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Neuroscience

चूहे में नींद/

Published: June 19, 2019 doi: 10.3791/58613
Automatic Translation
*1, *2, 2,3
1Department of Molecular Neuroscience and Integrative Physiology, Faculty of Medicine, Kanazawa University, 2International Institute for Integrative Sleep Medicine (WPI-IIIS), University of Tsukuba, 3Faculty of Medicine, University of Tsukuba
* These authors contributed equally

Summary

यहाँ, हम चूहों में नींद / जागना राज्यों की निगरानी के दौरान न्यूरॉन्स के विशेष प्रकार के optogenetic हेरफेर के तरीकों का वर्णन, एक उदाहरण के रूप में stria टर्मिनलिस के बिस्तर नाभिक पर हमारे हाल ही में काम पेश.

Abstract

हाल के वर्षों में, optogenetics व्यापक रूप से neuroवैज्ञानिक अनुसंधान के कई क्षेत्रों में इस्तेमाल किया गया है. कई मामलों में, एक opsin, जैसे चैनल रोडोप्सिन 2 (ChR2), विभिन्न Cre-driver चूहों में न्यूरॉन कोशिकाओं के एक विशेष प्रकार में एक वायरस वेक्टर द्वारा व्यक्त की है. इन opsins के सक्रियण प्रकाश दालों जो लेजर या ऑप्टिक केबल के माध्यम से एलईडी द्वारा वितरित कर रहे हैं के आवेदन से शुरू होता है, और सक्रियण के प्रभाव बहुत उच्च समय संकल्प के साथ मनाया जाता है. प्रयोगकर्ताओं को तीव्रता से न्यूरॉन्स को प्रोत्साहित करते हुए व्यवहार या चूहों में किसी अन्य शारीरिक परिणाम की निगरानी कर रहे हैं. Optogenetics चूहों में नींद के विनियमन में न्यूरॉन सर्किट के समारोह का मूल्यांकन करने के लिए उपयोगी रणनीतियों को सक्षम कर सकते हैं / यहाँ हम चूहों की नींद की अवस्था का मूल्यांकन करने के लिए इलेक्ट्रोएन्सेफेलोग्राम (ईईजी) और इलेक्ट्रोमाइओग्राम (ईएमजी) निगरानी के दौरान एक विशिष्ट रासायनिक पहचान के साथ न्यूरॉन्स के ऑप्टोजेनेटिक हेरफेर के प्रभाव की जांच करने के लिए एक तकनीक का वर्णन करते हैं। एक उदाहरण के रूप में, हम stria टर्मिनलिस (BNST) के बिस्तर नाभिक में GABAergic न्यूरॉन्स के हेरफेर का वर्णन. इन न्यूरॉन्स की तीव्र optogenetic उत्तेजना एनआरईएम नींद के दौरान लागू होने पर जागना करने के लिए एक तेजी से संक्रमण से चलाता है। ईईजी/ईएमजी रिकॉर्डिंग के साथ ऑप्टोजेनेटिक हेरफेर को न्यूरोनल सर्किट को समझने के लिए लागू किया जा सकता है जो नींद/जागरूकता राज्यों को विनियमित करता है।

Introduction

नींद इष्टतम संज्ञानात्मक समारोह के लिए आवश्यक है. हाल के निष्कर्षों से यह भी पता चलता है कि नींद में गड़बड़ी अनेक प्रकार की बीमारियों से जुड़ी हुई है1,2,3. हालांकि नींद के कार्य अभी तक काफी हद तक अनसुलझे हैं, तंत्रिका सर्किट और तंत्रहै कि नियंत्रण नींद को समझने में हाल ही में पर्याप्त प्रगति की गई है / स्तनधारियों में, सतर्कता के तीन राज्य हैं: जागना, गैर-रैपिड आंख आंदोलन (एनआरईएम) नींद, और तेजी से आंख आंदोलन (आरईएम) नींद। जागना उद्देश्यपूर्ण और निरंतर मोटर गतिविधि के साथ कम आयाम के तेजी से ईईजी दोलनों (5-12 हर्ट्ज) की विशेषता है। NREM नींद धीमी दोलनों द्वारा परिभाषित किया गया है (1-4 हर्ट्ज) उच्च आयाम (डेल्टा तरंगों), चेतना और उद्देश्यपूर्ण मोटर गतिविधि की कमी के साथ. रेम नींद कम आयाम के अपेक्षाकृत तेजी से दोलनों (6-12 हर्ट्ज) और लगभग पूरा द्विपक्षीय मांसपेशी atonia5की विशेषता है।

बोर्बेली ने नींद जागना विनियमन के एक सिद्धांत का प्रस्ताव किया जिसे दो प्रक्रिया मॉडल6,7 के रूप में जाना जाताहै। एक homeostatic प्रक्रिया, प्रक्रिया एस के रूप में भी जाना जाता है, नींद का दबाव है कि जागना के दौरान जमा हो जाता है और नींद के दौरान dissipates का प्रतिनिधित्व करता है. एक अन्य प्रक्रिया, जिसे प्रक्रिया सी कहा जाता है, एक सर्कैडियन प्रक्रिया है, जो बताती है कि 24 एच चक्र में सतर्कता स्तर में उतार-चढ़ाव क्यों होता है। इन दो प्रक्रियाओं के अतिरिक्त, नींद के विनियमन केलिए एलोस्टेटिक कारक भी महत्वपूर्ण हैं / Allostatic कारकों पोषण राज्यों और भावना शामिल हैं. भय और चिंता आमतौर पर स्वायत्त और न्यूरोएंडोक्राइन अनुक्रियाओं के साथ कामोत्तेजना में वृद्धि के साथ होती है10,11,12. माना जाता है कि limbic प्रणाली भय और चिंता के विनियमन में एक भूमिका निभाने के लिए माना जाता है, और स्वायत्त और neuroendocrine प्रतिक्रियाओं अंतर्निहित तंत्र बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है, लेकिन जिस के द्वारा limbic प्रणाली नींद को प्रभावित करती है / अभी तक पता चला है. ऑप्टो- और फार्माकोजेनेटिक्स का उपयोग करके हाल ही में किए गए अध्ययनों की एक बड़ी संख्या ने सुझाव दिया है कि नींद/जागरण राज्यों को विनियमित करने वाले न्यूरॉन्स और न्यूरोनल सर्किट पूरे मस्तिष्क में वितरित किए जाते हैं, जिसमें कॉर्टिस, बेसल फोरब्रेन, थैलेमस, हाइपोथैलेमस, और मस्तिष्क स्टेम. विशेष रूप से, optogenetics में हाल ही में प्रगति हमें प्रोत्साहित या उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प के साथ विशिष्ट तंत्रिका सर्किट मैंn vivo को बाधित करने की अनुमति दी है. इस तकनीक नींद और जागना के तंत्रिका substrates की हमारी समझ में प्रगति की अनुमति देगा, और कैसे नींद / जागना राज्यों circadian प्रक्रियाओं, नींद दबाव, और भावना सहित allostatic कारकों द्वारा विनियमित कर रहे हैं. इस कागज का उद्देश्य कैसे नींद के साथ संयुक्त optogenetic हेरफेर का उपयोग करने के लिए / और जागना. इस तंत्र की समझ जिसके द्वारा लिम्बिक प्रणाली नींद को नियंत्रित करती है / जागना राज्यों स्वास्थ्य के लिए सर्वोपरि महत्व का है, क्योंकि अनिद्रा आमतौर पर चिंता या सोने में असमर्थ होने के डर के साथ जुड़ा हुआ है (सोमनीफोबिया)।

BNST चिंता और भय में एक आवश्यक भूमिका निभाने के लिए सोचा है. जीएडी 67-एक्सप्रेशन गाबार्जिक न्यूरॉन्स BNST12,13की एक प्रमुख आबादी है. हमने नींद / जागना राज्यों पर इन न्यूरॉन्स (गाबाबीएनपीएसटी) के ऑप्टोजेनेटिक हेरफेर के प्रभाव की जांच की. हाल के वर्षों में तंत्रिका विज्ञान में सबसे बड़ी प्रगति में से एक तरीकों कि विवो में विशेष रासायनिक पहचान के साथ न्यूरॉन्स के हेरफेर सक्षम किया गया है, उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प के साथ. Optogenetics तंत्रिका गतिविधि और विशिष्ट व्यवहार प्रतिक्रियाओं14के बीच कारण संबंध का प्रदर्शन करने के लिए अत्यधिक उपयोगी है. हम ऑप्टोजेनेटिक्स को नींद/जागरूकता अवस्थाओं के विनियमन में परिभाषित तंत्रिका परिपथों की कार्यात्मक कनेक्टिविटी की जांच करने के लिए एक विधि के रूप में वर्णन करते हैं। इस तकनीक का उपयोग करके, न्यूरोनल सर्किट को समझने में महान प्रगतिहासिल की गई है जो नींद को विनियमित करता है / . कई मामलों में, opsins विशेष रूप से Cre-driver चूहों और Cre-inducible AAV-मध्यस्थ जीन हस्तांतरण का एक संयोजन द्वारा चयनात्मक मस्तिष्क क्षेत्रों में विशेष रासायनिक पहचान के साथ न्यूरॉन्स में पेश कर रहे हैं. इसके अलावा, इस तरह के channelrhodopsin 2 (ChR2)20 या archaerhodopsin (ArchT)21 एक Cre-loxP या Flp-FRT प्रणाली के साथ संयुक्त के रूप में फोटो के प्रति संवेदनशील opsins के फोकल अभिव्यक्ति हमें एक चयनात्मक न्यूरॉन जनसंख्या और विशिष्ट हेरफेर करने के लिए अनुमति देता है तंत्रिका मार्ग22|

हम यहाँ एक उदाहरण के रूप में BNST में GABAergic न्यूरॉन्स पर प्रयोगों का वर्णन. एक नामित न्यूरॉन आबादी में opsins व्यक्त करने के लिए, उपयुक्त क्रे ड्राइवर चूहों और क्रे-निर्भर वायरस वैक्टर सबसे अक्सर उपयोग किया जाता है. ट्रांसजेनिक या नॉक-इन लाइन्स जिनमें ओपिन्स को विशेष न्यूरोनल आबादी में व्यक्त किया जाता है, वे भी उपयोगी होते हैं। निम्नलिखित प्रयोगों में, हम GAD67-Cre दस्तक में चूहों का इस्तेमाल किया23 जिसमें केवल GABAergic न्यूरॉन्स एक C57BL/6J आनुवंशिक पृष्ठभूमि के साथ Cre recombinase व्यक्त करते हैं, और एक AAV वेक्टर जो ChR2 (hChR2 H134R) एक नियंत्रण के रूप में EY या EYFP के साथ जुड़े के साथ एक "FLEx (फ्लिप-निर्णय) स्विच"24| इस प्रक्रिया में विशेष रूप से BNST में GABAergic न्यूरॉन्स के optogenetic उत्तेजना का वर्णन नींद की निगरानी के दौरान /

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Protocol

यहाँ सभी प्रयोगों को एनआईएच दिशानिर्देशों का अनुपालन करते हुए, Tsukuba विश्वविद्यालय के पशु प्रयोग और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. पशु सर्जरी, वायरस इंजेक्शन, ईईजी / ईएमजी के लिए इलेक्ट्रोड, और ऑप्टिकल फाइबर प्रत्यारोपण

चेतावनी: उपयोग किए जाने वाले वायरस के जैव सुरक्षा स्तर के आधार पर उपयुक्त सुरक्षा और हैंडलिंग तकनीकों का चयन किया जाना चाहिए। AAV इंजेक्शन के लिए एक अलग P1A वर्गीकृत कमरे में इस्तेमाल किया जाना चाहिए, और AAV ले जाने ट्यूब सभी मात्रा ऊपर प्रयोग किया जाता है के बाद एक autoclave के साथ बाँझ किया जाना चाहिए. शल्य चिकित्सा साइट और सभी प्रत्यारोपित सामग्री उपयोग के दौरान स्वच्छ और बाँझ होना चाहिए.
नोट: चित्र 1देखें.

  1. ऑटोक्लेव के साथ शल्य चिकित्सा उपकरण को संक्रमित करें।
  2. एक संवेदनाहारी वाष्पित्र का उपयोग कर isoflurane के साथ चूहों एनेस्थेटाइज करें। माउस संज्ञाहरण की वांछित गहराई तक पहुँच गया है जब तक निरीक्षण करें, forceps के साथ पूंछ pinching के लिए प्रतिक्रिया के नुकसान से निर्धारित. उन्हें सुखाने को रोकने के लिए आंखों के लिए नेत्र मरहम लागू करें।
  3. आयोडीन समाधान या 70% EtOH (3x) के साथ शल्य चिकित्सा क्षेत्र को संक्रमित और पर्याप्त रूप से सूखा. सर्जरी किया जा रहा है के रूप में बर्फ पर फेंक करने के लिए वायरस की अनुमति दें। शोषक प्रयोगशाला बेंच पेपर के साथ शल्य चिकित्सा क्षेत्र को कवर करें।
  4. कान सलाखों और एक नाक चुटकी के साथ स्टीरियोटैक्टिक उपकरण में माउस के सिर को ठीक करें। सिर की पुष्टि करने के बाद, खोपड़ी में एक midsagital चीरा बनाने के लिए यह सुनिश्चित करने के लिए bregma और Lambda की स्थिति एक क्षैतिज रेखा पर एक ही स्तर पर स्थित हैं.
  5. एक स्थिति अंतर से बचने के लिए, उचित रूप से नाक चुटकी और कान सलाखों के स्तर को समायोजित ऊपर और नीचे. ब्रीग्मा और लैम्बडा क्रमशः सुटूरा सग्गिटलिस और सुटूरा कोरोनलिस या सुटूरा लैम्बडोइडल के बीच के अंतर को संदर्भित करतेहैं(चित्र 2)।
  6. कपाल के लिए उपयोग बनाए रखने के लिए त्वचा को पकड़ने के लिए Serafin clamps का प्रयोग करें. खोपड़ी के जोखिम के बाद, आयोडीन या 5% एच2ओ2के साथ खोपड़ी की सतह को कीटाणुरहित करें, ताकि ब्रीग्मा और लैम्ब्डा सहित कपाल टांके को अधिक स्पष्ट रूप से देखा जा सके।
  7. एएवी वेक्टर इंजेक्शन तैयार करें:
    1. एक 10 एमएल सिरिंज के अंदर धो (सामग्री की मेजदेखें) क्रमिक रूप से 70% EtOH, 100% EtOH, और बाँझ पानी, 5 बार प्रत्येक के साथ. एक माइक्रोइंजेक्शन पंप हाथ के दबाना में सिरिंज को सुरक्षित करें और सुनिश्चित करें कि सिरिंज में सभी समाधान छुट्टी दे दी गई है।
    2. ध्यान से हवा के बुलबुले के बिना खनिज तेल के 2 डिग्री सेल्सियस aspirate, तो वायरस समाधान के निर्दिष्ट मात्रा aspirate. आकांक्षा के बाद, प्लंजर बटन में हेरफेर और पुष्टि करें कि वायरस समाधान सुई की नोक पर उभरता है।
      नोट: वायरस समाधान के इंजेक्शन की मात्रा पायलट प्रयोगों में एक ही माउस तनाव और एक ही वायरस उत्पाद का उपयोग कर निर्धारित किया गया था. वायरस समाधान की मात्रा और संक्रमण क्षेत्र की सीमा के बीच संबंध अग्रिम में अनुमान लगाया जाना चाहिए।
  8. एएवी वेक्टर को इंजेक्ट करें:
    1. लघुअंगा पर माइक्रोइंजेक्शन सुई की नोक समायोजित करें और निर्देशांकों को मूल बिंदु के रूप में नोट करें। नामित इंजेक्शन साइट के लिए टिप ले जाएँ (BNST के लिए: anteroposter + 0.2 मिमी, औसत दर्जे का ] 1.0 मिमी, dorsoventral - 4.2 मिमी) और स्थिति पर सुई की नोक जगह. एक 0.7 मिमी कार्बाइड कटर के साथ एक दंत ड्रिल का उपयोग कर व्यास में लगभग 2 मिमी की खोपड़ी और ड्रिल छेद पर एक निशान रखो. ड्यूरा या मस्तिष्क के ऊतकों को नुकसान नहीं करने के लिए सावधान रहें।
    2. एक कपास झाड़ू के साथ छेद के आसपास से रक्त को हटाने के बाद, धीरे धीरे BNST की स्थिति में सुई ले जाएँ. धीरे-धीरे एक यांत्रिक माइक्रोइंजेक्टर के साथ वायरस समाधान (0.07 डिग्री सेल्सियस/मिनट) की निर्दिष्ट मात्रा इंजेक्ट करें। इंजेक्शन पूरा करने के बाद, पर्याप्त रूप से BNST ऊतक घुसपैठ करने के लिए समाधान की अनुमति देने के लिए 5 मिनट के लिए सुई छोड़ दें। ध्यान से सुई बाहर ले.
    3. द्विपक्षीय इंजेक्शन के लिए, दूसरी तरफ 1.8.1-1.8.2 चरणों को दोहराएँ। प्रक्रिया के दौरान, बाँझ नमकीन के अनुप्रयोगों के साथ खोपड़ी नम रखें।
      नोट: हम कस्टम EEG/EMG प्रत्यारोपण का इस्तेमाल किया (W: 5 मिमी, डी: 7 मिमी, एच: 1 मिमी) चार ईईजी इलेक्ट्रोड के साथ (4 मिमी), दो EMG इलेक्ट्रोड (2 मिमी; कटौती 4 मिमी इलेक्ट्रोड करने के लिए 2 nippers के साथ मिमी) और 6 इलेक्ट्रोड (4.5 मिमी) (चित्र ासा०).
  9. मिलाप दो स्टेनलेस स्टील के तारों (सामग्री की तालिकादेखें) जिसमें से 1 मिमी इन्सुलेशन के बंद छीन लिया है दोनों सिरों EMG इलेक्ट्रोड के लिए. इलेक्ट्रोड के केंद्र को संक्षिप्त माज़मा में समायोजित करें और प्रत्येक ईईजी इलेक्ट्रोड की स्थिति को चिह्नित करें (एंटीरोपोरिओर ] 1.5 मिमी, मध्यपार्श्विक ] 1.0 मिमी), और प्रत्यारोपण की स्थिति निर्धारित करें (चित्र 2बी)।
  10. प्रत्यारोपण ऑप्टिकल फाइबर:
    1. हेरफेर करने वाले को ऑप्टिक फाइबर फेरूल को संलग्न करें और मैनिप्युलर आर्म को घुमाएं ताकि यह एक क्षैतिज रेखा के खिलाफ $30 डिग्री का कोण हो (इस प्रक्रिया को केवल इलेक्ट्रोड और ऑप्टिक फाइबर के बीच हस्तक्षेप से बचने की आवश्यकता है, जैसे कि BNST उत्तेजना के मामले में)। bregma पर फाइबर टिप रखो और निर्देशांक रिकॉर्ड.
    2. लक्षित प्रविष्टि लाइन के लिए टिप ले जाएँ और खोपड़ी पर स्थिति चिह्नित. इसके अलावा लंगर शिकंजा के लिए प्रविष्टि साइट के पास अतिरिक्त अंक डाल दिया. ऑप्टिक फाइबर डालने और पेंच को ठीक करने के लिए एक दंत ड्रिल के साथ प्रत्येक साइट पर खोपड़ी ड्रिल। खोपड़ी पर पेंच को ठीक करें। ड्यूरा को तोड़ने या पेंच द्वारा किसी भी ऊतक को नुकसान नहीं करने के लिए सावधान रहें।
    3. ऑप्टिक फाइबर धीरे डालें जब तक एक manipulator के साथ BNST ऊपर तक पहुँचने. फेरूल को शेष कपाल पर आराम करना चाहिए (चित्र 1ख)
    4. फाइबर और पेंच को कवर करने के लिए फोटोक्यूरेबल डेंटल सीमेंट (सामग्री की तालिकादेखें) लागू करें। गोंद ठोस करने के लिए प्रतिक्रिया समय निर्माता के मैनुअल द्वारा निर्दिष्ट किया जाना चाहिए (हमारी सामग्री विशिष्ट लहर लंबाई फोटो जनरेटर के साथ कम से कम 10 एस के लिए प्रकाश के लिए जोखिम की जरूरत है. यह इस के बाद गोंद सूखी अनावश्यक है).
    5. इस चरण में, सुनिश्चित करें कि कोई सामग्री (स्क्रू या गोंद) इलेक्ट्रोड के लिए बढ़ते स्थान पर कब्जा. इसके अलावा, ऑप्टिक फाइबर और केबल से जोड़ने वाले फेरूल के लिए सीमेंट में कोई रुकावट बनाने से बचें। दोहराएँ कदम 1.10.1-1.10.4 द्विपक्षीय उत्तेजना के लिए विपरीत पक्ष पर.
  11. ईईजी/ईएमजी इलेक्ट्रोड के लिए ड्रिल होल। छेद में इलेक्ट्रोड के सुझावों को सम्मिलित करें. प्रत्यारोपण पकड़ो और खोपड़ी और इलेक्ट्रोड के बीच अंतरिक्ष के लिए cyanoacrylate चिपकने वाला लागू होते हैं। किसी भी सामग्री के साथ हस्तक्षेप नहीं करने के लिए ध्यान के साथ फिर से डालें।
  12. सिनोक्रिलेट चिपकने वाले के साथ इलेक्ट्रोड और ऑप्टिक फाइबर की परिधि को कवर करें जिसके बाद चिपकने वाले पर cyanoacrylate accelerant के आवेदन के बाद। इस चरण से बचा जाता है, जिससे फेरूल-टू-ऑप्टिक केबल और इलेक्ट्रोड-टू-लीड तार जोड़ने वाले क्षेत्र में कोई व्यवधान उत्पन्न होता है (चित्र 1C)।
    नोट: Cyanoacrylate चिपकने वाला और उसके accelerant माउस आंख के लिए हानिकारक हैं. इन रासायनिक पदार्थों के रिसाव का कारण नहीं ध्यान देना। इसके अलावा, चिपकने वाला ठोसीकरण के तुरंत बाद अप्रत्याशित विचलन से बचने के लिए इलेक्ट्रोड और फाइबर को दृढ़ता से स्पर्श न करें।
  13. माउस गर्दन की मांसपेशियों को उजागर और मांसपेशियों के नीचे EMG इलेक्ट्रोड के लिए तारों को सम्मिलित करें. EMG इलेक्ट्रोड की लंबाई को समायोजित करें ताकि यह केवल न्यूचल मांसपेशियों के नीचे पता लगा सके। इलेक्ट्रोड और मांसपेशी फासिया की नोक के बीच प्रकाश कनेक्शन EMG संकेत को पकड़ने के लिए पर्याप्त है.
  14. प्रत्यारोपण को भरने और त्वरण तरल के साथ चिपकने वाला ठोस करने के लिए cyanoacrylate चिपकने वाला लागू करें। फिर, वसूली के लिए एक गर्मी पैड पर माउस डाल जब तक postural पलटा प्रकट होता है. पशु आराम शरीर के तापमान के लिए गर्मी पैड तापमान समायोजित करें (36.0 डिग्री सेल्सियस में $T 0-12 C57BL6 चूहों के मामले में; 38.0 डिग्री सेल्सियस से अधिक नहीं है)।
    नोट: बाँझ सर्जरी के लिए एंटीबायोटिक की आवश्यकता नहीं है।
  15. पोस्ट ऑपरेटिव analgesia के लिए अपने स्थानीय संस्थागत दिशा निर्देशों का पालन करें. कम से कम 7 दिनों की वसूली अवधि के लिए चूहों को घर के पिंजरे में रखें।

2. विशिष्ट नींद राज्यों में लक्षित न्यूरॉन्स के फोटो उत्तेजना के साथ ईईजी/

चेतावनी: इस प्रोटोकॉल वर्ग 3B लेजर उपकरण या एलईडी उपकरणों का उपयोग भी शामिल है. प्रयोगकर्ताओं को सुरक्षा जानकारी के बारे में पता होना चाहिए। सुरक्षात्मक आंख काले चश्मे की आवश्यकता है.

  1. ऑप्टिक फाइबर के लिए लेजर केबल जोड़ने से पहले, एक स्केलर के साथ लेजर तीव्रता को समायोजित. एक ferrule के साथ एक अप्रयुक्त ऑप्टिक फाइबर के लिए लेजर केबल के टिप टेदर और पुष्टि करें कि फाइबर और केबल के बीच जंक्शन पर कोई जगह नहीं है.
  2. लेजर के मुख्य स्विच पर बारी और इसे गर्म करने के लिए 20 मिनट प्रतीक्षा करें।
  3. तीव्रता चेकर के लिए लेजर उत्सर्जन और 10 mW/mm2करने के लिए लेजर तीव्रता समायोजित करें। ट्रांजिस्टर तर्क करने के लिए लेजर मोड बदलें और पुष्टि करें कि प्रकाश दालों पैटर्न नियामक जो अवधि के लिए 10 एमएस पर सेट किया गया है द्वारा नियंत्रित फाइबर से उत्सर्जित कर रहे हैं, आराम के लिए 40 एमएस, चक्र के लिए 20 बार, और 20 बार दोहराने (अर्थात, 20 हर्ट्ज के 10 एमएस प्रकाश दालों के लिए 20 s).
  4. वसूली अवधि के बाद, चूहों ईईजी / ईएमजी रिकॉर्डिंग के लिए प्रयोगात्मक कक्ष में ले जाएँ। भोजन और पानी उपलब्ध विज्ञापन libitumके साथ एक 12 एच प्रकाश / अंधेरे चक्र के साथ एक निरंतर 23 डिग्री सेल्सियस पर घर चूहों .
  5. उलझन से बचने के लिए एक पर्ची की अंगूठी के लिए tethered है जो प्रत्यारोपित इलेक्ट्रोड और केबल एडेप्टर कनेक्ट. लेजर रिसाव को रोकने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी जैसे हल्के-अपारगम्य सामग्री के साथ जंक्शन को कवर करने की सिफारिश की जाती है। यदि एक द्विपक्षीय प्रयोग की आवश्यकता है, केबल के लिए एक द्विभाजन लगाव के साथ एक पर्ची अंगूठी का उपयोग करें.
  6. इस प्रोटोकॉल में, हम NREM स्लीप या रेम स्लीप से जागने के लिए लेटेंसी का आकलन करते हैं, इसलिए रिकॉर्डिंग समय ऑप्टिमाइज़ किए गए zeitgeber समय में सीमित होना चाहिए ($T0 को उस समय के रूप में परिभाषित किया गया है जब प्रकाश चालू है)। इस प्रोटोकॉल के बीच आयोजित किया गया था $T4 - $T10. चूहों acclimateization के रूप में कम से कम 1 एच के लिए प्रयोगात्मक कक्ष में स्वतंत्र रूप से रहने दें।
  7. प्रयोगात्मक अवधि के दौरान, एक ही मॉनिटर में ईईजी और ईएमजी संकेतों की निगरानी करें और जागना, एनआरईएम नींद या रेम नींद के रूप में माउस की स्थिति का मूल्यांकन करें। यह आसान प्रत्येक राज्य भेद करने के लिए बनाने के लिए प्रत्येक लहर के लिए लाभ नियंत्रण का प्रयोग करें.
  8. जागना विलंबता के लिए NREM नींद की माप के लिए, 40 s या 30 s के लिए स्थिर रेम नींद के लिए स्थिर NREM नींद का निरीक्षण, तो photostimulation के लिए पैटर्न जनरेटर के स्विच पर बारी (इस प्रोटोकॉल उत्पन्न करता है 20 के लिए 10 एमएस प्रकाश दालों 20 s). प्रत्यारोपित ऑप्टिक फाइबर के लिए लेजर उत्सर्जन की पुष्टि करें।
  9. जब तक नींद की स्थिति जागने में बदल जाती है, तब तक ईईजी/ईएमजी संकेतों को रिकॉर्ड करें। यदि दो या अधिक प्रयोगात्मक परीक्षणों की आवश्यकता होती है, तो ऑप्टोजेनेटिक हेरफेर को दिन में एक बार सीमित करें क्योंकि फोटोस्टिमुलेशन एक कृत्रिम हस्तक्षेप है जो नींद/जागरूकता वास्तुकला को प्रभावित कर सकता है।
  10. प्रयोग के बाद, इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण26के लिए पूरे मस्तिष्क के नमूने के लिए बाँझ लवण और पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) के साथ गहराई से एनेस्थेटाइज और परफ्यूज़ करना।

3. एनआरईएम नींद से जागना करने के लिए विलंब समय का विश्लेषण

  1. ईईजी/ईएमजी संकेतों को रिकॉर्ड करने के बाद, सिग्नल डेटा को स्लीप/जागरण राज्यों को स्कोरिंग करने के लिए कंप्यूटर पर स्थानांतरित करें। यह प्रोटोकॉल रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर के साथ ईईजी विश्लेषण की विधि का वर्णन करता है (सामग्री की तालिकादेखें )।
  2. स्लीप साइन अनुप्रयोग प्रारंभ करें और फ़ाइल टैब क्लिक करें और रिकॉर्ड किए गए डेटा (.kcd फ़ाइल) का चयन करने के लिए खोलें का चयन करें. प्रत्येक युग के लिए समय खिड़की का समायोजन करने के लिए युग समय का चयन करने के लिए नींद टैब पर क्लिक करें (हम 1 युग /
  3. मैन्युअल रूप से ईईजी/ईएमजी संकेतों के आधार पर नींद/ जागना राज्यों को निम्नलिखित मानदंडों के अनुसार: जागना, उच्च ईएमजी और उच्च आवृत्ति के साथ कम ईईजी वोल्टेज; NREM, कम EMG टोन और उच्च के साथ उच्च ईईजी वोल्टेज - (0.5-4 हर्ट्ज) आवृत्ति; और रेम, ईएमजी उच्च $ (6-9 हर्ट्ज) आवृत्ति के साथ मांसपेशियों atonia और कम ईईजी वोल्टेज इंगित करता है। एक स्थिति जो लगातार 16 s (यानी 4 epochs) के लिए जारी नहीं है एक राज्य परिवर्तन के रूप में परिभाषित नहीं है क्योंकि यह एक स्थिर स्थिति नहीं है.
  4. क्लिक करें और पहले युग पर बाएँ माउस बटन पकड़ और कर्सर खींचें जब तक 16 से अधिक s (4 युग) की विशिष्ट प्रवृत्ति समाप्त हो गया है. उसके बाद, बाएँ माउस बटन छोड़ें और पॉप-अप विंडो में उपयुक्त स्थिति (जागरूकता या NREM स्लीप या रेम स्लीप) का चयन करें। फ़ाइल में रिकॉर्ड किए गए सभी EEG/EMG संकेतों को स्कोर करने के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएँ।
  5. ईईजी NREM या रेम नींद से पता चलता है, जहां युग में उत्तेजना का सही समय का पता लगाएं, और उत्तेजना बिंदु के बाद राज्य संक्रमण दिखा युग. बस उत्तेजना के बाद और सिर्फ राज्य संक्रमण से पहले अवधि के बीच युगों की संख्या की गणना.
  6. फिर 4 s (A) द्वारा युगों की गिना संख्या गुणा। उत्तेजना के युग में, एक स्क्रीन शॉट लेने के लिए और उत्तेजना बिंदु और युग के अंत के बीच की चौड़ाई को मापने। फिर, मापा लंबाई पूरे युग की लंबाई से विभाजित और 4 s (बी) से गुणा. इसी प्रकार, राज्य परिवर्तन के युग में एनआरईएम नींद की अवधि की गणना करें, जिसका अर्थ है युग के प्रारंभ और राज्य परिवर्तन बिंदु (C) के बीच का समय।
  7. योग A, B और C NREM स्लीप से लेटेंसी प्राप्त करने के लिए जागना. एक ही प्रक्रिया REM नींद से जागना करने के लिए राज्य संक्रमण के विश्लेषण के लिए प्रयोग किया जाता है।

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Representative Results

वर्तमान अध्ययन नींद राज्य संक्रमण पर गाबाBNST न्यूरॉन्स के optogenetic उत्तेजना के प्रभाव से पता चला. CHR2-EYFP BNST में गाबा न्यूरॉन्स में फोकली व्यक्त किया गया था. एक situ संकरीकरण हिस्टोकेमिकल अध्ययन से पता चला कि ChR2-EYFP GAD 67 MRNA संकेतों को व्यक्त न्यूरॉन्स में colocalized था, यह दर्शाता है कि इन GABAergic न्यूरॉन्स हैं. इम्यूनोहिस्टोकेमिकल स्लाइस के नमूनों ने ऑप्टिक फाइबर की स्थिति की पुष्टि की, जिसकी नोक BNST25के ठीक ऊपर थी।

चित्र 3क एनआरईएम नींद के दौरान प्रतिनिधि ईईजी/ईएमजी निशान ों से पहले और बाद में फोटोस्टिमुलेशन दिखाता है। कोई EMG संकेतों के साथ उच्च वोल्टेज और धीमी आवृत्ति ईईजी NREM नींद का प्रतिनिधित्व करते हैं. फोटोस्टिमुलेशन (10 एमएस दालों पर 20 हर्ट्ज के लिए 20 सेकंड) स्थिर NREM नींद के बाद लागू किया गया था. उत्तेजना जागना करने के लिए तीव्र संक्रमण से चलाता है (कम वोल्टेज और सक्रिय EMG संकेतों के साथ उच्च आवृत्ति ईईजी) के बारे में 2 s ChR2-expressing चूहों में उत्तेजना के बाद. नियंत्रण चूहों (EYFP) उत्तेजना के बाद संक्रमण नहीं दिखाया (NREM से जागने की कमी: EYFP, 295.39 - 106.61 सेकंड, n ] 6; ChR2: 2.71 ] 0.59 सेकंड, n ] 6; ज10 ] 2.35, च और lt; 0.05; चित्र 3B, ऊपरी). इन आंकड़ों का सुझाव है कि NREM नींद के दौरान गाबाBNST न्यूरॉन्स की उत्तेजना जागना के तेजी से प्रेरण से चलाता है. दूसरी ओर, रेम नींद के दौरान photostimulation कोई प्रभाव नहीं था (EYFP: 36.45 ] 13.08 सेकंड, n ] 6; ChR2: 37.29 - 15.19 सेकंड, n ] 6; द10 र् 0ण्04 च र् 0ण्484; चित्र 3B, नीचे) तो एक संक्रमण प्रभाव केवल NREM नींद में उभरा.

Figure 1
चित्र 1 : प्रक्रिया एएवी इंजेक्ट करने के लिए, ऑप्टिक फाइबर और ईईजी / (क) विषाणु इंजेक्शन की प्रायोगिक प्रक्रिया। EYFP-fused ChR2 या EYFP (नियंत्रण के लिए) जीन AAV वेक्टर जिसका प्रतिलेखन Cre recombinase द्वारा सक्रिय है में शामिल द्विपक्षीय BNST में इंजेक्ट किया गया था. (ठ) इलेक्ट्रोड के साथ टकराव को रोकने के लिए क्षैतिज कोण पर BNST की ओर ऑप्टिक फाइबर डाले गए थे। इसके चारों ओर दो शिकंजा डाले गए थे। (ग) ऑप्टिक फाइबर के सुरक्षित स्थान के बाद ईईजी/ईएमजी रिकॉर्डिंग डिवाइस प्रत्यारोपित किया गया था। (घ) ऑपरेशन के अंत में, पूरे शल्य चिकित्सा क्षेत्र को सायनोऐक्रिलेट चिपकने वाला और दृढ़ता से तय किया जाना चाहिए। इलेक्ट्रोड और फेरुल्स को जोड़ने वाले क्षेत्र में किसी भी एजेंट को लागू न करना सुनिश्चित करें। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 : कस्टम ईईजी / ईएमजी इलेक्ट्रोड और इलेक्ट्रोड पिन प्रविष्टि साइटों। (ए) शीर्ष: से बाहर 6 इलेक्ट्रोड पिन, बाहरी दो पिन नीचे कटौती कर रहे हैं 2 मिमी नीचे: ईईजी / (बी) इन इलेक्ट्रोड और EMG चालन तार तो soldered हैं. जोड़ने क्षेत्र cyanoacrylate चिपकने वाला की तरह किसी भी इन्सुलेशन के साथ अलग किया जाना चाहिए. इलेक्ट्रोड ों की प्रविष्टि स्थल ब्रेग्मा (एंटीरोपोस्टरर ] 1.5 मिमी, मध्यपार्श्विक ] 1.0 मिमी) के सापेक्ष होते हैं। EMG तारों प्रविष्टि साइट पर तार की रक्षा इन्सुलेशन को हटाने के साथ गर्दन की मांसपेशियों के नीचे डाला जाता है (1 मिमी). कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 : गाबाBNST का प्रभाव NREM नींद और रेम नींद में राज्य संक्रमण पर उत्तेजना. (ए) प्रतिनिधि ईईजी और ईएमजी लहर और ईईजी पावर स्पेक्ट्रम। Photostimulation (10 एमएस दालों पर 20 हर्ट्ज के लिए 20 सेकंड) ChR2-expressing गाबाBNST न्यूरॉन्स के लिए लागू किया गया था 40 s NREM नींद के बाद. जागना तेजी से एक 2 s के बाद प्रेरित किया गया था. ईईजी ने ईएमजी फटने के साथ कम वोल्टेज और उच्च आवृत्ति दिखाई। ईईजी शक्ति स्पेक्ट्रोग्राम भी कम से उच्च आवृत्ति के लिए संक्रमण दिखाया. (बी ) गाबाबीएसएनएल न्यूरॉन्स की ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजना ने एनआरईएम नींद से जागना (ऊपरी) में तेजी से संक्रमण दिखाया, लेकिन रेम नींद (नीचे) में एक ही हेरफेर लागू करने के मामले में यह प्रभाव नहीं देखा गया था। *पी एंड एलटी; 0.05, वेल्च के टी-परीक्षण। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

हम यहाँ नींद के राज्य संक्रमण पर विशेष रासायनिक पहचान के साथ न्यूरॉन्स के optogenetic उत्तेजना के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए एक विधि प्रस्तुत / हमारे डेटा से पता चला है कि गाबाBNST न्यूरॉन्स के optogenetic उत्तेजना NREM नींद से जागना करने के लिए तत्काल संक्रमण में परिणाम.

विभिन्न प्रयोगात्मक डिजाइन optogenetic उपकरणों के कई प्रकार के विकास की वजह से उपलब्ध हैं. यह सक्रिय करने के लिए या इस तरह के CHR2, SSFO, halorhodopsin, ArchT, और iChloC27के रूप में, opsins के विभिन्न प्रकार का उपयोग कर विशेष न्यूरॉन्स के न्यूरोनल गतिविधि को बाधित करने के लिए संभव है। ChR2 न्यूरॉन्स फोटो उत्तेजना के बाद कुछ मिलीसेकंड सक्रिय कर सकते हैं और यह विशिष्ट नींद चरणों में तीव्र प्रभाव की जांच करने के लिए एक पल्स जनरेटर द्वारा एक चरण-लॉक तरीके से कार्रवाई की क्षमता पैदा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. एक स्थिर सक्रिय opsin जैसे स्थिर कदम समारोह opsin (SSFO), जो उत्तेजना के बाद 15 से 30 मिनट के लिए न्यूरॉन्स के depolarization लाती है, भी एक अर्द्ध-क्रोनिक प्रभाव का निरीक्षण करने के लिए डिज़ाइन प्रयोगों के कुछ प्रकार के लिए उपयोगी हो सकता है28. SSFO के साथ depolarized कोशिकाओं विभिन्न शारीरिक न्यूरॉन इनपुट के लिए और अधिक संवेदनशील हो सकता है और लंबी तरंगदैर्ध्य प्रकाश लागू करने से निष्क्रिय किया जा सकता है. इसके अलावा, हम एक axonal प्रक्षेपण के स्थल पर ऑप्टिक फाइबर के प्रत्यारोपण द्वारा axons सक्रिय कर सकते हैं. फाइबर उत्तेजना एक विशेष axonal प्रक्षेपण मार्ग के समारोह के बारे में जानकारी प्रदान कर सकता है.

ऑप्टोजेनेटिक हेरफेर के दौरान ईईजी/ईएमजी रिकॉर्डिंग चूहों में नींद/जागरूकता राज्यों पर चयनात्मक उत्तेजना/अवरोध के प्रत्यक्ष परिणामों को निर्धारित करने के लिए एक कम इनवेसिव विधि है। इस विधि के साथ, कई न्यूरॉन आबादी और तंत्रिका सर्किट नींद के विनियमन में शामिल किया जा करने के लिए दिखाया गया है / इस तकनीक के आगे के विकास की ओर, यह एक साथ कई रास्ते में हेरफेर करने के लिए कई फाइबर प्रत्यारोपण करने के लिए संभव है, या यह भी फाइबर photometory या miniscopes के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकता न्यूरॉन गतिविधियों पर नजर रखने के लिए.

अंत में, यह अनुमान है कि optogenetics मस्तिष्क द्वारा नींद विनियमन के रहस्य और रिफ्रैक्टरी अनिद्रा और अन्य नींद विकारों के लिए अभिनव चिकित्सा के विकास ताला खोलने में प्रगति में तेजी लाने जाएगा.

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Disclosures

इस परियोजना को आंशिक रूप से मर्क एंड कंपनी द्वारा आर्थिक रूप से समर्थित किया गया था।

Acknowledgments

इस अध्ययन को मर्क अन्वेषक अध्ययन कार्यक्रम (#54843), अभिनव क्षेत्रों पर वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए एक KAKENHI अनुदान-इन-एड द्वारा समर्थित किया गया था, "WillDynamics" (16H06401) (T.S.), और अभिनव क्षेत्रों पर अन्वेषणात्मक अनुसंधान के लिए एक KAKENHI अनुदान-इन-एड (टी.एस.) (18H02595).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x1 Fiber-optic Rotary Joints Doric FRJ 1x1 FC-FC for optogenetics
6-pin header KEL corporation DSP02-006-431G
6-pin socket Hirose 21602X3GSE
A/D converter Nippon koden N/A Analog to digital converter
AAV10-EF1a-DIO-ChR2-EYFP 3.70×1013(genomic copies/ml)
AAV10-EF1a-DIO-EYFP 5.82×1013(genomic copies/ml)
Ampicillin Fuji film 014-23302
Amplifier Nippon koden N/A for EEG/EMG recording
Anesthetic vaporizer Muromachi MK-AT-210D
Automatic injecter KD scientific 780311
Carbide cutter Minitor B1055 φ0.7 mm. Reffered as dental drill, used with high speed rotary micromotor 
Cyanoacrylate adhesion  (Aron alpha A) and acceleration Konishi #30533
Dental curing light 3M Elipar S10
Epoxy adhesive Konishi #04888 insulation around the solder of 6-pin and shielded cable
Fiber optic patch cord (branching) Doric BFP(#)_50/125/900-0.22
Gad67-Cre mice provided by Dr. Kenji Sakimura Cre recombinase gene is knocked-in in the Gad67 allele
Hamilton syringe Hamilton 65461-01
High speed rotary micromotor kit FOREDOM K.1070 Used with carbide cutter
Interconnecting sleeve Thorlab ADAF1 φ2.5 mm Ceramic 
Isoflurane Pfizer 871119
Laser   Rapp OptoElectronic N/A 473 nm wave length
Laser intesity checker COHERENT 1098293
Laser stimulator Bio research center STO2 reffered as pulse generator in text
Optic fiber with ferrule  Thorlab FP200URT-CANNULA-SP-JP
pAAV2-rh10 provided by PennVector Core
pAAV-EF1a-DIO-EYFP-WPRE-HGHpA Addgene plasimid # 20296
pAAV-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-HGHpA provided by Dr. Karl Deisseroth
Patch cord Doric D202-9089-0.4 0.4m length, laser conductor between laser and rotary joint
pHelper Stratagene
Photocurable dental cement 3M 56846
Serafin clamp Stoelting 52120-43P
Shielded cable mogami W2780 Soldering to 6-pin socket for EEG/EMG recording
Sleep recording chamber N/A N/A Custum-made (21 cm× 29 cm × 19 cm) with water tank holder
Sleep sign software KISSEI COMTEC N/A for EEG/EMG analysis
Slip ring neuroscience,inc N/A for EEG/EMG analysis
Stainless screw Yamazaki N/A φ1.0 x 2.0
Stainless wire Cooner wire AS633  0.0130 inch diameter
Stereotaxic frame with digital console Koph N/A Model 940
Syringe needle Hamilton 7803-05
Vital recorder software KISSEI COMTEC N/A for EEG/EMG recording

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 148 तंत्रिका विज्ञान Optogenetics नींद रिकॉर्डिंग ईईजी /
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Kodani, S., Soya, S., Sakurai, T.… More

Kodani, S., Soya, S., Sakurai, T. Optogenetic Manipulation of Neural Circuits During Monitoring Sleep/wakefulness States in Mice. J. Vis. Exp. (148), e58613, doi:10.3791/58613 (2019).

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