensity. Sleep Medicine. 9 (3), 266-272 (2008).
- Mellman, T. A. Sleep and anxiety disorders. Psychiatric Clinics of North America. 29 (4), 1047-1058 (2006).
- Scammell, T. E., Arrigoni, E., Lipton, J. O. Neural circuitry of wakefulness and sleep. Neuron. 93 (4), 747-765 (2017).
- Chemelli, R. M., et al. Narcolepsy in orexin knockout mice: Molecular genetics of sleep regulation. Cell. 98 (4), 437-451 (1999).
- Borbély, A. A., Daan, S., Wirz-Justice, A., Deboer, T. The two-process model of sleep regulation: A reappraisal. Journal of Sleep Research. 25 (2), 131-143 (2016).
- Daan, S., Beersma, D. G., Borbely, A. A. Timing of human sleep: recovery process gated by a circadian pacemaker. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 246 (2), R161-R183 (1984).
- Saper, C. B., Cano, G., Scammell, T. E. Homeostatic, circadian, and emotional regulation of sleep. Journal of Comparative Neurology. 493 (1), 92-98 (2005).
- Saper, C. B., Fuller, P. M., Pedersen, N. P., Lu, J., Scammell, T. E. Sleep state switching. Neuron. 68 (6), 1023-1042 (2010).
- LeDoux, J. E. Emotion circuits in the brain. Annual Review of Neuroscience. 23, 155-184 (2000).
- Tovote, P., Fadok, J. P., Lüthi, A. Neuronal circuits for fear and anxiety. Nature Reviews Neuroscience. 16 (6), 317-331 (2015).
- Lebow, M. A., Chen, A. Overshadowed by the amygdala: the bed nucleus of the stria terminalis emerges as key to psychiatric disorders. Molecular Psychiatry. 21 (4), 450-463 (2016).
- Wu, S., et al. Tangential migration and proliferation of intermediate progenitors of GABAergic neurons in the mouse telencephalon. Development. 138 (12), 2499-2509 (2011).
- Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nature Reviews Neuroscience. 13 (4), 251-266 (2012).
- de Lecea, L., Carter, M. E., Adamantidis, A. Shining light on wakefulness and arousal. Biological Psychiatry. 71 (12), 1046-1052 (2012).
- Carter, M. E., Brill, J., Bonnavion, P., Huguenard, J. R., Huerta, R., de Lecea, L. Mechanism for hypocretin-mediated sleep-to-wake transitions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (39), E2635-E2644 (2012).
- Weber, F., Dan, Y. Circuit-based interrogation of sleep control. Nature Publishing Group. 538, 51-59 (2016).
- Weber, F., Chung, S., Beier, K. T., Xu, M., Luo, L., Dan, Y. Control of REM sleep by ventral medulla GABAergic neurons. Nature. 526, 435-438 (2015).
- Oishi, Y., et al. Slow-wave sleep is controlled by a subset of nucleus accumbens core neurons in mice. Nature Communications. 8 (1), 1-12 (2017).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Han, X., et al. A high-light sensitivity optical neural silencer: development and application to optogenetic control of non-human primate cortex. Frontiers in Systems Neuroscience. 5, 1-8 (2011).
- Kim, C. K., Adhikari, A., Deisseroth, K. Integration of optogenetics with complementary methodologies in systems neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 18 (4), 222-235 (2017).
- Saito, Y. C., et al. GABAergic neurons in the preoptic area send direct inhibitory projections to orexin neurons. Frontiers in Neural Circuits. 7 (December), 1-3 (2013).
- Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. A FLEX switch targets Channelrhodopsin-2 to multiple cell types for imaging and long-range circuit mapping. Journal of Neuroscience. 28 (28), 7025-7030 (2008).
- Kodani, S., Soya, S., Sakurai, T. Excitation of GABAergic neurons in the bed nucleus of the stria terminalis triggers immediate transition from non-rapid eye movement sleep to wakefulness in mice. Journal of Neuroscience. 37, 7174-7176 (2017).
- Lin, F., Pichard, J. Handbook of practical immunohistochemistry: frequently asked questions. , Springer. (2011).
- Wiegert, J. S., Mahn, M., Prigge, M., Printz, Y., Yizhar, O. Silencing neurons: tools, applications, and experimental constraints. Neuron. 95 (3), 504-529 (2017).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Prigge, M., Schneider, F., Davidson, T. J., O’Shea, D. J., Sohal, V. S., Goshen, I., Finkelstein, J., Paz, J. T., Stehfest, K., Fudim, R., Ramakrishnan, C., Huguenard, J. R., Hegemann, P., Deisseroth, K. Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction. Nature. 40 (6), 1301-1315 (2012).
