Summary
Presenteren we een protocol om te evalueren van de expressie niveaus van circulerende microRNA (miRNAs) in plasma monsters van kankerpatiënten. In het bijzonder, hebben we gebruikt een verkrijgbare kit voor circulerende miRNA extractie en omgekeerde transcriptie. Ten slotte, geanalyseerd wij een panel van 24 geselecteerde miRNAs met behulp van real-time vooraf gevlekte sonde aangepaste platen.
Abstract
Er is steeds meer belangstelling in vloeibare biopsie voor kanker-diagnose, prognose en therapeutische monitoring, de behoefte aan betrouwbare en nuttige biomarkers voor de klinische praktijk te maken. Hier presenteren we een protocol wilt ophalen, omgekeerde transcriberen en evalueren van de expressie niveaus van circulerende miRNAs uit plasma monsters van patiënten met een colorectaal carcinoom (CRC). microRNAs (miRNAs) vormen een klasse van niet-coderende RNAs van 18-25 nucleotiden in lengte die de uitdrukking van de doelgenen translationeel niveau regelen en spelen een belangrijke rol, met inbegrip van de pro - en anti-angiogenic functie, in de fysiopathologie van verschillende organen. miRNAs zijn stabiel in biologische vloeistoffen zoals serum en plasma, waardoor ze ideale circulerende biomarkers voor kanker-diagnose, prognose en behandeling besluitvorming en controle. MiRNA extractie circulerende werd uitgevoerd met behulp van een snelle en effectieve methode, waarbij zowel organische als kolom gebaseerde methoden. Voor miRNA retrotranscription gebruikten we een scriptingregel procedure dat polyadenylatie op 3' en de afbinding van een adapter op 5' van de volwassen miRNAs acht, gevolgd door willekeurige miRNA pre versterking. Wij een 24-miRNA aangepaste panel te worden getest door kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie (qRT-PCR) geselecteerd en de miRNA sondes gespot op matrix aangepaste platen. Wij uitgevoerd qRT-PCR plaat draait op een real-time PCR-systeem. Huishouden miRNAs voor normalisatie zijn gekozen aan de hand van de GeNorm software (v. 3.2). Gegevens zijn geanalyseerd met behulp van de software van de suite van de expressie (v 1.1) en statistische analyses werden uitgevoerd. De methode bleek te zijn betrouwbaar en technisch robuust en nuttig kan zijn voor het evalueren van biomerker niveaus in vloeibare monsters zoals plasma en/of serum.
Introduction
CRC vertegenwoordigt de derde meest voorkomende gediagnosticeerd maligniteit en de vierde oorzaak van kanker sterfgevallen wereldwijd. Tot op heden zijn voor bevacizumab (B), een monoclonal antilichaam gericht tegen de vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF), en cetuximab (C) of panitumumab (P), monoklonale antilichamen gericht tegen epidermale groeifactor receptor (EGFR), goedgekeurd eerstelijns behandeling in combinatie met chemotherapie (CT) regimes.
Mutaties in de genen van K-RAS en N-RAS zijn de enige klinisch nuttig biomarkers staat van identificatie van de patiënten die zijn minste kans om te profiteren van de anti-EGFR-gebaseerde CT. Hoewel verschillende onderzoeken zijn uitgevoerd om te zoeken naar biomarkers die voorspellende van reactie op B gebaseerde CT zijn, is er nog steeds een aanzienlijk gebrek aan betrouwbare en effectieve geneesmiddelen voor gebruik in de klinische praktijk1.
miRNAs zijn kleine RNAs (18-25 nucleotiden in de lengte) dat de vertaling van de doelgenen reguleren en een cruciale rol in tal van pathofysiologische processen, met inbegrip van de embryogenese en carcinogenese. Deze moleculen zijn zeer stabiel in biologische vloeistoffen zoals plasma/serum, urine en sputum, waardoor ze robuuste biomarkers voor niet-invasieve bemonstering2te gebruiken. Met behulp van een panel van miRNAs die betrokken zijn bij het angiogenic traject, wij gericht vast te stellen nieuwe circulerende biomarkers staat het voorspellen van klinische resultaten bij patiënten met metastatische CRC (mCRC) behandeld met B gebaseerde CT.
We analyseren van een reeks van 52 mCRC patiënten behandeld met B gebaseerde CT binnen de toekomstige multicentrische gerandomiseerde fase III trial "Italiaanse Trial in geavanceerde colorectaal carcinoom" (ITACa). Dit protocol is goedgekeurd door de lokale ethische Commissie (Comitato Etico gebied Vasta e Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (eerste) IRCCS, no. 674) op 19th September 2007. Alle patiënten gaf geïnformeerde toestemming voordat bloed monster collectie. Voor elke patiënt, werden veneuze bloedmonsters verzameld vóór de behandeling en bij de eerste klinische evaluatie (na 8 weken) om basislijn miRNA expressie en haar modulatie tijdens behandeling met betrekking tot de patiënt resultaten te evalueren.
Via een zoekopdracht van de literatuur, die we geselecteerd 21 miRNAs gecorreleerd met het angiogenic-proces waarvan bekend is dat aantoonbaar in menselijk plasma: heeft-miR-107, heeft-miR-126-3 p heeft-miR-145-5 p, heeft-miR-194-5 p, heeft-miR-199a - 5p, heeft-miR-200b - 3p, heeft-miR-20b - 5p , heeft-miR-21-5 p, heeft-miR-210-3 p, heeft-miR-221-3 p, heeft-miR-24-3 p, heeft-miR-27a - 3p, heeft-miR - 29 ter - 3p, heeft-miR-335-5 p, heeft-miR-424-5 p, heeft-miR-497-5 p, heeft-miR - 520d - 3p, heeft-miR-92a - 3p, heeft-miR-17-5-p en heeft-miR-155-5 p. Wij ook geselecteerd heeft-miR-223-3 p en heeft-mir-484 endogene normalisatie3,,4,,5,6, en cel-miR-39 gezuiverd van C. elegans als een piek voor exogene normalisatie. Alle gegevens belangrijk waren uitgevoerd met behulp van de methode van de ̄(ΔΔCt) 2 ̂.
De detectie van circulerende miRNAs presenteert enkele technische problemen omdat de moleculen aanwezig op een zeer laag niveau in plasma zijn en hun versterking chemisch uitdagende gezien hun korte opeenvolging is. Wij hebben gekozen om deze redenen een procedure dat zowel organische extractie met fenol en een glasvezel kolom gebaseerde methodiek acht. Circulerend miRNA extractie is een hot topic op het gebied van vloeibare biopsie, en we kozen een commerciële kit die heeft aangetoond dat een van de meest betrouwbare in termen van hoeveelheid en de kwaliteit van de herstelde opbrengsten7,8. We kozen een protocol om te keren het transcriberen van miRNAs door de toevoeging van een adapter op 5' en een poly(A) staart naar 3' van de volwassen miRNA ter verbetering van de selectiviteit en de specificiteit van de reactie.
Gezien de robuustheid van de methode, wij ontwierp aangepaste borden met vooraf gevlekte sondes voor RT-PCR te beoordelen van elk monster in tweevoud en geanalyseerd 2 patiënten binnen elke plaat, zoals afgebeeld in figuur 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: Alle van de volgende stappen uit onder een gesteriliseerde zuurkast volgens goede laboratorium praktijk (GLP) uitvoeren.
1. plasma inzameling en opslag
- Verzamelen van 3 mL van perifeer bloedmonster in de buis van een K3E EDTA.
- Centrifugeer de buis bij kamertemperatuur bij 1,880 x g gedurende 15 minuten.
- Het supernatant plasma in porties van 450 µL herstellen.
- De monsters bij-80 ° C bewaren tot gebruik.
Opmerking: Proces de perifeer bloed buis binnen 2 uur van collectie. Wanneer het herstellen van het plasma van de buis, de lymfocyt laag niet storen.
2. extractie van circulerende miRNAs uit Plasma monsters (tabel of Materials)
-
Alle vereiste oplossingen voor te bereiden en ontdooien van de monsters voor de extractie stappen.
- 375 µL van 2-mercaptoethanol toevoegen aan de 2 x denaturating-oplossing en meng goed.
- Voeg 21 mL ACS grade 100% ethanol tot de miRNA wassen oplossing ik toe en meng goed.
- Voeg 40 mL ACS grade 100% ethanol tot de wash oplossing 2/3 en meng goed.
- Toestaan dat een plasma aliquoot ontdooien bij kamertemperatuur en dan beginnen de extractie stappen.
-
Biologische extractie
- Pipetteer 400 µL van het plasma monster in een tube 2 mL RNase-vrij.
- Voeg 400 µL van 2 x denaturating oplossing, Meng door vortexing en kort centrifugeren.
- Voeg 4 µL van 1 nM spike, Meng door vortexing en kort centrifugeren.
- Voeg 800 µL van zure fenol-chloroform.
- Vortex voor 60 s en centrifuge op maximale snelheid (≥10, 000 x g) gedurende 15 minuten.
- De bovenste waterfase overbrengen in een verse buis. De interfase niet storen. Opmerking het volume herstelde zich en negeren de buis met de niet-acqueous fase.
Opmerking: De 2 x denaturering oplossing wordt opgeslagen bij 4 ° C en bij deze temperatuur kan stollen. Vóór gebruik, warme de oplossing tot 37 ° C, af en toe voor 10-15 min. schudden voorzichtig te trekken van de fase van de bodem met de zure fenol-chloroform, niet in het geval van de acqueous-buffer die op de top van het mengsel ligt. Verwarm de oplossing van de elutie of nuclease-gratis water tot 95 ° C. Wees voorzichtig om te verwarmen van een voldoende hoeveelheid oplossing (100 µL per monster + 10% teveel).
-
Kleine RNA verrijking
- 1/3 hoeveelheid ethanol 100% toevoegen aan de waterige fase vanaf stap 2.2.6 en meng.
- Plaats een filterelement in de buis van een frisse collectie voor elk monster.
- Overdracht van maximaal 700 µL van lysate van stap 2.3.1 en ethanol in de filter cartridge en centrifugeer bij 10.000 x g gedurende 30 s.
- Als er > 700 µL van het mengsel links, plaatst u het filtraat in een verse buis en herhaalt u stap 2.3.3; Herhaal totdat alle het mengsel door de filter cartridge is verstreken.
- Meten van het totale volume van de doorstroming.
- Voeg 2/3 hoeveelheid ethanol 100% filtraat en meng.
- Plaats een tweede filter cartridge in een frisse collectie buis.
- Breng maximaal 700 µL van monstervolume in de cartridge samen en centrifugeer bij 10.000 x g voor 30 s. negeren de doorstroming.
- Herhaal stap 2.3.8 totdat alle het mengsel door de filter cartridge is verstreken.
- 700 µL van miRNA wassen oplossing 1 van toepassing op het filterelement en Centrifugeer het filterpatroon met de collectie buis 10.000 x g gedurende 15 s. negeren de doorstroming. Plaats de cartridge filter in de dezelfde collectie buis.
- Breng 500 µL wassen oplossing 2/3 voor het filterelement en centrifuge het filterpatroon met de collectie buis 10.000 x g voor 15 s. negeren de doorstroming. Plaats de cartridge filter in een frisse collectie buis.
- Plaats de cartridge filter in een frisse collectie buis en herhaalt u stap 2.3.11 met 500 µL van wassen oplossing 2/3. Negeren de doorstroming en de filterpatroon overbrengen in een frisse collectie buis.
- Centrifugeer de buizen met de filterpatronen bij 10.000 x g gedurende 1 minuut.
- Breng het filterelement in een tube van de collectie verse 1,5 mL en voeg 100 µL voorverwarmde (95 ° C) elutie oplossing of nuclease-gratis water.
- Centrifugeer bij 10.000 x g gedurende 30 s miRNAs herstellen en opslaan bij-80 ° C.
Opmerking: Een witte neerslag kan vormen in de wash oplossing 2/3. Dit is teveel EDTA vrijgelaten uit de oplossing. Vermijd deze kristallen opstellen tijdens de pipetting stappen.
3. uitvoeren van de omgekeerde transcriptie en miRNA pre versterking (tabel of Materials)
-
Uitvoeren van polyadenylatie reactie
- Ontdooi alle reagentia op het ijs, dan kort vortex en centrifuge te draaien naar de inhoud beneden. Bovendien, PEG dooi 50% 8000, zodat het bereiken van de kamertemperatuur.
- De mix van de reactie in een centrifugebuis 0,5 mL, verkrijgen een eindvolume van 3 µL van reactie cocktail voor elk monster voor te bereiden. Gebruik de volgende hoeveelheden, plus 10% extra volume voor elke reagens.
- Toevoegen van 1.7 µL van RNase-gratis water, 0,5 µL van 10 x Poly(A) buffer, 0,5 µL van 10 mM ATP en ten slotte 0,3 µL 5 U/µL PolyA enzym.
- Kort vortex en centrifuge de cocktail mix te draaien naar beneden van de inhoud.
- Breng 2 µL van het monster aan elk putje van de plaat van de reactie of de reactiebuis en voeg 3 µL van de reactie cocktail. Kort vortex en centrifuge te draaien naar beneden van de inhoud.
- Plaats de plaat/buizen in een thermische cycler en voer de volgende stappen uit.
- Incubeer bij 37 ° C gedurende 45 minuten (polyadenylatie stap).
- Incubeer bij 65 ° C gedurende 10 minuten (halte reactie), met een volgende houden bij 4 ° C.
-
De afbinding reactie uit te voeren.
- De mix van de reactie in een centrifugebuis met de volgende volumes voorbereiden op elke steekproef en 10% voor volume in overmaat.
- Voeg 0.4 µL van RNase-gratis water, 3 µL van 5 x DNA ligase buffer, 0.6 µL van 25 x afbinding adapter, 4.5 µL van 50% PEG 8000, en ten slotte 1.5 µL van RNA ligase.
- Kort vortex en centrifuge de cocktail mix te draaien naar beneden van de inhoud.
- 10 µL van het mengsel toevoegen aan elke goed/reactiebuis die het poly(A) tailing product bevatten. Meng door een plaat shaker van 1.900 toeren per minuut voor 1 min of kort vortexing en spin down de inhoud.
- Plaats de plaat/reactie buizen in een thermische cycler met de volgende instellingen: incubatie bij 60 ° C gedurende 60 minuten, met een volgende houden bij 4 ° C.
Opmerking: 50% PEG 8000 is zeer viskeuze. Gebruiken bij kamertemperatuur, zuigen en verstrekking langzaam. Na elke aspiratie en verstrekking stap, houd de plugger voor 10 s om het reagens te stromen op en neer.
-
Het uitvoeren van de omgekeerde transcriptie reactie.
- De mix van de reactie in een centrifugebuis, met de volgende hoeveelheden voor elk monster en 10% voor volume in overmaat voor te bereiden.
- Voeg 3.3 µL van RNase-gratis water, 6 µL van 5 x RT buffer, 1.2 µL van dNTP mix (elke 25 mM), 1.5 µL van 20 x universele RT inleidingen, en ten slotte 3 µL van 10 x RT enzym mix.
- Kort vortex en centrifuge de cocktail mix te draaien naar beneden van de inhoud.
- 15 µL van het mengsel toevoegen aan elke goed/reactiebuis die het afbinding product bevatten. Meng door een plaat shaker van 1.900 toeren per minuut voor 1 min of kort vortexing en spin down de inhoud.
- Plaats de plaat/reactie buizen in een thermische cycler met de volgende instellingen.
- Incubeer bij 42 ° C gedurende 15 minuten (reverse transcriptie).
- Incubeer bij 85 ° C gedurende 5 minuten (stop reactie), met een volgende houden bij 4 ° C.
Opmerking: De RT-product kan nu worden opgeslagen bij-20 ° C en maximaal 2 maanden stabiel zullen blijven.
-
Het uitvoeren van de miR-Amp reactie (tabel of Materials).
- De mix van de reactie in een centrifugebuis met de volgende volumes voorbereiden op elke steekproef en 10% voor volume in overmaat.
- 17.5 µL van RNase-gratis water, 25 µL van de 2 x miR-Amp master mix en 2.5 µL van 20 x miR-Amp primer mix toevoegen.
- Kort vortex en centrifuge de cocktail mix te draaien naar beneden van de inhoud.
- Voor elk monster, breng 45 µL van de reactie mix aan elk putje van een nieuwe reactie plaat of een reactiebuis. 5 µL van het RT product aan elke buis goed of reactie toevoegen. Meng door een plaat shaker van 1.900 toeren per minuut voor 1 min of kort vortexing en spin down de inhoud.
- Plaats de plaat/reactie buizen in een thermische cycler en run zoals aangegeven in tabel 1.
4. het uitvoeren van PCR in real time
- Verdun elk cDNA monster 1:10 in 0.1 x TE buffer.
- Bereken het aantal putten/replicatieonderzoeken voor elk monster. De mix van de reactie in een centrifugebuis met de volgende volumes voorbereiden op elk monster, 10% van het volume in overmaat toe te voegen.
- 4 µL van RNase-gratis water, 10 µL van 2 x snel geavanceerde master mix (Tabel van materialen) en ten slotte 5 µL van verdunde cDNA toevoegen.
- Mix van vortexing en kort centrifugeren om te draaien naar beneden van de inhoud.
- Breng 19 µL van reactie mix te elk Nou, afdichting van de plaat en kort centrifugeren.
- Het thermische protocol (tabel 2) op een RT-PCR-systeem uitvoeren
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We een panel van angiogenese-gerelateerde circulerende miRNAs in verband met de progressie-vrije overleving (PFS) geanalyseerd, totale overleving (OS) en objectieve reactie (ORR) stem in een 52 mCRC patiënten behandeld met B gebaseerde CT. De evaluatie van dergelijke biomarkers in plasma monsters is uitdagend vanwege technische problemen. We gebruikten gevestigde methodes voor miRNA extractie van patiënt plasma monsters, omgekeerde transcriptie en pre versterking. Na instructies van de fabrikant en met slechts een paar wijzigingen vereist, met name in de extractie stappen we geëvalueerd met succes alle onze doelen in de populatie (figuur 2).
In het bijzonder, geanalyseerd wij 2 plasma monsters/patiënt, correleren basislijn en therapie gemodificeerde miRNA expressie met patiënten uitkomst.
Wij uitgevoerd seriële verdunningen van cel-miR-39 op 0.05 nM 0.5 nM, 5nM en 5 pM in 800 µL van plasma monster (400 µL van plasma plus 400 µL van 2 x denaturating-oplossing) om te bepalen van de piek-in concentratie te gebruiken. Zoals blijkt uit figuur 4, toonde de exogene controle drempel cyclus (Ct)-waarden die congruent met de seriële verdunningen werden, met vermelding van de robuustheid van het gehele protocol (dat wil zeggen, extractie, omgekeerde transcriptie en evaluatie van de qRT-PCR). Bovendien, deze seriële verdunningen ons in staat gesteld om te selecteren van de spike-in concentratie die niet met de omgekeerde-transcriptie van alle doel miRNAs interfereren zou.
Deze methode konden we basislijn miRNAs correleren met klinische pathologische kenmerken. In het bijzonder, vonden we dat heeft-miR-199a - 5p, heeft-miR-335-5 p en heeft-miR - 520d - 3p waren aanzienlijk upregulated in linkerpagina met betrekking tot de rechterpagina laesies (p = 0,03, p = 0.006 en p = 0,008, respectievelijk). Daarentegen heeft-miR-21-5-p was aanzienlijk werden in RAS-gemuteerd patiënten (K-RAS, p = 0,01 en N-RAS, p = 0,008), terwijl heeft-miR-221-3 p upregulated was (p = 0,05, p = 0,01, K - en N-RAS, respectievelijk).
Vergelijken van de niveaus van de expressie van miRNA tussen de basislijn en de eerste klinische evaluatie, we hebben vastgesteld dat een verhoging heeft-miR-155-5 p expressie niveaus werd geassocieerd met kortere PFS (p = 0,04) en OS (p = 0,02). In het bijzonder bij patiënten met een ≥30% stijging heeft-miR-155-5 p, PFS was 9,5 maanden (95% CI, 6,8-18,7) en OS was 15.9 maanden (95% CI, 8.4-niet bereikt) t.o.v. 22.3 (95% CI, 10.2-25,5) en 42.9 maanden (95% CI, 24,8-niet bereikt) voor mensen met een < 30% toename (Zie figuur 3). De mediane waarde van variatie in de zaak-serie (30%) Als de afrekening was ingesteld. Circulerende basale niveaus van miRNAs waren dichotomized in "hoog" of "laag" volgens mediane waarden9.
Figuur 1: ontwerp van aangepaste plaat indeling. Sondes waren vooraf gevlekte in elk putje. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: voorbeelden van qRT-PCR versterking percelen. (A) versterking uitzetten van een aangepaste plaat van één qRT-PCR. Alle markeertekens waren beoordeelbare in beide monsters enkele plaat. (B) qRT-PCR van heeft-miR-17-5-p in het algemene geval serie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: experimentele en klinische resultaten ten opzichte van heeft-miR-155-5 p. (A) Ct waarden voor heeft-miR-155-5 p. De plot van de amplificatie van heeft-miR-155-5 p in het algemene geval serie. (B) PFS en OS van patiënten met een ≥30% of < 30% toename van de circulerende heeft-miR-155-5 p. PFS werd berekend door de tijd vanaf de datum van randomisatie om de datum van het eerste gedocumenteerd bewijs van progressie van de tumor, laatste tumor beoordeling of dood bij gebrek aan progressie van de ziekte. OS werd berekend door de tijd vanaf de datum van randomisatie om de datum van overlijden van de oorzaak en de eventuele follow-up van de laatste. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: experimentele resultaten forcel-miR-39 seriële verdunning. (A) qRT-PCR voor seriële verdunningen van cel-miR-39, met Cts. relatieve (B) verdunningen werden uitgevoerd op 5 nM 0.5 nM, 0.05 nM en 5 pM in plasma monsters uit de dezelfde patiënt. Dergelijke assay lineariteit ons in staat gesteld om te selecteren van de beste concentratie te gebruiken in het algemene geval serie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Stap | Temperatuur | Duur | Cycli |
| Enzymactivering | 95 ° C | 5 min | 1 |
| Denatureren | 95 ° C | 3 s | 14 |
| Anneal/verlengen | 60 ° C | 30 s | |
| Stop reactie | 99 ° C | 10 min | 1 |
| Houd | 4 ° C | Houd | ∞ |
Tabel 1: Thermische protocol van mir-AMP reactie.
| Stap | Temperatuur | Duur | Cycli |
| Enzymactivering | 95 ° C | 20 s | 1 |
| Denatureren | 95 ° C | 3 s | 40 |
| Anneal/verlengen | 60 ° C | 30 s | |
| Houd | 4 ° C | Houd | ∞ |
Tabel 2: Thermische protocol van qRT-PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
miRNAs zijn kleine niet-coderende RNAs (18-25 nucleotiden in lengte) staat de 3' UTR regio van hun doel messenger RNA bindend en remmen en/of vernederende het. Zij kunnen dus gen expressie regelgevers op translationeel niveau worden beschouwd. In het laatste decennium, hebben verschillende miRNAs zijn gecorreleerd met kanker inleiding en ontwikkeling, waardoor ze nuttig klinische biomarkers voor diagnose, prognose en therapie. Beschermd door RNases, zijn miRNAs aanwezig in een stabiele vorm in biologische vloeistoffen zoals bloed, plasma, serum, urine en speeksel, die heeft geleid tot een groeiende interesse in het mogelijke nut ervan in de klinische praktijk10.
Ondanks dit, de evaluatie van de circulerende miRNAs is een uitdagende taak en moeilijkheden met betrekking tot sample collectie, doel extractie, platform keuze en wereldwijde normalisatie zijn veelbesproken onderwerpen binnen de wetenschappelijke gemeenschap.
Voor samples en opslag, zijn vooraf analytische variabelen nauw verbonden met plasma behandeling en verwerking. We gericht op plasma in plaats van serum monsters, gezien het feit dat er voldoende bewijs van de hogere miRNA concentraties in het laatste, eventueel door de vrijval van deze moleculen tijdens de bloedstolling proces10,11,12 . We gecentrifugeerd om de kwestie van de introductie van cellulaire nucleic zuren die voortvloeien uit de lysis van de cel van het bloed, de monsters binnen 2 uur van bloed collectie. Ook gebruikten we K3E EDTA buizen, omdat andere anti-stollingsmiddelen is bekend dat ze interfereren met versterking stappen (dat wil zeggen, heparine) en hemolyse (bijvoorbeeld citraat) kunnen veroorzaken. Zoals is het essentieel om te voorkomen dat besmetting van bloedplaatjes en lymfocyt in de vooraf analytische fase, de plasma heel langzaam uit de buis verwijderd en wij niet de laatst ~ 50 µL van het monster uit de buis heeft gecombineerd.
Verschillende studies hebben aangetoond de superioriteit van kolom gebaseerde extractiemethoden over guanidine/fenol/chloroform gebaseerde protocollen11,13, maar Khoury et al. geïsoleerd effectief goede kwaliteit kleine RNAs van serum gebruik van deze reagentia zonder besmetting14. De commerciële kit we opeenvolgend gebruikten voert beide extractiemethoden, geschikt miRNA opbrengsten in termen van spike-in concentraties het toelaat. Wij alleen uitgevoerd één wijziging ten opzichte van de instructies van de fabrikant, dat wil zeggen, frisse collectie buizen altijd gewend waren na elke filter cartridge wassen stap elimineren/verminderen het risico van besmetting van het reagens. Om te identificeren van de beste spike-in concentratie in onze voorbeelden en dus te vermijden interferentie met latere reacties, we voor het eerst uitgevoerd het gehele protocol zonder toevoeging van de cel-miR-39 tijdens de extractie stap om te evalueren van de mediane expressie niveaus van onze doelstellingen. Wij vervolgens uitgevoerd DOVO miRNA extractie uit plasma monsters van de dezelfde patiënt met behulp van een seriële verdunning van cel-miR-39 te identificeren van de beste concentratie toe te voegen aan de plasma monsters van onze zaak serie (Figuur 4). Men moet echter wel onderstreepte dat de optimale concentratie van cel-miR-39, geïdentificeerd voor slechts één monster niet noodzakelijkerwijs de beste concentratie voor de algemene zaak serie vanwege een aantal interne variabelen zoals leeftijd, geslacht of leven gewoonten zijn, die absolute miRNA expressie in bloed kan beïnvloeden.
miRNA omgekeerde transcriptie en versterking vertegenwoordigen 2 kritische stappen. Van de twee belangrijkste technieken voor de detectie van de miRNA (dwz., qRT-PCR en microarray), kozen we qRT-PCR gezien de hoge gevoeligheid en onze noodzaak om alleen een geselecteerde paneel van miRNAs (een belangrijke beperking van deze methode is de lage doorvoersnelheid)15. We gebruikten reverse transcriptie chemie op basis van 3' polyA tailing en 5' afbinding adapter sequenties uit te breiden van de volwassen miRNA en toestaan gloeien universele RT inleidingen. Op basis van enkelvoudige basenpaar erkenning, kan de 5' afbinding adapter bijdragen aan het voorkomen van gemeenschappelijke vooroordelen zoals die met betrekking tot 5' wanverhouding. Deze kit bevat ook een versterking van de pre-stap die nodig is voor lage opbrengst monsters, zoals plasma. Hoewel noodzakelijk, kan deze stap sommige vooroordelen versterking voor de detectie stap invoeren.
In dit protocol geanalyseerd wij een panel van 24 geselecteerde miRNAs gecorreleerd met angiogenese. In het bijzonder, we koos vooraf gevlekte sonde aangepaste platen en volgde de instructies van de fabrikant van de qRT-PCR-runs. De belangrijkste kwesties met betrekking tot de miRNA qRT-PCR zijn de keuze van referentie genen en hun latere data analyse normalisatie.
Hoewel tal van studies hebben gevoerd om te identificeren van de beste miRNA te gebruiken voor normalisatie, heeft geen uniforme consensus is bereikt. Om deze beperking, voerden we een literatuurstudie te identificeren van de circulerende miRNAs die kunnen worden gebruikt als verwijzing genen in onze zaak serie.
Wij ook geselecteerd van de 4 miRNAs met sterk bewijs van stabiele meningsuiting in plasma monsters van mCRC patiënten en ze getest in een kleiner deel van onze case-serie. De 2 meest stabiele miRNAs werden geïdentificeerd door GeNorm analyse referentienummers huishouding genen.
Kortom, heeft de evaluatie van de circulerende miRNAs in monsters van perifeer bloed een aantal bekende problemen. Wij vinden echter dat de methoden die we gebruikten zijn betrouwbaar en robuust, waardoor voor een diepgaande en nauwkeurige studie van deze biomarkers die het potentieel hebben om het scenario van de behandeling voor colorectal kanker wijzigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen conflicten van belang om te vermelden.
Acknowledgments
Deze studie werd gedeeltelijk gefinancierd door Roche S.p.A. en de Italiaanse geneesmiddelen Agentschap (AIFA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rnase-free Safe-lock 1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030 123.328 | |
| Rnase-free Safe-lock 2 mL tubes | Eppendorf | 0030 123.344 | |
| Rnase-free 20 µL tips | Starlab | S1123-1810 | |
| Rnase-free 200 µL tips | Starlab | S1120-8810 | |
| Rnase-free 1,000 µL tips | Starlab | S1122-1830 | |
| mirVana PARIS RNA and Native Protein Purification Kit | Thermo Fisher | AM1556 | |
| TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher | A28007 | |
| 100% ethanol anidrous ACS grade | Carlo Erba Reagents | 414605 | |
| 2-mercapto-ethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher | 4444558 | |
| TaqMan Advanced miRNA Assays | Thermo Fisher | A25576 | |
| 7500 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4406984 | |
| 0.2-2, 1-10, 2-20, 20-200, 100-1,000 µL laboratory pipettes | |||
| Benchtop microcentrifuge | |||
| Vortex | |||
| Benchtop heating block | |||
| Fume hood | |||
| 0.2 mL PCR tubes |
References
- Luo, H. -Y., Xu, R. -H. Predictive and prognostic biomarkers with therapeutic targets in advanced colorectal cancer. World journal of gastroenterology. 20 (14), 3858-3874 (2014).
- Toiyama, Y., Okugawa, Y., Fleshman, J., Richard, C., Goel, A. MicroRNAs as potential liquid biopsy biomarkers in colorectal Cancer: A systematic review. BBA Reviews on Cancer. 5 (6), (2018).
- Kok, M. G. M., Halliani, A., Moerland, P. D., Meijers, J. C. M., Creemers, E. E., Pinto-Sietsma, S. J. Normalization panels for the reliable quantification of circulating microRNAs by RT-qPCR. FASEB Journal. 29 (9), 3853-3862 (2015).
- Marabita, F., De Candia, P., Torri, A., Tegnér, J., Abrignani, S., Rossi, R. L. Normalization of circulating microRNA expression data obtained by quantitative real-time RT-PCR. Briefings in Bioinformatics. 17 (2), 204-212 (2016).
- Danese, E., et al. Reference miRNAs for colorectal cancer: Analysis and verification of current data. Scientific Reports. 7 (1), 1-12 (2017).
- Zheng, G., et al. Identification and validation of reference genes for qPCR detection of serum microRNAs in colorectal adenocarcinoma patients. PLoS ONE. 8 (12), 1-10 (2013).
- Lv, W., et al. Optimization of the Original TRIzol-Based Technique Improves the Extraction of Circulating MicroRNA from Serum Samples. Clinical laboratory. 61 (12), 1953-1960 (2015).
- Tan, G. W., Khoo, A. S. B., Tan, L. P. Evaluation of extraction kits and RT-qPCR systems adapted to high-throughput platform for circulating miRNAs. Scientific reports. 5, 9430 (2015).
- Altman, D. G., McShane, L. M., Sauerbrei, W., Taube, S. E. Reporting Recommendations for Tumor Marker Prognostic Studies (REMARK): explanation and elaboration. PLoS medicine. 9 (5), (2012).
- Tiberio, P., Callari, M., Angeloni, V., Daidone, M. G., Appierto, V. Challenges in using circulating miRNAs as cancer biomarkers. BioMed Research International. 2015, (2015).
- Kroh, E. M., Parkin, R. K., Mitchell, P. S., Tewari, M. Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR). Methods (San Diego, Calif). 50 (4), 298-301 (2010).
- Cheng, H. H., et al. Plasma Processing Conditions Substantially Influence Circulating microRNA Biomarker Levels. PLoS ONE. 8 (6), 1-11 (2013).
- Moret, I., et al. Assessing an improved protocol for plasma microRNA extraction. PloS one. 8 (12), (2013).
- Khoury, S., Ajuyah, P., Tran, N. Isolation of small noncoding RNAs from human serum). Journal of visualized experiments JoVE. (88), e51443 (2014).
- Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer. Nature Reviews Clinical Oncology. 11 (3), 145-156 (2014).
