Summary
Aquí, describimos métodos de manipulación optogenética de determinados tipos de neuronas durante la monitorización de los estados de sueño/vigilia en ratones, presentando nuestro trabajo reciente en el núcleo de la estría terminal is como ejemplo.
Abstract
En los últimos años, la optogenética ha sido ampliamente utilizada en muchos campos de la investigación neurocientífica. En muchos casos, una opsin, como la rodopsina de canal 2 (ChR2), se expresa mediante un vector de virus en un tipo particular de células neuronales en varios ratones Cre-driver. La activación de estas opsins se activa mediante la aplicación de pulsos de luz que se entregan por láser o LED a través de cables ópticos, y el efecto de la activación se observa con una resolución de tiempo muy alta. Los experimentadores son capaces de estimular agudamente las neuronas mientras monitorean el comportamiento u otro resultado fisiológico en ratones. La optogenética puede permitir estrategias útiles para evaluar la función de los circuitos neuronales en la regulación de los estados de sueño/vigilia en ratones. Aquí describimos una técnica para examinar el efecto de la manipulación optogenética de las neuronas con una identidad química específica durante el electroencefalograma (EEG) y la monitorización del electromiograma (EMG) para evaluar la etapa del sueño de los ratones. Como ejemplo, describimos la manipulación de las neuronas GABAérgicas en el núcleo de la cama de la estría terminalis (BNST). La excitación optogenética aguda de estas neuronas desencadena una rápida transición a la vigilia cuando se aplica durante el sueño NREM. La manipulación optogenética junto con la grabación EEG/EMG se puede aplicar para descifrar los circuitos neuronales que regulan los estados de sueño/vigilia.
Introduction
El sueño es esencial para una función cognitiva óptima. Los hallazgos recientes también sugieren que las alteraciones en el sueño se asocian con una amplia gama de enfermedades1,2,3. Aunque las funciones del sueño están todavía en gran medida sin resolver, recientemente se han hecho progresos sustanciales en la comprensión de los circuitos neuronales y mecanismos que controlan los estados de sueño/vigilia4. En los mamíferos, hay tres estados de vigilancia: vigilia, sueño de movimiento ocular no rápido (NREM) y sueño de movimiento ocular rápido (REM). La vigilia se caracteriza por oscilaciones EEG rápidas (5-12 Hz) de baja amplitud con actividad motora intencionada y sostenida. El sueño NREM se define por oscilaciones lentas (1-4 Hz) de alta amplitud (ondas delta), con falta de conciencia y actividad motora deliberada. El sueño REM se caracteriza por oscilaciones relativamente rápidas (6-12 Hz)de baja amplitud y casi completa atonía muscular bilateral 5.
Borbely propuso una teoría de la regulación de la vigilia del sueño conocida como los dos modelos de proceso6,7. Un proceso homeostático, también conocido como proceso S, representa la presión del sueño que se acumula durante la vigilia y se disipa durante el sueño. Otro proceso, conocido como proceso C, es un proceso circadiano, que explica por qué los niveles de vigilancia fluctúan en el ciclo de 24 h. Además de estos dos procesos, los factores alostáticos también son importantes para la regulación del sueño/vigilia8,9. Los factores allostáticos incluyen estados nutricionales y emociones. El miedo y la ansiedad suelen ir acompañados de un aumento de la excitación junto con las respuestas autonómicas y neuroendocrinas10,11,12. Se cree que el sistema límbico desempeña un papel en la regulación del miedo y la ansiedad, y los mecanismos subyacentes a las respuestas autonómicas y neuroendocrinas se han estudiado extensamente, pero la vía por la cual el sistema límbico influye en los estados de sueño/vigilia no ha sido aún así se han revelado. Un gran número de estudios recientes con opto- y farmacogenética han sugerido que las neuronas y circuitos neuronales que regulan los estados de sueño/vigilia se distribuyen por todo el cerebro, incluyendo los cortices, el antecefálico basal, el tálamo, el hipotálamo, y el tallo cerebral. En particular, los recientes avances en optogenética nos han permitido estimular o inhibir circuitos neuronales específicos in vivo con altas resoluciones espaciales y temporales. Esta técnica permitirá avanzar en nuestra comprensión de los sustratos neuronales del sueño y la vigilia, y cómo los estados de sueño/vigilia están regulados por procesos circadianos, presión de sueño y factores alostáticos, incluyendo la emoción. Este artículo tiene como objetivo introducir cómo utilizar la manipulación optogenética combinada con la grabación de sueño/vigilia, que podría tener el potencial de actualizar nuestra comprensión de los connectomes y mecanismos en el cerebro que juegan un papel en la regulación del sueño NREM, sueño REM, y la vigilia. La comprensión de este mecanismo por el cual el sistema límbico regula los estados de sueño/vigilia es de suma importancia para la salud, porque el insomnio generalmente se asocia con la ansiedad o el miedo a no poder dormir (somnifobia).
Se cree que el BNST juega un papel esencial en la ansiedad y el miedo. GAD 67-expresando neuronas GABAérgicas son una población importante del BNST12,13. Examinamos el efecto de la manipulación optogenética de estas neuronas (GABABNST) en estados de sueño/vigilia. Uno de los mayores avances en neurociencia en los últimos años han sido los métodos que permiten la manipulación de las neuronas con identidades químicas particulares in vivo, con altas resoluciones espaciales y temporales. La optogenética es muy útil para demostrar vínculos causales entre la actividad neuronal y las respuestas conductuales específicas14. Describimos la optogenética como un método para examinar la conectividad funcional de los circuitos neuronales definidos en la regulación de los estados de sueño/vigilia. Mediante la utilización de esta técnica, se ha logrado un gran progreso en la comprensión de los circuitos neuronales que regulan los estados de sueño/vigilia15,16,17,19,19 . En muchos casos, las opsins se introducen específicamente en neuronas con identidades químicas particulares en regiones cerebrales selectivas mediante una combinación de ratones Cre-driver y transferencia de genes mediada por AAV inducible Cre. Además, la expresión focal de opsins fotosensibles como la cifrodopsina 2 (ChR2)20 o la arqueerhodopsina (ArchT)21 combinada con un sistema Cre-loxP o Flp-FRT nos permite manipular una población neuronal selectiva y específica vía neural22.
Aquí describimos los experimentos sobre neuronas GABAérgicas en el BNST como un ejemplo. Para expresar opsins en una población neuronal designada, se utilizan con mayor frecuencia ratones conductores de Cre apropiados y vectores de virus dependientes de Cre. También son útiles las líneas transgénicas o de impacto en las que las opsins se expresan en determinadas poblaciones neuronales. En los siguientes experimentos, utilizamos ratones knock-in GAD67-Cre 23 en los que sólo las neuronas GABAérgicas expresan la recombinación de Cre con un fondo genético C57BL/6J, y un vector AAV que contiene ChR2 (hChR2 H134R) fusionado con EYFP o EYFP como un vector de control con un interruptor "FLEx (Flip-escision)"24. El procedimiento describe específicamente la excitación optogenética de las neuronas GABAérgicas en el BNST durante el seguimiento de los estados de sueño/vigilia25.
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Protocol
Todos los experimentos aquí fueron aprobados por el Comité de Experimento y Uso Animal de la Universidad de Tsukuba, cumpliendo con las directrices de NIH.
1. Cirugía animal, inyección de virus, electrodo para EEG/EMG e implantación de fibra óptica
PRECAUCION: Deben seleccionarse técnicas adecuadas de protección y manipulación en función del nivel de bioseguridad del virus que se va a utilizar. AAV se debe utilizar en una sala de inyección aislada con calificación P1A, y el tubo que transporta AAV debe esterilizarse con un autoclave después de que se haya agotado todo el volumen. El sitio quirúrgico y todo el material implantado deben estar limpios y estériles durante el uso.
NOTA: Vea la figura1.
- Desinfectar el equipo quirúrgico con el autoclave.
- Anestetizar ratones con isoflurano usando un vaporizador anestésico. Observe hasta que el ratón haya alcanzado la profundidad deseada de la anestesia, determinada por la pérdida de respuesta a pellizcar la cola con fórceps. Aplique pomada oftálmica en los ojos para evitar que se sequen.
- Desinfectar el campo quirúrgico con solución de yodo o 70% EtOH (3x) y secar lo suficiente. Permita que el virus se desconda sobre hielo mientras se realiza la cirugía. Cubra el área quirúrgica con papel de banco de laboratorio absorbente.
- Fije la cabeza del ratón en el aparato estereotáctico con barras de oído y un pellizco nasal. Después de confirmar que la cabeza se mantiene establemente, haga una incisión mediasgittal en el cuero cabelludo para asegurar se encuentran las posiciones del bregma y lambda en el mismo nivel en una línea horizontal.
- Para evitar un espacio de posicionamiento, ajuste adecuadamente los niveles de pellizcar la nariz y las barras de los oídos hacia arriba y hacia abajo. El bregma y lambda se refieren a la intersección entre la sutura saggitalis y sutura coronalis o sutura lambdoidal, respectivamente (Figura 2).
- Utilice abrazaderas Serafin para sujetar la piel y mantener el acceso al cráneo. Después de la exposición del cráneo, desinfectar la superficie del cráneo con yodo o 5% H2O2, para permitir que las suturas craneales incluyendo el bregma y lambda se visualicen más claramente.
- Preparar la inyección vectorial AAV:
- Lave el interior de una jeringa de 10 ml (ver Tabla de materiales)secuencialmente con 70% EtOH, 100% EtOH y agua esterilizada, 5 veces cada una. Fije la jeringa en la abrazadera de un brazo de bomba de microinyección y asegúrese de que se haya descargado toda la solución de la jeringa.
- Aspirar con cuidado 2 l de aceite mineral sin burbujas de aire, luego aspirar el volumen designado de la solución de virus. Después de la aspiración, manipule el botón del émbolo y confirme que la solución del virus emerge en la punta de la aguja.
NOTA: El volumen de inyección de la solución de virus se determinó en experimentos piloto utilizando la misma cepa de ratón y el mismo producto de virus. La relación entre el volumen de solución del virus y la extensión de la zona de infección debe estimarse de antemano.
- Inyectar vector AAV:
- Ajuste la punta de la aguja de microinyección en el bregma y anote las coordenadas como el punto original. Mueva la punta al lugar de inyección designado (para el BNST: anteroposterior + 0,2 mm, mediolateral a 1,0 mm, dorsoventral - 4,2 mm) y coloque la punta de la aguja en la posición. Ponga una marca en el cráneo y taladre agujeros de aproximadamente 2 mm de diámetro utilizando un taladro dental con una cortadora de metal duro de 0,7 mm. Tenga cuidado de no dañar la dura o el tejido cerebral.
- Después de extraer la sangre de alrededor de los orificios con un hisopo de algodón, mueva lentamente la aguja a la posición del BNST. Inyectar lentamente la cantidad designada de solución del virus (0,07 l/min) con un microinyector mecánico. Después de completar la inyección, deje la aguja durante 5 minutos para permitir que la solución se infiltre lo suficiente en el tejido BNST. Saque con cuidado la aguja.
- Para la inyección bilateral, repita los pasos 1.8.1-1.8.2 en el otro lado. Durante todo el procedimiento, mantenga el cráneo húmedo con aplicaciones de solución salina estéril.
NOTA: Utilizamos implantes EEG/EMG personalizados (W: 5 mm, D: 7 mm, H: 1 mm) con cuatro electrodos EEG (4 mm), dos electrodos EMG (2 mm; cortar el electrodo de 4 mm a 2 mm con pinzadas) y 6 electrodos (4,5 mm) (Figura2A).
- Soldar dos cables de acero inoxidable (ver Tabla de Materiales)de los cuales 1 mm del aislamiento se despoja de ambos extremos a los electrodos EMG. Ajustar el centro de los electrodos al bregma y marcar la posición de cada electrodo EEG (anteroposterior a 1,5 mm, mediolateral a 1,0 mm) y determinar la posición del implante (Figura2B).
- Fibras ópticas de implante:
- Fije una férula de fibra óptica al manipulador y gire el brazo del manipulador de modo que tenga un ángulo de 30o contra una línea horizontal (este proceso sólo es necesario para evitar interferencias entre electrodos y fibras ópticas, como en el caso de la estimulación BNST). Ponga la punta de fibra en el bregma y registre las coordenadas.
- Mueva la punta a la línea de inserción objetivo y marque la posición en el cráneo. Coloque también marcas adicionales cerca del sitio de inserción para los tornillos de anclaje. Taladre el cráneo en cada sitio con un taladro dental para insertar la fibra óptica y fijar el tornillo. Fije el tornillo en el cráneo. Tenga cuidado de no romper la dura o dañar cualquier tejido por tornillo.
- Inserte la fibra óptica suavemente hasta llegar por encima del BNST con un manipulador. La férula debe recaer en el cráneo restante (Figura1B).
- Aplique cemento dental fotocurable (ver Tabla de Materiales)para cubrir la fibra y el tornillo. El tiempo de reacción para solidificar el pegamento debe especificarse en el manual del fabricante (Nuestro material necesita exposición a la luz durante al menos 10 s con fotogenerador de longitud de onda específica. No es necesario secar el pegamento después de esto).
- En este paso, asegúrese de que ningún material (tornillo o pegamento) ocupe el espacio de montaje de los electrodos. Además, evite realizar cualquier interrupción en el cemento para la férula que se conecta a la fibra óptica y el cable. Repita los pasos 1.10.1-1.10.4 en el lado opuesto para la estimulación bilateral.
- Agujeros de perforación para electrodos EEG/EMG. Inserte las puntas de los electrodos en los orificios. Sostenga el implante y aplique adhesivo de cianoacrilato en el espacio entre el cráneo y los electrodos. Inserte de nuevo con atención para no interferir con ningún material.
- Cubrir la circunferencia de los electrodos y fibras ópticas con adhesivo de cianoacrilato seguido de la aplicación de cianoacrilato accelerant en el adhesivo. Este paso evita causar cualquier interrupción en la zona de conexión de cable de ferrule-to-optic y electrode-to-lead (Figura1C).
NOTA: El adhesivo de cianoacrilato y su acelerador son perjudiciales para el ojo del ratón. Preste atención para no causar derrames de estas sustancias químicas. Además, tenga cuidado de no tocar fuertemente los electrodos y las fibras con el fin de evitar la desviación inesperada inmediatamente después de la solidificación adhesiva. - Exponer los músculos del cuello del ratón e insertar los cables para el electrodo EMG debajo del músculo. Ajuste la longitud del electrodo EMG para que se localice justo debajo de los músculos nucales. La conexión de luz entre la punta del electrodo y la fascia muscular es suficiente para captar la señal EMG.
- Aplique adhesivo de cianoacrilato para llenar los implantes y solidificar el adhesivo con líquido de aceleración. Luego, coloque el ratón en una almohadilla de calor para recuperarse hasta que aparezca el reflejo postural. Ajustar la temperatura de la almohadilla de calor a la temperatura corporal en reposo de los animales (36,0 oC en ZT 0-12 en el caso de ratones C57BL6; no exceda los 38,0 oC).
NOTA: No se requiere un antibiótico para la cirugía estéril. - Siga sus pautas institucionales locales para la analgesia postoperatoria. Mantenga a los ratones en una jaula doméstica durante un período de recuperación de al menos 7 días.
2. Monitoreo de EEG/EMG con fotoexcitación de neuronas dirigidas en estados específicos del sueño
PRECAUCION: Este protocolo incluye el uso de equipos láser de clase 3B o dispositivos LED. Los experimentadores deben estar al tanto de la información de seguridad. Se requieren gafas protectoras.
- Antes de conectar el cable láser a la fibra óptica, ajuste la intensidad del láser con un escalador. Ate la punta del cable láser a una fibra óptica no utilizada con una férula y confirme que no hay espacio en la unión entre la fibra y el cable.
- Encienda el interruptor principal del láser y espere 20 minutos para que se caliente.
- Emitir el láser al comprobador de intensidad y ajustar la intensidad del láser a 10 mW/mm2. Cambie el modo láser a la lógica del transistor y confirme que los pulsos de luz son emitidos por la fibra controlada por el regulador de patrón que se establece en 10 ms para la duración, 40 ms para el descanso, 20 veces para el ciclo, y 20 veces repetir (es decir, 20 Hz de 10 ms pulsos de luz para 20 s).
- Después del período de recuperación, mueva los ratones a la cámara experimental para registrar EEG/EMG. Ratones de la casa a una temperatura constante de 23oC con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h con alimentos y agua disponibles ad libitum.
- Conecte el electrodo implantado y el adaptador de cable que está atado a un anillo deslizante para evitar el enredo. Se recomienda cubrir la unión con material impermeable a la luz, como papel de aluminio para evitar fugas de láser. Si se requiere un experimento bilateral, utilice un anillo deslizante con un accesorio de bifurcación para los cables.
- En este protocolo, evaluamos la latencia a la vigilia desde el sueño NREM o el sueño REM, por lo que el tiempo de grabación debe limitarse en el tiempo optimizado zeitgeber (ZT0 se define como el momento en que la luz está encendida). Este protocolo se llevó a cabo entre ZT4 - ZT10. Deje que los ratones permanezcan libremente en la cámara experimental durante al menos 1 h como aclimatación.
- Durante el período experimental, monitoriza las señales EEG y EMG en el mismo monitor y evalúa el estado del ratón como vigilia, sueño NREM o sueño REM. Utilice el control de ganancia para cada onda para que sea más fácil distinguir cada estado.
- Para la medición del sueño NREM a la latencia de vigilia, observe sueño NREM estable para 40 s o sueño REM estable durante 30 s, luego encienda el interruptor del generador de patrones para la fotoestimulación (este protocolo genera 20 Hz de 10 ms pulsos de luz para 20 s). Confirme la emisión del láser a las fibras ópticas implantadas.
- Registre las señales EEG/EMG hasta que el estado de sueño cambie a la vigilia. Si se necesitan dos o más ensayos experimentales, limite la manipulación optogenética a una vez al día porque la fotoestimulación es una intervención artificial que podría afectar la arquitectura del sueño/vigilia.
- Después del experimento, anestesia profundamente y perpetúe con solución salina estéril y paraformaldehído (PFA) para el muestreo de todo el cerebro para el análisis inmunohistoquímico26.
3. Análisis del tiempo de latencia desde NREM Sleep hasta Wakefulness
- Después de grabar las señales EEG/EMG, transfiera los datos de la señal a un ordenador para puntuar los estados de sueño/vigilia. Este protocolo describe el método para el análisis de EEG con software de grabación (ver Tabla de Materiales).
- Inicie la aplicación de signo de suspensión y haga clic en la pestaña Archivo y seleccione Abrir para elegir los datos grabados (archivo .kcd). Haga clic en la pestaña Suspender para seleccionar Tiempo de época para ajustar la ventana de tiempo para cada época (utilizamos 1 época/4 seg).
- Puntuación manual de estados de sueño/vigilia basados en señales EEG/EMG, de acuerdo con los siguientes criterios: vigilia, alta EMG y baja tensión EEG con alta frecuencia; NREM, tono EMG bajo y alto voltaje EEG con alta frecuencia de (0,5-4 Hz); y REM, EMG indica atonía muscular y baja tensión EEG con alta frecuencia de 6-9 Hz. Un estado que no continúa consecutivamente durante 16 s (es decir, 4 épocas) no se define como un cambio de estado porque no es un estado estable.
- Haga clic y mantenga pulsado el botón izquierdo del ratón en la primera época y arrastre el cursor hasta que finalice la tendencia específica de más de 16 s (4 épocas). A continuación, suelte el botón izquierdo del ratón y elija el estado adecuado (vigilia o sueño NREM o sueño REM) en la ventana emergente. Repita este procedimiento para puntuar todas las señales EEG/EMG registradas en el archivo.
- Encuentre la hora exacta de estimulación en la época en la que el EEG muestra sueño NREM o REM, y la época que muestra la transición de estado después del punto de estimulación. Cuente el número de épocas entre los períodos justo después de la estimulación y justo antes de la transición del estado.
- A continuación, multiplique el número contado de épocas por 4 s (A). En la época de la estimulación, tome una captura de pantalla y mida la anchura entre el punto de estimulación y el final de la época. A continuación, divida la longitud medida por toda la longitud de la época y multiplique por 4 s (B). Del mismo modo, calcule la duración del sueño NREM en la época del cambio de estado, lo que significa el tiempo entre el inicio de la época y el punto de cambio de estado (C).
- Suma A, B y C para obtener la latencia del sueño NREM a la vigilia. El mismo procedimiento se utiliza para el análisis de la transición de estado de sueño REM a vigilia.
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Representative Results
El presente estudio mostró el efecto de la excitación optogenética de las neuronas GABABNST en la transición del estado del sueño. ChR2-EYFP se expresó focalmente en las neuronas GABA en el BNST. Un estudio histoquímico de hibridación in situ mostró que ChR2-EYFP fue colocalizado en neuronas que expresan señales de MRNA GAD 67, lo que indica que estas son neuronas GABAérgicas. Las muestras de rodajas inmunohistoquímicas confirmaron la posición de la fibra óptica, cuya punta estaba justo por encima de la BNST25.
La Figura 3A muestra los rastros representativos del EEG/EMG antes y después de la fotoestimulación durante el sueño NREM. EEG de alta tensión y frecuencia lenta sin señales EMG representan el sueño NREM. La fotoestimulación (10 ms pulsos a 20 Hz durante 20 seg) se aplicó después del sueño Estable NREM. La estimulación desencadena una transición aguda a la vigilia (eEG de baja tensión y alta frecuencia con señales EMG activas) aproximadamente 2 s después de la estimulación en ratones chr2. Los ratones de control (EYFP) no mostraron transición después de la estimulación (latencia de despertar de NREM: EYFP, 295,39 a 106,61 seg, n a 6; ChR2: 2,71 á 0,59 seg, n a 6; t10 a 2,35, p < 0,05; Figura 3B, superior). Estos datos sugieren que la excitación de las neuronas GABABNST durante el sueño NREM desencadena la inducción rápida de la vigilia. Por otro lado, la fotoestimulación durante el sueño REM no tuvo ningún efecto (EYFP: 36,45 á 13,08 seg, n a 6; ChR2: 37,29 á 15,19 seg, n a 6; t10 a 0,04, p a 0,484; Figura 3B, abajo) por lo que un efecto de transición sólo surgió en el sueño NREM.
Figura 1 : Procedimiento para inyectar AAV, implante de fibras ópticas e implantes EEG/EMG. (A) Procedimiento experimental de inyección de virus. El gen ChR2 o EYFP (para el control) fusionado con EYFP (para el control) incorporado en el vector AAV cuya transcripción es activada por Cre recombinase se inyectó bilateralmente en el BNST. (B) Se insertaron fibras ópticas hacia el BNST en un ángulo de 30o con respecto al horizontal para evitar la colisión con el electrodo. Se insertaron dos tornillos a su alrededor. (C) El dispositivo de grabación EEG/EMG se implantó después de la colocación segura de las fibras ópticas. (D) Al final de la operación, toda la zona quirúrgica debe estar cubierta con adhesivo de cianoacrilato y fuertemente fijada. Asegúrese de no aplicar ningún agente a la región que conecta el electrodo y las férulas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Sitios de inserción de electrodos y pasadores de electrodos EEG/EMG personalizados. (A) Parte superior: De 6 pines de electrodo, los dos pines externos se cortan hasta 2 mm. Parte inferior: electrodos EEG/EMG. (B) Estos electrodos y cables de conducción EMG se sueldan. La zona de conexión debe aislarse con cualquier aislamiento como adhesivo de cianoacrilato. Los sitios de inserción de los electrodos son relativos al bregma (anteroposterior a 1,5 mm, mediolateral a 1,0 mm). Los cables EMG se insertan debajo del músculo del cuello con la eliminación del aislamiento que protege el alambre en el sitio de inserción (1 mm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Efecto de GABABNST estimulación en la transición del estado en el sueño NREM y el sueño REM. (A) Espectro de potencia representativo de ondas EEG y EMG y EEG. Fotoestimulación (10 ms pulsos a 20 Hz durante 20 seg) se aplicó a ChR2-expresando neuronas GABABNST después de 40 s NREM sueño. La vigilia fue inducida rápidamente después de un 2 s. El EEG mostró baja tensión y alta frecuencia con eMG de ráfaga. El espectrograma de potencia EEG también mostró la transición de baja a alta frecuencia. (B) Excitación optogenética de neuronas GABABNST mostró una rápida transición del sueño NREM a la vigilia (superior), pero este efecto no se vio en el caso de aplicar la misma manipulación en el sueño REM (abajo). *p < 0.05, prueba tde Welch. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Aquí presentamos un método para evaluar el efecto de la estimulación optogenética de las neuronas con identidades químicas particulares en las transiciones de estado de sueño / vigilia y dio un ejemplo de manipulación de las neuronas GABABNST. Nuestros datos mostraron que la excitación optogenética de las neuronas GABABNST resulta en la transición inmediata del sueño NREM a la vigilia.
Varios diseños experimentales están disponibles debido al desarrollo de numerosos tipos de herramientas optogenéticas. Es posible activar o inhibir la actividad neuronal de neuronas particulares utilizando diferentes tipos de opsins, tales como ChR2, SSFO, halorhodopsin, ArchT, e iChloC27. ChR2 puede activar las neuronas unos milisegundos después de la fotoestimulación y esto se puede utilizar para evocar potenciales de acción de una manera de bloqueo de fase por un generador de pulsos para examinar el impacto agudo en etapas específicas del sueño. Una opsina de activación estable como la opsin a la función de paso estable (SSFO), que induce la despolarización de las neuronas durante 15 a 30 minutos después de la estimulación, también podría ser útil para algunos tipos de experimentos diseñados para observar un efecto semicrónico28. Las células despolarizadas con SSFO podrían volverse más sensibles a varias entradas neuronales fisiológicas y desactivarse aplicando luz de longitud de onda larga. Además, podemos activar axons mediante la implantación de fibras ópticas en el sitio de una proyección axonal. La estimulación de la fibra podría proporcionar información sobre la función de una vía de proyección axonal en particular.
El registro EEG/EMG durante la manipulación optogenética es un método menos invasivo para determinar las consecuencias directas de la excitación/inhibición selectiva de circuitos neuronales en estados de sueño/vigilia en ratones. Con este método, muchas poblaciones neuronales y circuitos neuronales se han demostrado para estar involucrados en la regulación de los estados de sueño / vigilia. Hacia el desarrollo posterior de esta técnica, es posible implantar múltiples fibras para manipular múltiples vías simultáneamente, o esto también podría ser utilizado en combinación con fotometoriodes de fibra o miniscopios para monitorear las actividades neuronales.
En conclusión, se prevé que la optogenética acelerará el progreso en la desvelación del misterio de la regulación del sueño por el cerebro y el desarrollo de terapias innovadoras para el insomnio refractario y otros trastornos del sueño.
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Disclosures
Este proyecto fue apoyado financieramente por Merck & Co.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por el Programa de Estudios de Investigadores de Merck (#54843), una Subvención en Ayuda para La Investigación Científica de KAKENHI sobre áreas innovadoras, "WillDynamics" (16H06401) (T.S.) y una Subvención en Ayuda de KAKENHI para Investigación Exploratoria en Áreas Innovadoras (T.S.) (18H02595).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x1 Fiber-optic Rotary Joints | Doric | FRJ 1x1 FC-FC | for optogenetics |
| 6-pin header | KEL corporation | DSP02-006-431G | |
| 6-pin socket | Hirose | 21602X3GSE | |
| A/D converter | Nippon koden | N/A | Analog to digital converter |
| AAV10-EF1a-DIO-ChR2-EYFP | 3.70×1013(genomic copies/ml) | ||
| AAV10-EF1a-DIO-EYFP | 5.82×1013(genomic copies/ml) | ||
| Ampicillin | Fuji film | 014-23302 | |
| Amplifier | Nippon koden | N/A | for EEG/EMG recording |
| Anesthetic vaporizer | Muromachi | MK-AT-210D | |
| Automatic injecter | KD scientific | 780311 | |
| Carbide cutter | Minitor | B1055 | φ0.7 mm. Reffered as dental drill, used with high speed rotary micromotor |
| Cyanoacrylate adhesion (Aron alpha A) and acceleration | Konishi | #30533 | |
| Dental curing light | 3M | Elipar S10 | |
| Epoxy adhesive | Konishi | #04888 | insulation around the solder of 6-pin and shielded cable |
| Fiber optic patch cord (branching) | Doric | BFP(#)_50/125/900-0.22 | |
| Gad67-Cre mice | provided by Dr. Kenji Sakimura | Cre recombinase gene is knocked-in in the Gad67 allele | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 65461-01 | |
| High speed rotary micromotor kit | FOREDOM | K.1070 | Used with carbide cutter |
| Interconnecting sleeve | Thorlab | ADAF1 | φ2.5 mm Ceramic |
| Isoflurane | Pfizer | 871119 | |
| Laser | Rapp OptoElectronic | N/A | 473 nm wave length |
| Laser intesity checker | COHERENT | 1098293 | |
| Laser stimulator | Bio research center | STO2 | reffered as pulse generator in text |
| Optic fiber with ferrule | Thorlab | FP200URT-CANNULA-SP-JP | |
| pAAV2-rh10 | provided by PennVector Core | ||
| pAAV-EF1a-DIO-EYFP-WPRE-HGHpA | Addgene | plasimid # 20296 | |
| pAAV-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-HGHpA | provided by Dr. Karl Deisseroth | ||
| Patch cord | Doric | D202-9089-0.4 | 0.4m length, laser conductor between laser and rotary joint |
| pHelper | Stratagene | ||
| Photocurable dental cement | 3M | 56846 | |
| Serafin clamp | Stoelting | 52120-43P | |
| Shielded cable | mogami | W2780 | Soldering to 6-pin socket for EEG/EMG recording |
| Sleep recording chamber | N/A | N/A | Custum-made (21 cm× 29 cm × 19 cm) with water tank holder |
| Sleep sign software | KISSEI COMTEC | N/A | for EEG/EMG analysis |
| Slip ring | neuroscience,inc | N/A | for EEG/EMG analysis |
| Stainless screw | Yamazaki | N/A | φ1.0 x 2.0 |
| Stainless wire | Cooner wire | AS633 | 0.0130 inch diameter |
| Stereotaxic frame with digital console | Koph | N/A | Model 940 |
| Syringe needle | Hamilton | 7803-05 | |
| Vital recorder software | KISSEI COMTEC | N/A | for EEG/EMG recording |
References
- Spoormaker, V. I., Montgomery, P. Disturbed sleep in post-traumatic stress disorder: Secondary symptom or core feature? Sleep Medicine Reviews. 12 (3), 169-184 (2008).
- Dworak, M., Wiater, A., Alfer, D., Stephan, E., Hollmann, W., Struder, H. K. Increased slow wave sleep and reduced stage 2 sleep in children depending on exercise intensity. Sleep Medicine. 9 (3), 266-272 (2008).
- Mellman, T. A. Sleep and anxiety disorders. Psychiatric Clinics of North America. 29 (4), 1047-1058 (2006).
- Scammell, T. E., Arrigoni, E., Lipton, J. O. Neural circuitry of wakefulness and sleep. Neuron. 93 (4), 747-765 (2017).
- Chemelli, R. M., et al. Narcolepsy in orexin knockout mice: Molecular genetics of sleep regulation. Cell. 98 (4), 437-451 (1999).
- Borbély, A. A., Daan, S., Wirz-Justice, A., Deboer, T. The two-process model of sleep regulation: A reappraisal. Journal of Sleep Research. 25 (2), 131-143 (2016).
- Daan, S., Beersma, D. G., Borbely, A. A. Timing of human sleep: recovery process gated by a circadian pacemaker. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 246 (2), R161-R183 (1984).
- Saper, C. B., Cano, G., Scammell, T. E. Homeostatic, circadian, and emotional regulation of sleep. Journal of Comparative Neurology. 493 (1), 92-98 (2005).
- Saper, C. B., Fuller, P. M., Pedersen, N. P., Lu, J., Scammell, T. E. Sleep state switching. Neuron. 68 (6), 1023-1042 (2010).
- LeDoux, J. E. Emotion circuits in the brain. Annual Review of Neuroscience. 23, 155-184 (2000).
- Tovote, P., Fadok, J. P., Lüthi, A. Neuronal circuits for fear and anxiety. Nature Reviews Neuroscience. 16 (6), 317-331 (2015).
- Lebow, M. A., Chen, A. Overshadowed by the amygdala: the bed nucleus of the stria terminalis emerges as key to psychiatric disorders. Molecular Psychiatry. 21 (4), 450-463 (2016).
- Wu, S., et al. Tangential migration and proliferation of intermediate progenitors of GABAergic neurons in the mouse telencephalon. Development. 138 (12), 2499-2509 (2011).
- Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nature Reviews Neuroscience. 13 (4), 251-266 (2012).
- de Lecea, L., Carter, M. E., Adamantidis, A. Shining light on wakefulness and arousal. Biological Psychiatry. 71 (12), 1046-1052 (2012).
- Carter, M. E., Brill, J., Bonnavion, P., Huguenard, J. R., Huerta, R., de Lecea, L. Mechanism for hypocretin-mediated sleep-to-wake transitions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (39), E2635-E2644 (2012).
- Weber, F., Dan, Y. Circuit-based interrogation of sleep control. Nature Publishing Group. 538, 51-59 (2016).
- Weber, F., Chung, S., Beier, K. T., Xu, M., Luo, L., Dan, Y. Control of REM sleep by ventral medulla GABAergic neurons. Nature. 526, 435-438 (2015).
- Oishi, Y., et al. Slow-wave sleep is controlled by a subset of nucleus accumbens core neurons in mice. Nature Communications. 8 (1), 1-12 (2017).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Han, X., et al. A high-light sensitivity optical neural silencer: development and application to optogenetic control of non-human primate cortex. Frontiers in Systems Neuroscience. 5, 1-8 (2011).
- Kim, C. K., Adhikari, A., Deisseroth, K. Integration of optogenetics with complementary methodologies in systems neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 18 (4), 222-235 (2017).
- Saito, Y. C., et al. GABAergic neurons in the preoptic area send direct inhibitory projections to orexin neurons. Frontiers in Neural Circuits. 7 (December), 1-3 (2013).
- Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. A FLEX switch targets Channelrhodopsin-2 to multiple cell types for imaging and long-range circuit mapping. Journal of Neuroscience. 28 (28), 7025-7030 (2008).
- Kodani, S., Soya, S., Sakurai, T. Excitation of GABAergic neurons in the bed nucleus of the stria terminalis triggers immediate transition from non-rapid eye movement sleep to wakefulness in mice. Journal of Neuroscience. 37, 7174-7176 (2017).
- Lin, F., Pichard, J. Handbook of practical immunohistochemistry: frequently asked questions. , Springer. (2011).
- Wiegert, J. S., Mahn, M., Prigge, M., Printz, Y., Yizhar, O. Silencing neurons: tools, applications, and experimental constraints. Neuron. 95 (3), 504-529 (2017).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Prigge, M., Schneider, F., Davidson, T. J., O’Shea, D. J., Sohal, V. S., Goshen, I., Finkelstein, J., Paz, J. T., Stehfest, K., Fudim, R., Ramakrishnan, C., Huguenard, J. R., Hegemann, P., Deisseroth, K. Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction. Nature. 40 (6), 1301-1315 (2012).
