Summary
Vi presenterar ett protokoll för att utvärdera uttrycksnivåerna av cirkulerande mikroRNA (Mirna) i plasmaprover från cancerpatienter. I synnerhet använde vi ett kommersiellt tillgängliga kit för cirkulerande miRNA utvinning och omvänd transkription. Slutligen, analyserade vi en panel med 24 utvalda microRNA använder realtid pre fläckig sonden anpassade plattor.
Abstract
Det ökar intresset för flytande biopsi för diagnos, prognos och terapeutisk övervakning, skapar behovet av tillförlitliga och användbara biomarkörer för klinisk praxis. Här presenterar vi ett protokoll extrakt, omvänd transkribera och utvärdera uttrycksnivåerna av cirkulerande microRNA från plasmaprover av patienter med kolorektal cancer (CRC). mikroRNA (Mirna) är en klass av icke-kodande RNAs 18-25 nukleotider i längd som reglerar uttrycket av målgener på translationell nivå och spela en viktig roll, bland annat av pro - och anti-angiogena funktion, i Fysiopatologi av olika organ. microRNA är stabila i biologiska vätskor såsom serum och plasma, vilket gör dem idealiska cirkulerande biomarkörer för cancer diagnos, prognos och behandling beslutsfattande och övervakning. Cirkulerande miRNA extraktionen utfördes med hjälp av en snabb och effektiv metod som innefattar både ekologisk och kolumn-baserade metoder. För miRNA retrotranscription använde vi en multi-steg-procedur som anser polyadenylation på 3' och ligering av en adapter på 5' av den mogna microRNA, följt av slumpmässiga miRNA före förstärkning. Vi valde en 24-miRNA anpassad panel ska testas av kvantitativ realtids polymeras-kedjereaktion (qRT-PCR) och fläckig miRNA sonderna på array anpassade plattor. Vi genomförde qRT-PCR plate körs på en realtids PCR-System. Städning microRNA för normalisering valdes använder GeNorm programvara (v. 3.2). Data analyserades med hjälp av uttrycket suite-programvara (v 1.1) och statistiska analyser utfördes. Metoden visade sig vara tillförlitliga och tekniskt robust och kan vara användbart att utvärdera biomarkör nivåer i flytande prov såsom plasma eller serum.
Introduction
CRC representerar tredje vanligaste diagnosen malignitet och den fjärde orsaken till cancerrelaterad död i världen. Hittills har har bevacizumab (B), en monoklonal antikropp riktad mot vascular-endotel tillväxtfaktor (VEGF), och (C) cetuximab eller panitumumab (P), monoklonala antikroppar riktade mot epidermal tillväxtfaktor (EGFR), godkänts för första linjens behandling i kombination med kemoterapi (CT) regimer.
Mutationer i K-RAS - och N-RAS gener är de enda kliniskt användbara biomarkörer kan identifiera patienter som är minst benägna att dra nytta av anti-EGFR-baserade CT. Även om flera studier har genomförts för att söka efter biomarkörer som är prediktiva för svar till B-baserade CT, finns det fortfarande en betydande brist på tillförlitliga och effektiva läkemedel för användning i klinisk praxis1.
microRNA är små RNAs (18-25 nukleotider i längd) som reglerar översättningen av målgener och spelar en avgörande roll i många physiopathological processer, inklusive embryogenes och karcinogenicitet. Dessa molekyler är mycket stabil i biologiska vätskor såsom plasma/serum, urin och slem, som gör dem robusta biomarkörer för att använda för icke-invasiv provtagning2. Med hjälp av en panel av microRNA involverade i angiogena väg, vi syftade till att identifiera nya cirkulerande biomarkörer kan förutsäga kliniskt utfall hos patienter med metastatisk CRC (mCRC) behandlas med en B-baserad CT regim.
Vi analyserade en rad 52 mCRC-patienter som behandlas med B-baserade CT inom den prospektiv multicenter randomiserad fas III-prövning ”italienska rättegång i avancerad kolorektalcancer” (ITACa). Detta protokoll godkändes av den lokala etiska kommittén (Comitato Etico området Vasta e Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, nr 674) på 19: e September 2007. Alla patienter gav informerat samtycke innan blod provsamling. För varje patient, venöst blodprover samlades in före behandling och vid den första kliniska utvärderingen (efter 8 veckor) för att utvärdera baslinjen miRNA uttryck och dess modulering under behandling i förhållande till patientens resultatet.
Genom att söka på litteraturen, vi valt 21 microRNA korrelerade med angiogena processen som är kända för att kunna upptäckas i human plasma: har-miR-107, har-miR-126-3 p, har-miR-145-5 p, har-miR-194-5 p, har-miR-199a - 5p, har-miR-200b - 3p, har-miR-20b - 5p , har-miR-21-5 p, har-miR-210-3 p, har-miR-221-3 p, har-miR-24-3 p, har-miR-27a - 3p, har-miR-29b - 3p, har-miR-335-5 p, har-miR-424-5 p, har-miR-497-5 p, har-miR - 520d - 3p, har-miR-92a - 3p, har-miR-17-5 p och har-miR-155-5 p. Vi valde också har-miR-223-3 p och har-mir-484 för endogena normalisering3,4,5,6, och cel-miR-39 renas från C. elegans som ett spike för exogena normalisering. Alla data normalizations utfördes med hjälp av metoden 2 ̂ ̄(ΔΔCt).
Påvisande av cirkulerande microRNA presenterar några tekniska svårigheter eftersom molekylerna befinner sig på mycket låga nivåer i plasma och deras förstärkning är kemiskt utmanande med tanke på deras kort sekvens. Av dessa skäl har valt vi ett förfarande som anser både organiska extraktion med fenol och en glas-fiber kolumnbaserade metod. Cirkulerande miRNA utvinning är ett hett ämne i fältet av flytande biopsi, och vi valde ett kommersiella kit som har visat sig vara en av de mest tillförlitliga när det gäller mängden och kvaliteten på återvunna avkastning7,8. Vi valde ett protokoll till omvänd transkribera microRNA genom tillägg av en adapter 5' och en poly(A) svans till 3' av den mogna miRNA att förbättra fiskeredskapens selektivitet och specificitet av reaktionen.
Robustheten av metoden, vi utformade anpassade plattor med pre fläckig sonder för RT-PCR att bedöma varje prov i två exemplar och analyseras 2 patienter inom varje platta, som visas i figur 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs: Utför alla de följande stegen under en steriliserad spiskåpa enligt god laboratoriesed (GLP).
1. plasma insamling och lagring
- Samla 3 mL av perifert blodprovet i en K3E EDTA-rör.
- Centrifugera röret vid rumstemperatur vid 1 880 x g i 15 min.
- Återställa supernatant plasma i alikvoter av 450 µL.
- Lagra proverna vid-80 ° C fram till användning.
Obs: Processen perifert blod röret inom 2 h av samling. När du återställer plasma från röret, stör inte lagrets lymfocyter.
2. utvinning av cirkulerande microRNA från plasmaprover (tabell av material)
-
Förbered alla nödvändiga lösningar och Tina proverna för utvinning stegen.
- Lägger till 375 µL av 2-merkaptoetanol i 2 x denaturating-lösningen och blanda väl.
- Tillsätt 21 mL ACS grade 100% etanol till miRNA tvättlösningen jag och blanda väl.
- Tillsätt 40 mL ACS grade 100% etanol till tvättlösningen 2/3 och blanda väl.
- Tillåta en plasma alikvotens att Tina i rumstemperatur och sedan börja utvinning stegen.
-
Organiska utvinning
- Överföra 400 µL plasma provet i ett RNase-fri 2 mL rör.
- Tillsätt 400 µL av 2 x denaturating lösning, blanda genom vortexa och centrifugera kort.
- Tillsätt 4 µL 1 nM spike-i, blanda genom vortexa och centrifugera kort.
- Tillsätt 800 µL syra fenol-kloroform.
- Virvel för 60 s och centrifugera vid högsta hastighet (≥10, 000 x g) under 15 minuter.
- Överföra övre vattenfasen till en frisk slang. Stör inte interphasen. Obs volymen återhämtat sig och kassera tuben som innehåller den icke-acqueous-fasen.
Obs: 2 x denatureringen lösning lagras vid 4 ° C och får stelna vid denna temperatur. Före användning, varma lösningen till 37 ° C, agitera ibland för 10-15 min. var noga med att dra tillbaka den nedre fasen som innehåller den sura fenol-kloroform, inte acqueous bufferten som ligger ovanpå blandningen. Värm det eluering lösning eller nuclease-fria vattnet till 95 ° C. Var noga med att värma en lämplig volym av lösningen (100 µL per prov + 10% överskott).
-
Små RNA anrikning
- Tillsätt 1/3 mängd etanol 100% till vattenfasen från steg 2.2.6 och blanda väl.
- Placera en filterpatron i en färsk insamling tube för varje prov.
- Överför upp till 700 µL av lysat från steg 2.3.1 och etanol in i filterpatronen och centrifugera vid 10 000 x g under 30 s.
- Om det finns > 700 µL blandning kvar, Placera filtratet i en frisk slang och upprepa steg 2.3.3; Upprepa tills alla blandningen har passerat genom filterpatronen.
- Mät den totala volymen av genomströmmande.
- Tillsätt 2/3 mängd etanol 100% till filtratet och blanda väl.
- Placera en andra filterpatron i en färsk insamling tube.
- Överför upp till 700 µL av provvolymen in i kassetten och centrifugera 10 000 x g i 30 s. Kassera genomflöde.
- Upprepa steg 2.3.8 tills alla blandningen har passerat genom filterpatronen.
- Gälla filterpatronen 700 µL miRNA tvättlösning 1 och centrifugera filterpatronen med samling röret vid 10.000 x g i 15 s. Kassera genomflöde. Placera filterpatronen i samma samling röret.
- Tillämpa 500 µL tvättlösning 2/3 till filterpatronen och centrifugera filterpatronen med samling röret vid 10.000 x g för 15 s. Kassera genomströmmande. Placera filterpatronen i en färsk insamling tube.
- Placera filterpatronen i en fräsch samling röret och upprepa steg 2.3.11 med 500 µL tvättlösning 2/3. Kassera genomströmmande och överföra filterpatronen till en färsk insamling tube.
- Centrifugera rören med filterpatronerna vid 10 000 x g i 1 min.
- Överföra filterpatronen i en fräsch 1,5 mL samling röret och tillsätt 100 µL av förvärmd (95 ° C) eluering lösning eller nuclease-gratis vatten.
- Centrifugera vid 10 000 x g under 30 s till återvinna microRNA och lagra vid-80 ° C.
Obs: Kan en vit fällning bildas i tvättlösningen 2/3. Detta är överflödigt EDTA som frigörs från lösningen. Undvik att rita upp dessa kristaller under pipettering stegen.
3. utföra omvänd transkription och miRNA före amplifiering (tabell av material)
-
Utföra polyadenylation reaktion
- Tina alla reagens på isen, sedan kort vortex och centrifugera att snurra ner innehållet. Dessutom PEG Tina 50% 8000, gör det möjligt att nå rumstemperatur.
- Förbereda reaktionsblandning i en 0,5 mL centrifugrör, att erhålla en slutlig volym av 3 µL av reaktion cocktail för varje prov. Använda den följande volymer, plus 10% överskottet för varje reagens.
- Lägg till 1,7 µL RNase-gratis vatten, 0,5 µL 10 x Poly(A) buffert, 0,5 µL 10 mM ATP och slutligen 0,3 µL 5 U/µL PolyA enzym.
- Kort ner vortex och centrifugera cocktail mixen att snurra innehållet.
- Överför 2 µL av provet till varje brunn reaktion plattan eller reaktionsröret och tillsätt 3 µL av reaktionen cocktail. Kort ner vortex och centrifugera att snurra innehållet.
- Placera plattan/rören i en termocykel och utför följande steg.
- Inkubera vid 37 ° C i 45 min (polyadenylation steg).
- Inkubera vid 65 ° C i 10 min (stop reaktion), med följande stadga vid 4 ° C.
-
Utföra ligatur reaktionen.
- Förbereda reaktionsblandning i ett centrifugrör med följande volymer för varje prov och 10% av volymen i överskott.
- Lägg till 0.4 µL RNase-gratis vatten, 3 µL av 5 x DNA-ligase buffert, 0.6 µL av 25 x ligering adapter, 4,5 µL av 50% PEG 8000 och slutligen 1,5 µL av RNA ligase.
- Kort ner vortex och centrifugera cocktail mixen att snurra innehållet.
- Tillsätt 10 µL av mixen till varje brunn/reaktionsröret som innehåller poly(A) tailing produkten. Blanda genom en tallrik shaker vid 1 900 rpm för 1 min eller kort vortexa och spinn ner innehållet.
- Placera plattan/reaktion rören i en termocykel med följande inställningar: inkubation vid 60 ° C i 60 min, med en följande håll vid 4 ° C.
Obs: 50% PEG 8000 är mycket trögflytande. Använda vid rumstemperatur, aspirera och dispensering långsamt. Efter varje aspiration och dispensering steg, hålla plugger för 10 s att reagenset flyta upp och ner.
-
Utföra omvänd transkription reaktionen.
- Förbereda reaktionsblandning i ett centrifugrör, med följande volymer för varje prov och 10% av volymen i överskott.
- Tillsätt 3.3 µL av RNase-gratis vatten, 6 µL av 5 x RT buffert, 1,2 µL av dNTP mix (25 mM), 1,5 µL 20 x Universal RT primers och slutligen 3 µL 10 x RT enzym mix.
- Kort ner vortex och centrifugera cocktail mixen att snurra innehållet.
- Tillsätt 15 µL av mixen till varje brunn/reaktionsröret som innehåller ligering produkten. Blanda genom en tallrik shaker vid 1 900 rpm för 1 min eller kort vortexa och spinn ner innehållet.
- Placera plattan/reaktion rören i en termocykel med följande inställningar.
- Inkubera vid 42 ° C under 15 min (omvänd transkription).
- Inkubera vid 85 ° C för 5 min (stop reaktion), med följande stadga vid 4 ° C.
Obs: RT produkten kan nu lagras vid-20 ° C och förblir stabila i upp till 2 månader.
-
Utföra miR-Amp reaktionen (tabell av material).
- Förbereda reaktionsblandning i ett centrifugrör med följande volymer för varje prov och 10% av volymen i överskott.
- Lägg till 17,5 µL RNase-gratis vatten, 25 µL av 2 x miR-Amp huvudmixen och 2,5 µL 20 x miR-Amp primer mix.
- Kort ner vortex och centrifugera cocktail mixen att snurra innehållet.
- För varje prov, över 45 µL av reaktionsblandning till varje brunn för en ny reaktion-platta eller en reaktionsröret. Tillsätt 5 µL av produktens RT till varje brunn eller reaktion röret. Blanda genom en tallrik shaker vid 1 900 rpm för 1 min eller kort vortexa och spinn ner innehållet.
- Placera plattan/reaktion rören i en termocykel och kör som visas i tabell 1.
4. utför realtids-PCR
- Späd varje cDNA prov 1:10 i 0,1 x TE buffert.
- Beräkna antalet brunnar/replikat för varje prov. Förbereda reaktionsblandning i ett centrifugrör med följande volymer för varje prov, lägga till 10% av volymen i överskott.
- Tillsätt 4 µL RNase-gratis vatten, 10 µL av 2 x snabb avancerade master mix (Tabell av material) och slutligen 5 µL utspädda cDNA.
- Blanda genom vortexa och centrifugera kort för att snurra ner innehållet.
- Över 19 µL av reaktionsblandning till varje brunn, försegla plattan och centrifugera kort.
- Utföra termisk protokollet (tabell 2) på en RT-PCR-system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi analyserade en panel av angiogenes-relaterade cirkulerande microRNA avseende progressionsfri överlevnad (PFS), total överlevnad (OS) och objektiva svar Betygsätt (ORR) i en 52 mCRC patienter behandlade med B-baserade CT. Utvärderingen av sådana biomarkörer i plasmaprover är utmanande på grund av tekniska svårigheter. Vi använde etablerade metoder för miRNA utvinning från patientens plasmaprover, omvänd transkription och före förstärkning. Efter tillverkarens anvisningar och med endast några ändringar krävs, särskilt i utvinning steg, utvärderat vi framgångsrikt alla våra mål i patientpopulationen (figur 2).
I synnerhet vi analyserat 2 plasma prover/patienten, korrelera baslinjen och terapi-modifierade miRNA uttryck med patientens resultatet.
Vi utförde seriespädningar av cel-miR-39 på 0,05 nM, 0,5 nM, 5nM och 5 pM i 800 µL plasma prov (400 µL plasma plus 400 µL 2 x denaturating lösning) för att fastställa spike-i koncentrationen att använda. I figur 4visas exogena kontroll visade tröskel cykel (Ct) värden som var kongruent med de seriella utspädningar, som anger robustheten i hela protokollet (dvs, extraktion, omvänd transkription och qRT-PCR utvärdering). Dessutom aktiverat dessa seriespädningar oss välja den spike-i-koncentration som inte skulle störa omvänd-transkriptionen av alla mål microRNA.
Denna metod tillät oss att korrelera baslinjen microRNA med kliniska patologiska funktioner. Vi fann särskilt att har-miR-199a - 5p, har-miR-335-5 p och har-miR - 520d - 3p var betydligt uppreglerad i vänstersidig avseende högersidig lesioner (p = 0,03, p = 0,006 och p = 0,008, respektive). Däremot har-miR-21-5 p var betydligt nedreglerade i RAS-muterade patienter (K-RAS, p = 0,01 och N-RAS, p = 0,008), medan har-miR-221-3 p var uppreglerad (p = 0,05, p = 0,01, K - och N-RAS, respektive).
Jämförelse uttryck av miRNA mellan baslinjen och första klinisk utvärdering, vi observerade att en ökning har-miR-155-5 p uttryck nivåer var associerade med kortare progressionsfri överlevnad (p = 0,04) och OS (p = 0,02). Särskilt hos patienter med en ≥30% ökning har-miR-155-5 p, PFS var 9,5 månader (95% CI, 6,8-18,7) och OS var 15,9 månader (95% CI, 8,4-inte nått) jämfört med 22,3 månader (95% CI, 10.2-25,5) och 42,9 månader (95% CI, 24,8-inte nått) för dem med ett < 30% öka (figur 3). Medianvärdet för variation i fall serien (30%) angavs som brytpunkten. Cirkulerande basala nivåer av microRNA var dichotomized till ”hög” eller ”låg” enligt medianvärden9.
Figur 1: Design av anpassade plattan layout. Sonder var pre fläckig i varje brunn. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: exempel på qRT-PCR amplifiering tomter. (A) Amplification plot enda qRT-PCR anpassade platta. Alla markörer var utvärderbara i båda enda skylt prover. (B) qRT-PCR har-miR-17-5 p i övergripande mål-serien. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: experimentella och kliniska resultat i förhållande till har-miR-155-5 s. (A), Ct-värden för har-miR-155-5 p. Förstärkning tomt har-miR-155-5 p i den övergripande mål serien. (B) PFS och OS för patienter med en ≥30% eller < 30% ökning av cirkulerande har-miR-155-5 p. PFS beräknades som tiden från dagen för randomisering till dagen för den första dokumentera bevisen för tumör progression, sista tumör bedömning eller död i avsaknad av progression av sjukdomen. OS beräknades som tiden från dagen för randomisering till datumet för dödsfallet från någon orsak eller senaste uppföljningen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: experimentella resultat forcel-miR-39 seriell utspädning. (A) qRT-PCR för seriespädningar av cel-miR-39, med relativ (B) Cts. utspädningar utfördes på 5 nM, 0,5 nM, 0,05 nM och 5 pM i plasmaprover från samma patient. Sådan analys linjäritet aktiverat oss att välja bästa koncentrationen att använda i den övergripande mål serien. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Steg | Temperatur | Varaktighet | Cykler |
| Enzym aktivering | 95 ° C | 5 min | 1 |
| Denaturera | 95 ° C | 3 s | 14 |
| Glödga/förlänga | 60 ° C | 30 s | |
| Stoppa reaktion | 99 ° C | 10 min | 1 |
| Håll | 4 ° C | Håll | ∞ |
Tabell 1: Termisk protokollet av mir-AMP reaktion.
| Steg | Temperatur | Varaktighet | Cykler |
| Enzym aktivering | 95 ° C | 20 s | 1 |
| Denaturera | 95 ° C | 3 s | 40 |
| Glödga/förlänga | 60 ° C | 30 s | |
| Håll | 4 ° C | Håll | ∞ |
Tabell 2: Termisk protokoll av qRT-PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
microRNA är små icke-kodande RNAs (18-25 nukleotider i längd) kan bindande regionen 3' UTR i deras mål messenger RNA och hämmande eller förnedrande det. De kan alltså anses gene expression tillsynsmyndigheter på translationell nivå. Under det senaste decenniet, har flera microRNA korrelerats med cancer initiering och utveckling, vilket gör dem användbara kliniska biomarkörer för diagnostik, prognos och behandling. Skyddas av Rnaser, är microRNA närvarande i en stabil form i biologiska vätskor såsom blod, plasma, serum, urin och saliv, vilket har lett till ett växande intresse för deras potentiella användbarhet i klinisk praxis10.
Trots detta utvärdering av cirkulerande microRNA är en utmanande uppgift och svårigheter avseende provtagning, mål utvinning, plattform val och globala normalisering är hett omdebatterade ämnen inom det vetenskapliga samfundet.
För provtagning och förvaring, är före analytiska variabler nära kopplade till plasma hantering och bearbetning. Vi fokuserade på plasma i stället för serum prover eftersom det finns gott om bevis för högre miRNA koncentrationer i den senare, möjligen på grund av utsläpp av dessa molekyler under koagulering process10,11,12 . För att lösa frågan om frisläppandet av cellular nucleic syror som härrör från blod cell lysis, centrifugeras vi proverna inom 2 timmar efter blodtappning. Vi använde också K3E EDTA rör eftersom andra antikoagulantia är kända för att störa förstärkning steg (t.ex. heparin) och kan utlösa hemolys (dvs, citrat). Eftersom det är avgörande för att undvika trombocyter och lymfocyter kontaminering i förväg analytisk fas, vi bort plasma från röret mycket långsamt och aspirera inte de senaste ~ 50 µL av provet från röret.
Olika studier har visat kolumnbaserade extraktionsmetoder överlägsenhet över guanidin/fenol/kloroform-baserade protokoll11,13, men Khoury et al. effektivt isolerade god kvalitet små RNAs från serum med sådan reagenser utan kontaminering14. Den kommersiella kit som vi använde sekventiellt utför både extraktionsmetoder, tillåter lämplig miRNA avkastning i form av spike-i koncentrationer. Vi genomförde endast en ändring avseende tillverkarens instruktioner, dvs, fräsch samling rör användes alltid efter varje filter patron tvätt steg för att eliminera/minska risken för reagens kontaminering. För att identifiera bästa spike-i koncentrationen i våra prover och därmed undvika störningar med efterföljande reaktioner, utfört vi först hela protokollet utan att lägga den cel-miR-39 under utvinning steg att utvärdera de median uttrycksnivåerna för våra mål. Vi genomförde sedan de novo miRNA utvinning från plasmaprover av samma patient använder en seriell utspädning av cel-miR-39 för att identifiera bästa koncentrationen att lägga till de plasma proverna av våra case series (figur 4). Det måste dock understrykas att den optimala cel-miR-39 koncentrationen, identifieras för endast ett prov, inte nödvändigtvis får bästa koncentrationen för övergripande mål serien på grund av en rad interna variabler såsom ålder, kön eller liv vanor, som skulle kunna påverka absoluta miRNA uttryck inom blod.
miRNA omvänd transkription och förstärkning representerar 2 kritiska moment. Av de två huvudsakliga teknikerna för miRNA upptäckt (i.e., qRT-PCR och microarray), vi valde qRT-PCR med tanke på dess höga känslighet och vårt behov av att utvärdera endast en vald panel av microRNA (en stor begränsning av denna metod är dess låg genomströmning)15. Vi använde omvänd transkription kemi baserat på 3' polyA tailing och 5' ligering adapter sekvenser att förlänga den mogna miRNA och tillåta glödgning av universella RT primers. Baserat på enstaka baspar erkännande, kan 5' ligering adaptern bidra till att undvika vanliga fördomar som de kopplade till 5' mismatch. Detta kit innehåller också ett före förstärkning steg som krävs för låg avkastning prover, såsom plasma. Även om det är nödvändigt, kan detta steg införa vissa förstärkning fördomar innan detektionssteget.
I detta protokoll analyserade vi en panel med 24 utvalda microRNA korrelerade med angiogenes. I synnerhet vi valde pre fläckig sonden anpassade plattor och följt tillverkarens instruktioner för de qRT-PCR-körningarna. De viktigaste frågor som avser miRNA qRT-PCR är valet av referens gener och deras efterföljande data analys normalisering.
Även om många studier har genomförts för att identifiera den bästa miRNA för normalisering, har ingen enhetlig konsensus uppnåtts. För att lösa denna begränsning, genomförde vi en litteratursökning för att identifiera den cirkulerande microRNA som kan användas som referens gener i vårt fall serien.
Vi valde de 4 microRNA med starka bevis för stabil uttryck i plasmaprover från mCRC-patienter och testade dem i en mindre del av vår mål-serien. De 2 mest stabila microRNA identifierades av GeNorm analys som referera städning gener.
Sammanfattningsvis, har utvärdering av cirkulerande microRNA i perifert blodprover ett antal kända problem. Vi anser dock att de metoder vi använt är tillförlitliga och robusta, möjliggör en grundlig och noggrann undersökning av dessa biomarkörer som har potential att förändra scenariot behandling för kolorektal cancer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter avslöja.
Acknowledgments
Denna studie finansierades delvis av Roche S.p.A. och den italienska läkemedel byrån (AIFA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rnase-free Safe-lock 1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030 123.328 | |
| Rnase-free Safe-lock 2 mL tubes | Eppendorf | 0030 123.344 | |
| Rnase-free 20 µL tips | Starlab | S1123-1810 | |
| Rnase-free 200 µL tips | Starlab | S1120-8810 | |
| Rnase-free 1,000 µL tips | Starlab | S1122-1830 | |
| mirVana PARIS RNA and Native Protein Purification Kit | Thermo Fisher | AM1556 | |
| TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher | A28007 | |
| 100% ethanol anidrous ACS grade | Carlo Erba Reagents | 414605 | |
| 2-mercapto-ethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher | 4444558 | |
| TaqMan Advanced miRNA Assays | Thermo Fisher | A25576 | |
| 7500 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4406984 | |
| 0.2-2, 1-10, 2-20, 20-200, 100-1,000 µL laboratory pipettes | |||
| Benchtop microcentrifuge | |||
| Vortex | |||
| Benchtop heating block | |||
| Fume hood | |||
| 0.2 mL PCR tubes |
References
- Luo, H. -Y., Xu, R. -H. Predictive and prognostic biomarkers with therapeutic targets in advanced colorectal cancer. World journal of gastroenterology. 20 (14), 3858-3874 (2014).
- Toiyama, Y., Okugawa, Y., Fleshman, J., Richard, C., Goel, A. MicroRNAs as potential liquid biopsy biomarkers in colorectal Cancer: A systematic review. BBA Reviews on Cancer. 5 (6), (2018).
- Kok, M. G. M., Halliani, A., Moerland, P. D., Meijers, J. C. M., Creemers, E. E., Pinto-Sietsma, S. J. Normalization panels for the reliable quantification of circulating microRNAs by RT-qPCR. FASEB Journal. 29 (9), 3853-3862 (2015).
- Marabita, F., De Candia, P., Torri, A., Tegnér, J., Abrignani, S., Rossi, R. L. Normalization of circulating microRNA expression data obtained by quantitative real-time RT-PCR. Briefings in Bioinformatics. 17 (2), 204-212 (2016).
- Danese, E., et al. Reference miRNAs for colorectal cancer: Analysis and verification of current data. Scientific Reports. 7 (1), 1-12 (2017).
- Zheng, G., et al. Identification and validation of reference genes for qPCR detection of serum microRNAs in colorectal adenocarcinoma patients. PLoS ONE. 8 (12), 1-10 (2013).
- Lv, W., et al. Optimization of the Original TRIzol-Based Technique Improves the Extraction of Circulating MicroRNA from Serum Samples. Clinical laboratory. 61 (12), 1953-1960 (2015).
- Tan, G. W., Khoo, A. S. B., Tan, L. P. Evaluation of extraction kits and RT-qPCR systems adapted to high-throughput platform for circulating miRNAs. Scientific reports. 5, 9430 (2015).
- Altman, D. G., McShane, L. M., Sauerbrei, W., Taube, S. E. Reporting Recommendations for Tumor Marker Prognostic Studies (REMARK): explanation and elaboration. PLoS medicine. 9 (5), (2012).
- Tiberio, P., Callari, M., Angeloni, V., Daidone, M. G., Appierto, V. Challenges in using circulating miRNAs as cancer biomarkers. BioMed Research International. 2015, (2015).
- Kroh, E. M., Parkin, R. K., Mitchell, P. S., Tewari, M. Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR). Methods (San Diego, Calif). 50 (4), 298-301 (2010).
- Cheng, H. H., et al. Plasma Processing Conditions Substantially Influence Circulating microRNA Biomarker Levels. PLoS ONE. 8 (6), 1-11 (2013).
- Moret, I., et al. Assessing an improved protocol for plasma microRNA extraction. PloS one. 8 (12), (2013).
- Khoury, S., Ajuyah, P., Tran, N. Isolation of small noncoding RNAs from human serum). Journal of visualized experiments JoVE. (88), e51443 (2014).
- Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer. Nature Reviews Clinical Oncology. 11 (3), 145-156 (2014).
