Summary
هنا، يمكننا وصف البروتوكول وتنفيذ الميثيل-Seq، منصة ابيجينوميك، باستخدام نموذج الفئران لتحديد تغييرات جينية المرتبطة بالتعرض للإجهاد المزمن. النتائج تبين أن منصة Seq الميثيل الفئران قادرة على اكتشاف الاختلافات مثلايشن التي تنشأ من التعرض للإجهاد في الفئران.
Abstract
كلما توفرت مورثات من طائفة متنوعة من الحيوانات، هناك حاجة متزايدة للأدوات التي يمكن التقاط دينامية تغييرات جينية في هذه النماذج الحيوانية. الفأر هو الحيوان نموذج معين واحد حيث أداة جينية يمكن أن تكمل العديد من الدراسات الدوائية والسلوكية لتوفير المعلومات آليا الثاقبة. وتحقيقا لهذه الغاية، علينا تكييف "نظام التقاط الهدف سوريسيليكت" (المشار إليها ك Seq الميثيل) للفئران، التي يمكن تقييم مستويات مثلايشن الحمض النووي عبر جينوم الفئران. واستهدفت تصميم الفئران المروجين والبد جزر وشواطئ الجزيرة والمناطق الغنية GC من جميع ريفسيق الجينات.
لتنفيذ منهاج العمل في تجربة الفئران، الفئران "سبراغ داولي" الذكور يتعرضون للإجهاد المزمن المتغير لمدة 3 أسابيع، بعد ذلك تم جمع عينات الدم لاستخراج الحمض النووي الجينوم. وشيدت المكتبات Seq الميثيل من عينات الحمض النووي الفئران بالقص وربط محول وإثراء الهدف، بيكبريتيت التحويل والإرسال المتعدد. المكتبات كانت متسلسلة على منصة الجيل التالي تسلسل وحللت ما يلي تسلسل زمني لتحديد DMRs بين الحمض النووي فئران أكد وبهيج. DMRs المرشح العلوي كانت تؤيدها بشكل مستقل بيكبريتيت بيروسيكوينسينج للتأكد من متانة النظام الأساسي.
النتائج تبين بأن منهاج Seq الميثيل الفئران أداة جينية مفيدة يمكن التقاط مثلايشن التغييرات الناجمة عن التعرض التأكيد.
Introduction
السلف في التسلسل الفائق أدت إلى ثروة تسلسل الجينوم للنموذج والكائنات الحية غير نموذجية. وسهلت توافر هذه التسلسلات البحوث في علم الوراثة وعلم الجينوم المقارن، وترانسكريبتوميكس. على سبيل المثال، تسلسل الجينوم المتوفرة مفيدة للغاية لمحاذاة البيانات تسلسل من تجارب Seq رقاقة التي تثري الحمض النووي استناداً إلى ارتباطه مع هستون التعديلات1، أو تسلسل بيكبريتيت، الذي يقيس مثلايشن الحمض النووي قبل اكتشاف اليوراسيل تكونت من تحويل بيكبريتيت سيتوسينيس أونميثيلاتيد2. ومع ذلك، كانت هناك تأخيرات في تنفيذ مناهج ابيجينوميك التي تتضمن بيانات تسلسل الجينوم متاحة في تصميمها بسبب الافتقار إلى البيانات المشروح لإبلاغها متواليات التنظيمية التي يمكن أن تؤثر على وظيفة الجينات.
على وجه الخصوص، مثلايشن الحمض النووي هو واحد من تعديلات جينية درس على نطاق واسع في الحمض النووي التي يمكن الاستفادة من البيانات الجينية المتاحة لبناء منصة ميثيلوميك. واحد هذه الأمثلة هو منصة المستندة إلى الصفيف مثيلوم البشرية3، التي تستخدم على نطاق واسع في مختلف التخصصات من الأورام للطب النفسي4،5. ولسوء الحظ، منصات مشابهة لنماذج حيوانية غير البشرية نادرة، كما أن هناك تقريبا لا تستخدم على نطاق واسع المنصات التي استفادت من تسلسل الجينوم في تصميمها الأولى.
أسلوب شائع لتقييم المناظر الطبيعية ميثيلوميك من نماذج حيوانية غير البشرية انخفاض تمثيل بيكبريتيت التسلسل (رربس)6. وهذا النهج ويتغلب على تكلفة تسلسل بيكبريتيت الجينوم كل ذلك، بينما توفر المناظر الطبيعية ميثيلوميك شامل، يوفر تغطية القراءة-عمق أقل بسبب التكلفة ومحدودية المعلومات الفنية في المناطق الفقيرة بالجينات الكبيرة الجينوم2 . رربس ينطوي على خلاصة القيد واختيار حجم من الحمض النووي لإثراء للغاية الغنية GC متواليات مثل جزر البد التي وجدت بالقرب من مروجي الجينات ويعتقد أن تلعب دوراً في تنظيم الجينات7عادة. في حين قد استخدمت الأسلوب رربس في عدد من الدراسات الهامة، إلى الاعتماد على إنزيمات التقييد لا يخلو أبرز التحديات والقيود. على سبيل المثال، إثراء لتسلسل GC الغنية في رربس اعتماداً كلياً على وجود تسلسل معين المعترف بها من قبل إنزيم تقييد التحديد حجم اللاحقة بالتفريد. وهذا يعني استبعاد أي مناطق الجينوم التي لا تحتوي على هذه المواقع تقييد أثناء اختيار الحجم. أيضا، تشكل تحديا مقارنات عبر الأنواع إلا إذا كان نفس المواقع بتقييد موجودة في المكان نفسه فيما بين الأنواع المختلفة.
نهج واحد للتغلب على القيود المفروضة على رربس هو استخدام أسلوب إثراء الذي يستفيد من تسلسل الجينوم المنشورة في تصميم منهاج العمل. يستخدم المنهاج البشري القائم على صفيف التمهيدي المسابر المصممة ضد المعبأة معينة محددة اليل (CG مقابل تيراغرام بعد التحويل بيكبريتيت) هدف التمديد الصلب والتمهيدي. ويعكس تصميمها ليس فقط المتاحة تسلسل الجينوم البشري، ولكن التحقق منها تجريبيا المناطق التنظيمية المكتسبة من عدة أسطر من التحقيق، مثل ترميز وانسيمبل8. على الرغم من استخدامه على نطاق واسع في التحقيقات ميثيلوميك البشرية، لا توجد منصة مماثلة للحيوانات النموذجية. وباﻹضافة إلى ذلك، تنسيق المستندة إلى صفيف يضع قيد كبير على مساحة السطح المتوفرة لموضع التحقيق. في السنوات العديدة الماضية، بذلت جهود الجمع بين الهدف-خصوصية تتيحها تصميم المسبار الالتقاط والميزة الفائق من الجيل التالي التسلسل. مسعى من هذا القبيل قد أدى نظام الإثراء المستهدف على أساس تسلسل الجينوم الماوس (الماوس Seq الميثيل)، الذي كان يستخدم لتحديد الاختلافات الخاصة بالدماغ أو بفعل جلوكوكورتيكويد في مثلايشن9،10. منصات مشابهة لنموذج ونموذج غير الحيوانات الأخرى ضرورية لتيسير البحوث ابيجينوميك في هذه الحيوانات.
هنا، علينا أن نظهر تنفيذ منهاج هذه الرواية إجراء تحليل ميثيلوميك في الفئران. الفئران بمثابة نموذج حيوانية هامة في علم الصيدلة، والايض، ونيوروندوكرينولوجي، والسلوك. على سبيل المثال، هناك حاجة متزايدة لفهم الآليات الكامنة التي تؤدي إلى سمية العقاقير، والسمنة، وإجهاد استجابة، أو الإدمان على المخدرات. منصة الفائق قادرة على التقاط التغييرات ميثيلوميك المرتبطة بهذه الشروط ستزيد من فهمنا للآليات. حيث لا يزال يفتقر جينوم الفئران إلى الشرح للمناطق التنظيمية، أدرجت المروجين غير زائدة، جزر البد، وشواطئ الجزيرة11، وسبق تحديد التسلسلات GC الغنية في الفئران Seq الميثيل منهاج12.
لتقييم النجاح في تصميم وتنفيذ برنامج "تخصيب الهدف سوريسيليكت" (يشار إليها عموما Seq الميثيل) لجينوم الفئران، استخدمنا نموذج الفئران ل الإجهاد المزمن متغير (السير الذاتية)13 تحديد الأثران ميثليته المناطق بين الحيوانات بهيج وأكد. لدينا تصميم منصة والبروتوكول، والتنفيذ قد يكون مفيداً للمحققين الذين قد يرغبون في إجراء تحقيقات شاملة وغير متحيزة جينية في الكائن حي الذي تسلسل الجينوم متاحة بالفعل، لكنها لا تزال سيئة المشروح.
Protocol
جميع التجارب التي أنجزت وفقا والامتثال لجميع التنظيمية والمؤسسية المبادئ التوجيهية ذات الصلة، بما في ذلك استخدام لجنة في "مدرسة جونز هوبكنز للطب" ورعاية الحيوان المؤسسية.
1-الحيوانات
- الحصول على الفئران سبراغ داولي المراهقين الذكور في 4 أسابيع عمر. بيت الحيوانات في أقفاص الجرذان البولي في درجة حرارة-وتوفر غرفة التحكم في الرطوبة في ح 12، ح 12 الظلام دائرة ضوء مع ظهور الضوء في 0600 h. الحيوانات مع إعلانية libitum الوصول إلى المياه.
- السماح للفئران إلى تأقلم لمدة أسبوع واحد للحد من التوتر المرتبطة بالنقل. بيت زوج الحيوانات (N = 16) يحول دون عزل الإجهاد، وتبدأ في 5 أسابيع من العمر، متغير المزمنة التشديد على نظام (السير الذاتية) لمدة 3 أسابيع.
2-المزمن الإجهاد متغير
- إدارة نظام السير الذاتية مرة واحدة في الصباح (9-11:00 ص) ومرة واحدة في فترة بعد الظهر (1 – 03:00 م) في أوقات غير منتظمة للحفاظ على روتين لا يمكن التنبؤ بها. تتضمن عوامل الإجهاد معتدل بين عشية وضحاها. نظام "السير الذاتية" ويشمل: ح 1) 3 في اسطوانة ضبط النفس؛ 2) السباحة 10 دقيقة؛ إمالة قفص ح 3) 3، 4) ح 1 بطء تهز النظام الأساسي؛ و 5) ح 1 في غرفة باردة 4 درجات مئوية.
ملاحظة: الإجهاد بين عشية وضحاها تشمل الاستبعاد الاجتماعي (5 في القفص)، والعزلة الاجتماعية، الأسرة الرطب، التقييد الغذائي، وأضواء على. ويرد جدول أسبوعي نموذجي لنظام الإجهاد في الجدول 1.
3-الغدد الصماء فحوصات
-
تحديد مستويات القشري (كورت) باستخدام عينات الدم (~ 50 مل) ذيل جمعها في نفس الوقت (09:00 ص) مرتين في الأسبوع في جميع أنحاء هذه التجربة، قبل نظام السير الذاتية لإنشاء مستويات هرمون خط الأساس (يوم 0)، مرة واحدة خلال منتصف الذاتية أسبوعية (الأيام 4,11، و 18)، بعد كل 7 أيام من السير الذاتية (7 أيام و 14)، وفي ختام السيرة الذاتية (21 يوم). جمع عينات الدم قبل نظام الإجهاد اليومية.
- جمع عينة الدم الجذع نهائية واحدة أثناء القتل الرحيم (25 يوم) لريا واستخراج الحمض النووي الجينوم.
- الطرد المركزي جميع عينات الدم (600 x ز، 4 درجة مئوية، 10 دقيقة) لفصل البلازما من خلايا الدم. بيبيت من البلازما (المادة طافية) وتخزين العينات في-80 درجة مئوية.
- ذوبان الجليد واستخدام البلازما لتحديد مستويات كورت ب radioimmunoassay (ريا). ضمان أن كورت البلازما الأسبوع 3 المستويات مرتفعة في الحيوانات المجهدة للتحقق من مدى متانة نظام الإجهاد.
4-السلوك
- بعد على نظام السير الذاتية (أيام 23 – 24)، تقييم كل الحيوانات للسلوك مثل القلق على مرتفعة بالإضافة إلى متاهة (EPM)14.
- استخدام كاميرا فيديو، سجل الحيوانات على الجهاز EPM 300 s وتسجيل الوقت الذي يقضيه في الوسط، أغلقت الأسلحة، وفتح الأسلحة.
5-تصميم الفئران الميثيل-Seq
- استخدام "مستعرض الجينوم التسخن"، الحصول على إحداثيات الجينوم غير زائدة (الفئران الجمعية rn4 نوفمبر 2004) البد جزر وشواطئ جزيرة (± 1 كيلوبايت المرافقة جزر البد)، والمروجين (± 1 كيلو بايت لكل خدمات الدعم التقني) لكل جين ريفسيق، وتسلسل الأخرى التي قد تكون متاحة من المؤلفات ذات الصلة.
ملاحظة: للفئران Seq الميثيل، تمت إضافة إضافية GC الغنية متواليات من منصة مثلايشن المستندة إلى الصفيف سابق12. أخذت عينات مناطق بديلة من 500 bps لمناطق أكبر من 5 كيلو بايت في الثانية، تليها 1 كيلو بايت في الثانية التي تم تخطيها. تصميم Seq الميثيل الفئران النهائي يتكون من 111 ميغابايت في الثانية، 2.3 مليون المعبأة؛ وحجم متوسط منطقة 594 بت في الثانية. وهو يستهدف المكاني الفريد 228,800. - الدخول قائمة مجمعة لإحداثيات الجينوم في برنامج تصميم التقاط هدف متوفرة تجارياً لتصميم التحقيق المناسب.
6-بناء المكتبة الفئران Seq الميثيل من الحمض النووي
ملاحظة: لإزالة الآثار دفعة، تجهيز عينات متعددة في نفس الوقت، والارتقاء يمزج رئيسية تبعاً لذلك. استخراج الحمض النووي باستخدام مجموعة أدوات استخراج الحمض النووي متاحة تجارياً. عمود أو هطول الأمطار-أساليب قائمة على كلا تسفر عن الحمض النووي عالي الجودة (نسبة ~ 1.8 من 260/280). لا ينصح باستخدام أساليب تستند الفينول. الوتي أو ريسوسبيند الحمض النووي في المخزن المؤقت "الشركة المصرية للاتصالات المنخفضة" (مم TE، 0.1 مم يدتا، pH 8.0 من 10).
- إعداد نموذج
ملاحظة: لكل خطوة باستخدام الحمض النووي ملزم المغناطيسي الخرز، تأكد الخرز تأقلم بدرجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل وتمتزج جيدا قبل الاستخدام.- قص الحمض النووي
- استخدام فلوروميتير لتحديد تركيز الحمض النووي المزدوج-الذين تقطعت بهم السبل الأولية لكل عينة. تمييع > 1 ميكروغرام من جدنا إلى 50 ميليلتر مع العازلة TE منخفضة (10 ملم TE، 0.1 مم يدتا، pH 8.0) في أنابيب ميكروسينتريفوجي الحمض النووي ملزم منخفضة.
- القص العينات باستخدام سونيكاتور متحاور (10% دورة العمل، وكثافة 5، 200 دورات كل الاندفاع، 6 دورات 60 s، وتواتر أعمال التجريف، 4 درجة مئوية).
- تقييم الجودة للحمض النووي باستخدام نظام قائم على التفريد الذي يقيس حجم الحمض النووي والكمية.
ملاحظة: الحمض النووي المبلغ الموصى به هو 1 ميكروغرام، أو 3 ميكروغرام. إذا لم يكن هناك محدودة ابتداء من المواد، ينبغي أن يكون أدنى مقدار الإدخال > 500 نانوغرام، كمبالغ أدنى ستؤثر سلبا على كمية ونوعية للمكتبات التي تم إنشاؤها.
- ينتهي إصلاح الحمض النووي.
- استخدام الفئران مجموعة الميثيل Seq لتحضير هذا المزيج نهاية-إصلاح الأصول الرأسمالية على الجليد. إضافة ميليلتر 52 من مزيج لكل عينة واحتضان في cycler حرارية دون غطاء ساخن (20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، عقد 4 درجات مئوية).
نهاية-إصلاح ميكس ماجستير (لكل عينة):
35.2 ميليلتر من الماء
10 ميليلتر من نهاية إصلاح المخزن المؤقت (10 x)
1.6 ميليلتر من دنتب ميكس
1 ميليلتر من T4 بوليميراز الدنا
2 ميليلتر من بوليميريز الحمض النووي كلينوو
2.2 ميليلتر من T4 بولينوكليوتيدي كيناز - تنقية العينات باستخدام ميليلتر 180 من الحمض النووي ملزم المغناطيسي الخرز و 400 ميليلتر من الإيثانول 70% طازجة كل عينة. إضافة ميليلتر 180 من حبات لكل عينة واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بيليه الخرز وإزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 200 ميليلتر من الإيثانول 70%. إزالة الإيثانول وتكرار الغسيل مرة واحدة.
- استخدم لوحة مغناطيسية لبيليه الخرز وإزالة الإيثانول قدر الإمكان. الجافة في 37 درجة مئوية الجاف هياتبلوك لمدة 3-5 دقيقة حتى بيليه حبة نهائياً. ريسوسبيند في ميليلتر 44 مياه خالية من نوكلاس وجمع ما يقرب من 42 ميليلتر من المادة طافية.
نقطة التوقف: بعد انتهاء تصليح الحمض النووي، عينات قد تكون مختومة والمخزنة في-20 درجة مئوية.
- استخدام الفئران مجموعة الميثيل Seq لتحضير هذا المزيج نهاية-إصلاح الأصول الرأسمالية على الجليد. إضافة ميليلتر 52 من مزيج لكل عينة واحتضان في cycler حرارية دون غطاء ساخن (20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، عقد 4 درجات مئوية).
- وينتهي أدينيلاتي 3 '.
- إعداد مزيج الرئيسي أدينيليشن على الجليد. إضافة 9 ميليلتر ميكس لكل عينة واحتضان في cycler حرارية دون غطاء دافئ (37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، عقد 4 درجات مئوية).
سيد أدينيلاتيون ميكس (لكل عينة):
5 ميليلتر من المخزن المؤقت كلينوو
1 ميليلتر من داتب
3 ميليلتر من بوليميريز الحمض النووي كلينوو - تنقية العينات باستخدام ميليلتر 90 من الحمض النووي ملزم المغناطيسي الخرز و 400 ميليلتر من الإيثانول 70% طازجة كل عينة. إضافة ميليلتر 90 من حبات لكل عينة واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بيليه الخرز وإزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 200 ميليلتر من الإيثانول 70%. إزالة الإيثانول وتكرار الغسيل مرة واحدة.
- استخدم لوحة مغناطيسية لبيليه الخرز وإزالة الإيثانول قدر الإمكان. الجافة في 37 درجة مئوية الجاف هياتبلوك لمدة 3-5 دقيقة حتى بيليه حبة نهائياً. ريسوسبيند في 35 ميليلتر من المياه خالية من نوكلياسي وجمع حوالي 33.5 ميليلتر من المادة طافية.
- إعداد مزيج الرئيسي أدينيليشن على الجليد. إضافة 9 ميليلتر ميكس لكل عينة واحتضان في cycler حرارية دون غطاء دافئ (37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، عقد 4 درجات مئوية).
- اضطر المحول ميثليته.
- إعداد مزيج الرئيسي ربط على الجليد وإضافة 16.5 ميليلتر من مزيج لكل عينة. احتضان في cycler حرارية دون غطاء ساخن (20 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، عقد 4 درجات مئوية).
مزيج الرئيسي ربط (كل عينة):
2.5 ميليلتر من الماء
2.5 ميليلتر من الميثيل Seq ميثليته محول
10 ميليلتر من T4 الحمض النووي ليجاسى المخزن المؤقت (5 س)
1.5 ميليلتر من ليجاسى الحمض النووي T4 - تنقية العينات باستخدام ميليلتر 90 من الحمض النووي ملزم المغناطيسي الخرز و 400 ميليلتر من الإيثانول 70% طازجة كل عينة. إضافة ميليلتر 90 من حبات لكل عينة واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بيليه الخرز وإزالة المادة طافية ريسوسبيند بيليه في 200 ميليلتر من الإيثانول 70%. إزالة الإيثانول وتكرار الغسيل مرة واحدة.
- استخدم لوحة مغناطيسية لبيليه الخرز وإزالة الإيثانول قدر الإمكان. الجافة في 37 درجة مئوية الجاف هيتبلوك لمدة 3-5 دقيقة حتى بيليه حبة نهائياً. ريسوسبيند في 22 ميليلتر من المياه خالية من نوكلاس وجمع حوالي 22 ميليلتر من المادة طافية. تقييم الجودة باستخدام بيواناليزير.
ملاحظة: إذا كان المبلغ الإجمالي للحمض النووي هو أقل من 500 نانوغرام، القص وعملية إضافية الحمض النووي قبل الشروع في الخطوات اللاحقة. إذا كان متوسط حجم الحمض النووي لا يزيد بأكثر من 30 bps، تحقق للتأكد من أن الكواشف الجديدة، بوليميراز الدنا T4، كلينوو، و/أو T4 ليجاسى قد تكون قديمة.
نقطة التوقف: بعد ليجاتينج محول ميثليته، عينات قد تكون مختومة والمخزنة في-20 درجة مئوية.
- إعداد مزيج الرئيسي ربط على الجليد وإضافة 16.5 ميليلتر من مزيج لكل عينة. احتضان في cycler حرارية دون غطاء ساخن (20 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، عقد 4 درجات مئوية).
- قص الحمض النووي
- تهجين
- نقل العينات إلى أنابيب ميكروسينتريفوجي الحمض النووي ملزم منخفضة واستخدام مركز فراغ ساخنة لتقليل حجم العينة إلى إعادة عينات ميليلتر-أقل من 3.4 إلى 3.4 ميليلتر.
ملاحظة: تركيز العينات لحوالي ~ 3 ميليلتر ضمان إزالة عينات من مركزات فراغ قبل كل سائل يتبخر. - إعداد المخزن المؤقت التهجين في درجة حرارة الغرفة و "المزيج كتلة" Seq الميثيل على الجليد. إضافة ميليلتر 5.6 المزيج كتلة Seq الميثيل لكل عينة واحتضان في cycler الحرارية (95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، 65 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، عقد 65 درجة مئوية).
المخزن المؤقت التهجين (كل عينة):
6.63 ميليلتر من الميثيل Seq هيب 1
0.27 ميليلتر من الميثيل Seq هيب 2
2.65 ميليلتر من الميثيل Seq هيب 3
ميليلتر 3.45 من الميثيل Seq هيب 4
ميكس كتلة Seq الميثيل (كل عينة):
2.5 ميليلتر الميثيل Seq الفهرسة الكتلة 1
2.5 ميليلتر من كتلة Seq الميثيل 2
ميليلتر 0.6 Seq الميثيل كتلة 3 - إعداد "رناسي كتلة خليط" ومزيج التهجين "التقاط المكتبة". إضافة 20 ميليلتر من "التقاط ميكس التهجين مكتبة" لكل عينة واحتضان عند 65 درجة مئوية على الأقل 16 ح.
رناسي المزيج كتلة (كل عينة):
0.5 ميليلتر من كتلة رناسي
1.5 ميليلتر من الماء
التقاط "ميكس التهجين مكتبة" (كل عينة):
13 ميليلتر من التهجين المخزن المؤقت
2 ميليلتر من المزيج كتلة رناسي
5 ميليلتر من الفئران الميثيل-Seq التقاط المكتبة
ملاحظة: الاحتفاظ بردود الفعل على 65 درجة مئوية عند إضافة "مزيج التهجين" لمنع الربط غير محددة. - الكوة 50 ميليلتر من حبات ستريبتافيدين المغناطيسي كل عينة في أنبوب قطاع 8 آبار جديدة. أغسل حبات مع 200 ميليلتر الميثيل Seq ملزمة المخزن المؤقت. استخدام اللوحة المغناطيسية لبيليه الخرز وإزالة المادة طافية بين كل المياه والصرف الصحي لما مجموعة 3 يغسل. بعد الغسيل النهائي، ريسوسبيند حبات ستريبتافيدين في 200 ميليلتر الميثيل Seq ملزمة المخزن المؤقت.
- إضافة عينات إلى 200 ميليلتر من حبات مغناطيسية ستريبتافيدين غسلها واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة استخدام خلاط الدورية. بينما خلط، ميليلتر 200 اليكووت الميثيل Seq يغسل المخزن المؤقت 2 في ثلاث آبار لصفيحة 96-جيدا كل عينة ومكان في cycler حرارية قبل الحارة إلى 65 درجة مئوية.
- بعد الحضانة، بيليه الخرز ستريبتافيدين المغناطيسي باستخدام اللوحة المغناطيسية وريسوسبيند الخرز في 200 ميليلتر الميثيل Seq يغسل المخزن المؤقت 1. احتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. استخدم لوحة مغناطيسية لبيليه، وتجاهل المادة طافية.
- أغسل حبات 3 مرات مع الميثيل Seq يغسل المخزن المؤقت 2: ريسوسبيند بيليه حبة في 200 ميليلتر ليغسل 2 المخزن المؤقت (درجة حرارة مسبقاً في الخطوة 6.2.5.)، واحتضان الخرز في cycler الحرارية (65 درجة مئوية، 10 دقيقة)، وبيليه الخرز. تجاهل المادة طافية بعد كل غسل باستخدام لوحة مغناطيسية.
ملاحظة: الاحتفاظ بردود فعل التهجين عند 65 درجة مئوية عند إضافة 2 المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي لمنع الربط غير محددة. - إضافة 20 ميليلتر الميثيل Seq شطف المخزن المؤقت الخرز غسلها واحتضان في درجة حرارة الغرفة لاستخدام لوحة مغناطيسي الخرز بيليه ونقل طافية إلى أنبوب قطاع جديد 20 دقيقة. تجاهل الخرز.
ملاحظة: حين تفرخ، إعداد كاشف بيكبريتيت التحويل.
- نقل العينات إلى أنابيب ميكروسينتريفوجي الحمض النووي ملزم منخفضة واستخدام مركز فراغ ساخنة لتقليل حجم العينة إلى إعادة عينات ميليلتر-أقل من 3.4 إلى 3.4 ميليلتر.
- بيكبريتيت التحويل
ملاحظة: إجراء تحويل بيكبريتيت ssDNA التيد استخدام الكواشف الملائمة والتعليمات من أدوات تحويل بيكبريتيت متاحة تجارياً.- إضافة 130 ميليلتر بيكبريتيت استعداد التحويل الكاشف إلى المادة طافية من الخطوة السابقة. تقسيم كل من 150 ميليلتر ردود فعل على قدم المساواة إلى بئرين. احتضان في cycler حرارية (64 درجة مئوية، ل 2.5 ح، عقد 4 درجات مئوية).
ملاحظة: يتم تقسيم 150 ميليلتر رد فعل على قدم المساواة إلى بئرين منفصلة لضمان درجة حرارة متجانسة. بعد حضانة ح 2.5، مباشرة انتقل إلى الخطوة التالية. - ربط عينات تدور الأعمدة عن طريق إضافة 600 ميليلتر من "المخزن المؤقت ملزم" ويغسل مرة واحدة مع 100 ميليلتر من "المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي". الطرد المركزي الأعمدة (15,000 س ز، 1 دقيقة) بين جميع خطوات التحويل بيكبريتيت وتجاهل التدفق من خلال.
- عينات ديسولفوناتي بإضافة 200 ميليلتر من المخزن المؤقت ديسولفوناتيون للأعمدة. احتضان في درجة حرارة الغرفة للطرد المركزي تكرار 15-20 دقيقة، وتجاهل التدفق من خلال.
- غسل الأعمدة مرتين مع 200 ميليلتر "يغسل المخزن المؤقت". الوتي كل العينة بإضافة 10 ميليلتر من "شطف المخزن المؤقت" للعمود، حضانة لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وسينتريفوجينج (15,000 س ز، 1 دقيقة). كرر الخطوة شطف لما مجموعة 20 ميليلتر.
- إعداد تفاعل PCR 1 ميكس ماجستير في الجليد. إضافة ميليلتر 82 من مزيج لكل عينة. احتضان في cycler حرارية مع البرنامج التالي.
بكر رد الفعل الرئيسي ميكس 1 (كل عينة):
30 ميليلتر من الماء
50 ميليلتر الميثيل Seq بكر ماجستير المزيج
1 ميليلتر من الميثيل Seq PCR1 التمهيدي و
1 ميليلتر من الميثيل Seq PCR1 التمهيدي R
برنامج Cycler الحرارية:
المرحلة 1، دورة 1: 95 ° ج 2 دقيقة
المرحلة 2، 8 دورات: s 95 درجة مئوية 30، 60 درجة مئوية 30 ق، ق 72 درجة مئوية 30
المرحلة 3، دورة 1: 72 ° ج 7 دقيقة
المرحلة 4، دورة 1: 4 درجات مئوية عقد - تنقية العينات باستخدام ميليلتر 180 من الحمض النووي ملزم المغناطيسي الخرز و 400 ميليلتر من الإيثانول 70% طازجة كل عينة. إضافة ميليلتر 180 من حبات لكل عينة واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بيليه الخرز وإزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 200 ميليلتر من الإيثانول 70%. إزالة الإيثانول وتكرار الغسيل مرة واحدة.
- استخدم لوحة مغناطيسية لبيليه الخرز وإزالة الإيثانول قدر الإمكان. الجافة في 37 درجة مئوية الجاف هيتبلوك لمدة 3-5 دقيقة حتى بيليه حبة نهائياً. ريسوسبيند في 21 ميليلتر من المياه خالية من نوكلاس وجمع حوالي 19.5 ميليلتر من المادة طافية.
- إضافة 130 ميليلتر بيكبريتيت استعداد التحويل الكاشف إلى المادة طافية من الخطوة السابقة. تقسيم كل من 150 ميليلتر ردود فعل على قدم المساواة إلى بئرين. احتضان في cycler حرارية (64 درجة مئوية، ل 2.5 ح، عقد 4 درجات مئوية).
- الفهرسة
- إعداد رد بكر سيد ميكس 2 على الجليد. إضافة ميليلتر 25.5 2 ميكس ماستر لكل عينة. إضافة 5 ميليلتر التجارية الفهرسة كبسولة تفجير لعينات الأفراد واحتضان في cycler حرارية.
بكر رد فعل مزيج الرئيسي 2 (لكل عينة):
25 ميليلتر الميثيل Seq بكر سيد ميكس
0.5 ميليلتر الميثيل Seq التمهيدي الفهرسة المشتركة
برنامج Cycler الحرارية:
المرحلة 1، دورة 1: 95 ° ج 2 دقيقة
المرحلة 2، 6 دورات: s 95 درجة مئوية 30، 60 درجة مئوية 30 ق، ق 72 درجة مئوية 30
المرحلة 3، دورة 1: 72 ° ج 7 دقيقة
المرحلة 4، دورة 1: 4 درجات مئوية عقد
ملاحظة: قد تكون ضرورية إذا كان تركيز الحمض النووي انطلاق أدناه القيم الموصى بها دورات إضافية (2-3). - تنقية العينات باستخدام ميليلتر 90 من الحمض النووي ملزم المغناطيسي الخرز و 400 ميليلتر من الإيثانول 70% طازجة كل عينة. إضافة ميليلتر 90 من حبات لكل عينة واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بيليه الخرز وإزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 200 ميليلتر من الإيثانول 70%. إزالة الإيثانول وتكرار الغسيل مرة واحدة.
- استخدم لوحة مغناطيسية لبيليه الخرز وإزالة الإيثانول قدر الإمكان. الجافة في 37 درجة مئوية الجاف هيتبلوك لمدة 3-5 دقيقة حتى بيليه حبة نهائياً. ريسوسبيند في 24 ميليلتر من المياه خالية من نوكلياسي وجمع حوالي 24 ميليلتر من المادة طافية.
- تقييم تركيز وحجم بي بي باستخدام الكواشف الكشف عن الحمض النووي حساسية عالية في بيواناليزير.
ملاحظة: إذا فشل بيواناليزير الكشف عن وجود مكتبة الحمض النووي، كرر الخطوات إعداد مع الحمض النووي الإضافي.
وقف نقطة: بعد تنقية، قد تكون مختومة العينات مفهرسة والمخزنة في-20 درجة مئوية. - تجميع عينات لمنصة مناسبة الجيل التالي التسلسل المستخدمة.
- استخدام البيانات تركيز بيواناليزير، الذي يحدد molarity الحمض النووي استناداً إلى حجم المكتبة وكمية في حجم معين، يضعف مع المخزن المؤقت "الشركة المصرية للاتصالات المنخفضة" (6.1.1.1) وضم جميع العينات بتركيز نهائي من 15 بعد الظهر.
ملاحظة: أسلوب أكثر حساسية للتحديد الكمي للمكتبة بالكمي PCR في الوقت الحقيقي باستخدام كبسولة تفجير تستهدف المحولات الواصلة. - تشغيل العينات المجمعة على عدد الممرات التي تكفي لعينات 4 كل حارة في التسلسل الجيل القادم.
ملاحظة: على سبيل المثال، إذا تم فهرستها 16 مكتبة عينات وجنبا إلى جنب فريد، تشغيل المكتبات أكثر من 4 حارات، أي ما يعادل 4 عينات كل حارة.
- استخدام البيانات تركيز بيواناليزير، الذي يحدد molarity الحمض النووي استناداً إلى حجم المكتبة وكمية في حجم معين، يضعف مع المخزن المؤقت "الشركة المصرية للاتصالات المنخفضة" (6.1.1.1) وضم جميع العينات بتركيز نهائي من 15 بعد الظهر.
- إعداد رد بكر سيد ميكس 2 على الجليد. إضافة ميليلتر 25.5 2 ميكس ماستر لكل عينة. إضافة 5 ميليلتر التجارية الفهرسة كبسولة تفجير لعينات الأفراد واحتضان في cycler حرارية.
7-التسلسل في التسلسل الجيل التالي
- إرسال العينات إلى تسلسل المؤسسية الأساسية لتجميع مكتبة Seq الميثيل، متبوعاً بالتسلسل على جهاز تسلسل الجيل القادم.
8-تحليل لتحديد DMRs
- تنفيذ بيسمارك15، الذي يستدعي Bowtie 2.0 كتسلسل داخلية راصفة16،17، لمحاذاة الخام يقرأ الإدخال للجينوم تحويلها بيكبريتيت، زائد-حبلا. بعد المحاذاة، استخدم في Bismark_methylation_extractor للقيام بمراقبة الجودة وتعيين قيمة مثلايشن المقدرة لكل البد.
- إنشاء قائمة DMRs مع حزمة BS Seq18 في بيوكوندوكتور. تصفية DMRs استناداً إلى وجود أكبر من 3 المعبأة على التوالي وقيمة P < 0.05.
ملاحظة: إنشاء قائمة هيئة الهجرة واللاجئين يتضمن إحداثيات الجينوم، المسافة إلى أقرب الجين ريفسيق، عدد المعبأة داخل كل هيئة الهجرة واللاجئين، % متوسط قيمة مثلايشن البد عبر هيئة الهجرة واللاجئين لمجموعات المقارنة بين اثنين (مثلاً، أكد مقابل بهيج)، قيمة P، و قيمة فرانكلين روزفلت (معدل اكتشاف كاذبة). استخدم قائمة هيئة الهجرة واللاجئين، أي.، إحداثيات الجينوم، تصميم كبسولة تفجير بيروسيكوينسينج للتحقق من صحة.
9-التحقق من بيروسيكوينسينج بيكبريتيت
-
التصميم التمهيدي
- تصميم كبسولة تفجير بيكبريتيت PCR وبيروسيكوينسينج. تصميم مجموعتين من الإشعال PCR (خارج ومتداخلة) بحيث سوف يعشق [بكر] تضخيم bps 150 – 400 من هيئة الهجرة واللاجئين.
ملاحظة: بشكل عام، هي الأسس مالا يقل عن 24 كبسولة تفجير تصميم طويلة مع مالا يقل عن 4 – 5 غير متتالية G (ج لعكس التمهيدي) لحساب تخفض الصلب درجة الحرارة من فقدان لتعقيد تسلسل. سيكون أحد أجهزة الإشعال متداخلة المسمى البيوتين وتنقيته [هبلك]. ومع ذلك، ينبغي أن أمرت الإشعال القياسية أول خطوة PCR بالشكل الأمثل بحسم أن ردود الفعل على [اغروس] هلام.- تصميم بيروسيكوينسينج الاعتداء التمهيدي حيث أنه يستهدف بيوتينيلاتيد تكميلية حبلا أسس فقط 1-2 المنبع المعبأة تكون جزيئي. تصميم متعددة بيروسيكوينسينج الإشعال عند الاقتضاء، كما يمكن الاعتداء كل التمهيدي بيروسيكوينسينج موثوق بها 30 bps المصب.
- بالنسبة Rt1--m4، استخدم ما يلي:
rRT1M4 خارج--"و تجتايجاتتتجتاتيجتاات"
rRT1M4 خارج-"آكتتاكااتتكاككاكتكا آر"
متداخل rRT1M4 – "جتججتايجتجاتاتاتاتاج و"
متداخل rRT1M4 – آتكاكتاككاتكتكتكتكتاكتا R
rRT1M4 Pyro1 تايجتجاتاتاتاتاجات
rRT1M4 Pyro2 جاتاجتاتتجيجاجتاج
rRT1M4 Pyro3 جاجتاتتجاجاجتجات
rRT1M4 Pyro4 جاتتتاتاتتغت
- تصميم كبسولة تفجير بيكبريتيت PCR وبيروسيكوينسينج. تصميم مجموعتين من الإشعال PCR (خارج ومتداخلة) بحيث سوف يعشق [بكر] تضخيم bps 150 – 400 من هيئة الهجرة واللاجئين.
-
استخدام أدوات متوفرة تجارياً لتحويل بيكبريتيت جدنا الدم الفئران.
ملاحظة: خطوات التحويل بيكبريتيت قد كيفت من الطقم المتاحة تجارياً مع إدخال التعديلات التالية: في الخطوة 1، إضافة 50-100 نانوغرام من جدنا الدم وتخفف بالماء إلى 20 ميليلتر. في الخطوة 9، الوتي ميليلتر 20 كل عينة.- إعداد كاشف بيكبريتيت التحويل وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة، والجمع جدنا المخفف. احتضان في cycler الحرارية (64 درجة مئوية، ل 2.5 ح، عقد 4 درجات مئوية).
- إضافة "المخزن المؤقت الملزم" لجدنا المحولة في أعمدة الدوران وجهاز الطرد المركزي (15,000 س ز، 1 دقيقة). أعمدة يغسل مرة واحدة ثم إضافة المخزن المؤقت ديسولفونيشن للأعمدة واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. أجهزة الطرد المركزي (س 15,000 ز، 1 دقيقة).
- أغسل العمود مع "المخزن المؤقت لغسل" وأجهزة الطرد المركزي (س 15,000 ز، 1 دقيقة). كرر الخطوة يغسل بالطرد المركزي (س 15,000 ز، 2 دقيقة). إضافة 20 ميليلتر "شطف المخزن المؤقت" والطرد المركزي (س 15,000 ز، 1 دقيقة) الوت.
-
[بكر] تضخيم
- إعداد خارج ميكس ماجستير PCR. إضافة 21.5 ميليلتر من مزيج الرئيسي إلى 3.5 ميليلتر تحويل بيكبريتيت جدنا وتشغيل برنامج cycler الحرارية.
خارج ميكس سيد بكر:
16.25 ميليلتر من الماء
ميليلتر 2.5 بوليميريز المخزن المؤقت [10 س]
0.5 ميليلتر من دنتب [10 مم]
1 ميليلتر من التمهيدي إلى الأمام [0.1 ميكرومتر]
1 ميليلتر من التمهيدي عكس [0.1 ميكرومتر]
ميليلتر 0.25 من بوليميراز الدنا بوليميراز [5000 U/مل].
برنامج cycler الحرارية:
المرحلة 1، دورة 1: 94 ° ج 4 دقيقة
المرحلة 2، 47 دورات: 94 ° ج 1 دقيقة, 53 درجة مئوية 30 ثانية، 72 ° ج 1 دقيقة
المرحلة 3، دورة 1: 72 درجة مئوية دقيقة 8، 4 درجة مئوية عقد - إعداد مزيج سيد بكر متداخلة. إضافة 23 ميليلتر من مزيج الرئيسي إلى 2 ميليلتر من عينة من بكر خارج وكرر cycler الحرارية PCR خارج البرنامج. تقييم جودة المنتج بكر عن طريق التفريد هلام (المخزن المؤقت x TAE 1، 1% [اغروس] هلام).
ميكس ماجستير يعشق [بكر]:
17.75 ميليلتر من الماء
ميليلتر 2.5 بوليميريز المخزن المؤقت [10 س]
0.5 ميليلتر من دنتب [10 مم]
1 ميليلتر من التمهيدي إلى الأمام [0.1 ميكرومتر]
1 ميليلتر من التمهيدي عكس [0.1 ميكرومتر]
ميليلتر 0.25 من بوليميراز الدنا بوليميراز [5000 U/mL]
ملاحظة: لبكر متداخلة، أما من الأمام أو عكس التمهيدي يجب بيوتينيلاتيد.
- إعداد خارج ميكس ماجستير PCR. إضافة 21.5 ميليلتر من مزيج الرئيسي إلى 3.5 ميليلتر تحويل بيكبريتيت جدنا وتشغيل برنامج cycler الحرارية.
-
بيروسيكوينسينج
- جعل مزيج رئيسي يتضمن ميليلتر 38 من "المخزن المؤقت ملزم" و 35 ميليلتر من الماء 2 ميليلتر من حبات المغلفة ستريبتافيدين سيفاروسي كل عينة. في صفيحة 96، حسنا، إضافة ميليلتر 75 من مزيج الرئيسي و 5 ميليلتر المتداخلة PCR المنتج. هزة في شاكر طبق لمدة 15-60 دقيقة.
- بينما تهز، إضافة 12 ميليلتر من التمهيدي (0.5 ميكرومتر، مخففة في المخزن المؤقت انلينغ) في الآبار من صفيحة الإنزيم بيروسيكوينسينج.
- بعد الهز، نفذ الخطوات يغسل استخدام المخازن المؤقتة ليغسل رد فعل ملزم. ضع أداة فراغ في حوض مملوء بالماء ثم جمع عينات من اللوحة. غمر أداة فراغ في أحواض مملوءة بالنصف الذي يحتوي على الإيثانول 70% وهيدروكسيد الصوديوم (0.2 M) تريس خلات المخزن المؤقت (10 ملم، ودرجة الحموضة 7.4). قطع الاتصال من أداة فراغ الفراغ والمكان في لوحة الفحص HS لنقل الخرز.
- وضع لوحة على كتلة الحرارة واحتضان عند 80 درجة مئوية للحد الأدنى 2 لوحة السماح لتبرد لمدة 5 دقائق ثم يبدأ البرنامج بايرو.
Representative Results
يعتمد تنفيذ ناجح لمنهاج Seq الميثيل الفئران على عدة معايير. الشكل 1 يبين سير العمل العام للدراسة ويسلط الضوء على خطوات محددة من مراقبة الجودة (QC) مطلوبة قبل المضي قدما. واحدة من العوامل الأولى للنظر هو متانة النموذج الحيواني ونظام الإجهاد، التي تحدد حجم التغيرات جينية التي تحدث عبر مثيلوم. منذ يستند عملنا الحيوان ملاحظتنا السابقة أن التعرض القشري (كورت) يمكن أن يؤدي إلى تغييرات في الحمض النووي مثلايشن19،20، لدينا نظام الإجهاد المزمن متغير (السير الذاتية) بحاجة إلى تكون ذات دقة كافية لإنتاج وشدد على الفئران مع مستويات مرتفعة من البلازما كورت. نظام السير ذاتية التنزيلات نموذجي هو المبين في الجدول 1 وتألفت من الضغوطات اليومية في الصباح وبعد الظهر، وبين عشية وضحاها أن يتم تغييرها باستمرار لمنع التعود وتناقص استجابة الإجهاد. في جميع أنحاء نظام 3 أسابيع، أظهرت الحيوانات المجهدة مستويات مرتفعة بدرجة كبيرة من البلازما يعني كورت [أيام 4 – 21، التحكم: 32.7 3.7 نانوغرام/ملليلتر، الإجهاد: 103.0 11.9 نانوغرام/مليلتر (يعني SEM)، ف = 2.2 × 10-4، الشكل 2 أ] على بهيج، مراقبة الحيوانات. الدوام، هذه الحيوانات كما أظهر السلوك مثل القلق أكبر على ارتفاع زائد المتاهة (EPM)، حسبما أوضحه أكثر بشكل ملحوظ الوقت المستغرق في الأسلحة مغلقة في EPM وأقل وقت بأذرع مفتوحة (الشكل 2). وتبين هذه النتائج أن التعرض السير الذاتية أدى إلى الغدد الصماء كبير والتغيرات السلوكية، مما يؤدي بنا التحقيق في ما إذا كانت هذه التغييرات ارتبطت بالتوقيعات مثلايشن الحمض النووي محددة.
ونشدد على العديد من نقاط التفتيش التي لا بد منها للبناء الناجح للمكتبة Seq الميثيل. بدءاً بكمية كافية من الحمض النووي ضروري، sonication، وتنقية المياه والصرف الصحي/متعددة، هدف الإثراء، وخطوات التحويل بيكبريتيت تباعا خفض كمية الحمض النووي في مكتبة الانتهاء. على الرغم من أن العديد من الخطوات التضخيم بكر تخفيف الخسائر في قالب الحمض النووي، يمكن إدخال إعداد دورة PCR المفرطة أعلى مكرر على ما يلي. لدراسة الفئران Seq الميثيل الحالية، استخدمت ز 2 من جدنا الدم في الفئران. ونلاحظ أنه يمكن بمكتبات Seq الميثيل مع بدء كمية الحمض النووي منخفضة تصل إلى 500 نانوغرام. ابتداء من أصغر مادة تسمح للمستخدمين بإنشاء مكتبات من الحمض النووي تم عزلة بواسطة نظام مراقبة الأصول الميدانية (الأسفار تنشيط الخلية الفرز) أو إبرة اللكمات، على الرغم من أن هناك خطر متزايد لإنتاج مبلغ غير كاف للمكتبات لتسلسل اللاحقة. يتم تنفيذ مراقبة الجودة بالتفريد 1 لتر من العينة في بيواناليزير، التي تنص على الحمض النووي الوزن الجزيئي، والكمية، ومولاريتي. ثلاث خطوات حاسمة تتطلب استخدام بيواناليزير: 1) بعد الخطوة سونيكيشن لضمان القص كافية من الحمض النووي (~ 170 شركة بريتيش بتروليوم، الأحمر، الشكل 3)؛ 2) في أعقاب الخطوة ربط محول أشارت إلى تحول في حجم متوسط للحمض النووي المنفصمة (~ 200 شركة بريتيش بتروليوم، الأزرق، الشكل 3) لضمان بهم التضخيم اللاحقة ببكر؛ و 3) بعد الخطوة تنقية المكتبة النهائية التأكد من كمية وحجم المكتبة للتسلسل.
R-الحزم بسيق وبسموث في بيوكوندوكتور كانت تستخدم لتحليل بيكبريتيت تسلسل البيانات18. وهي تشمل أدوات وأساليب لمحاذاة على ما يلي تسلسل، أداء مراقبة الجودة، وتحديد الأثران ميثليته المناطق (DMRs). استدعاء البرنامج بسموث Bowtie 2.016،17 راصفة تسلسل داخلي للحصول على الملخصات على قياس مستوى البد، بمحاذاة من الخام يقرأ الإدخال إلى تحويل بيكبريتيت تسلسل الجينوم. ثم يتم تصفيتها على الانحياز ما يلي من خلال إجراءات صارمة لمراقبة الجودة التي تسعى إلى تحديد التسلسل المنهجي واستدعاء قاعدة الأخطاء التي قد تحرف تحليلات المتلقين للمعلومات. يتم إنشاء سلسلة من المؤامرات للمعونة بصريا في عملية التصفية. أيضا يتم إنشاء مقاييس التسلسل لوثيقة المعلومات ذات الصلة مثل عدد من الانحياز على ما يلي: الهدف %، وكل التغطية البد، بين أمور أخرى (الجدول 2). حالما يتم تصفية البيانات، يتم تنفيذ خوارزمية تجانس تطبيع، حيث يتم تعيين كل البد قيمة مثلايشن المقدرة استناداً إلى مراقبة الجودة جميع يقرأ من كل عينة وتقديرات من المجاورة المعبأة لضمان الاتصال أكثر دقة من مثلايشن حالة حتى في الحالات التي يكون فيها تغطية تسلسل منخفضة. توفر هذه القيمة على تقدير ممهدة لاحتمال مثلايشن في كل موقع البد. وبمقارنة متوسط التقديرات مثلايشن ممهدة لكل عينة بين مجموعتين من العلاج ومناطق الجينوم الترتيب من الأكثر اختلافاً على الأقل، يتم إنشاء قائمة DMRs (الجدول 3).
وأكد أعلى هيئة الهجرة واللاجئين بين المجموعات وأكد وبهيج كان يقع في المروج للجينات الرئيسية histocompatibility الفئران Rt1--m4، مع الحيوانات نستعرض مستويات مثلايشن أعلى عبر جميع المعبأة من الحيوانات بهيج (الشكل 4 أ). للتأكد من التنفيذ الناجح لبرنامج Seq الميثيل وتحليل البيانات، وصممت كبسولة تفجير ضد هيئة الهجرة واللاجئين، ومستويات الدم مثلايشن الحمض النووي في فوج كامل من الحيوانات أكد وبهيج (8 متسلسلة بتسلسل الميثيل و 8 غير متسلسلة) قيمت قبل بيكبريتيت بيروسيكوينسينج. وتبين النتائج زيادة كبيرة في مثلايشن الحمض النووي عبر 10 من أصل المعبأة 12 جزيئي (تغيير 5.1 – 10.4 في المائة مثلايشن، ف < 0.037، الشكل 4B). تم إجراء تحليل مسار كيج في كل من DMRs كبيرة اسمياً لتحديد المسارات المرتبطة بالإجهاد. دأبت، تورط مسارات مرتبطة بهيئة الهجرة واللاجئين الأمراض المرتبطة بالتعرض للإجهاد المزمن، مثل السكري وأمراض القلب والأوعية الدموية، والسرطان (الجدول 4). 21 , 22 , 23 وللتدليل على اقتران بين بيانات جينية ودرجة التعرض التأكيد، تم مقارنة مستويات مثلايشن في البد-10 مستويات كورت 3 أسابيع يعني لكل الحيوانات. وأظهرت النتائج وجود ارتباط متواضعة بين البيانات والغدد الصماء ومثلايشن (ص2= 0.54، P = 0.001، الرقم 5).
رقم 1: سير العمل التخطيطي العام لمنصة الفئران الميثيل Seq. ز واحد من الحمض النووي الجينومي المستخرجة من الدم وأكد والفئران التحكم تتم أولاً لتشييد المكتبات الميثيل Seq للتسلسل، والتحليل، وتحديد الهدف. آخر 100 نانوغرام من الحمض النووي يستخدم للتحقق المستقل من أهداف جينية محددة قبل بيكبريتيت بيروسيكوينسينج. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: التعرض للإجهاد المزمن متغير (السير الذاتية) يؤدي إلى تغيرات الغدد الصماء والسلوكية في الفئران. (أ) أخذ عينات متعددة من القشري (كورت) تثبت المتانة الأسبوع 3 نظام السير الذاتية. تم جمع عينات الدم في الصباح قبل نظام الإجهاد اليومية. (ب) أكدت على الحيوانات تنفق المزيد من الوقت في الأسلحة مغلقة وأقل وقت في أحضان مفتوحة مرتفعة بالإضافة إلى المتاهة (EPM). وترد بوكسبلوتس مع نقطة بيانات لكل الحيوانات. وأجرى اختبار T للطالب للدلالة الإحصائية. * ف < 0.05، * * ف < 0.01، و * * * ف < 0.001. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: كوانتيتيشن الفئران المنفصمة ومتصلة محول الحمض النووي على بيواناليزير. تظهر منحنيات الأحمر والأزرق في كمية وحجم الحمض النووي (أحمر) بعد القص في سونيكاتور متحاور وربط محول، على التوالي. كل سطر يمثل عينة واحدة والأحمر والمنحنيات الزرقاء تعكس فقدان الحمض النووي خلال عدة خطوات الإصلاح نهاية (3 '--أدينيلاتيون، وتنظيف العينة) وزيادة في حجم bp بسبب ربط المحولات. حادة القمم في 25 شركة بريتيش بتروليوم وشركة بريتيش بتروليوم 1500 هي علامات القياسية التي تم إضافتها إلى المخزن المؤقت تحميل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: اكتشاف تغييرات جينية المستحثة بالسير الذاتية بالفئران ما يليها الميثيل تحليل (A) من الفئران البيانات Seq الميثيل المتورطين المروج للجينات Rt1m4 كمنطقة ميثليته خلطات (هيئة الهجرة واللاجئين) بين أكد (أحمر) والفئران التحكم (أزرق). يعرض الإخراج رسومية ل Rt1m4 هيئة الهجرة واللاجئين (المنطقة المظللة الوردي) كل البد (خط عمودي رمادية)، والعينات الأربعة في كل مجموعة (خطوط حمراء أو زرقاء)، ومستويات مثلايشن % لكل الحيوانات (نقطة حمراء أو زرقاء). (ب) "اثني عشر المعبأة" داخل هيئة الهجرة واللاجئين كانت يقرها بيكبريتيت بيروسيكوينسينج. تمثل الرسوم البيانية بار كما تعني وزارة شؤون المرأة، وتم إجراء اختبار T للطالب للدلالة الإحصائية. * ف < 0.05. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: تحليل الانحدار الخطي وأظهرت ارتباط متواضعة بين % الحمض النووي مثلايشن في البد-10 من Rt1m4 والأسبوع 3 يعني البلازما مستويات كورت على حد سواء وأكد ومراقبة الحيوانات (N = 16). وتمثل البيانات من الحيوانات المجهدة بدوائر حمراء. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| الأسبوع | 1 يوم | 2 يوم | 3 يوم | 4 يوم | يوم 5 | 6 يوم | يوم 7 |
| صباحا | ضبط النفس | السباحة | غرفة تبريد | السباحة | ضبط النفس | شاكر | السباحة |
| بعد الظهر | شاكر | إمالة القفص | ضبط النفس | شاكر | غرفة تبريد | ضبط النفس | غرفة تبريد |
| بين عشية وضحاها | تقييد المواد الغذائية | ويت الفراش | العزل | الضوء على | الازدحام | الضوء على | ويت الفراش |
الجدول 1: نموذجية جدول أسبوعي الإجهاد المزمن متغير نظام المعالجة (السير الذاتية).
| ترتيب المقاييس | الإجهاد1 | مراقبة1 |
| (n = 4) | (n = 4) | |
| إقران يقرأ نهاية (الواحد) | 89,290,397 | 80,165,674 |
| يقرأ فريد تم تعيينه نهاية الاقتران (أومبير) | 39,200,255 | 35,013,406 |
| كفاءة معدل/تعيين المحاذاة (أمبير/الواحدة) | 44% | 44% |
| قراءة مكررة (% أومبير) | 73% | 65% |
| يؤدي أومبير | 10,481,031 | 12,306,018 |
| متوسط القراءة عمق التغطية (x) (أردك) | 6 x | 6 x |
| المعبأة (N) | 12,056,878 | 12,056,878 |
| أردك (x) من المعبأة | 2 x | 2 x |
| المعبأة بالقراءة على الأقل 10 (N) | 481,383 | 595,850 |
| أردك (X) من المعبأة مع 10 على الأقل ما يلي: | 19 | 19 |
| في "الهدف المعبأة" (التداخل التام مع التحقيق في المناطق المستهدفة) | 1,923,872 | 2,007,638 |
| هدف أردك (x) من المعبأة | 7 x | 8 x |
| في "الهدف المعبأة" مع 10 على الأقل ما يلي: (N) | 428,249 | 531,419 |
| حول "الهدف أردك" (x) من المعبأة مع 10 على الأقل ما يلي: | 18 x | 18 x |
| في الهدف (مع تداخل زوج قاعدي 1 أو أكثر مع التحقيق في المناطق المستهدفة) (أمبير) | 8,277,715 | 9,369,523 |
| % من الهدف (لامبير يؤدي) | 78% | 77% |
| في الهدف (مجموع القواعد المعينة) ميجا بايت | 125 ميغابايت | 128 ميغا بايت |
| متوسط القراءة المستهدفة على عمق التغطية (x) (أردك) | 9 x | 10 x |
| 1 ترتيب المقاييس استناداً المتوسطات عبر مواضيع في كل مجموعة |
الجدول 2: تسلسل القياسات التي تم الحصول عليها من منصة Seq الميثيل الفئران.
| لجنة حقوق الإنسان | بدء تشغيل | نهاية | الجينات | المسافة | أريستات | مينديف | الإجهاد | عنصر التحكم | الاتجاه |
| chr20 | 1,644,246 | 1,644,390 | RT1--M4 | in_gene | 93.03 | 0.22 | 0.33 | 0.11 | الحصول على |
| chr5 | 160,361,352 | 160,361,564 | LOC690911 | in_gene | -70.75 | -0.19 | 0.72 | 0.91 | خسارة |
| chr3 | 61,138,281 | 61,138,330 | RGD1564319 | 265569 | 61.79 | 0.21 | 0.94 | 0.72 | الحصول على |
| chr2 | 143,064,811 | 143,065,010 | Ufm1 | 8569 | -59.48 | -0.11 | 0.13 | 0.24 | خسارة |
| chr7 | 30,764,111 | 30,764,284 | Ntn4 | in_gene | 57.04 | 0.21 | 0.94 | 0.73 | الحصول على |
| chr17 | 12,469,112 | 12,469,218 | إيدنك | 41996 | -50.91 | -0.13 | 0.74 | 0.88 | خسارة |
| chr7 | 47,101,725 | 47,101,930 | باور | in_gene | -50.54 | -0.12 | 0.64 | 0.76 | خسارة |
| chr5 | 76,111,248 | 76,111,822 | Txndc8 | 151703 | -50.38 | -0.11 | 0.85 | 0.96 | خسارة |
| chr11 | 80,640,132 | 80,640,356 | دجكج | in_gene | -50.07 | -0.16 | 0.73 | 0.89 | خسارة |
| chr8 | 71,759,248 | 71,759,411 | Mir190 | 210226 | -47.84 | -0.17 | 0.58 | 0.75 | خسارة |
الجدول 3: أعلى 10 خلطات ميثليته المناطق. لكل هيئة الهجرة واللاجئين، ويبين الجدول الناتج من اليسار إلى العمود الأيمن: موقع الصبغية (لجنة حقوق الإنسان)، وتنسق (بداية/نهاية)، يبدأ اسم الجينات، المسافة من النسخ الموقع، إحصاءات منطقة التفاضلية بين أكد والتحكم في مجموعات (أرياستات)، يعني أكد مثلايشن متوسط مستويات عبر كل هيئة الهجرة واللاجئين مثلايشن التفاضلية (مينديف)، وتغيير مجموعات التحكم (الإجهاد/التحكم)، واتجاه مثلايشن من عناصر التحكم.
| شروط مسار كج | عدد الجينات | % | قيمة P | بينجاميني |
| مرض السكري | ||||
| النوع الثاني السكري | 12 | 0.1 | 3.6 x 10-4 | 9.8 × 10-3 |
| أمراض القلب والأوعية الدموية | ||||
| تقلص العضلات الملساء والأوعية الدموية | 18 | 0.1 | 1.6 × 10-3 | 3.6 x 10-2 |
| عضلة البطين الأيمن أرهيثموجينيك (أرفك) | 13 | 0.1 | 4.0 × 10-3 | 7.1 × 10-2 |
| اعتلال عضلة القلب المتوسعة | 14 | 0.1 | 7.6 × 10-3 | 1.2 × 10-1 |
| وظيفة الخلايا العصبية | ||||
| التقوية طويلة الأجل | 11 | 0.1 | 1.5 × 10-2 | 1.4 x 10-1 |
| مما يشير إلى | ||||
| MAPK المسار إرسال الإشارات | 35 | 0.2 | 2.4 x 10-4 | 9.9 × 10-3 |
| مسار الإشارات الكالسيوم | 22 | 0.1 | 1.2 × 10-2 | 1.4 x 10-1 |
| مسار الإشارات تشيموكيني | 21 | 0.1 | 1.2 × 10-2 | 1.3 × 10-1 |
| سرطان | ||||
| مسارات في السرطان | 42 | 0.3 | 4.1 x 10-5 | 3.4 × 10-3 |
| الدبقي | 15 | 0.1 | 4.4 x 10-5 | 2.4 × 10-3 |
| عدم الصغيرة سرطان الرئة | 10 | 0.1 | 7.9 × 10-3 | 1.1 x 10-1 |
| سرطان القولون والمستقيم | 13 | 0.1 | 8.4 × 10-3 | 1.1 x 10-1 |
| سرطان الدم النقوي المزمن | 12 | 0.1 | 1.2 × 10-2 | 1.3 × 10-1 |
الجدول 4: تحليل مسار كج DMRs تم التعرف عليها من الفئران الميثيل-ما يليها
Discussion
في هذه الدراسة، ونحن تصميم وتنفيذ منهاج الميثيل-تسلسل جينوم الفئران. بإظهار فائدتها مع نموذج الفئران من الإجهاد، أثبتنا أن خط الأنابيب التجريبية والتحليلية يمكن أن توفر مناطق ميثليته متفاوتاً بين المجموعتين المقارنة.
لضمان تنفيذ ناجح لمنهاج العمل، بحاجة إلى العديد من الخطوات الهامة التي يتعين مراعاتها. أولاً، الأولى من الحمض النووي نوعية وكمية أثرا كبيرا على نوعية وكمية من المكتبة Seq الميثيل النهائي. كنا فلوروميتير، بدلاً من جهاز المطياف الضوئي، لضمان أن يعكس قياس الحمض النووي لدينا كمية الحمض النووي المزدوج-الذين تقطعت بهم السبل الحالية. بيواناليزير استخدمت لقياس حجم الجزيئي وكمية من الحمض النووي بعد القص وبعد ربط محول. التحقق من حجم الجزيئي "التحول" بين هذه الخطوات أمر حاسم لتأكيد وجود محولات في نهاية كل جزء من الحمض النووي التي ستخضع لمحول بوساطة PCR في الخطوات اللاحقة. كمية الحمض المتبقي في نهاية هذه الخطوة ربط محول مهم أيضا، منذ مالا يقل عن 100 نانوغرام المنتج مكتبة مطلوب في هذه الخطوة لضمان توفر كمية كافية بعد هدف الإثراء وبيكبريتيت خطوات التحويل. أجرى قياس حساسية عالية نهائي على المكتبة Seq الميثيل شيدت حتى أن المكتبة يمكن أن تضعف بشكل صحيح للمجموعات اللاحقة على التسلسل الجيل القادم. أخيرا، كان يعمل بيروسيكوينسينج بيكبريتيت كأسلوب كمي عالية ومستقلة تقييم مدى دقة خط الأنابيب التحليلية. المصادقة النهائية على استخدام عينات الأصلي والنسخ المتماثل باستخدام الحيوانات إضافية خطوات حاسمة لضمان أن هذه التجربة يمكن الكشف عن تغيرات هامة بيولوجيا في مثلايشن الحمض النووي.
نحن تشمل أيضا العديد من المبادئ التوجيهية في حالة الانحراف عن البروتوكول، أو إذا كانت تواجه مشاكل. أولاً، من الممكن أن تفقد الكثير من الحمض النووي خلال نهاية الإصلاح أو ربط محول خطوات تنقية حبة المغناطيسية. وبدلاً من ذلك، بدأت كميات من الحمض النووي يمكن أن تكون صغيرة (< 200 نانوغرام) نظراً لتوافر محدود الأنسجة/الحمض النووي أو تنفيذ مختلف أساليب الإثراء مثل الأسفار تنشيط الخلية الفرز. زيادة عدد دورة خلال الخطوات التضخيم مكتبة اثنين قد تكون قادرة على تعويض عن خسارة المفرط للحمض النووي أو منخفضة ابتداء من كمية الحمض النووي في جميع أنحاء البروتوكول بناء المكتبة. ومع ذلك، لا أكثر من إضافية 2 – 3 دورات يوصي، التضخيم المفرط قالب من المرجح أن تؤدي إلى زيادة في عدد القراءات مكررة يجري التسلسل. وتستبعد هذه التكرارات أثناء الخطوة المحاذاة للحيلولة دون تحيز في المئة مثلايشن العمليات الحسابية. ثانيا، إذا كان متوسط حجم الحمض النووي لا يزيد بأكثر من 30 bps، تحقق للتأكد من أن الكواشف جديدة، بوليميراز الدنا T4، كلينوو، و/أو T4 ليجاسى قد تكون قديمة. ويمكن استخدام الكواشف استبدال المتاحة تجارياً.
بالإضافة إلى ذلك، فمن الممكن أن DMRs المتوقعة قد لا التحقق من صحة بيروسيكوينسينج، حيث لا توجد الاختلافات مثلايشن الحمض النووي أو هي أقل بكثير من تلك التي تنبأ بها التحليل. التحقق من صحة الفقراء من المناطق المرشحة مشكلة شائعة جداً للعديد من التحليلات على نطاق الجينوم، مثل عندما لم تؤكد النتائج بيروسيكوينسينج مثلايشن التفاضلية أو حجم التأثير أصغر بكثير من التي تنبأ بها التحليل. بسموث حزمة واحدة التحليلية أن "ينعم" مستويات مثلايشن عبر نافذة المعبأة متعددة. للتجربة الحالية، تورط بسموث مستويات مثلايشن التي كانت تؤيدها بيروسيكوينسينج بيكبريتيت هيئة الهجرة واللاجئين. ومع ذلك، سيكون هناك يرجح أن التباين بين المستويات مثلايشن التي تنبأ بها بسموث، وتلك التي يتم التحقق من بيروسيكوينسينج. الاختلافات تنشأ من تجانس الدالة التي تقدر القيم مثلايشن المتوسط عبر جميع المعبأة داخل هيئة الهجرة واللاجئين، بما في ذلك على التوالي المعبأة التي قد تختلف في مثلايشن الحمض النووي بأكثر من 50% أو المعبأة قيمها مثلايشن استبعدت نظراً العتبة الفرعية قراءة متعمقة. R-مجموعات مثل ميثيلكيت24 يمكن استخدامها لتحديد أصغر ويندوز المعبأة أو المعبأة واحد حتى مستويات مثلايشن التي ترتبط بشدة بتلك التي يصادق عليها بيروسيكوينسينج. وسيكفل تنفيذ حزم مختلفة واختبار تلك المناطق المتوقعة أو المعبأة من مثلايشن التفاضلية التي بيروسيكوينسينج متانة بيانات. بدلاً من ذلك، يمكن أن ريسيقوينسيد الأصلي Seq الميثيل المكتبات، وإضافة إلى ملفات القراءة لزيادة عمق القراءة. حيث يتم تحديد مستويات مثلايشن شبه كمي وأملت بعدد ما يلي: [(# of CpGs)/(# تبجس + المعبأة)]، زيادة عمق القراءة سوف يزيد البد المعطاة دقة قيمة النسبة المئوية مثلايشن. في هذه الدراسة، ونحن فقط نظرت المعبأة القيم مثلايشن التي حددت بعشرة على الأقل ما يلي: ويتحقق تغطية قراءة شاملة ل 19 x لكل البد.
منهاج Seq الميثيل الفئران لا يخلو من أوجه القصور. في حين أنها أكثر فعالية من حيث التكلفة من تسلسل الجينوم كل بيكبريتيت، أغلى بكثير من أساليب أخرى. ومع ذلك، كان معظم التكاليف شراء الممرات في التسلسل وليس لنظام التقاط. اعتماداً على عمق القراءة اللازمة، مع إجراء مقارنات عبر الأنسجة التي تتطلب أقل بسبب الاختلافات الكبيرة (25 – 70 في المائة)12 في مثلايشن الحمض النووي، يمكن تخفيض التكلفة الإرسال المتعدد أكثر العينات كل حارة واستخدام منصة أعلى قدرة. أيضا، يتم إعداد نموذج أكثر استهلاكاً للوقت من الأساليب الأخرى. بينما مماثلة إلى النهج المنسدلة الأخرى التي تتضمن تسلسل الجيل القادم، إضافة خطوات التحويل وتنقية بيكبريتيت المضافة لعبء العمل. إجمالاً، منصة Seq الميثيل بديلاً فعالاً من حيث التكلفة لتسلسل الجينوم الجامعة ويوفر القرار زوج قاعدي في المعبأة أكثر من 2.3 مليون، وأكثر بكثير من تلك التي جزيئي بالأنظمة الأساسية المستندة إلى ميكرواري. قد استخدمت حتى الآن، البشرية المتاحة تجارياً والماوس منصات الميثيل Seq لتوثيق التغيرات تعتمد على الكحول في25،الدماغ المكاك26، الجينات النمائية في الماوس الدماغ9، والدم والدماغ أهداف الكورتيزون10. علاوة على ذلك، يجعل من القدرة على استهداف مناطق معينة بغض النظر عن الاعتراف بتسلسل من إنزيمات التقييد منصة مثالية لإجراء مقارنات عبر الأنواع. لهذه الدراسة، قمنا بتصميم برنامج Seq الميثيل الفئران، التي يتم تنفيذ العديد من التجارب الدوائية والأيضية والسلوكية دون الاستفادة من أداة ميثيلوميك على نطاق الجينوم. وتظهر البيانات المتوفرة لدينا أنه يمكن استخدامها للكشف عن DMRs في نموذج الفئران من الإجهاد ويرتبط المعلمات الفسيولوجية الأخرى مثل مستويات البلازما عموما كورت.
منهاج Seq الميثيل مثالي لتجارب جينية في الحيوانات مع تسلسل الجينوم التي قد لا يكون لديك ما يكفي من الأدلة التجريبية التي توثق المناطق التنظيمية. عندما تتاح هذه المناطق، تكون مناطق إضافية خصيصا وتعلق على الإصدار الحالي. علاوة على ذلك، المنهاج مثالي لعلم الجينوم المقارن، نظراً لإثراء الهدف يعوقه عدم الاعتراف بإنزيم التقييد. على سبيل المثال، يمكن التقاط منطقة المروج للجينات أي اهتمام بغض النظر عن ما إذا كان أنها تؤوي موقع قيود محددة. وبالمثل، يمكن التقاط أي المناطق التنظيمية، مثل تلك المحددة في الماوس أو البشر، والتي يتم المحافظة عليها في جينوم الفائدة.
Disclosures
المخطوطة جزء من جائزة المسابقة من "اجيلنت التكنولوجيات".
Acknowledgments
تم تمويل هذه الدراسة بالمعاهد الوطنية للصحة منحة MH101392 (RSL) والدعم من جوائز والأسس التالية: جائزة المحقق الشاب نارساد، مارغريت أن السعر المحقق، وجيمس واه مزاج اضطرابات الباحث صندوق عبر المؤسسة باور ت. تشارلز بيكر مؤسسة، ومؤسسة مطابقة المشروع (RSL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Radioimmuno assay (RIA) | MP Biomedicals | 7120126 | Corticosterone, 125I labeled |
| Master Pure DNA Purification Kit | Epicentre/Illumina | MC85200 | |
| Thermal-LOK 2-Position Dry Heat Bath | USA Scientific | 2510-1102 | Used with 1.5 mL tubes |
| Vortex Genie 2 | Fisher | 12-812 | Vortex Mixer |
| Ethyl alcohol, Pure | Sigma-Aldrich | E7023 | 100% Ethanol, molecular grade |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | - | Must be capable of 20,000 x g |
| Qubit 2.0 | ThermoFisher Scientific | Q32866 | Fluorometer |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | ThermoFisher Scientific | Q32851 | High sensitivity DNA detection reagents |
| Qubit Assay Tubes | ThermoFisher Scientific | Q32856 | |
| SureSelectXT Rat Methyl-Seq Reagent Kit | Agilent Technologies | G9651A | Reagents for preparing the Methyl-Seq library |
| SureSelect Rat Methyl-Seq Capture Library | Agilent Technologies | 931143 | RNA baits for enrichment of rat targets |
| IDTE, pH 8.0 | IDT DNA | 11-05-01-09 | 10 mM TE, 0.1 mM EDTA |
| DNA LoBind Tube 1.5 mL | Eppendorf | 22431021 | |
| Covaris E-series or S-series | Covaris | - | Isothermal sonicator |
| microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm (25) | Covaris | 520045 | |
| Water, Ultra Pure (Molecular Biology Grade) | Quality Biological | 351-029-721 | |
| Veriti 96 Well-Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4375786 | |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63880 | DNA-Binding magnetic beads |
| 96S Super Magnet | ALPAQUA | A001322 | Magnetic plate for purification steps |
| 2200 TapeStation | Agilent Technologies | G2965AA | Electrophresis-based bioanalyzer |
| D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5582 | |
| D1000 ScreenTape High Sensitivity | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
| D1000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5583 | |
| D1000 Reagents High Sensitivity | Agilent Technologies | 5067-5585 | |
| DNA110 SpeedVac | ThermoFisher Scientific | - | Vacuum Concentrator |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 magnetic beads | Invitrogen | 65601 | Streptavidin magnetic beads |
| Labquake Tube Rotator | ThermoFisher Scientific | 415110Q | Nutator Mixer is also acceptable |
| EZ DNA Methylation-Gold Kit | Zymo Research | D5006 | Bisulfite conversion kit. Contains Binding, Wash, Desulphonation, and Elution buffers |
| Illumina Hi-Seq 2500 | Illumina | - | Next-generation sequencing machine |
| PCR and Pyrosequencing Primers | IDT DNA | Variable | |
| Taq DNA Polymerase with ThermoPol Buffer - 2,000 units | New England BioLabs | M0267L | |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set | New England BioLabs | N0446S | |
| Pyromark MD96 | QIAGEN | - | Pyrosequencing machine |
| Ethyl Alcohol 200 Proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | 70% Ethanol solution |
| Sodium Hydroxide Pellets | Sigma-Aldrich | 221465 | 0.2 M NaOH denature buffer solution |
| Tris (Base) from J.T. Baker | Fisher Scientific | 02-004-508 | 10 mM Tris Acetate Buffer wash buffer solution |
| PyroMark Gold Q96 Reagents (50x96) | QIAGEN | 972807 | Reagents required for pyrosequencing |
| PyroMark Annealing Buffer | QIAGEN | 979009 | |
| PyroMark Binding Buffer (200 mL) | QIAGEN | 979006 | |
| Streptavidin Sepharose High Performance Beads | GE Healthcare | 17-5113-01 | Streptavidin-coated sepharose beads |
| PyroMark Q96 HS Plate | QIAGEN | 979101 | Pyrosequencing assay plate |
| Eppendorf Thermomixer R | Fisher Scientific | 05-400-205 | Plate mixer. 96-well block sold separately (cat. No 05-400-207) |
| SureDesign Website | Agilent Technologies | - | Target capture design software (https://earray.chem.agilent.com/suredesign/) |
| UCSC Genome Browser | University of California Santa Cruz | - | rat Nov 2004 rn4 assembly |
| Agilent Methyl-Seq Protocol | Agilent Technologies | - | https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/G7530-90002.pdf |
References
- Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
- Meissner, A., et al. Genome-scale DNA methylation maps of pluripotent and differentiated cells. Nature. 454 (7205), 766-770 (2008).
- Bibikova, M., et al. High density DNA methylation array with single CpG site resolution. Genomics. 98 (4), 288-295 (2011).
- Naumov, V. A., et al. Genome-scale analysis of DNA methylation in colorectal cancer using Infinium HumanMethylation450 BeadChips. Epigenetics. 8 (9), 921-934 (2013).
- Wockner, L. F., et al. Genome-wide DNA methylation analysis of human brain tissue from schizophrenia patients. Translational Psychiatry. 4, e339 (2014).
- Meissner, A., et al. Reduced representation bisulfite sequencing for comparative high-resolution DNA methylation analysis. Nucleic Acids Research. 33 (18), 5868-5877 (2005).
- Smith, Z. D., Gu, H., Bock, C., Gnirke, A., Meissner, A. High-throughput bisulfite sequencing in mammalian genomes. Methods. 48 (3), 226-232 (2009).
- Slieker, R. C., et al. Identification and systematic annotation of tissue-specific differentially methylated regions using the Illumina 450k array. Epigenetics Chromatin. 6 (1), 26 (2013).
- Hing, B., et al. Adaptation of the targeted capture Methyl-Seq platform for the mouse genome identifies novel tissue-specific DNA methylation patterns of genes involved in neurodevelopment. Epigenetics. 10 (7), 581-596 (2015).
- Seifuddin, F., et al. Genome-wide Methyl-Seq analysis of blood-brain targets of glucocorticoid exposure. Epigenetics. 12 (8), 637-652 (2017).
- Irizarry, R. A., et al. The human colon cancer methylome shows similar hypo- and hypermethylation at conserved tissue-specific CpG island shores. Nature Genetics. 41 (2), 178-186 (2009).
- Lee, R. S., et al. Adaptation of the CHARM DNA methylation platform for the rat genome reveals novel brain region-specific differences. Epigenetics. 6 (11), 1378-1390 (2011).
- Jankord, R., et al. Stress vulnerability during adolescent development in rats. Endocrinology. 152 (2), 629-638 (2011).
- Pellow, S., Chopin, P., File, S. E., Briley, M. Validation of open:closed arm entries in an elevated plus-maze as a measure of anxiety in the rat. Journal of Neuroscience Methods. 14 (3), 149-167 (1985).
- Krueger, F., Andrews, S. R. Bismark: a flexible aligner and methylation caller for Bisulfite-Seq applications. Bioinformatics. 27 (11), 1571-1572 (2011).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 10 (3), R25 (2009).
- Hansen, K. D., Langmead, B., Irizarry, R. A. BSmooth: from whole genome bisulfite sequencing reads to differentially methylated regions. Genome Biology. 13 (10), R83 (2012).
- Lee, R. S., et al. Chronic corticosterone exposure increases expression and decreases deoxyribonucleic acid methylation of Fkbp5 in mice. Endocrinology. 151 (9), 4332-4343 (2010).
- Lee, R. S., et al. A measure of glucocorticoid load provided by DNA methylation of Fkbp5 in mice. Psychopharmacology. , (2011).
- Bose, M., Olivan, B., Laferrere, B. Stress and obesity: the role of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis in metabolic disease. Current Opinion in Endocrinology, Diabetes, and Obesity. 16 (5), 340-346 (2009).
- Brydon, L., Magid, K., Steptoe, A. Platelets, coronary heart disease, and stress. Brain, Behavior, and Immunity. 20 (2), 113-119 (2006).
- McKlveen, J. M., et al. Chronic Stress Increases Prefrontal Inhibition: A Mechanism for Stress-Induced Prefrontal Dysfunction. Biological Psychiatry. 80 (10), 754-764 (2016).
- Akalin, A., et al. methylKit: a comprehensive R package for the analysis of genome-wide DNA methylation profiles. Genome Biology. 13 (10), R87 (2012).
- Cervera-Juanes, R., Wilhelm, L. J., Park, B., Grant, K. A., Ferguson, B. Alcohol-dose-dependent DNA methylation and expression in the nucleus accumbens identifies coordinated regulation of synaptic genes. Translational Psychiatry. 7 (1), e994 (2017).
- Cervera-Juanes, R., Wilhelm, L. J., Park, B., Grant, K. A., Ferguson, B. Genome-wide analysis of the nucleus accumbens identifies DNA methylation signals differentiating low/binge from heavy alcohol drinking. Alcohol. 60, 103-113 (2017).
