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Developmental Biology

体内の胎児と胎盤の開発の分析のための高周波超音波

doi: 10.3791/58616 Published: November 8, 2018

Summary

ここで高周波超音波マウスの胎児の生体内解析のための手法について述べる。このメソッドには、胎児のフォロー アップと胎盤のパラメーターだけでなく、妊娠中の母体と胎児の血流解析ができます。

Abstract

超音波検査は、人間や動物の体内器官の異常や腫瘍を検出するために使用広範な方法です。メソッドが非侵襲的な無害かつ無痛でありアプリケーションが簡単、高速、およびモバイル デバイスでも、どこでも行うことができます。妊娠中、超音波検査、胎児の発育を密接に監視する標準使用されます。テクニックは、子宮内胎児発育制限 (IUGR)、母親と胎児の両方の短期および長期健康影響と妊娠合併症を評価するために重要です。IUGR のプロセスを理解することが効果的な治療戦略を開発するために不可欠です。

この原稿で使用されている超音波装置、小動物の解析のため生産超音波デバイスであり妊娠研究など様々 な分野で使用することができます。ここで自然なキラー (NK) 細胞・肥満細胞 (MC) から胎児の生体内解析のためのシステムの使用状況を説明-子犬の成長制限を生む欠乏の母親。プロトコルを含むシステムの準備前に、と計測、および B モードの使用中にマウスの処理、色のドップラー モード、およびパルス波ドップラー モード。胎児の大きさ、胎盤のサイズ、および胎児への血液供給を行った。妊娠中期以降から NK/三菱商事-欠損マウスで縮小注入サイズおよび小さい胎盤を見つけました。さらに、MC/NK-欠乏欠席に関連付けられていたし、逆に胎児動脈 umbilicalis(UmA) と高抵抗指数の拡張期フロー。プロトコルで説明する方法は、関連と非関連の研究トピックに簡単に使用できます。

Introduction

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超音波検査は、約 20 kHz1より高い人間の耳の可聴範囲を超える周波数をもつ音波です。動物のようなラット5マウス4イルカ2,3ウェールズ バットとマウスのキツネザル6すべての向きや通信の超音波を使用します。人間はいくつかの技術および医療アプリケーションのための超音波の利用します。超音波装置は音の波を作成して配布および信号を表すことができます。超音波には、障害が検出されると、音は反映されて、吸収または、それを通過することができます。人間の有機組織や心臓 (心エコー検査)789、甲状腺10 のような動物用医薬品の分析、ソノグラフィー イメージングの方法として超音波のアプリケーションを使用します。、腎臓11、および尿および生殖管12,13;胆石14と腫瘍15; を検出血管や臓器の16,17の灌流の評価。超音波は、妊娠中、出生前のケアの標準的な方法と、胎児の発達障害や障害を早く認識できます。具体的には、胎児の成長は、認識可能な IUGR を定期的に密接に監視されます。最後に、胎児血流を監視できます、これは成長制限18,19,20,21を指摘できます。

超音波断層像の撮影のような他の方法と比べての大きな利点は、分析する組織のサウンドの無害です。この簡単かつ迅速な方法は、非侵襲的、無痛とすることができますいくつかの時間を使用します。超音波デバイスの最初の経費がかかるです。ただし、必要な消耗品、材料が安価です。この原稿で使用されている超音波システムは、適切な動物モデルの範囲の(すなわち、マウスおよび魚) 15-70 mHz の周波数はマウスに必要な人間にとっては、超音波装置には 3-15 mHz の周波数が必要ですが。

本稿では、B モード、カラードプラ モード、およびパルス波ドップラー モードの使用のためのプロトコルについて説明します。説明には、マウスと同様にパフォーマンス、データ集録、およびストレージの準備が含まれています。このメソッドは、すべての妊娠の日別に正常に適用されたマウス系統をされている、胎子及び胎盤の開発だけでなく、母体と胎児の血液パラメーターを調査する使用ことができます。ここでは、すべてのアプリケーション、妊娠の MC/NK 欠損とコントロールのマウスを用いた研究は私たちにに基づいて説明します。

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Protocol

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ここで説明したすべてのメソッドは、によって承認されている、"Landesverwaltungsamt ザクセン ・ アンハルト州: 42502 2 1296UniMD."

1. 実験手順

  1. チームメイトに 8 週齢女性 MC 欠損 C57BL/6 j-Cpa3 6Cre/+ (Cpa3Cre/+) マウスと MC 十分 C57BL/6 j-Cpa3+/+ (制御のコロニー;Cpa3+/+) BALB/c 男性と。
  2. 妊娠日膣にプラグの確認後 0 (gd) を定義し、プラグ確認後すぐに、女性を扱います。
    注: プラグインは、女性の膣口に男性の精子です。
    1. 250 μ L の PBS コントロール Cpa3 腹腔内+/+を注入女性。
    2. MC 欠損 Cpa3 でアンチ CD122 (0.25 mg) の 250 μ L を腹腔内注入Cre/+の女性。
      注: アンチ CD122 0.25 mg の注射を使い果たす周辺 NKs と MC 欠損 Cpa3 で uNKsCre/+女性22を前述のよう。
  3. Gd5 まで待ちます。
    注: gd5 で注入解析の初期の可能性があります。
    1. 手順 2-5 超音波解析を続行します。
  4. Gd5、超音波イメージングを実行 8、10、12、および 14。

2. 超音波システムの準備

  1. システムの電源を (図 1 a; 背面とコンピューターの主電源左のサイトでスタンバイ)、温水のプラットフォーム (図 1 b; コントロール パッドで)、およびゲルの暖かい (図 1)。
    注: 超音波ゲルは、約 0.5 h 間のウォーム アップする必要があります。
  2. イソフルランのユニットが十分に充填されてことを確認 (図 1)。
  3. ブラウザーで既存の研究では、新しい研究新しいシリーズを開きます。研究情報ウィンドウに必要な情報 (所有者、試験名、シリーズ名、動物データ) を入力します。[Ok]をクリックします。
  4. [Ok]をクリックすると、B モード画像ウィンドウが表示され、B モード画像処理が自動的に開始されますを確認します。

3. マウス処理

  1. マウスの anesthetization
    1. (図 1E) のノックダウンのボックスにマウスを置き、ボックスを閉じます、ノックダウンのボックスにイソフルラン管を開き、イソフルラン (濃度 3.5%) をオンにします。
    2. ときマウスが暖房プラットフォームの方向にチューブを開くことによってイソフルラン フローのリダイレクトし、ノックダウン ボックスへの流れを閉じるには麻酔、(へ濃度 1.5%) より低い。
      注: 十分な麻酔をまで待って追加 10 s 後マウスが移動されなくなります。
    3. 仰臥位での暖房プラットフォーム (図 1 階) にノックアウト ボックスから、マウスを迅速に転送し、優しくプラットフォーム上にある麻酔鼻チューブでその鼻を配置します。
  2. マウスの測定に備えて、脱毛、固定
    1. 目の乾燥を防ぐためには、マウスのそれぞれの目のクリームの目の保護を配置します。
    2. 温水のプラットフォーム (図 1 f) の 4 つの銅領域の各電極ゲルの一滴を配置します。
    3. 暖房プラットフォームの電極ゲル被覆部分にサージカル テープで足をタップします。
    4. 心電図をチェック [最適値 = 450-550 ビート/分 (BPM)] とすべての回で呼吸生理学。
      注: 直腸プローブを使用することにより体温測定可能ですが、必須ではありません。
    5. 場脱毛マウスの腹部にクリーム、こする綿棒と待機 1 分前後クリームは水に浸した湿布とクリームを削除します。すべての毛がなくなっている場合は、この手順を繰り返します。
    6. Depilated 皮膚上に予め温めておいた超音波ゲルを適用します。

4. 測定と画像や動画の取得

  1. 手で探触子 (図 1) を保持または保持装置にクランプ (図 1 H; 保持デバイスをお勧めします)。
  2. 探触子の膀胱を識別し、参照ポイントとして使用します。探触子をトレースした絵を腹部の左と右のサイトに移動します。
  3. 二次元のグレースケール画像の解剖学的構造の可視化の B モード
    1. 探触子を移動またはプラットフォーム テーブルの最初の注入が最大サイズで画面に表示されるまで、マウスが執着を加熱します。
      1. 画像ラベルを選択し、単一のフレーム、またはシネ ストア全体の注入測定のための cineloop を格納する格納する名前、またはフレーム ストア(名前のないストレージ) を入力してください。
    2. 探触子または UmA 内の血流が表示される位置に胎盤を持ってテーブルに移動します。1 つのフレームまたは cineloop を保存 (4.3.1.1 手順参照) 胎盤の測定のため。
      注: 胎盤測定は gd10 以降から可能です。
    3. 同じメソッドを使用してすべてで実行した場合に進みます。
  4. 視覚化し、血流の方向を決定するカラードプラ モード
    1. カラーボタンを押します。
    2. カラー ボックスを移動 (この地区では、信号が見える) トラック ボールを使用して、必要な位置に。必要に応じて、更新を押すことによって、[ボックスのサイズを変更し、trackball を動かす (右側/上方に大きく =; = 左側上下に小さい)。ボックスに適切なサイズがある場合は、選択を押します。
    3. 4.3.1.1 の手順で説明されているように単一のフレームまたは cineloops を格納します。
  5. 血液が流れる動脈 uterina (子宮動脈、UA) で血管を定量化するパルス波 (PW) ドップラー モードと仔馬
    1. 色ドップラーの買収にも関心の領域を探します。
      注: UA は膀胱に尾側に位置する、UmA は胎児と胎盤との間に位置します。
    2. プレス、 PWと破線が表示されます。この線を目的の血管に移動し、血流に沿った「ドップラー角度」つまみを使用してライン角度を調整。プレス更新
      注: 探触子と血流の方向と角度しなければならないすべての動物、特に 60 ° 以上の角度を使用する場合 (ここでは、Ua に対して 70 ° と 45 ° 未確認生物の使用された)。
    3. PW ドプラ アクイジション ・ ウィンドウに表示されるドップラー ラインの cineloop を格納します。

5. 見直しとデータ集録を仕上げと一連の保存

  1. データを確認するキーを押します研究管理します。目的のサムネイル画像をスクロールし、更新プログラムをダブルクリックします。
  2. 研究管理すぐブラウザー ウィンドウでデータ取得を終了し、保存記録シリーズ最初キーを押します。
    注: 一連を終了後、もうこのシリーズのフレームまたは cineloops を格納することはできません。

6. マウスの次のデータの取得を処理

  1. 乾燥圧縮の助けを借りてハイパーカプニア動物からゲルを削除します。
  2. 足からサージカル テープを慎重に削除します。
  3. イソフルラン チューブ (濃度 0%) を閉じます。
  4. Gd5、次超音波解析を進める 8、10、12。
    1. 場所動物だけで 5 分以上のケージの中に目覚め、オリエンテーションの時間があるので。
    2. 元のケージに戻るには、マウスを置きます。
      注: 電源を切らないで、イソフルラン ゲルとサージカル テープを削除する前にマウスを非常に迅速に覚ますよう (約 20 秒)、イソフルランをオフにした後。
  5. Gd14 で次の超音波解析を続行します。
    1. それは頚部転位によって覚ます前に女性を犠牲に。動物を開き、子宮を削除、別の胎児および胎盤、胎児と胎盤の重量を測定します。

7. コピーし、データをインポートします。

  1. エクスポート] をクリックして 1 つまたは複数の系列をマークし、ハード ディスクにデータをコピーするストレージ領域を選択します。
  2. コンピューターでソフトウェアを開くとコピーからクリックし、研究/シリーズ研究/シリーズをソフトウェアにインポートするのにはハード ディスクから。
  3. ソフトウェアを使用してデータを分析します。

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Representative Results

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この原稿で使用される超音波システムの個々 のコンポーネントは、図 1のとおりです。図 2に示す代表 gd5、8、10、12 の(B)対応する注入面積測定で B モード超音波画像取得結果(A)の重要な減少の注入領域を示すアンチ CD122 扱われる Cpa3Cre/+ gd10 以降からマウス。

図 3番組 (脱落膜によって、胎盤、胎児) 植の単一の部品 B モード (図 3 a) で獲得し、胎盤測定 (面積、厚さ、直径) を放冷 (図 3 b)。胎盤測定結果胎盤の面積が大幅減少 (図 3 a)、厚さ (図 3 b) と反 CD122 治療 Cpa3 の直径 (図 3)Cre/+マウスの gd10 と gd12 で WTs と比較されます。対照的に、胎盤の領域と直径 gd14 でグループ間で同等であったし、アンチ CD122 治療 Cpa3 で有意に増加した厚さCre/+ gd14 WTs と比較してマウス。

図 4は、gd14 で、胎児と胎盤の重量を示します。結果大幅 decreasedfetal 重量 (図 4 a), 匹敵する胎盤重量 (図 4 b) と大幅反 CD122 治療 Cpa3 の胎盤インデックス (FPI) (図 4)Cre/+マウスWTs。図 5を示していますと比較して WT マウス (図 5 a) の UA と収縮期波 (PSV) (図 5 b) の測定の代表的な PW ドプラ画像終了流速 (EDV) (図 5) と計算抵抗係数 (図 5)、すべての値がグループ間で同等であったという。図 6 gd14 の WT の胎仔馬の代表色ドップラー画像を示しています (図 6 a) および通常、存在しない、または逆に代表的な PW ドップラー画像終了拡張フロー (図 6 b) PV (図の測定6 C)、EDV (図 6)、収縮期血圧/拡張期比, (図 6 e) と抵抗 (図 6 階) のインデックスします。アンチ CD122 治療 Cpa3 の抵抗係数Cre/+マウスは WT マウスと比較して増加しました。

Figure 1
図 1: イメージング システム。メイン コントロール ユニット (A) 加熱プラットフォーム制御パッド (B)、ゲルの暖かい (C)、イソフルラン コントロール ユニット (D)、4 つの銅領域 (F; でノックダウン ボックス (E) 加熱プラットフォームF.1) 探触子 (G) と探触子デバイス (H) を保持します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: gd5、注入分野の比較 8、10、12.(WT Cpa3 から A) 注入エリア+/+ + PBS マウス (マウス n = 2-5、同腹の n = 1 日あたり 6-31) と MC/NK 欠損 Cpa3Cre/+ + アンチ CD122 マウス (マウス n = 3、同腹 n = 8-16 日あたり) gd5 で 8、10、12。結果は、各単一の注入および平均の個々 の値として表示されます。統計的な差異が対になっていないtを使用して得られた-テスト (* * p < 0.01 * * * p < 0.001)。(B) 代表的な超音波画像 Cpa3 から+/+ + gd5 (i)、gd8 (ii)、gd10 (iii)、および gd12 (iv) PBS マウス。gd、妊娠日;WT、野生型;三菱商事、肥満細胞;NK、ナチュラル キラー細胞.この図は、以前文書23から再発行されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: 胎盤測定 gd10、12、および 14 。(A) 代表的な超音波像脱落膜によって、胎盤、胎児を示す gd10 で WT 注入。(B) 代表的な超音波像胎盤厚 (厚) と胎盤径 (dia) を示す gd12 で WT 注入。胎盤領域 (C)、胎盤厚 (D) と WT Cpa3 から胎盤の径 (e)+/+ + PBS マウス (マウス n = 3-5、胎盤 n = 12-22 日あたり) と MC/NK 欠損 Cpa3Cre/+ + アンチ CD122 マウス (マウス n = 3-4、胎盤 n = 8-14 日あたり) で gd10、12 と14 の結果は、各単一胎盤および平均の個々 の値として掲載されています。統計的な差異が対になっていないtを使用して得られた-テスト (* p < 0.05 * * p < 0.01)。gd、妊娠日;WT、野生型;厚い、厚さ;dia、直径;三菱商事、肥満細胞;NK、ナチュラル キラー細胞.この図は、以前文書23から再発行されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4: 胎児と胎盤の重量測定と胎盤インデックス (FPI) gd14.胎子体重 (A)、胎盤重量は (B) と (C) FPIs WT Cpa3 の子孫から+/+ + PBS マウス (マウス n = 4、胎児・胎盤 n = 35) と MC/NK 欠損 Cpa3Cre/+ + アンチ CD122 マウス (マウス n = 3、胎児・胎盤 n = 28) gd14 で。結果は、個々 の値と平均値として掲載されています。対になっていない t 検定を用いて有意差が得られた (* p < 0.05 * * p < 0.01)。gd、妊娠日;WT、野生型;三菱商事、肥満細胞;NK、ナチュラル キラー細胞.この図は、以前文書23から再発行されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 5
図 5: gd10 で子宮動脈速度の解析。(A) 代表的なパルス波ドップラー画像 WT Cpa3 から+/+ + PSV と EDV PBS マウス。Cpa3 から子宮動脈の PSV (B)、EDV (C)、および抵抗のインデックス (D)+/+ + PBS (n = 3)、Cpa3Cre/+ + アンチ CD122 (n = 3) 妊娠の gd10 マウス。SEM. 統計解析の意味は、マン ・ ホイットニーの U 検定を用いて行われたように、データが掲載されています。gd、妊娠日;WT、野生型;三菱商事、肥満細胞;NK ナチュラル キラー細胞;PSV、収縮期波;EDV、最後流速。この図は、以前文書23から再発行されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 6
図 6: gd14 で臍動脈速度の解析。(Gd 14 で胎仔馬の代表 A) カラードプラ イメージ。(B) 代表的なパルス波ドップラー画像 Cpa3 から+/+ + PBS (i) と Cpa3Cre/+ + アンチ CD122 (ii, iii) マウス、通常示すエンドは不在の拡張期フロー (ii) (i) 拡張期の流れまたは逆エンド拡張のフロー (iii)。PSV (C)、EDV (D)、収縮期血圧/拡張期比 (E) と抵抗 (F) のインデックス Cpa3 から胎児の未確認生物+/+ + PBS (マウス n = 3、UmA 測定 n = 7)、Cpa3Cre/+ + アンチ CD122 (マウス n = 3、UmA 測定 n = 10) gd14 マウス。SEM. 統計解析の意味が対になっていないtを用いて行ったようにデータが表示されます-テスト (* p < 0.05)。UmA、臍動脈;gd、妊娠日;PSV、収縮期波;EDV、最後流速。この図は、以前文書23から再発行されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

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Discussion

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我々 は上 gd10 から MC/NK-欠乏の母親の胎児発育制限を実証私たち超音波システムを使用しています。さらに、gd10 と 12、減らされた胎盤の次元を見ましたと gd14 で不在または拡張期フロー uMC/uNK 欠損マウスのいくつかの胎児の未確認生物での復帰。貧しい血管新生のこの記号は、IUGR を示す動脈の大きな抵抗インデックスと関連付けられました。妊娠と胎児の幸福と IUGR のコースを理解することで、結果は uMCs と uNKs の重要な役割を確認します。

プロトコルは適用妊娠毎日 gd5 から以降 (着床) 後です。考慮する必要がありますプロトコルにはいくつかの重要なステップがあります。まず、毛の取り外しは慎重に行う必要があります。たとえば、脱毛クリームとの過剰な接触には、皮膚の炎症があります。ただし、不完全な脱毛は、信号干渉の画面上に影として表示に します。(影や粒子の粗い写真) が不足している信号を別の理由はマウスと超音波ビーム間に配置されたゲルのあまりにも低額にもできます。我々 の経験でむしろゲル (約 10 mL) の高量は十分な信号の表示に必要です。第二に、2 D の測定が不正確になりやすい何らかの形にすることができます。同腹の測定の違いを最小限に抑えるために注入を貫通するとき、最大の使用可能なサイズの使用をお勧めします。胎盤の正確な測定は、すべてで実行した場合は、UmA 血流を見ることができる方法で配置されました。さらに、間違いの源を最小限にするため常に同じ演算子が測定必要があります実行します。第三に、パルス波ドップラー計測用超音波ビームと血流の方向と角度をウォッチすることが重要です。高すぎる角度または単一の実験動物の間の別の角度は、不正確な速度測定する可能性があります。注意は、女性の反復的な anesthetization のリスクにも支給する必要があります。このリスクと母親のストレスを減らすためには、超音波測定は 1 日おき以上行う必要があります。

妊娠中妊娠関連日胎児をフォロー アップする可能性は、超音波技術の大きな利点です。別の妊娠時期を犠牲にするマウスに反して技術個々 の妊娠マウスの正確な縦断的解析を実行することが出来ます。この強さにもかかわらず考慮すべきシステムのいくつかの制限があります。たとえば、胎児は妊娠の過程で位置を変更可能性があります。したがって、異なる個々 の胎児時に取得した特定のデータ セットを割り当てることができません。また、時々 は、i) の位置は、梁で到達困難なすることができます、ii) 胎児が大きすぎて画面に合うように可能性がありますまたは iii) 彼らは腸の下に隠れることがあります後妊娠日、いくつかの胎児の監視されません。マウス緊張によって全体の注入測定は gd12 または gd14 まで可能です。後にのみ単一の臓器、心臓など、胎児を測定し、記録することができます。全体の注入自体は画面に収まるように妊娠後期の大きすぎます。

我々 の知る限り、超音波映像は (一緒に磁気共鳴画像やコンピューター断層撮影) 妊娠中妊娠で異なるいくつかの動物を犠牲にすることがなく示されたパラメーターを分析する唯一の方法日。これは血流と方向を正確に評価することができる唯一の方法であるドップラー イメージングのため特に (赤 = 超音波の方向にビーム; 青超音波ビームの反対の方向の流れを =)。パルス波ドップラー イメージング、超音波ビームと血流24の速度情報を提供する組織によって返されるいくつかのパルスを送信します。

超音波自体から母親と胎児は無害であるように、超音波検査は妊娠研究に最適です。それにもかかわらず、この原稿で説明する方法は多数他研究の領域にも適用できます。たとえば、システム 3 D 計測、可視化と、時間をかけて組織の動きの定量化ができます可視化血の腫瘍、細胞表面、血圧測定に関するバイオ マーカーの検出の流れし、超音波ガイド下注射。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

(特ににマグダレナ シュタイナー、カトリン ・ Suppelt、サンドラ ・ マイヤー) イメージング計測器会社、快適で高速サポートとイメージング システムとその利用状況を速やかにかつ完全にに関するすべての私たちの質問に答えるために感謝します。Cpa3 植民地を提供する教授ハンス ・ ライマーのよれば、博士トーステン ファイヤアーベント (DKFZ ハイデルベルク、ドイツ) に感謝しております。また、ステファニー Langwisch、マウス コロニーを担当していた人と、図 1 の画像を生成したに感謝いたします。

補助金によってドイツ研究振興協会 (DFG) から A.C.Z. (ZE526/6-1 および AZ526/6-2) に、DFG 優先順位プログラム 1394"マスト細胞における健康と病気"埋め込まれたプロジェクトを資金が供給された仕事およびイメージング システム

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LEAF anti-Maus CD122 (IL-2Rb) BioLegend 123204 Klon TM-β1; 500 µg
Vevo 2100 System  FujiFilm VisualSonics Inc. Transducer MS550D-0421
Vevo LAB Software  FujiFilm VisualSonics Inc.
Isoflurane Baxter PZN: 6497131
Electrode gel Parker 12_8
Surgical tape 3M Transpore 1527-1
Eye cream Bayer PZN: 1578675
Cotton tipped applicators Raucotupf 11969 100 pieces
Depilatory cream Reckitt Benckiser 2077626
Compresses Nobamed Paul Danz AG 856110 10 x 10 cm
Ultrasound gel Gello GmbH 246000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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<em>体内</em>の胎児と胎盤の開発の分析のための高周波超音波
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Meyer, N., Schüler, T., Zenclussen, A. C. High Frequency Ultrasound for the Analysis of Fetal and Placental Development In Vivo. J. Vis. Exp. (141), e58616, doi:10.3791/58616 (2018).More

Meyer, N., Schüler, T., Zenclussen, A. C. High Frequency Ultrasound for the Analysis of Fetal and Placental Development In Vivo. J. Vis. Exp. (141), e58616, doi:10.3791/58616 (2018).

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