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Developmental Biology

Hochfrequenz-Ultraschall für die Analyse der fetalen und plazentaren Entwicklung In Vivo

doi: 10.3791/58616 Published: November 8, 2018

Summary

Hier beschreiben wir die Technik der Hochfrequenz-Ultraschall zur in Vivo Analyse der Feten bei Mäusen. Diese Methode ermöglicht das Follow-up von Föten und die Analyse der plazentaren Parameter sowie mütterlichen und fetalen Durchblutung während der gesamten Schwangerschaft.

Abstract

Ultraschall-Bildgebung ist eine weit verbreitete Methode zur Erkennung von Organanomalien und Tumoren im menschlichen und tierischen Geweben. Die Methode ist nicht invasiv, harmlos und schmerzlos, und die Anwendung ist einfach, schnell und überall, auch mit mobilen Geräten durchgeführt werden kann. Während der Schwangerschaft ist Ultraschall-Bildgebung standardgemäß zur fetalen Entwicklung aufmerksam verfolgen. Die Technik ist wichtig, intrauterine Wachstumsretardierung (IUGR), eine Komplikation der Schwangerschaft mit kurz- und langfristigen gesundheitlichen Folgen für die Mutter und Fötus zu bewerten. Verständnis des Prozesses der IUGR ist unverzichtbar für die Entwicklung von wirksamerer Therapiestrategien.

Das Ultraschallsystem verwendet in diesem Manuskript ist ein Ultraschallgerät für die Analyse von kleinen Tieren hergestellt und kann in verschiedenen Forschungsbereichen, einschließlich der Schwangerschaft verwendet werden. Hier beschreiben wir die Nutzung des Systems für in Vivo Analyse der Feten von natürlichen killer (NK) Zelle/Mastzellen (MC)-mangelhafte Mütter das Wachstum eingeschränkt Welpen gebären. Das Protokoll beinhaltet die Vorbereitung des Systems, Umgang mit den Mäusen vor und während der Messungen und die Verwendung von den B-Modus, Farb-doppler-Modus und Puls-Wave doppler-Modus. Fetale Größe, plazentare Größe und Blut-Versorgungsmaterial zu den Fötus wurden analysiert. Wir fanden reduzierte Implantation Größen und kleinere Plazenta in NK/MC-defizienten Mäusen von Mid Schwangerschaft ab. Darüber hinaus MC/NK-Mangel war abwesend zugeordnet und umgekehrt Ende diastolischer Strömung in der fetalen Arteria Umbilicalis(UmA) und einen erhöhten Widerstand-Index. Die im Protokoll beschriebenen Methoden können leicht für Verwandte und nicht verwandte Forschungsthemen verwendet werden.

Introduction

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Ultraschall ist Schallwellen mit Frequenzen oberhalb des hörbaren Bereiches des menschlichen Ohres, größer als etwa 20 kHz1. Tiere wie Fledermäuse, Wales, Delfine2,3, Mäuse4, Ratten5und Maus Lemuren6 alle verwenden Ultraschall zur Orientierung oder Kommunikation. Menschen nutzen des Ultraschalls für verschiedene technische und medizinische Anwendungen. Ein Ultraschallgerät kann die Schallwelle zu erstellen und zu verteilen und repräsentieren das Signal. Wenn Ultraschall auf ein Hindernis stösst, der Klang wird reflektiert, absorbiert oder kann durch sie gehen. Die Anwendung von Ultraschall als ein bildgebendes Verfahren, Sonographie, genannt dient zur Analyse von organischen Geweben in der Human- oder Veterinärmedizin wie das Herz (Echokardiographie)7,8, Lunge9, Schilddrüse10 , Nieren11und urinausscheidenden und reproduktiven Traktate12,13; Erkennung von Gallensteinen14 und Tumoren15; und Bewertung der Durchblutung der Gefäße oder Organe16,17. Ultraschall ist eine Standardmethode in Vorsorgeuntersuchungen während der Schwangerschaft und fetalen Entwicklungsstörungen oder Beeinträchtigungen frühzeitig erkannt werden können. Insbesondere wird das Wachstum des Fötus in regelmäßigen Abständen zu erkennen, eine mögliche IUGR überwacht. Schließlich kann fetalen Durchblutung überwacht werden, da das Wachstum Einschränkungen18,19,20,21hinweisen kann.

Ein großer Vorteil der Ultraschall-Bildgebung im Vergleich zu anderen Methoden wie Röntgen ist der Klang Harmlosigkeit der Gewebe analysiert werden. Diese einfache und schnelle Methode ist nicht invasiv, schmerzlos, und kann eine Anzahl von Zeiten verwendet. Die Anschaffungskosten ein Ultraschallgerät ist teuer; Allerdings sind die Verbrauchsmaterialien benötigt billig. In diesem Manuskript verwendete Ultraschall-System eignet sich für eine Reihe von Tiermodellen (d. h. Mäuse und Fische) während ein Ultraschallgerät für den Menschen eine Frequenz von 3-15 mHz erfordert, eine Frequenz von 15-70 mHz ist erforderlich für Mäuse.

Das vorliegende Manuskript beschreibt ein Protokoll für die Verwendung von B-Mode, doppler Farbmodus und Puls-Wave doppler-Modus. Die Beschreibung beinhaltet die Vorbereitung von Mäusen als auch Leistung, Datenerfassung und Speicherung. Diese Methode wurde erfolgreich angewandte, verschiedene Mausstämme überhaupt Schwangerschafts Tage und kann zur fetalen und plazentaren Entwicklung sowie mütterlichen und fetalen Blutparameter zu untersuchen. Hier werden alle Anwendungen basierend auf unsere Studien mit schwangeren MC/NK-defizienten und Kontrolle Mäuse erklärt.

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Protocol

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Alle hier beschriebene Methoden wurden durch genehmigt die "Landesverwaltungsamt Sachsen Anhalt: 42502-2-1296UniMD."

(1) experimentelle Verfahren

  1. 6 bis 8 Wochen alten weiblichen MC-defizienten C57BL/6J-Cpa3 PaarenCre /+ (Cpa3Cre /+) Mäuse und MC-ausreichend C57BL/6J-Cpa3+/+ (Kolonie Kontrollen; Cpa3+/+) mit BALB/c Männchen.
  2. Definieren des Schwangerschaft Tages (gd) 0 nach der Bestätigung der vaginal Plug und die Weibchen sofort nach der Operationsbestätigung Stecker zu behandeln.
    Hinweis: Ein Stecker ist das Sperma des Mannes in die vaginale Öffnung des Weibchens.
    1. 250 µL PBS intraperitoneal Adis Cpa3+/+ zu injizieren Weibchen.
    2. Injizieren Sie 250 µL Anti-CD122 (0,25 mg) intraperitoneal in MC-defizienten Cpa3Cre /+ Weibchen.
      Hinweis: Eine Injektion von 0,25 mg Anti-CD122 verbraucht, periphere NKs und uNKs in MC-defizienten Cpa3Cre /+ Weibchen bereits22beschrieben.
  3. Warten Sie, bis gd5.
    Hinweis: Bei gd5 ist die früheste Möglichkeit zur Implantation Analyse.
    1. Führen Sie Schritte 2 bis 5 für die Ultraschall-Analyse.
  4. Führen Sie die Ultraschall-Bildgebung bei gd5, 8, 10, 12 und 14.

2. Vorbereitung des Ultraschall-System

  1. Schalten Sie das System (Abbildung 1A, Hauptschalter auf der Rückseite und Computer Standby-auf der linken Seite), die beheizte Plattform (Abbildung 1 b; auf dem Steuerkreuz), und das Gel wärmer (Abbildung 1).
    Hinweis: Ultraschallgel muss Aufwärmphase von ca. 0,5 h.
  2. Sicherzustellen, dass das Isofluran-Gerät ausreichend gefüllt wird (Abbildung 1).
  3. Öffnen Sie eine Neue Studie oder Neue Serie in einer vorhandenen Studie im Browser. Füllen Sie alle erforderlichen Informationen (Besitzer, Studie, Serie, Daten aus Tierversuchen) im Studium Info -Fenster. Klicken Sie auf Ok.
  4. Nach einem Klick auf Ok, damit Image Fenster B-Modus erscheint und beginnt automatisch mit der Bildgebung im B-Modus.

(3) Maus-Handling

  1. Anesthetization der Maus
    1. Platzieren Sie den Mauszeiger im Feld Knockdown (Abbildung 1E), schließen Sie das Öffnen Sie Isofluran Rohres der Knockdown Box und schalten Sie die Isofluran (Konzentration 3,5 %).
    2. Wenn die Maus narkotisierten, niedriger (bis 1,5 % Konzentration) und leiten die Isofluran Ablauf durch das Rohr in die Richtung der Heizung Plattform öffnen und schließen den Fluss zum Feld Niederschlag.
      Hinweis: Um ausreichende Anästhesie zu erreichen, warten Sie weitere 10 s nach die Maus nicht mehr bewegt.
    3. Übertragen Sie die Maus schnell aus dem Ko-Feld auf die Heizung-Plattform (Abb. 1F) in eine Rückenlage und positionieren Sie sanft seine Nase in der Anästhesie-Nase-Röhre auf der Oberseite der Plattform.
  2. Fixierung, Enthaarung und Vorbereitung der Maus für die Messung
    1. Augenschutz Creme in jedes Auge der Maus, um zu verhindern, dass trockene Augen zu platzieren.
    2. Geben Sie einen Tropfen Elektrodengel auf jeder der vier Kupferflächen auf der beheizten Plattform (Abb. 1F).
    3. Tippen Sie auf die Pfoten mit chirurgischen Klebeband auf die Gel-beschichtete Elektrodenflächen der Heizung-Plattform.
    4. ECG zu überprüfen [optimalen Wert = 450-550 Schläge/Minute (BPM)] und Atmungsphysiologie zu allen Zeiten.
      Hinweis: Mithilfe einer rektale Sonde Körper Temperaturmessung ist möglich, aber nicht notwendig.
    5. Ort Enthaarungsmittel Creme auf den Bauch der Maus, Rub die Creme mit einem Wattestäbchen und warten ca. 1 min. Entfernen Sie die Creme mit Wasser getränkten Kompresse. Wiederholen Sie diesen Schritt, wenn nicht alle Haare verschwunden sind.
    6. Das vorgewärmte Ultraschallgel auf die enthaarten Haut auftragen.

4. Messungen und Erwerb von Bildern und Videos

  1. Die Wandler (Abbildung 1) in der Hand halten oder Klemmen Sie es in die Haltevorrichtung (Abbildung 1 H; halten, Gerät wird empfohlen).
  2. Identifizieren Sie die Blase mit der Wandler und verwenden Sie es als Bezugspunkt. Bewegen Sie den Schallkopf zu den linken und rechten Seiten des Bauches, Spur Implantationen.
  3. B-Modus für die Visualisierung von anatomischen Strukturen in 2D Graustufenbild
    1. Bewegen Sie den Schallkopf oder Heizung Plattform Tisch wo die Maus fixiert, ist bis die erste Implantation sichtbar auf dem Bildschirm in der größten Größe ist.
      1. Wählen Sie Bild-Beschriftung und geben Sie einen Namen oder Frame Store (Lagerung ohne Namen) zum Speichern von Einzelbildern oder Cine Store eine Cineloop für ganze Implantation Messungen speichern.
    2. Bewegen Sie den Schallkopf oder Tabelle, die die Plazenta um eine Position zu bringen, wo die Durchblutung in den oberen Speicherbereich sichtbar ist. Ein einzelnes Bild oder Cineloop zu speichern (siehe Schritt 4.3.1.1) für plazentare Messungen.
      Hinweis: Plazentale Messungen sind möglich von gd10 ab.
    3. Fahren Sie mit allen Implantationen mit der gleichen Methode.
  4. Color doppler-Modus zu visualisieren und bestimmen Sie die Richtung des Blutflusses
    1. Drücken Sie die Schaltfläche " Farbe ".
    2. Bewegen Sie das Farbfeld (in diesem Bereich ist das Signal sichtbar) in die gewünschte Position mit dem Trackball. Falls erforderlich, ändern Sie die Größe des Feldes durch Update drücken und bewegen Sie den Trackball (auf der rechten Seite/nach oben = größer, auf der linken Seite/unten = kleiner). Wenn die Box die richtige Größe hat, drücken Sie wählen.
    3. Einzelbilder oder Cineloops zu speichern, wie in Schritt 4.3.1.1 beschrieben.
  5. Pulswelle (PW) doppler-Modus, Blutfluss durch die Gefäße in die Arteria Uterina (uterine Arterie, UA) zu quantifizieren und UmA
    1. Suchen Sie die Region von Interesse in der Farbe doppler Erwerb.
      Hinweis: Die UA liegt kaudalen in die Blase und der oberen Speicherbereich befindet sich zwischen dem Fötus und Plazenta.
    2. Presse PWund eine gestrichelte Linie erscheint. Verschieben Sie diese Zeile in das Blutgefäß von Interesse und stellen Sie den Winkel der Linie mit dem Knopf "Doppler-Winkel" im Einklang mit den Blutfluss. Drücken Sie auf Update.
      Hinweis: Der Winkel zwischen der Richtung des Blutflusses und der Wandler muss bei allen Tieren, konsistent sein, insbesondere bei Verwendung von mehr als 60 ° Winkel (hier 70° für UAs und 45° für UmAs verwendet wurden).
    3. Speichern Sie eine Cineloop der erscheinenden doppler Linien in der PW doppler Erfassungsfenster.

5. Überprüfung und Abschluss der Datenerfassung und speichern eine Reihe

  1. Um Daten zu überprüfen, drücken Sie Studienmanagement. Wählen Sie die Miniaturansicht von Interesse und doppelklicken Sie auf Update.
  2. Drücken Sie zuerst Studienmanagement dann nah im Browser-Fenster zur Datenerfassung beenden und speichern Sie eine aufgezeichneten Serien.
    Hinweis: Nach dem Schließen einer Reihe, ist es nicht zum Speichern von Frames oder Cineloops in dieser Serie nicht mehr möglich.

6. Umgang mit Übernahme von Daten der Maus

  1. Entfernen Sie das Gel vom narkotisierter Tier mit Hilfe der trockenen Kompressen.
  2. Nehmen Sie die chirurgische Klebeband vorsichtig aus der Pfoten.
  3. Schließen Sie das Isofluran-Rohr (Konzentration 0 %).
  4. Fahren Sie mit folgenden Ultraschall-Analyse bei gd5, 8, 10 und 12.
    1. Legen Sie das Tier allein in einem Käfig für ein Minimum von 5 min so es ist Zeit aufzuwachen und zu orientieren.
    2. Platzieren Sie den Mauszeiger wieder in den ursprünglichen Käfig.
      Hinweis: Schalten Sie nicht den Isofluran vor Entfernen der Gel und chirurgische Band, da Mäuse sehr schnell aufwachen (ca. 20 s) nach dem Ausschalten der Isofluran.
  5. Fahren Sie mit der folgenden Ultraschall-Analyse bei gd14.
    1. Das Weibchen zu opfern, bevor es durch zervikale Dislokation aufwacht. Öffnen Sie das Tier, entfernen Sie die Gebärmutter zu, trennen Sie die Föten und der Plazenta und Messen Sie fetalen und plazentaren Gewichte zu.

7. kopieren und Importieren von Daten

  1. Markieren einer oder mehreren Reihen durch Klicken auf Exportieren nach und wählen Sie den Speicherplatz, Daten auf eine Festplatte zu kopieren.
  2. Öffnen Sie die Software auf einem Computer und klicken Sie auf Kopieren aus und wählen Sie die Studienreihe von der Festplatte auf eine Studienreihe in die Software importieren.
  3. Analysieren Sie die Daten mit der Software.

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Representative Results

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Einzelkomponenten der Ultraschall-System verwendet in dieser Handschrift sind in Abbildung 1dargestellt. Abbildung 2 zeigt Vertreter Ultraschallbilder im B-Modus zu gd5, 8, 10 und 12 (B) und entsprechenden Implantation Flächenmessung Ergebnisse (A), zeigen einen deutliche reduzierte Implantation Bereich erworben Anti-CD122-behandelten Cpa3Cre / + Mäuse aus gd10 ab.

Abbildung 3 zeigt die Einzelteile der Implantation (Decidua Basalis, Plazenta, Embryo) im B-Modus (Abbildung 3A) erworben und Währungspaar plazentar Messung (Bereich, Dicke, Durchmesser) (Abb. 3 b). Plazentare Messungen führte zu einem deutlich reduzierten plazentar Bereich (Abbildung 3A), Dicke (Abb. 3 b) und Durchmesser (Abbildung 3) im Anti-CD122-behandelten Cpa3Cre / + Mäuse im Vergleich zur WTs gd10 und gd12. Demgegenüber plazentar Bereich und Durchmesser waren vergleichbar zwischen den Gruppen bei gd14, und Dicke wurde deutlich erhöht, in Anti-CD122-behandelten Cpa3Cre / + Mäusen im Vergleich zur WTs in gd14.

Abbildung 4 zeigt fetalen und plazentaren Gewicht am gd14. Ergebnisse zeigten eine deutlich Decreasedfetal Gewicht (Abb. 4A), vergleichbare plazentar Gewicht (Abbildung 4 b) und deutlich verringerte Feto-plazentaren Index (FPI) (Abbildung 4) im Anti-CD122-behandelten Cpa3Cre / + Mäuse im Vergleich zur WTs. Abbildung 5 zeigt ein repräsentatives PW doppler Bild UA Mausklick WT (Abb. 5A) und Messungen der Peak systolischen Geschwindigkeit (PSV) (Abb. 5 b), am Ende diastolische Velocity (EDV) (Abbildung 5) und die berechnete Widerstand-Index (Abbildung 5), wobei alle Werte zwischen den Gruppen vergleichbar waren. Abbildung 6 zeigt einen repräsentativen doppler Farbbild ein WT fetalen Uma in gd14 (Abb. 6A) und repräsentative PW doppler Bilder mit Normal, abwesend oder umgekehrt zu beenden, diastolischer Strömung (Abb. 6 b) und Messungen der PVS (Abbildung 6 C), EDV (Abbildung 6), systolische/diastolische Ratio (Abb. 6E), und Widerstand index (Abbildung 6F). Der Widerstand-Index des Anti-CD122-behandelten Cpa3Cre / + Mäusen wurde deutlich erhöht im Vergleich zum WT-Mäuse.

Figure 1
Abbildung 1: Das Abbildungssystem. Steuereinheit (A) mit Plattform Heizungssteuerung pad (B), gel wärmer (C), Isofluran Steuergerät (D), Quick Box (E), beheizt-Plattform mit vier Kupferflächen (F; F. 1), Wandler (G) und Transducer Haltevorrichtung (H). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Vergleich der Implantation Bereiche im gd5, 8, 10 und 12. (A) Implantation Bereiche von WT Cpa3+ / + + PBS Mäuse (Mäuse n = 2-5, Implantationen n = 6-31 pro Tag) und MC/NK-defizienten Cpa3Cre / + + Anti-CD122 Mäuse (Mäuse n = 3, Implantationen n = 8-16 pro Tag) bei gd5, 8, 10 und 12. Die Ergebnisse werden als Einzelwerte für jede einzelne Implantation und bedeuten. Statistische Unterschiede wurden mit einem ungepaarten t-test (** p < 0,01 *** p < 0,001). (B) repräsentativen Ultraschallbilder von Cpa3+ / + + PBS Mäuse gd5 (i), gd8 (Ii), gd10 (Iii) und gd12 (iv). GD, Schwangerschaft Tag; WT Wildtyp; MC, Mastzellen; NK, natürlichen Killerzellen. Diese Zahl ist aus einer früheren Veröffentlichung23neu aufgelegt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Plazenta Messungen an gd10, 12 und 14. (A) repräsentative Ultraschallbild eine WT-Implantation bei gd10 mit der Decidua Basalis, Plazenta und Embryo. (B) repräsentativen Ultraschallbild eine WT-Implantation bei gd12 zeigt plazentar Stärke (Dicke) und Plazenta Durchmesser (Dia). Plazentar Bereich (C), Plazenta Dicke (D) und Plazenta Durchmesser (e) von WT Cpa3+ / + + PBS Mäuse (Mäuse n = 3-5, Plazenta n = 12-22 pro Tag) und MC / NK-defizienten Cpa3Cre / + + Anti-CD122 Mäuse (Mäuse n = 3-4, Plazenta n = 8-14 pro Tag) bei gd10, 12, und 14. die Ergebnisse werden als Einzelwerte für jede einzelne Plazenta und bedeuten. Statistische Unterschiede wurden mit einem ungepaarten t-test (* p < 0,05, ** p < 0,01). GD, Schwangerschaft Tag; WT Wildtyp; Dicke, Dicke; Dia, Durchmesser; MC, Mastzellen; NK, natürlichen Killerzellen. Diese Zahl ist aus einer früheren Veröffentlichung23neu aufgelegt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: fetalen und plazentaren Gewichtsmessung und Feto-plazentaren Index (FPI) am gd14. Fetalen Gewichten (A), Plazenta wiegt (B) und FPIs (C) von Nachkommen der WT Cpa3+ / + + PBS Mäuse (Mäuse n = 4, Fötus/Plazenta n = 35) und MC/NK-defizienten Cpa3Cre / + + Anti-CD122 Mäuse (Mäuse n = 3, Fötus/Plazenta n = 28) an gd14. Die Ergebnisse werden als Einzelwerte und bedeuten. Statistische Unterschiede wurden mit ungepaarten t-Test (* p < 0,05, ** p < 0,01). GD, Schwangerschaft Tag; WT Wildtyp; MC, Mastzellen; NK, natürlichen Killerzellen. Diese Zahl ist aus einer früheren Veröffentlichung23neu aufgelegt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5: Analyse der uterinen Arterie Geschwindigkeiten bei gd10. (A) repräsentative Pulswelle doppler Bilder von WT Cpa3+ / + + PBS Mäuse zeigen PSV und EDV. PSV (B), EDV (C) und Widerstand Index (D) der uterinen Arterien von Cpa3+ / + + PBS (n = 3) und Cpa3Cre / + + Anti-CD122 (n = 3) Mäuse am gd10 der Schwangerschaft. Daten werden dargestellt als Mittelwert mit SEM statistische Analyse mit Hilfe der Mann-Whitney U-Test durchgeführt wurde. GD, Schwangerschaft Tag; WT Wildtyp; MC, Mastzellen; NK, natürlichen Killerzellen; PSV, Peak systolischen Geschwindigkeit; EDV, Ende diastolische Geschwindigkeit. Diese Zahl ist aus einer früheren Veröffentlichung23neu aufgelegt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6: Analyse der Nabelarterie Geschwindigkeiten bei gd14. (A) Vertreter Color Doppler Bild einer fetalen Uma bei gd 14. (B) repräsentativen Pulswelle doppler Bilder aus Cpa3+ / + + PBS (i) und Cpa3Cre / + + Anti-CD122 (Ii, Iii) Mäuse, zeigt normale end diastolischer Strömung (i), abwesend Ende diastolischer Strömung (Ii) oder umgekehrte Ende diastolischer Strömung (Iii). PSV (C), EDV (D), systolische/diastolische Verhältnis (E) und Widerstand Index (F) des UmAs der Feten von Cpa3+ / + + PBS (Mäuse n = 3, UmA Messungen n = 7) und Cpa3Cre / + + Anti-CD122 (Mäuse n = 3, UmA Messungen n = 10) Mäusen in gd14. Daten werden dargestellt als Mittelwert mit SEM statistische Analyse erfolgte mit einem ungepaarten t-test (* p < 0,05). UmA, Nabelarterie; GD, Schwangerschaft Tag; PSV, Peak systolischen Geschwindigkeit; EDV, Ende diastolische Geschwindigkeit. Diese Zahl ist aus einer früheren Veröffentlichung23neu aufgelegt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

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Mit unserem Ultraschallsystem haben wir bewiesen fetale Wachstumsretardierung bei MC/NK-defizienten Müttern aus gd10 auf. Darüber hinaus bei gd10 und 12, wir beobachteten reduzierte plazentare Abmessungen und bei gd14 das Fehlen oder die Umkehrung der Ende diastolischer Strömung in die UmAs einige Föten von uMC/uNK-defizienten Mäusen. Dieses Zeichen der schlechten Vaskularisation war verbunden mit einem nennenswerten Widerstand Index der Arterien IUGR angibt. Ergebnisse bestätigen die wichtige Rolle der uMCs und uNKs in der Schwangerschaft und fetalen Wohlbefinden und den Verlauf der IUGR zu verstehen.

Das Protokoll gilt an jedem Tag der Schwangerschaft vom gd5 ab (nach der Implantation). Es gibt einige wichtige Schritte in das Protokoll, das berücksichtigt werden muss. Erstens die Haarentfernung muss sorgfältig durchgeführt werden. Zum Beispiel kann übermäßiger Kontakt mit der Enthaarung Creme Hautreizungen verursachen. Unvollständige Haarentfernung führt jedoch um zu Störungen als "Schatten" auf dem Bildschirm sichtbar zu signalisieren. Ein weiterer Grund für eine ungenügende Signal (Schatten oder körnige Bilder) kann auch eine zu geringe Menge des Gels zwischen der Maus und Ultraschall-Strahl platziert werden. Nach unserer Erfahrung ist eine hohe Menge des Gels (ca. 10 mL) eher für ausreichende Signal Sicht notwendig. Zweite, 2D Messungen können irgendwie Ungenauigkeit anfällig sein. Um Messung Unterschiede zwischen Implantationen zu minimieren, empfehlen wir die Verwendung von die größte verfügbare Größe bei die Implantation umgibt. Für präzise Plazenta Messungen wurden alle Implantationen so positioniert in denen UmA Blutfluss gesehen werden könnte. Um Fehlerquellen zu minimieren, sollte darüber hinaus stets vom gleichen Betreiber Messungen durchgeführt werden. Drittens für Puls-Welle doppler Messungen ist es wichtig, den Winkel zwischen der Richtung des Blutflusses und des Ultraschallstrahls beobachten. Einem zu hohen Winkel oder verschiedenen Winkeln zwischen den Tieren in einem einzigen Experiment führen zu ungenauen Geschwindigkeitsmessungen. Augenmerk sollte auch auf die Gefahr der sich wiederholenden Anesthetization der Weibchen. Um dieses Risiko und Stress für die Mutter zu reduzieren, sollte nicht mehr als jeden zweiten Tag Ultraschallmessungen durchgeführt werden.

Die Möglichkeit, Follow-up-Föten relevanten Schwangerschafts Tage während der Schwangerschaft ist ein großer Vorteil der Ultraschall-Technologie. Im Gegensatz zu Opfern Mäuse in verschiedenen Schwangerschaft Stadien ermöglicht die Technologie präzise Längsschnittanalysen von einzelnen schwangeren Mäusen. Trotz dieser Stärke gibt es einige Einschränkungen des Systems, die berücksichtigt werden sollten. Beispielsweise können Föten Positionen im Verlauf der Schwangerschaft ändern. Daher kann es schwierig, bestimmte Datensätze erhalten zu unterschiedlichen Zeitpunkten einzelne Föten zuzuordnen sein. Darüber hinaus ist es manchmal nicht möglich, einige Föten in späteren Tagen der Schwangerschaft, zu überwachen, da (i) ihre Position schwierig sein kann, mit dem Strahl zu erreichen, (Ii) Föten möglicherweise zu groß für den Bildschirm oder (Iii) sie werden, unter den Darm versteckt können. Abhängig von der Maus Sorte sind ganze Implantation Messungen bis gd12 oder gd14 möglich. Später können nur einzelne Organe des Feten, einschließlich des Herzens gemessen und aufgezeichnet werden. Die gesamte Implantation selbst ist zu groß, in späteren Phasen der Schwangerschaft, in den Bildschirm passen.

Nach bestem Wissen und gewissen ist Ultraschall-Bildgebung (zusammen mit Kernspintomographie und Computertomographie) die nur verfügbare Methode, die angegebenen Parametern während der Schwangerschaft zu analysieren, ohne dabei mehrere Tiere bei verschiedenen Schwangerschafts Tage. Dies gilt insbesondere für die doppler-Bildgebung, die einzige Methode, die Durchblutung und Richtung genau zu beurteilen ist (rot = Strömung in Richtung des Ultraschalls beam; blau = Fluss in die entgegengesetzte Richtung von der Ultraschall-Strahl). Während der Pulswelle doppler-Bildgebung sendet die Ultraschallstrahls mehrere Impulse, die durch das Gewebe zurückgegeben werden und Geschwindigkeit informieren über Blut fließen24.

Wie Ultraschall selbst scheint unbedenklich für Mutter und Fötus, ist Ultraschall-Bildgebung für die Schwangerschaft Forschung perfekt geeignet. Trotzdem können in diesem Manuskript beschriebenen Methoden auf zahlreichen anderen Forschungsbereichen angewendet werden; zum Beispiel das System ermöglicht auch für 3D-Messungen, Visualisierung und Quantifizierung von Gewebe Bewegung im Laufe der Zeit Visualisierung von Blut fließen in Tumoren, Nachweis von Biomarkern auf der Zelle Oberfläche, Blutdruck-Messungen, und Ultraschall-geführte -Injektionen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Vielen Dank an die Imaging Instrument Company (insbesondere für Magdalena Steiner, Katrin Suppelt und Sandra Meyer) für ihre angenehme und schnelle Unterstützung und alle unsere Fragen bezüglich der Imaging-System und dessen Nutzung unverzüglich und vollständig zu beantworten. Wir sind dankbar, Prof. Hans-Reimer Rodewald und Dr. Thorsten Feyerabend (DKFZ Heidelberg, Deutschland) für die Bereitstellung der Cpa3-Kolonie. Darüber hinaus bedanken wir uns bei Stefanie Langwisch, wer war verantwortlich für die Maus-Kolonien und generiert, die die Bilder in Abbildung 1.

Die Arbeit und das Imaging System wurden durch Zuschüsse von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG), A.C.Z. (ZE526/6-1 und AZ526/6-2) finanziert, die Projekte eingebettet in die DFG Priorität Programm 1394 "Mastzellen in Gesundheit und Krankheit."

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LEAF anti-Maus CD122 (IL-2Rb) BioLegend 123204 Klon TM-β1; 500 µg
Vevo 2100 System  FujiFilm VisualSonics Inc. Transducer MS550D-0421
Vevo LAB Software  FujiFilm VisualSonics Inc.
Isoflurane Baxter PZN: 6497131
Electrode gel Parker 12_8
Surgical tape 3M Transpore 1527-1
Eye cream Bayer PZN: 1578675
Cotton tipped applicators Raucotupf 11969 100 pieces
Depilatory cream Reckitt Benckiser 2077626
Compresses Nobamed Paul Danz AG 856110 10 x 10 cm
Ultrasound gel Gello GmbH 246000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abramowicz, J. S., Kremkau, F. W., Merz, E. Ultraschall in der Geburtshilfe: Kann der Fötus die Ultraschallwelle hören und die Hitze spüren? Ultraschall in der Medizin. 33, (3), Stuttgart, Germany. 215-217 (1980).
  2. Jones, G. Echolocation. Current Biology. 15, (13), R484-R488 (2005).
  3. Simmons, J. A. The sonar receiver of the bat. Annals of the New York Academy of Sciences. 188, 161-174 (1971).
  4. Zala, S. M., Reitschmidt, D., Noll, A., Balazs, P., Penn, D. J. Sex-dependent modulation of ultrasonic vocalizations in house mice (Mus musculus musculus). Public Library of Science ONE. 12, (12), e0188647 (2017).
  5. Wöhr, M., Seffer, D., Schwarting, R. K. W. Studying Socio-Affective Communication in Rats through Playback of Ultrasonic Vocalizations. Current Protocols in Neuroscience. 75, 1-8 (2016).
  6. Hasiniaina, A. F., et al. High frequency/ultrasonic communication in a critically endangered nocturnal primate, Claire's mouse lemur (Microcebus mamiratra). American Journal of Primatology. e22866 (2018).
  7. Yeo, L., Romero, R. Color and power Doppler combined with Fetal Intelligent Navigation Echocardiography (FINE) to evaluate the fetal heart. Ultrasound in Obstetrics & Gynecology. 50, (4), 476-491 (2017).
  8. Teichholz, L. E. Echocardiography in valvular heart disease. Progress in Cardiovascular Diseases. 17, (4), 283-302 (1975).
  9. Zechner, P. M., et al. Lungensonographie in der Akut- und Intensivmedizin. Der Anaesthesist. 61, (7), 608-617 (2012).
  10. Blank, W., Schuler, A. Sonografie der Schilddrüse - Update 2017. Praxis. 106, (12), 631-640 (2017).
  11. Hansen, K. L., Nielsen, M. B., Ewertsen, C. Ultrasonography of the Kidney: A Pictorial Review. Diagnostics. 6, (1), Basel, Switzerland. (2015).
  12. Older, R. A., Watson, L. R. Ultrasound anatomy of the normal male reproductive tract. Journal of Clinical Ultrasound. 24, (8), 389-404 (1996).
  13. Reeves, J. J., Rantanen, N. W., Hauser, M. Transrectal real-time ultrasound scanning of the cow reproductive tract. Theriogenology. 21, (3), 485-494 (1984).
  14. Sharma, M., Somani, P., Sunkara, T. Imaging of gall bladder by endoscopic ultrasound. World Journal of Gastrointestinal Endoscopy. 10, (1), 10-15 (2018).
  15. Weskott, H. -P. Ultraschall in der Diagnostik maligner Lymphome. Der Radiologe. 52, (4), 347-359 (2012).
  16. Shirinifard, A., Thiagarajan, S., Johnson, M. D., Calabrese, C., Sablauer, A. Measuring Absolute Blood Perfusion in Mice Using Dynamic Contrast-Enhanced Ultrasound. Ultrasound in Medicine & Biology. 43, (8), 1628-1638 (2017).
  17. Quaia, E. Assessment of tissue perfusion by contrast-enhanced ultrasound. European Radiology. 21, (3), 604-615 (2011).
  18. Saw, S. N., Poh, Y. W., Chia, D., Biswas, A., Zaini Mattar, C. N., Yap, C. H. Characterization of the hemodynamic wall shear stresses in human umbilical vessels from normal and intrauterine growth restricted pregnancies. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. (2018).
  19. Kessler, J., Rasmussen, S., Godfrey, K., Hanson, M., Kiserud, T. Fetal growth restriction is associated with prioritization of umbilical blood flow to the left hepatic lobe at the expense of the right lobe. Pediatric Research. 66, (1), 113-117 (2009).
  20. Laurin, J., Lingman, G., Marsál, K., Persson, P. H. Fetal blood flow in pregnancies complicated by intrauterine growth retardation. Obstetrics and Gynecology. 69, (6), 895-902 (1987).
  21. Arduini, D., Rizzo, G., Romanini, C., Mancuso, S. Fetal blood flow velocity waveforms as predictors of growth retardation. Obstetrics and Gynecology. 70, (1), 7-10 (1987).
  22. Meyer, N., et al. Chymase-producing cells of the innate immune system are required for decidual vascular remodeling and fetal growth. Scientific Reports. 7, 45106 (2017).
  23. Meyer, N., Schüler, T., Zenclussen, A. C. Simultaneous Ablation of Uterine Natural Killer Cells and Uterine Mast Cells in Mice Leads to Poor Vascularization and Abnormal Doppler Measurements That Compromise Fetal Well-being. Frontiers in Immunology. 8, 1913 (2017).
  24. Evans, D. H., Jensen, J. A., Nielsen, M. B. Ultrasonic color Doppler imaging. Interface Focus. 1, (4), 490-502 (2011).
Hochfrequenz-Ultraschall für die Analyse der fetalen und plazentaren Entwicklung <em>In Vivo</em>
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Meyer, N., Schüler, T., Zenclussen, A. C. High Frequency Ultrasound for the Analysis of Fetal and Placental Development In Vivo. J. Vis. Exp. (141), e58616, doi:10.3791/58616 (2018).More

Meyer, N., Schüler, T., Zenclussen, A. C. High Frequency Ultrasound for the Analysis of Fetal and Placental Development In Vivo. J. Vis. Exp. (141), e58616, doi:10.3791/58616 (2018).

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