Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

En rotte Methyl-Seq Platform til at identificere epigenetiske ændringer forbundet med Stress eksponering

Published: October 24, 2018 doi: 10.3791/58617
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1,3, 1,2, 1
1Departments of Psychiatry and Behavioral Sciences, Johns Hopkins School of Medicine, 2Department of Medicine, Johns Hopkins School of Medicine, 3Department of Mental Health, Johns Hopkins School of Public Health

Summary

Vi beskriver her, protokol og gennemførelsen af Methyl-FF., en epigenomiske platform, ved hjælp af en rotte model til at identificere epigenetiske ændringer forbundet med kronisk stress eksponering. Resultaterne viser, at rotte Methyl-Seq platform er i stand til at opdage methylering forskelle, der opstår fra stress eksponering i rotter.

Abstract

Som genomer af en bredere vifte af dyr bliver tilgængelige, er der et stigende behov for værktøjer, der kan fange dynamiske epigenetiske ændringer i disse dyremodeller. Rotten er en særlig model dyr hvor en epigenetisk værktøj kan supplere mange farmakologiske og adfærdsmæssige undersøgelser at give indsigtsfulde mekanistiske information. Med henblik herpå tilpasset vi SureSelect fange målsystemet (benævnt Methyl-Seq) rotte, som kan vurdere DNA methylering niveauer på tværs af rotte genom. Rotte design målrettet initiativtagere, CpG øer, island kyster og GC-rige regioner fra alle RefSeq gener.

For at gennemføre platformen på en rotte eksperiment, blev mandlige Sprague Dawley rotter udsat for kroniske variable stress for 3 uger, hvorefter blev blodprøver indsamlet for genomisk DNA-ekstraktion. Methyl-Seq biblioteker blev bygget fra rotte DNA-prøver af klipning, adapter ligatur, target berigelse, bisulfite konvertering og multiplexing. Biblioteker blev sekventeret på en next-generation sequencing platform og sekventeret læser blev analyseret for at identificere Mickael mellem DNA af stressede og tryksvage rotter. Spidskandidat Mickael blev selvstændigt valideret af bisulfite pyrosequencing at bekræfte robustheden af platformen.

Resultaterne viser, at rotte Methyl-Seq platform er en nyttig epigenetiske værktøj, der kan fange methylering forandringer som følge af eksponering til at understrege.

Introduction

Fremskridt i høj overførselshastighed sekventering har ført til et væld af genomiske sekvenser for både model og ikke-model organismer. Tilgængeligheden af sådanne sekvenser har fremmet forskningen i genetik, Komparativ genomforskning og transcriptomics. Eksempelvis tilgængelige genomiske sekvenser er meget nyttige til at justere sequencing data fra ChIP-Seq eksperimenter, der beriger DNA baseret på sin forening med Histon ændringer1eller bisulfite sekventering, som måler DNA methylering af afsløre uracil dannet af bisulfite omdannelse af unmethylated cytosines2. Der har imidlertid været forsinkelser i gennemførelsen af epigenomiske platforme, at inddrage tilgængelige genomisk sequencing data i deres design på grund af manglende kommenteret data artsspecifikke regulerende sekvenser, der kan påvirke genfunktion.

Navnlig er DNA methylering en af de mest studerede epigenetiske ændringer på DNA, der kan udnytte tilgængelige genomisk data for at opbygge en methylomic platform. Et eksempel er en array-baseret platform til den menneskelige methylome3, som har været meget anvendt i forskellige discipliner fra onkologi til psykiatri4,5. Desværre, lignende platforme for ikke-menneskelige dyr modeller er knappe, som der er stort set ingen udbredte platforme, der har draget fordel af den genomiske sekvens i deres oprindelige design.

En fælles metode til at vurdere methylomic landskabet af ikke-menneskelige dyr modeller er reduceret repræsentation bisulfite sekventering (RRBS)6. Denne tilgang overvinder udgifterne til hele-genom bisulfite sekventering, der samtidig med en omfattende methylomic landskab, giver lavere Læs-dybde dækning på grund af omkostningerne og begrænsede funktionelle oplysninger i store gen-fattige områder af genom2 . RRBS indebærer begrænsning digest og størrelse-udvalg af genomisk DNA til at berige for meget GC-rige sekvenser som CpG øer, der er almindeligt forekommende i nærheden af genet initiativtagere og menes at spille en rolle i gen forordning7. Mens metoden RRBS er blevet brugt i en række vigtige undersøgelser, er dens afhængighed af restriktionsenzymer ikke uden markante udfordringer og begrænsninger. For eksempel, er berigelse af GC-rige sekvenser i RRBS helt afhængig af tilstedeværelsen af specifikke sekvenser anerkendt af begrænsning enzym og efterfølgende størrelse udvælgelse af elektroforese. Det betyder, at enhver genomisk områder, der ikke indeholder disse begrænsning websteder er udelukket under valg af størrelse. Også, cross-arter sammenligninger er udfordrende, medmindre de samme begrænsning steder findes i de samme loci blandt de forskellige arter.

En metode til at overvinde begrænsningerne af RRBS er at bruge en berigelse metode, der udnytter den offentliggjorte genomisk sekvens i udformningen af platformen. Array-baserede menneskelige platformen bruger primer sonder designet mod specifikke CpGs for allel-specifik (CG vs TG efter bisulfite konvertering) target udglødning og primer forlængelse. Dens design afspejler ikke blot de tilgængelige menneskelige genomisk sekvens, men eksperimentelt verificeret regulerende regioner erhvervet fra flere linjer af undersøgelse, som INDKODE og ENSEMBL8. På trods af sin bredt anvendes i human methylomic undersøgelser findes en lignende platform ikke for model dyr. Derudover placerer array-baseret format betydelig begrænsning på arealet til sondens placering. I de sidste mange år, har været bestræbelser at kombinere mål-specificitet som fange sonde design og høj overførselshastighed i næste generation sequencing. Sådan en bestræbelse har resulteret i sekventering-baserede målsystemet-berigelse for musen genomet (mus Methyl-FF.), som blev brugt til at identificere hjerne-specifikke eller glukokortikoid induceret forskelle i methylering9,10. Lignende platforme for andre model og ikke-model dyr er nødvendig for at lette epigenomiske forskning i disse dyr.

Her viser vi gennemførelsen af denne roman platform til at gennemføre methylomic analyse på rotten. Rotten har fungeret som en vigtig dyremodeller i farmakologi, stofskifte, neuroendocrinology og adfærd. For eksempel er der et stigende behov for at forstå de underliggende mekanismer, der giver anledning til lægemiddeltoksicitet, fedme, stressrespons eller stofmisbrug. En høj overførselshastighed platform kan indfange methylomic ændringer forbundet med disse betingelser ville øge vores forståelse af mekanismerne. Da rotte genom mangler stadig anmærkning for lovgivningsmæssige områder, vi indgår ikke-redundante initiativtagere, CpG øer, island kyster11, og tidligere identificerede GC-rige sekvenser i rotte Methyl-Seq platform12.

For at vurdere vellykket design og implementering af SureSelect Target berigelse (generisk benævnt Methyl-Seq) platform for rotte genom, ansat vi en rotte model af kronisk variable stress (CVS)13 at identificere varierende methylerede regionerne mellem tryksvage og stressede dyr. Vores Platformsdesign, protokol og implementering kan være nyttige for efterforskere, der måtte ønske at foretage en omfattende og upartiske epigenetiske undersøgelse på en organisme, hvis genomisk sekvens er allerede tilgængelige, men er stadig dårligt kommenteret.

Protocol

Alle eksperimenter blev udført i overensstemmelse og overensstemmelse med alle relevante lovgivningsmæssige og institutionelle retningslinjer, herunder institutionelle Animal Care og brug Udvalget på Johns Hopkins School of Medicine.

1. dyr

  1. Få mandlige unge Sprague-Dawley rotter på 4 ugens i alder. Hus dyr i polycarbonat rotte bure i en temperatur- og fugtindhold-kontrollerede værelse på en 12 h lys, 12 h mørke cyklus med lys debut på 0600 h. give dyr med ad libitum adgang til vand.
  2. Gøre det muligt rotter at acclimate til 1 uge til at reducere stress i forbindelse med transport. Par-hus dyr (N = 16) til hinder isolation stress, og ved 5 ugers alderen, begynder variablen kronisk stress (CVS) regime i 3 uger.

2. kronisk Variable Stress

  1. Administrere CVS regime engang i morgen (9-11 AM) og en gang om eftermiddagen (1-3 PM) på uregelmæssig gange at holde rutinen uforudsigelige. Indarbejde overnight mild stressfaktorer. The CVS regime omfatter: 1) 3 h i en tilbageholdenhed cylinder; 2) 10 min svømme; 3) 3 h bur vippe 4) 1 h langsom ryster platform; og 5) 1 h i 4 ° C koldt værelse.
    Bemærk: Overnight stressfaktorer omfatter sociale fortrængning (5 pr bur), social isolation, våde sengetøj, mad begrænsning, og lyset tændt. En typisk ugeskema af stress regime er fastsat i tabel 1.

3. hormonforstyrrende Assays

  1. Bestemmer niveauet af corticosterone (CORT) ved hjælp af halen blod (~ 50 mL) prøveudtagninger indsamlet på samme tid (9 AM) to gange om ugen i hele eksperimentet, forudgående til CVS regime for at etablere baseline hormonniveauer (dag 0), en gang i midten af den ugentlige CVS (dage 4,11, og 18), efter hver 7 dage af CVS (dage 7 og 14), og ved afslutningen af CVS (dag 21). Indsamle blodprøver før den daglige stress regime.
    1. Saml en sidste trunk blodprøve under eutanasi (dag 25) for RIA og genomisk DNA-ekstraktion.
  2. Der centrifugeres alle blodprøver (600 x g, 4 ° C, 10 min) til at adskille plasmaet fra blodceller. Med pipette overfoeres ud plasma (supernatanten) og gemme prøver på-80 ° C.
  3. Tø og bruge plasma til at bestemme CORT niveauer af radioimmunoassay (RIA). Sikre, at 3 uge plasma CORT niveauer er forhøjede i de stressede dyr at kontrollere stress regime robusthed.

4. opførsel

  1. Efter CVS regime (dage 23-24), vurdere hvert enkelt dyr for angst-lignende adfærd på forhøjet plus labyrint (EPM)14.
  2. Ved hjælp af et videokamera, post dyr på EPM apparater til 300 s og score tid tilbragt i midten, lukkede arme, og åbne arme.

5. design af rotte Methyl-Seq

  1. Bruger UCSC genom-Browser, hente ikke-redundante genomisk koordinater (rotte Nov 2004 rn4 forsamling) til CpG øer og øen kyster (± 1 kb flankerende CpG øer), initiativtagerne (± 1 kb af hver TSS) af hver RefSeq genet, og andre sekvenser, der er tilgængelige fra relevante litteratur.
    Bemærk: For rotte Methyl-FF., yderligere GC-rige sekvenser fra et tidligere array-baserede methylering platform blev tilføjet12. For regioner, der er større end 5 kbps, var skiftevis regioner af 500 bps stikprøven, efterfulgt af 1 kbps, der blev sprunget over. Endelige rotte Methyl-Seq design består af 111 Mbps, 2,3 millioner CpGs; og en gennemsnitlig region størrelse af 594 bps. Det mål 228,800 unikke loci.
  2. Angiv en kompileret liste over genomisk koordinater til et kommercielt tilgængelige target fange design software for passende sonde design.

6. opbygning af rotte Methyl-Seq bibliotek fra genomisk DNA

Bemærk: For at eliminere batch effekter, behandle flere prøver på samme tid, og skalere op master blander i overensstemmelse hermed. Uddrag DNA ved hjælp af en kommercielt tilgængelig DNA udvinding kit. Kolonne - eller nedbør-baserede metoder, begge give høj kvalitet genomisk DNA (260/280 forholdet ~ 1,8). Brug af fenol-baserede metoder er ikke anbefales. Elueres eller resuspend DNA i lav TE buffer (10 mM TE, 0.1 mM EDTA, pH 8,0).

  1. Forberedelse af prøver
    Bemærk: For hvert trin ved hjælp af DNA-bindende magnetiske perler, Sørg for perlerne er akklimatiseret til stuetemperatur i mindst 30 min. og godt blandet før brug.
    1. Shear DNA
      1. Bruge en fluorometer til at bestemme første dobbelt-strenget DNA koncentration af hver prøve. Fortynd > 1 µg gDNA til 50 µL med lav TE buffer (10 mM TE, 0.1 mM EDTA, pH 8,0) i lave DNA-bindende microcentrifuge rør.
      2. Shear prøver ved hjælp af en isotermisk sonikator (10% Duty Cycle, 5 intensitet, 200 cykler pr. brast, 6 cyklusser af 60 s, frekvens fejning, 4 ° C).
      3. Vurdere kvaliteten af DNA ved hjælp af en elektroforese-baseret system, der måler DNA størrelse og mængde.
        Bemærk: DNA anbefalede beløb er 1 µg, eller 3 µg. Hvis der er begrænset starter materiale, den laveste input mængde bør > 500 ng, som lavere beløb vil påvirke mængden og kvaliteten af de biblioteker, der er genereret.
    2. Reparere DNA ender.
      1. Bruge rotte Methyl-Seq kit til at forberede den ende-reparation Master Mix på is. Tilføje 52 µL af mix til hver prøve og inkuberes i en termisk cycler uden en opvarmet låg (20 ° C i 30 min, 4 ° C hold).
        Ende-reparation Master Mix (pr. sample):
        35.2 µL vand
        10 µL af slutningen reparation Buffer (10 x)
        1.6 µL af dNTP Mix
        1 µL af T4 DNA Polymerase
        2 µL af Klenow DNA Polymerase
        2.2 µL af T4 Polynucleotide Kinase
      2. Rense prøver ved hjælp af 180 µL DNA-bindende magnetiske perler og 400 µL af frisklavede 70% ethanol pr. prøve. Tilføj 180 µL af perler til hver prøve og Inkuber i 5 min ved stuetemperatur. Pellet perler, Fjern supernatanten og resuspend pellet i 200 µL af 70% ethanol. Fjerne ethanol og Gentag vask en gang.
      3. Bruge en magnetisk plade til pellet perler og fjerne så meget ethanol som muligt. Tør i et 37 ° C heatblock i 3-5 min. indtil perle pellet er helt tørre. Resuspend i 44 µL nukleasen-gratis vand og saml ca 42 µL af supernatanten.
        Standsested: Efter reparation DNA slutter, prøver kan forsegles og opbevares ved-20 ° C.
    3. Adenylate 3' slutter.
      1. Forberede Adenylation Master Mix på is. Tilføje 9 µL mix til hver prøve og inkuberes i en termisk cycler uden en opvarmet låg (37 ° C i 30 min, 4 ° C hold).
        Adenylation Master Mix (pr. sample):
        5 µL af Klenow buffer
        1 µL af dATP
        3 µL af Klenow DNA Polymerase
      2. Rense prøver ved hjælp af 90 µL DNA-bindende magnetiske perler og 400 µL af frisklavede 70% ethanol pr. prøve. Tilføje 90 µL af perler til hver prøve og Inkuber i 5 min ved stuetemperatur. Pellet perler, Fjern supernatanten og resuspend pellet i 200 µL af 70% ethanol. Fjerne ethanol og Gentag vask en gang.
      3. Bruge en magnetisk plade til pellet perler og fjerne så meget ethanol som muligt. Tør i et 37 ° C heatblock i 3-5 min. indtil perle pellet er helt tørre. Resuspend i 35 µL nukleasen-gratis vand og saml ca 33,5 µL af supernatanten.
    4. Ligate methylerede adapteren.
      1. Forberede ligatur Master Mix på isen og tilføje 16,5 µL af mix til hver prøve. Inkuber i et termisk cycler uden en opvarmet låg (20 ° C i 15 min, 4 ° C hold).
        Ligatur Master Mix (pr. sample):
        2,5 µL vand
        2,5 µL af Methyl-Seq methylerede Adapter
        10 µL af T4 DNA Ligase Buffer (5 x)
        1,5 µL af T4 DNA Ligase
      2. Rense prøver ved hjælp af 90 µL DNA-bindende magnetiske perler og 400 µL af frisklavede 70% ethanol pr. prøve. Tilføje 90 µL af perler til hver prøve og Inkuber i 5 min ved stuetemperatur. Pellet perler og Fjern supernatanten resuspend pellet i 200 µL af 70% ethanol. Fjerne ethanol og Gentag vask en gang.
      3. Bruge en magnetisk plade til pellet perler og fjerne så meget ethanol som muligt. Tør i et 37 ° C heatblock i 3-5 min. indtil perle pellet er helt tørre. Resuspend i 22 µL nukleasen-gratis vand og saml ca 22 µL af supernatanten. Vurdere kvalitet ved hjælp af en bioanalyzer.
        Bemærk: Hvis det samlede beløb af DNA er mindre end 500 ng, shear og processen yderligere DNA før proceduren med de efterfølgende skridt. Hvis den gennemsnitlige DNA størrelse ikke øger af mere end 30 bps, check for at sikre, at reagenserne, der er nye, som T4 DNA polymerase, Klenow og/eller T4 kan ligase være gammel.
        Standsested: Efter ligating methylerede adapter, prøver kan forsegles og opbevares ved-20 ° C.
  2. Hybridisering
    1. Overføre prøver at lave DNA-bindende microcentrifuge rør og bruge en opvarmet vakuum koncentrator for at reducere sample volumen til mindre end 3,4 µL. rekonstruere prøver til 3,4 µL.
      Bemærk: Koncentrat prøver at ca ~ 3 µL at sikre prøver er fjernet fra vakuum koncentrator før alle væske fordamper.
    2. Forberede hybridisering buffer ved stuetemperatur og Methyl-Seq blok Mix på is. Tilføje 5,6 µL af Methyl-Seq blok Mix til hver prøve og Inkuber i termisk cycler (95 ° C i 5 min, 65 ° C i 2 min., 65 ° C hold).
      Hybridisering Buffer (pr. sample):
      6.63 µL af Methyl-Seq Hyb 1
      0,27 µL af Methyl-Seq Hyb 2
      2,65 µL af Methyl-Seq Hyb 3
      3,45 µL af Methyl-Seq Hyb 4
      Methyl-Seq blok Mix (pr. sample):
      2,5 µL af Methyl-Seq indeksering blok 1
      2,5 µL af Methyl-Seq blok 2
      0,6 µL af Methyl-Seq blok 3
    3. Forberede RNase blok Mix og fange bibliotek hybridisering mix. Tilføj 20 µL af fange bibliotek hybridisering Mix til hver prøve og inkuberes ved 65 ° C i mindst 16 h.
      RNase blok Mix (pr. sample):
      0,5 µL af RNase blok
      1,5 µL vand
      Fange bibliotek hybridisering Mix (pr. sample):
      13 µL af hybridisering Buffer
      2 µL af RNase blok Mix
      5 µL af rotte Methyl-Seq fange bibliotek
      Bemærk: holde reaktioner på 65 ° C når du tilføjer hybridisering Mix for at forhindre ikke-specifik binding.
    4. Alikvot 50 µL af streptavidin magnetiske perler per prøve i en ny 8-godt strip tube. Vaske perlerne med 200 µL af Methyl-Seq bindende Buffer. Bruge magnetisk plade til pellet perler og Fjern supernatanten mellem hver vask for ialt 3 vasker. Efter den sidste vask, resuspend streptavidin perler i 200 µL af Methyl-Seq bindende Buffer.
    5. Tilføje prøver til 200 µL af vasket streptavidin magnetiske perler og inkuberes ved stuetemperatur i 30 min. ved hjælp af en roterende mixer. Mens blanding, alikvot 200 µL af Methyl-Seq Wash Buffer 2 i tredobbelt wells af en 96-brønd plade pr. prøve og sted i en termisk cycler til pre varm til 65 ° C.
    6. Efter inkubationen pellet streptavidin magnetiske perler ved hjælp af magnetisk plade og resuspend perlerne i 200 µL Methyl-Seq Wash Buffer 1. Inkuber i 15 min ved stuetemperatur. Bruge en magnetisk plade til pellet og kassér supernatanten.
    7. Vaske perlerne 3 gange med Methyl-Seq vaske Buffer 2: resuspend perle pellet i 200 µL af vaske Buffer 2 (pre varmet i trin 6.2.5.), inkuberes perler i termisk cycler (65 ° C, 10 min) og pellet perler. Kassér supernatanten efter hver vask ved hjælp af en magnetisk plade.
      Bemærk: Fastholde hybridisering reaktioner på 65 ° C, når du tilføjer Wash Buffer 2 for at forhindre ikke-specifik binding.
    8. Tilføj 20 µL af Methyl-Seq eluering Buffer til vasket perlerne og inkuberes ved stuetemperatur i 20 min. Brug en magnetisk plade til pellet perler og supernatanten overføres til en ny stribe tube. Kassér perlerne.
      Bemærk: Mens inkubere, forberede bisulfite konvertering reagens.
  3. Bisulfite konvertering
    Bemærk: Udføre bisulfite konvertering af den eluted ssDNA ved hjælp af passende reagenser og instruktioner fra en kommercielt tilgængelig bisulfite konvertering kit.
    1. Tilføje 130 µL forberedt bisulfite konvertering reagens til supernatanten fra forrige trin. Opdele hver af de 150 µL reaktioner ligeligt i to brønde. Inkuber i et termisk cycler (64 ° C for 2,5 h, 4 ° C hold).
      Bemærk: 150 µL reaktion er ligeligt fordelt i to separate brønde at sikre ensartet temperatur. Efter inkubation i 2,5 timer, straks gå videre til næste trin.
    2. Binde prøver at dreje kolonner ved at tilføje 600 µL af Binding Buffer og vaske en gang med 100 µL af Wash Buffer. Der centrifugeres kolonner (15.000 x g, 1 min) mellem alle bisulfite Konverteringstrin og kassér gennemstrømningen.
    3. Desulphonate prøver ved at tilføje 200 µL af Desulphonation Buffer til kolonner. Inkuber ved stuetemperatur for 15-20 min. Gentag centrifugering og kassér gennemstrømningen.
    4. Vask kolonner to gange med 200 µL af vaske Buffer. Elueres hver prøve ved at føje 10 µL af eluering Buffer til den kolonne, inkubere i 3 min. ved stuetemperatur, og centrifugering (15.000 x g, 1 min). Gentag eluering trin for i alt 20 µL.
    5. Forberede PCR reaktion Master Mix 1 på is. Tilføje 82 µL af mix til hver prøve. Inkuber i et termisk cycler med følgende program.
      PCR reaktion Master Mix 1 (pr. sample):
      30 µL vand
      50 µL af Methyl-Seq PCR Master Mix
      1 µL af Methyl-Seq PCR1 Primer F
      1 µL af Methyl-Seq PCR1 Primer Rasmussen
      Termisk Cycler Program:
      Fase 1, 1 cyklus: 95 ° C 2 min
      Fase 2, 8 cyklusser: 95 ° C 30 s, 60 ° C 30 s, 72 ° C 30 s
      Fase 3, 1 cyklus: 72 ° C 7 min
      Fase 4, 1 cyklus: 4 ° C Hold
    6. Rense prøver ved hjælp af 180 µL DNA-bindende magnetiske perler og 400 µL af frisklavede 70% ethanol pr. prøve. Tilføj 180 µL af perler til hver prøve og Inkuber i 5 min ved stuetemperatur. Pellet perler, Fjern supernatanten og resuspend pellet i 200 µL af 70% ethanol. Fjerne ethanol og Gentag vask en gang.
    7. Bruge en magnetisk plade til pellet perler og fjerne så meget ethanol som muligt. Tør i et 37 ° C heatblock i 3-5 min. indtil perle pellet er helt tørre. Resuspend i 21 µL nukleasen-gratis vand og indsamle cirka 19,5 µL af supernatanten.
  4. Indeksering
    1. Forberede PCR reaktion Master Mix 2 på is. Tilføje 25,5 µL Master Mix 2 til hver prøve. Tilsæt 5 µL kommercielle indeksering primere til individuelle prøver og inkuberes i en termisk cycler.
      PCR reaktion Master Mix 2 (pr. sample):
      25 µL methyl-Seq PCR Master Mix
      0,5 µL methyl-Seq fælles indeksering Primer
      Termisk Cycler Program:
      Fase 1, 1 cyklus: 95 ° C 2 min
      Fase 2, 6 cyklusser: 95 ° C 30 s, 60 ° C 30 s, 72 ° C 30 s
      Fase 3, 1 cyklus: 72 ° C 7 min
      Fase 4, 1 cyklus: 4 ° C Hold
      Bemærk: Yderligere cykler (2-3) kan være nødvendigt, hvis start DNA koncentrationen er under de anbefalede værdier.
    2. Rense prøver ved hjælp af 90 µL DNA-bindende magnetiske perler og 400 µL af frisklavede 70% ethanol pr. prøve. Tilføje 90 µL af perler til hver prøve og Inkuber i 5 min ved stuetemperatur. Pellet perler, Fjern supernatanten og resuspend pellet i 200 µL af 70% ethanol. Fjerne ethanol og Gentag vask en gang.
    3. Bruge en magnetisk plade til pellet perler og fjerne så meget ethanol som muligt. Tør i et 37 ° C heatblock i 3-5 min. indtil perle pellet er helt tørre. Resuspend i 24 µL nukleasen-gratis vand og saml ca 24 µL af supernatanten.
    4. Vurdere koncentration og bp størrelse ved hjælp af high-sensitivity DNA påvisning reagenser på en bioanalyzer.
      Bemærk: Hvis bioanalyzer undlader at påvise tilstedeværelsen af bibliotek DNA, Gentag trinene forberedelse med yderligere DNA.
      Stoppunkt: efter rensning, indekseret prøver kan forseglet og opbevares ved-20 ° C.
    5. Samle prøver for passende næste generation sequencing anvendte platform.
      1. Ved hjælp af koncentration data fra bioanalyzer, som bestemmer DNA molariteten baseret på biblioteket størrelse og mængde udtrykt i en given mængde, fortyndes med lav TE buffer (6.1.1.1) og kombinere alle prøver til en endelig koncentration på 15 pM.
        Bemærk: En mere følsom metode til kvantificering af biblioteket er af kvantitativ real-time PCR ved hjælp af primere, der er målrettet de sammenskrevne adaptere.
      2. Køre poolede prøver på antallet af vognbaner, der er tilstrækkeligt til 4 prøver pr. vognbane på et næste-generations sequencer.
        Bemærk: For eksempel, hvis 16 bibliotek prøver er unikt indekseret og kombineret, køre bibliotekerne over 4 baner, svarende til 4 prøver pr. vognbane.

7. sekvensering på et næste-generations Sequencer

  1. Sende prøverne til institutionelle sekventering kernen til klynger af Methyl-Seq bibliotek, efterfulgt af sekventering på en next-generation sequencing maskine.

8. analyse til at identificere Mickael

  1. Gennemføre Bismark15, der påberåber sig Butterfly 2.0 som en indre sekvens aligner16,17, for at justere rå input læser til bisulfite-konverteret, plus-strand genom. Efter justering, brug Bismark_methylation_extractor til at udføre kvalitetskontrol og tildele en anslået methylering værdi til hver CpG.
  2. Generer en liste over Isabella med BS-Seq pakke18 i Bioconductor. Filter Mickael baseret på at have større end 3 på hinanden følgende CpGs og P-værdi < 0,05.
    Bemærk: Generere en DMR-liste, der indeholder genomisk koordinater, afstand til nærmeste RefSeq-genet, antallet af CpGs inden for hver DMR, gennemsnit % CpG methylering værdi på tværs af DMR for to sammenligning grupperne (f.eks. understregede vs tryksvage), P-værdi, og den FDR (falske opdagelse sats) værdi. Brug listen DMR, dvs., genomisk koordinater, til at designe pyrosequencing primere for validering.

9. validering af Bisulfite Pyrosequencing

  1. Primer Design
    1. Design primere for bisulfite PCR og pyrosequencing. Designe to sæt PCR-primere (udefra og indlejrede), så de indlejrede PCR vil forstærke 150-400 bps af en DMR.
      Bemærk: I almindelighed, designede primere er mindst 24 baser lang med mindst 4-5 ikke-fortløbende G's (CS til den omvendte primer) konto for reduceret udglødning temperatur fra tab af sekvens kompleksitet. En af de indlejrede primere bliver biotin-mærket og HPLC-renset. Standard primere skal dog bestilles første til at optimere PCR skridt ved at løse reaktioner på en agarosegel.
      1. Design af pyrosequencing assay primer, så at det henvender sig til de supplerende biotinylated strand kun 1-2 baser opstrøms i CpGs skal analyseres. Designe flere pyrosequencing primere som nødvendigt, som hver pyrosequencing primer kan pålideligt assay 30 bps nedstrøms.
    2. For Rt1-m4, skal du bruge følgende:
      rRT1M4 uden for-F TGTAYGATTTTGGTTATYGTAAAT
      rRT1M4 uden for-R AACTTACAAATTTCACCAACTCA
      rRT1M4 indlejrede – F GTGGGTTAYGTGGATAATATATAG
      rRT1M4 indlejrede-R AATCACTTACCATTCTCTCTCTAACTA
      rRT1M4 Pyro1 TAYGTGGATAATATATAGAT
      rRT1M4 Pyro2 GATAGTTATTTGGYGAGTTAG
      rRT1M4 Pyro3 GAGTATTTGGAGGAGTTGAT
      rRT1M4 Pyro4 GGATTTTAATATTTGGT
  2. Bruge et kommercielt tilgængeligt kit til bisulfite konvertering af rotte blod gDNA.
    Bemærk: Konverteringstrin bisulfite er blevet tilpasset fra den kommercielt tilgængeligt kit med følgende ændringer: I trin 1, tilføje 50 – 100 ng af blod gDNA og fortyndes med vand til 20 µL. I trin 9, elueres 20 µL pr. prøve.
    1. Forberede bisulfite konvertering reagens ifølge producentens protokol og kombinere med fortyndet gDNA. Inkuber i termisk cycler (64 ° C for 2,5 h, 4 ° C hold).
    2. Tilføje bindende Buffer til konverterede gDNA i spin kolonner og centrifuge (15.000 x g, 1 min). Vask kolonner en gang derefter tilføje Desulphonation Buffer til kolonnerne og Inkuber i 15 min. ved stuetemperatur. Centrifuge (15.000 x g, 1 min).
    3. Vaske kolonnen med vaske Buffer, og der centrifugeres (15.000 x g, 1 min). Gentag vask trin med centrifugering (15.000 x g, 2 min). Tilføj 20 µL eluering Buffer, og der centrifugeres (15.000 x g, 1 min) at eluere.
  3. PCR-amplifikation
    1. Udarbejde udendørs PCR Master Mix. Tilføje 21,5 µL af Master Mix til 3,5 µL bisulfite-konverteret gDNA og køre termisk cycler program.
      Udenfor PCR Master Mix:
      16,25 µL vand
      2,5 µL af Buffer, Polymerase [10 x]
      0,5 µL af dNTP [10 mM]
      1 µL af fremad Primer [0,1 µM]
      1 µL af Reverse Primer [0,1 µM]
      0,25 µL af Taq DNA Polymerase [5000 U/mL].
      Termisk cycler program:
      Fase 1, 1 cyklus: 94 ° C 4 min
      Fase 2, 47 cyklusser: 94 ° C 1 min., 53 ° C 30 s, 72 ° C 1 min
      Fase 3, 1 cyklus: 72 ° C 8 min, 4 ° C Hold
    2. Forberede indlejrede PCR Master Mix. Tilføje 23 µL af Master Mix til 2 µL af prøven fra udenfor PCR og Gentag programmet udenfor PCR termisk cycler. Vurdere PCR produktkvalitet gennem gelelektroforese (1 x TAE buffer, 1% agarosegel).
      Indlejrede PCR Master Mix:
      17.75 µL vand
      2,5 µL af Buffer, Polymerase [10 x]
      0,5 µL af dNTP [10 mM]
      1 µL af fremad Primer [0,1 µM]
      1 µL af Reverse Primer [0,1 µM]
      0,25 µL af Taq DNA Polymerase [5000 U/mL]
      Bemærk: For indlejrede PCR, enten fremad eller den omvendte primer skal være biotinylated.
  4. Pyrosequencing
    1. Gøre en master mix der indeholder 38 µL af bindende Buffer, 35 µL vand og 2 µL af streptavidin-belagt sepharose perler pr. prøve. I en 96-brønd plade, tilføje 75 µL af master mix og 5 µL af indlejrede PCR produkt. Ryste på en plade shaker i 15-60 min.
    2. Tilføje 12 µL af primer (0,5 µM, fortyndet i udgloedning buffer) i hullerne i en pyrosequencing assay plade under omrystning.
    3. Efter omrystning, udføre vask trin ved hjælp af bindende reaktion vask buffere. Placer vakuum værktøj i trug fyldt med vand og derefter indsamle prøver fra pladen. Dykke vakuum værktøj i halv-fyldte trug med 70% ethanol, NaOH (0,2 M) og Tris acetat buffer (10 mM, pH 7,4). Afbryde forbindelsen fra vakuum og sted vakuum værktøj i HS assay plade til at overføre perler.
    4. Placere plade på varme blok og inkuberes ved 80 ° C i 2 min. Tillad plade til at afkøle i 5 min. derefter begynde pyro program.

Representative Results

En vellykket gennemførelse af rotte Methyl-Seq platform afhænger af flere kriterier. Figur 1 viser den samlede arbejdsgang af undersøgelsen og fremhæver særlige kvalitetskontrol (QC) trin, der er nødvendige, før du flytter videre. En af de første faktorer er robusthed af de dyremodel og stress regime, der bestemmer omfanget af epigenetiske forandringer, der sker på tværs af methylome. Da vores animalske arbejde er baseret på vores tidligere observation, at corticosterone (CORT) eksponering kan føre til ændringer i DNA methylering19,20, vores kronisk variable stress (CVS) regime skulle være af tilstrækkelig strenghed at producere understregede rotter med forhøjet plasma CORT niveauer. En typisk ugentlig CVS regime er vist i tabel 1 og bestod af daglige stressfaktorer i morgen, eftermiddag, og natten der konstant ændres for at undgå tilvænning og formindsket stressrespons. Hele 3 ugers regime, de stressede dyr udstillet væsentligt forhøjede niveauer af gennemsnitlig plasma CORT [dage 4-21, kontrol: 32.7 3,7 ng/mL, Stress: 103.0 11,9 ng/mL (gennemsnitlig SEM), P = 2.2 x 10-4, figur 2A] over de af tryksvage, kontroldyr. Konsekvent, disse dyr også viste større angst-lignende adfærd på forhøjet plus labyrint (EPM), som angivet af den betydeligt mere tid i de lukkede arme af EPM'EN og mindre tid i de åbne arme (figur 2B). Disse resultater viser, at CVS eksponering førte til betydelig endokrine og adfærdsmæssige ændringer, der fører os til at undersøge, om disse ændringer var forbundet med specifikke DNA methylering signaturer.

Vi fremhæve flere kontrolsteder, der er afgørende for en vellykket opførelse af Methyl-Seq bibliotek. Startende med en tilstrækkelig mængde af DNA er nødvendige, som sonikering, flere vask/rensning, target berigelse, og bisulfite Konverteringstrin reducere successivt mængden af DNA i den færdige bibliotek. Selv om flere PCR forstærkning trin afbøde tabet af DNA skabelon, kan overdreven PCR cyklus numre indføre højere dublerede læser. For den nuværende rotte Methyl-Seq undersøgelse, blev 2 g af blod gDNA pr. rotte brugt. Vi bemærker, at Methyl-Seq biblioteker kan gøres med start DNA beløb så lavt som 500 ng. Mindre starter materiale tillader brugernes hen til oprette biblioteker fra DNA isoleret af FACS (Fluorescens-aktiveret celle sortering) eller nål slag, selv om der er øget risiko for at producere en utilstrækkelig mængde af biblioteker til efterfølgende sekvensering. QC udføres af elektroforese af 1 L i eksemplet på en bioanalyzer, som giver DNA molekylvægt, mængde, der og Molaritet. Tre kritiske trin, der kræver brug af bioanalyzer er: 1) Efter ultralydbehandling skridt for at sikre tilstrækkelig klipning af DNA (~ 170 bp, rød, figur 3); 2) følgende adapter ligatur trin angivet ved et skift i den gennemsnitlige størrelse af den afrevne DNA (~ 200 bp, blå, figur 3) at sikre deres efterfølgende forstærkning af PCR; og 3) følgende endelige bibliotek rensning trin for at sikre, at mængden og størrelsen af bibliotek til sekvensering.

R-pakker BSSeq og BSmooth i Bioconductor blev brugt til at analysere bisulfite sequencing data18. De omfatter værktøjer og metoder til at justere sekvens lyder, udførelse af kvalitetskontrol, og at identificere varierende methylerede regioner (Isabella). BSmooth software påberåber sig Butterfly 2.016,17 som en indre sekvens aligner skaffe CpG-niveau måling resuméer, ved justering af rå input læser til bisulfite-konverteret genomiske sekvenser. De justerede læser derefter filtreres gennem strenge kvalitetskontrolprocedurer, der søger at identificere systematisk sekvensering og base-ringer fejl, som kan give en skævhed downstream analyser. En serie af parceller genereres for at visuelt støtte i denne proces for filtrering. Sekventering metrics er også genereret til dokument relevante oplysninger, såsom antal justeret læser, %-målet, og per CpG dækning, blandt andre (tabel 2). Når dataene er filtreret, en gulvafslibning/normalisering algoritme udføres, hvor hver CpG er tildelt en anslået methylering værdi baseret på alle QC læser fra hver prøve og skøn fra nærliggende CpGs for at sikre mere præcise kald af methylering status selv i tilfælde, hvor sekvens dækning er lav. Denne værdi indeholder en glattes skøn over sandsynligheden for methylering på hver CpG site. Ved at sammenligne middelværdien af glattes methylering skøn over hver prøve mellem de to behandlingsgrupper og ranking genomisk regioner fra de mest markant anderledes mildt, genereres en liste over Isabella (tabel 3).

Toppen DMR mellem stresset og tryksvage grupper var placeret i promotor af rotte store histocompatibility gen Rt1-m4, med stressede dyr udstiller højere methylering niveauer på tværs af alle CpGs end tryksvage dyr (figur 4A). For at bekræfte en vellykket gennemførelse af Methyl-Seq-platformen og dataanalyse, var primere designet mod DMR, og blodet DNA methylering i hele kohorten af stressede og tryksvage dyr (8 sekventeret af Methyl-FF. og 8 ikke sekventeret) blev vurderet af bisulfite pyrosequencing. Resultaterne viser betydelig stigning i DNA methylering på tværs af 10 af de 12 CpGs analyseres (5.1 – 10.4 ændring i % methylering, P < 0.037, figur 4B). KEGG sti analyse blev udført på alle de nominelt betydelig Isabella til at identificere veje forbundet med stress. Konsekvent, impliceret DMR-associerede veje sygdomme forbundet med kronisk stress eksponering, såsom diabetes, hjerte-kar-sygdom og kræft (tabel 4). 21 , 22 , 23 for at demonstrere en tilknytning mellem den epigenetiske data og graden af eksponering til stress, methylering niveauer på CpG-10 sammenlignet med de gennemsnitlige 3-ugers CORT niveauer for hvert dyr. Resultaterne viste en beskeden korrelation mellem det endokrine og methylering data (R2= 0,54, P = 0,001, figur 5).

Figure 1
Fig. 1: samlede skematisk arbejdsgang for den rotte Methyl-Seq platform. Én g af genomisk DNA ekstraheret fra blod understregede og kontrol rotter behandles først til at konstruere Methyl-Seq biblioteker til sekvensering, analyse og målet identifikation. En anden 100 ng af DNA anvendes til uafhængig validering af de identificerede epigenetiske mål af bisulfite pyrosequencing. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: eksponering for kronisk variable stress (CVS) fører til hormonforstyrrende og adfærdsmæssige ændringer i rotter. (A) flere prøveudtagninger af corticosterone (CORT) demonstrere robusthed af de 3 uge CVS regime. Blodprøver blev indsamlet om morgenen før den daglige stress regime. (B) stresset dyr brugt mere tid i de lukkede arme og mindre tid i de åbne arme af forhøjet plus labyrint (EPM). Boxplots med datapunkt for hvert dyr er vist. Student's T-test blev udført for Statistisk signifikans. * P < 0,05, ** P < 0,01, og *** P < 0,001. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: kvantitering af afrevne og adapter-forbundet rotte DNA på en bioanalyzer. De røde og blå kurver viser mængden og størrelsen af genomisk DNA (red) efter klipning i en isotermisk sonikator og adapter ligatur, henholdsvis. Hver linje repræsenterer én prøve og røde og blå kurver afspejler både tab af DNA under de flere trin (slutningen-reparation, 3'-adenylation og prøve oprydning) og øge i bp størrelse som følge af ligatur af adapterne. Skarpe toppe på 25 bp og 1500 bp er standard markører, der er blevet føjet til loading bufferen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: CVS-induceret epigenetiske ændringer registreres af rotte Methyl-FF. (A) analyse af rotte Methyl-Seq data impliceret promotor af genet Rt1m4 som en varierende methylerede region (DMR) mellem stresset (rød) og kontrol (blå) rotter. Den grafiske produktion for Rt1m4 DMR (pink skraverede område) viser hver CpG (lodret grå linje), de fire prøver i hver gruppe (rød eller blå linjer), og % methylering niveauer for hvert dyr (rød eller blå prik). (B) tolv CpGs inden for DMR blev valideret af bisulfite pyrosequencing. I søjlediagrammer er repræsenteret som betyder SEM, og en Student's T-test blev udført for Statistisk signifikans. * P < 0,05. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: lineær regressionsanalyse viste en beskeden korrelation mellem % DNA methylering på CpG-10 i Rt1m4 og 3 uge mener plasma CORT niveauer af begge understregede og kontrollere dyr (N = 16). Data fra stressede dyr vises som røde cirkler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Uge Dag 1 Dag 2 Dag 3 Dag 4 Dag 5 Dag 6 Dag 7
AM Tilbageholdenhed Svømme Kølerum Svømme Tilbageholdenhed Shaker Svømme
PM Shaker Bur Tilt Tilbageholdenhed Shaker Kølerum Tilbageholdenhed Kølerum
Overnatning Mad begrænse Vådt strøelse Isolation Lys på Fortrængning Lys på Vådt strøelse

Tabel 1: En typisk ugeskema af kronisk variable stress regime (CVS).

Sekventering målinger Stress1 Kontrol1
(n = 4) (n = 4)
Parret ende læser (PER) 89,290,397 80,165,674
Entydigt kortlagt parrede ende læser (UMPER) 39,200,255 35,013,406
Justering sats/kortlægning effektivitet (UMPER / PER) 44% 44%
Dublerede læser (% af UMPER) 73% 65%
Deduplicated UMPER 10,481,031 12,306,018
Gennemsnitlig Læs dybde dækning (x) (ARDC) 6 x 6 x
CpGs (N) 12,056,878 12,056,878
ARDC (x) af CpGs 2 x 2 x
CpGs med mindst 10 læser (N) 481,383 595,850
ARDC (X) af CpGs med mindst 10 læser 19 19
På Target CpGs (komplet overlapning med sonde destinationsområderne) 1,923,872 2,007,638
På Target ARDC (x) af CpGs 7 x 8 x
På Target CpGs med mindst 10 læser (N) 428,249 531,419
På Target ARDC (x) af CpGs med mindst 10 læser 18 x 18 x
På mål (PER med 1 eller flere basepar overlapning med sonde destinationsområderne) (UMPER) 8,277,715 9,369,523
% På mål (i Deduplicated UMPER) 78% 77%
På mål (samlede baser tilknyttet) Mb 125 mb 128 mb
På Target gennemsnitlige Læs dybde dækning (x) (ARDC) 9 x 10 x
1 Sekventering målinger baseret på gennemsnit på tværs af fag i hver gruppe

Tabel 2: Sekventering metrikværdier fra rotte Methyl-Seq platform.

Chr Start udgangen gen afstand areaStat meanDiff stress kontrol retning
chr20 1,644,246 1,644,390 RT1-M4 in_gene 93.03 0,22 0,33 0,11 gevinst
chr5 160,361,352 160,361,564 LOC690911 in_gene -70.75 -0.19 0.72 0,91 tab
chr3 61,138,281 61,138,330 RGD1564319 265569 61.79 0,21 0,94 0.72 gevinst
chr2 143,064,811 143,065,010 Ufm1 8569 -59.48 -0.11 0,13 0,24 tab
chr7 30,764,111 30,764,284 Ntn4 in_gene 57,04 0,21 0,94 0,73 gevinst
chr17 12,469,112 12,469,218 Idnk 41996 -50.91 -0.13 0,74 0,88 tab
chr7 47,101,725 47,101,930 Pawr in_gene -50.54 -0.12 0,64 0,76 tab
chr5 76,111,248 76,111,822 Txndc8 151703 -50.38 -0.11 0,85 0,96 tab
chr11 80,640,132 80,640,356 Dgkg in_gene -50.07 -0.16 0,73 0.89 tab
chr8 71,759,248 71,759,411 Mir190 210226 -47.84 -0.17 0,58 0,75 tab

Tabel 3: Top 10 varierende methylerede områder. For hver DMR outputtabel vises fra venstre til højre kolonne: kromosomale placering (chr), koordinerer (start/slut), gen navn, afstand fra transkription starter site, differential område statistik mellem understreget og kontrol grupper (areaStat), mener differential methylering (meanDiff), betyder methylering niveauer på tværs af hver DMR for understregede og kontrolgrupper (stress/kontrol) og retning af methylering ændres fra kontrolelementer.

KEGG Pathway vilkår Gen tæller % P-værdi Benjamini
Diabetes
Type II diabetes mellitus 12 0,1 3.6 x 10-4 9,8 x 10-3
Hjerte-kar-sygdom
Vaskulære glatte muskelsammentrækning 18 0,1 1.6 x 10-3 3.6 x 10-2
Arrhythmogenic højre ventrikel kardiomyopati (ARVC) 13 0,1 4,0 x 10-3 7.1 x 10-2
Forstørrede kardiomyopati 14 0,1 7.6 x 10-3 1.2 x 10-1
Neuron-funktion
Langsigtede potensering 11 0,1 1.5 x 10-2 1.4 x 10-1
Signalering
MAPK signalvejen 35 0,2 2.4 x 10-4 9,9 x 10-3
Calcium signalvejen 22 0,1 1.2 x 10-2 1.4 x 10-1
Chemokine signalvejen 21 0,1 1.2 x 10-2 1,3 x 10-1
Kræft
Veje i kræft 42 0,3 4.1 x 10-5 3.4 x 10-3
Gliom 15 0,1 4.4 x 10-5 2.4 x 10-3
Ikke-småcellet lungekræft 10 0,1 7.9 x 10-3 1.1 x 10-1
Kolorektal cancer 13 0,1 8.4 x 10-3 1.1 x 10-1
Kronisk myeloid leukæmi 12 0,1 1.2 x 10-2 1,3 x 10-1

Tabel 4: KEGG sti analyse af Mickael identificeret fra rotte Methyl-FF.

Discussion

I denne undersøgelse, vi designet og implementeret Methyl-Seq platform for rotte genom. Ved at demonstrere dens nytte med en rotte model af stress, viste vi, at experimental og analytisk rørledningen kan give varierende methylerede regioner mellem to sammenligning grupper.

For at sikre en vellykket gennemførelse af platformen, skal flere kritiske trin overholdes. Første, indledende DNA kvalitet og mængde har en betydelig indvirkning på kvaliteten og kvantiteten af den endelige Methyl-Seq bibliotek. Vi brugte en fluorometer i stedet for et spektrofotometer, til at sikre, at vores DNA måling afspejles mængden af dobbelt-strenget DNA stede. Bioanalyzer blev brugt til at måle den molekylære størrelse og mængde DNA efter klipning og efter adapter ligatur. Kontrollere den molekylære størrelse "shift" mellem disse trin er afgørende for at bekræfte tilstedeværelsen af adaptere for enden af hver DNA-fragment, der vil gennemgå adapter-medieret PCR i de efterfølgende trin. Mængden af DNA resterende for enden af adapteren ligatur skridt er også vigtigt, siden mindst 100 ng af varens bibliotek er nødvendigt på dette skridt til at sikre tilstrækkelig mængde findes efter mål berigelse og bisulfite Konverteringstrin. En endelige Højfølsom måling blev udført på biblioteket bygget Methyl-Seq således at biblioteket kan fortyndes ordentligt for efterfølgende klynger på næste generations sequencer. Endelig var bisulfite pyrosequencing ansat som en yderst kvantitative, uafhængige metode til at vurdere nøjagtigheden af den analytiske pipeline. Den endelige validering ved hjælp af den oprindelige prøver og replikering ved hjælp af yderligere dyr er afgørende skridt til at sikre, at eksperimentet kan registrere biologisk signifikante ændringer i DNA methylering.

Vi har desuden flere retningslinjer i tilfælde af afvigelser fra protokollen eller hvis er stødt på problemer. For det første er det muligt at tabe for meget DNA i slutningen-reparation, adapter ligatur eller magnetisk bead rensning trin. Alternativt, starter mængder DNA kunne være små (< 200 ng) på grund af begrænset væv/DNA tilgængelighed eller gennemførelsen af forskellige berigelse metoder såsom fluorescens aktiveret celle sortering. Stigende cyklus antallet under to bibliotek forstærkning trin kan være stand til at kompensere for den uforholdsmæssigt store tab af DNA eller lave start DNA beløb i hele biblioteket konstruktion protokol. Dog anbefales ikke mere end en yderligere 2-3 cykler, som overdreven skabelon forstærkning forventes at føre til en stigning i antallet af dublerede læser at blive sekventeret. Disse dubletter er udelukket under trinnet tilpasning at forhindre bias i procent methylering beregninger. For det andet, hvis den gennemsnitlige DNA størrelse ikke øger af mere end 30 bps, kontrollere for at sikre, at reagenserne, der er nye, som T4 DNA polymerase, Klenow og/eller T4 ligase kan være gammel. Kan bruges kommercielt tilgængelige udskiftning reagenser.

Desuden er det muligt, at de forudsagte Mickael ikke kunne validere ved pyrosequencing, hvor DNA methylering forskelle eksisterer ikke eller er betydeligt mindre end dem forudsagt af analyse. Dårlig validering af kandidat regioner er et problem for fælles for mange analyser, genome-wide, som når pyrosequencing resultater ikke bekræfter differential methylering eller effekt størrelse er meget mindre end forudsagt af analysen. BSmooth er en analytisk pakke at "udjævner" methylering niveauer på tværs af en rude af flere CpGs. For den aktuelle eksperiment impliceret BSmooth en DMR hvis methylering niveauer blev valideret af bisulfite pyrosequencing. Dog vil der sandsynligvis være uoverensstemmelser mellem methylering niveauer forudsagt af BSmooth og verificeret af pyrosequencing. Forskellene opstår fra funktionen udjævning, der anslår de gennemsnitlige methylering værdier på tværs af alle CpGs inden for en DMR, herunder sammenhængende CpGs, der kan variere i DNA methylering af mere end 50% eller CpGs hvis methylering værdier blev udelukket grund sub tærskel læse dybde. R-pakker såsom MethylKit24 kan bruges til at identificere mindre vinduer i CpGs eller endda enkelt CpGs hvis methylering niveauer korrelerer stærkt med dem valideret af pyrosequencing. Gennemføre forskellige pakker og teste deres forudsagte regioner eller CpGs af differential methylering af pyrosequencing vil sikre robusthed af data. Alternativt, oprindelige Methyl-Seq biblioteker kan være resequenced og tilføjet til de Læs filer til at øge Læs dybde. Da bestemmelse af methylering niveauer er semi-kvantitative og dikteret af antallet af læser [(# of CpGs) / (# af TpGs + CpGs)], øge den Læs dybde for en given CpG vil øge nøjagtigheden af dens procent methylering værdi. I denne undersøgelse fandt vi kun CpGs hvis methylering værdier blev bestemt af mindst ti læser og opnåede en samlet Læs dækning af 19 x for hver CpG.

Rotte Methyl-Seq platform er ikke uden sine begrænsninger. Mens det er mere omkostningseffektive end hele-genom bisulfite sekventering, er det væsentligt dyrere end andre metoder. Ikke desto mindre, størstedelen af omkostningerne var købt baner på sequencer og ikke for capture-system. Afhængigt af den Læs dybde nødvendigt med cross-væv sammenligninger kræver mindre på grund af store (25-70%) forskelle12 i DNA methylering, kan omkostningerne reduceres ved multiplexing flere prøver pr. vognbane og bruge en højere kapacitet platform. Også, at prøveforberedelsen er mere tidskrævende end andre metoder. Mens ligner andre pulldown tilgange, der indarbejder næste generation sequencing, tilføje ekstra bisulfite konvertering og rensning trin til arbejdsbyrden. Samlet set Methyl-Seq platform er en omkostningseffektiv alternativ til hele-genome sequencing og giver basepar opløsning på mere end 2,3 millioner CpGs, hvilket er betydeligt mere end de analyseres af microarray-baserede platforme. Til dato, kommercielt tilgængelige menneskelige og mus har Methyl-Seq platforme været brugt til at dokumentere alkohol-afhængige ændringer i makak hjernen25,26, Neuro-udviklingsmæssige gener i mus hjernen9, og blod-hjerne af glukokortikoider10mål. Yderligere, evnen til at målrette specifikke regioner uanset sekvens anerkendelse af restriktionsenzymer gør det en ideel platform for cross-arter sammenligninger. For denne undersøgelse designet vi Methyl-Seq platformen for rotte, som mange farmakologiske, metaboliske og adfærdsmæssige eksperimenter er foretaget uden gavn for en genome-wide methylomic værktøj. Vores data viser, at det kan bruges til at registrere Isabella i en rotte model af stress og korreleret andre fysiologiske parametre såsom samlede plasma CORT niveauer.

Methyl-Seq-platformen er ideel til epigenetiske eksperimenter i dyr med sekventeret genomer, der ikke måske har nok eksperimentelle bevismateriale dokumenterer lovgivningsmæssige områder. Når sådanne regioner stilles til rådighed, kan yderligere regioner specialdesignede og knyttet til den aktuelle version. Yderligere, platformen er ideel til Komparativ genomforskning, da målet berigelse ikke er begrænset af begrænsning enzym anerkendelse. For eksempel, kan regionen promotor af enhver gen af interesse blive fanget uanset om det havne en specifik restriktion site. Ligeledes, enhver regulerende regioner, såsom dem fundet i mus eller mennesker, som er bevaret i genomet af interesse kan blive fanget.

Disclosures

Håndskriftet er en del af en konkurrence præmie fra Agilent Technologies.

Acknowledgments

Undersøgelsen blev finansieret af NIH grant MH101392 (RSL) og støtte fra de følgende priser og fonde: en NARSAD Young Investigator Award, Margaret Ann pris Investigator fond, James Wah humør lidelser Scholar fonden via Charles T. Bauer Foundation, Baker Foundation, og projektet Match Foundation (RSL).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Radioimmuno assay (RIA) MP Biomedicals 7120126 Corticosterone, 125I labeled
Master Pure DNA Purification Kit Epicentre/Illumina MC85200
Thermal-LOK 2-Position Dry Heat Bath USA Scientific 2510-1102 Used with 1.5 mL tubes
Vortex Genie 2 Fisher 12-812 Vortex Mixer
Ethyl alcohol, Pure Sigma-Aldrich E7023 100% Ethanol, molecular grade
Centrifuge 5424 R Eppendorf - Must be capable of 20,000 x g
Qubit 2.0 ThermoFisher Scientific Q32866 Fluorometer
Qubit dsDNA BR Assay Kit ThermoFisher Scientific Q32850
Qubit dsDNA HS Assay Kit ThermoFisher Scientific Q32851 High sensitivity DNA detection reagents
Qubit Assay Tubes ThermoFisher Scientific Q32856
SureSelectXT Rat Methyl-Seq Reagent Kit Agilent Technologies G9651A Reagents for preparing the Methyl-Seq library
SureSelect Rat Methyl-Seq Capture Library Agilent Technologies 931143 RNA baits for enrichment of rat targets
IDTE, pH 8.0 IDT DNA 11-05-01-09 10 mM TE, 0.1 mM EDTA
DNA LoBind Tube 1.5 mL Eppendorf 22431021
Covaris E-series or S-series Covaris - Isothermal sonicator
microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm (25) Covaris 520045
Water, Ultra Pure (Molecular Biology Grade) Quality Biological 351-029-721
Veriti 96 Well-Thermal Cycler Applied Biosystems 4375786
AMPure XP Beads Beckman Coulter A63880 DNA-Binding magnetic beads
96S Super Magnet ALPAQUA A001322 Magnetic plate for purification steps
2200 TapeStation Agilent Technologies G2965AA Electrophresis-based bioanalyzer
D1000 ScreenTape Agilent Technologies 5067-5582
D1000 ScreenTape High Sensitivity Agilent Technologies 5067-5584
D1000 Reagents Agilent Technologies 5067-5583
D1000 Reagents High Sensitivity Agilent Technologies 5067-5585
DNA110 SpeedVac ThermoFisher Scientific - Vacuum Concentrator
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 magnetic beads Invitrogen 65601 Streptavidin magnetic beads
Labquake Tube Rotator ThermoFisher Scientific 415110Q Nutator Mixer is also acceptable
EZ DNA Methylation-Gold Kit Zymo Research D5006 Bisulfite conversion kit. Contains Binding, Wash, Desulphonation, and Elution buffers
Illumina Hi-Seq 2500 Illumina - Next-generation sequencing machine
PCR and Pyrosequencing Primers IDT DNA Variable
Taq DNA Polymerase with ThermoPol Buffer - 2,000 units New England BioLabs M0267L
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set New England BioLabs N0446S
Pyromark MD96 QIAGEN - Pyrosequencing machine
Ethyl Alcohol 200 Proof Pharmco-Aaper 111000200 70% Ethanol solution
Sodium Hydroxide Pellets Sigma-Aldrich 221465 0.2 M NaOH denature buffer solution
Tris (Base) from J.T. Baker Fisher Scientific 02-004-508 10 mM Tris Acetate Buffer wash buffer solution
PyroMark Gold Q96 Reagents (50x96) QIAGEN 972807 Reagents required for pyrosequencing
PyroMark Annealing Buffer QIAGEN 979009
PyroMark Binding Buffer (200 mL) QIAGEN 979006
Streptavidin Sepharose High Performance Beads GE Healthcare 17-5113-01 Streptavidin-coated sepharose beads
PyroMark Q96 HS Plate QIAGEN 979101 Pyrosequencing assay plate
Eppendorf Thermomixer R Fisher Scientific 05-400-205 Plate mixer. 96-well block sold separately (cat. No 05-400-207)
SureDesign Website Agilent Technologies - Target capture design software (https://earray.chem.agilent.com/suredesign/)
UCSC Genome Browser University of California Santa Cruz - rat Nov 2004 rn4 assembly
Agilent Methyl-Seq Protocol Agilent Technologies - https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/G7530-90002.pdf

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
  2. Meissner, A., et al. Genome-scale DNA methylation maps of pluripotent and differentiated cells. Nature. 454 (7205), 766-770 (2008).
  3. Bibikova, M., et al. High density DNA methylation array with single CpG site resolution. Genomics. 98 (4), 288-295 (2011).
  4. Naumov, V. A., et al. Genome-scale analysis of DNA methylation in colorectal cancer using Infinium HumanMethylation450 BeadChips. Epigenetics. 8 (9), 921-934 (2013).
  5. Wockner, L. F., et al. Genome-wide DNA methylation analysis of human brain tissue from schizophrenia patients. Translational Psychiatry. 4, e339 (2014).
  6. Meissner, A., et al. Reduced representation bisulfite sequencing for comparative high-resolution DNA methylation analysis. Nucleic Acids Research. 33 (18), 5868-5877 (2005).
  7. Smith, Z. D., Gu, H., Bock, C., Gnirke, A., Meissner, A. High-throughput bisulfite sequencing in mammalian genomes. Methods. 48 (3), 226-232 (2009).
  8. Slieker, R. C., et al. Identification and systematic annotation of tissue-specific differentially methylated regions using the Illumina 450k array. Epigenetics Chromatin. 6 (1), 26 (2013).
  9. Hing, B., et al. Adaptation of the targeted capture Methyl-Seq platform for the mouse genome identifies novel tissue-specific DNA methylation patterns of genes involved in neurodevelopment. Epigenetics. 10 (7), 581-596 (2015).
  10. Seifuddin, F., et al. Genome-wide Methyl-Seq analysis of blood-brain targets of glucocorticoid exposure. Epigenetics. 12 (8), 637-652 (2017).
  11. Irizarry, R. A., et al. The human colon cancer methylome shows similar hypo- and hypermethylation at conserved tissue-specific CpG island shores. Nature Genetics. 41 (2), 178-186 (2009).
  12. Lee, R. S., et al. Adaptation of the CHARM DNA methylation platform for the rat genome reveals novel brain region-specific differences. Epigenetics. 6 (11), 1378-1390 (2011).
  13. Jankord, R., et al. Stress vulnerability during adolescent development in rats. Endocrinology. 152 (2), 629-638 (2011).
  14. Pellow, S., Chopin, P., File, S. E., Briley, M. Validation of open:closed arm entries in an elevated plus-maze as a measure of anxiety in the rat. Journal of Neuroscience Methods. 14 (3), 149-167 (1985).
  15. Krueger, F., Andrews, S. R. Bismark: a flexible aligner and methylation caller for Bisulfite-Seq applications. Bioinformatics. 27 (11), 1571-1572 (2011).
  16. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  17. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 10 (3), R25 (2009).
  18. Hansen, K. D., Langmead, B., Irizarry, R. A. BSmooth: from whole genome bisulfite sequencing reads to differentially methylated regions. Genome Biology. 13 (10), R83 (2012).
  19. Lee, R. S., et al. Chronic corticosterone exposure increases expression and decreases deoxyribonucleic acid methylation of Fkbp5 in mice. Endocrinology. 151 (9), 4332-4343 (2010).
  20. Lee, R. S., et al. A measure of glucocorticoid load provided by DNA methylation of Fkbp5 in mice. Psychopharmacology. , (2011).
  21. Bose, M., Olivan, B., Laferrere, B. Stress and obesity: the role of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis in metabolic disease. Current Opinion in Endocrinology, Diabetes, and Obesity. 16 (5), 340-346 (2009).
  22. Brydon, L., Magid, K., Steptoe, A. Platelets, coronary heart disease, and stress. Brain, Behavior, and Immunity. 20 (2), 113-119 (2006).
  23. McKlveen, J. M., et al. Chronic Stress Increases Prefrontal Inhibition: A Mechanism for Stress-Induced Prefrontal Dysfunction. Biological Psychiatry. 80 (10), 754-764 (2016).
  24. Akalin, A., et al. methylKit: a comprehensive R package for the analysis of genome-wide DNA methylation profiles. Genome Biology. 13 (10), R87 (2012).
  25. Cervera-Juanes, R., Wilhelm, L. J., Park, B., Grant, K. A., Ferguson, B. Alcohol-dose-dependent DNA methylation and expression in the nucleus accumbens identifies coordinated regulation of synaptic genes. Translational Psychiatry. 7 (1), e994 (2017).
  26. Cervera-Juanes, R., Wilhelm, L. J., Park, B., Grant, K. A., Ferguson, B. Genome-wide analysis of the nucleus accumbens identifies DNA methylation signals differentiating low/binge from heavy alcohol drinking. Alcohol. 60, 103-113 (2017).

Tags

Biokemi spørgsmål 140 Epigenetik DNA methylering rotte Methyl-FF. stress neuroendocrinology
En rotte Methyl-Seq Platform til at identificere epigenetiske ændringer forbundet med Stress eksponering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Carey, J. L., Cox, O. H., Seifuddin, … More

Carey, J. L., Cox, O. H., Seifuddin, F., Marque, L., Tamashiro, K. L. K., Zandi, P. P., Wand, G. S., Lee, R. S. A Rat Methyl-Seq Platform to Identify Epigenetic Changes Associated with Stress Exposure. J. Vis. Exp. (140), e58617, doi:10.3791/58617 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter