Summary
Vi beskriver här, protokoll och genomförandet av metyl-Seq, en epigenetisk plattform, använda en råtta modell för att identifiera epigenetiska förändringar i samband med kronisk stress exponering. Resultaten visar att råtta metyl-Seq plattformen kan upptäcka metylering skillnader som uppstår från stress exponering hos råttor.
Abstract
Som genomen hos en större mängd djur blir tillgängliga, finns det ett ökande behov av verktyg som kan fånga dynamiska epigenetiska förändringar i dessa djurmodeller. Råttan är en viss modell djur där en epigenetisk verktyg kan komplettera många farmakologiska och beteendevetenskapliga studier att ge insiktsfulla mekanistiska information. I detta syfte anpassat vi SureSelect Target Capture-systemet (kallad metyl-Seq) för råtta, som kan bedöma DNA metylering nivåer över råtta genomet. Rat design riktade initiativtagare, CpG öar, ön stränder och GC-rika regioner från alla RefSeq gener.
För att implementera plattformen på en råtta experiment, utsattes manliga Sprague Dawley-råttor för kronisk variabeln stress för 3 veckor, varefter blodprover samlades för genomisk DNA-extraktion. Metyl-Seq bibliotek konstruerades råtta DNA prover av klippning, adapter ligatur, target anrikning, bisulfite konvertering och multiplexing. Biblioteken var sekvenserade i en nästa generations sekvensering plattform och den sequenced läser analyserades för att identifiera Jespers mellan DNA av betonade och obetonade råttor. Toppkandidat Jespers validerades självständigt av bisulfite pyrosekvensering bekräfta robustheten av plattformen.
Resultaten visar att råtta metyl-Seq plattformen är en användbar epigenetiska verktyg som kan fånga metylering förändringar orsakade av exponering betona.
Introduction
Framsteg i hög genomströmning sekvensering har lett till en uppsjö av genomsekvenser både modell och icke-modellorganismer. Tillgången till sådana sekvenser har underlättat forskning i genetik, komparativ genomik och transkriptomik. Exempelvis tillgängliga genomsekvenser är mycket användbart för att anpassa sekvensering data från ChIP-Seq experiment som berikar DNA baserat på associationen med Histon ändringar1eller bisulfite sekvensering, som mäter DNA-metylering av att upptäcka uracil bildas från bisulfite omvandling av unmethylated cytosin2. Dock har förekommit förseningar i genomförandet av epigenetisk plattformar som införlivar tillgängliga genomisk sekvensering data i deras design på grund av kommenterad data av artspecifika reglerande sekvenser som kan påverka geners funktion.
I synnerhet är DNA-metylering en av de mest studerade epigenetiska förändringar på DNA som kan utnyttja tillgängliga genomisk data för att bygga en methylomic plattform. Ett sådant exempel är en array-baserad plattform för mänskliga methylome3, som allmänt har använts i olika discipliner från onkologi till psykiatrin4,5. Tyvärr, liknande plattformar för icke-mänskliga djurmodeller är knappa, som det finns praktiskt taget ingen utbredda plattformar som har dragit nytta av genomiska sekvensen i sin ursprungliga design.
En vanlig metod att bedöma methylomic landskap av icke-mänskliga djurmodeller är minskad representation bisulfite sekvensering (RRBS)6. Detta tillvägagångssätt övervinner kostnaden för helgenom-bisulfite sekvensering som, samtidigt som den ger en omfattande methylomic landskap, ger lägre Läs-djup täckning på grund av kostnaden och begränsad funktionell information i stora gen-fattiga områden av genomet2 . RRBS innebär begränsning digest och storlek-urval av genomisk DNA för att berika för mycket GC-rika sekvenser såsom CpG öar som vanligen hittas nära gen promotorer och tros spela en roll i gen förordning7. Medan den RRBS metoden har använts i ett antal viktiga studier, är beroendet av restriktionsenzym inte utan betydande utmaningar och begränsningar. Anrikning av GC-rika sekvenser i RRBS är exempelvis helt beroende av förekomsten av specifika sekvenser igen av restriktionsenzym och efterföljande storlek urval av elektrofores. Detta innebär att någon genomisk områden som inte innehåller dessa begränsning platser undantas vid val av storlek. Cross-arter jämförelser utmanar också, om inte samma begränsning platser finns i de samma loci bland olika arter.
En strategi för att övervinna begränsningarna av RRBS är att använda en anrikning metod som utnyttjar publicerade genomiska sekvensen i utformningen av plattformen. Arraybaserade mänskliga plattformen använder primer sonder utformad mot specifika CpGs för allel-specifika (CG vs. TG efter bisulfite konvertering) målet glödgning och primer filändelsen. Dess design speglar inte bara den tillgängliga mänskliga genomiska sekvensen, men experimentellt verifierade regulatoriska regioner förvärvats från flera rader för bevisupptagning, såsom koda och HÄCKNING8. Trots dess omfattande användning i mänskliga methylomic utredningar finns inte en liknande plattform för modell djur. Dessutom förlägger formatet array-baserade betydande konkurrenstryck på yta som är tillgänglig för sonden placering. I flera år, har man gjort ansträngningar för att kombinera mål-specificitet ges av capture sonden designen och funktionen hög genomströmning av nästa generations sekvensering. En sådan strävan har resulterat i sekvensering-baserade anrikning målsystemet för mus genomet (mus metyl-Seq), som användes för att identifiera hjärnan-specifika eller glukokortikoidinducerad skillnader i metylering9,10. Liknande plattformar för andra modell och icke-modell djur behövs för att underlätta epigenetisk forskning hos dessa djur.
Här visar vi genomförandet av denna nya plattform för att genomföra methylomic analys på råtta. Råttan har fungerat som en viktig djurmodell i farmakologi, metabolism, neuroendokrinologi och beteende. Exempelvis finns det ett ökande behov av att förstå de underliggande mekanismer som ger upphov till drug toxicitet, fetma, stress svar eller narkotikamissbruk. En hög genomströmning plattform kan fånga methylomic förändringar i samband med dessa villkor skulle öka vår förståelse av mekanismerna. Eftersom råtta genomet saknar fortfarande anteckning för regulatoriska regioner, vi införlivas icke-redundant initiativtagare, CpG öar, ön shores11och tidigare identifierat GC-rika sekvenser i råtta metyl-Seq plattform12.
För att bedöma framgångsrik design och implementering av SureSelect mål anrikning (allmänt kallad metyl-Seq) plattformen för råtta genomet, anställt vi en råtta modell av kronisk variabeln stress (CVS)13 att identifiera differentially metylerade regioner mellan obetonade och stressade djur. Vår plattform design, protokoll och genomförandet kan vara användbart för utredare som kanske vill göra en omfattande och förutsättningslös epigenetiska utredning på en organism vars genomiska sekvensen finns redan men är fortfarande dåligt kommenterade.
Protocol
Alla experiment slutfördes i enlighet och efterlevnaden av alla relevanta rättsliga och institutionella riktlinjer, inklusive de institutionella djur vård och användning kommittén vid Johns Hopkins School of Medicine.
1. djur
- Få manliga unga Sprague-Dawley-råttor vid 4 veckors ålder. Hus djur i polykarbonat råtta burar i en temperatur- och luftfuktighet-kontrollerade rum på en 12 h ljus, 12 h mörka cykel med ljus debut på 0600 h. ge djuren med ad libitum tillgång till vatten.
- Tillåta råttor att acklimatisera för 1 vecka att minska stress i samband med transport. Par-house djuren (N = 16) utesluter isolering stress, och vid 5 veckors ålder, börja variabeln kronisk stress (CVS) regim i 3 veckor.
2. kronisk variabeln Stress
- Administrera den CVS regimen en gång på morgonen (9-11 AM) och en gång på eftermiddagen (1 – 3 PM) på oregelbundna tider att hålla rutinen oförutsägbara. Införliva nattens milda stressfaktorer. The CVS regim inkluderar: (1) 3 h i återhållsamhet cylinder; (2) 10 min simtur; (3) 3 h bur luta 4) 1 h långsam skakar plattform; och 5) 1 h i 4 ° C kyla rummet.
Obs: Övernattning stressfaktorer inkluderar sociala trängsel (5 per bur), social isolering, blöta sängkläder, mat begränsning och lampor-on. En typisk veckoschema av stress-regimen finns i tabell 1.
3. endokrina analyser
-
Bestämma nivåer av kortikosteron (CORT) med hjälp av svansen blod (~ 50 mL) provtagningar samlas in samtidigt (9 AM) två gånger per vecka under hela försöket, före CVS regim för att upprätta baslinjen hormonnivåer (dag 0), en gång under mitten av vecka CVS (dagar 4,11 och 18), efter varje 7 dagar för CVS (dagar 7 och 14), och vid ingående av CVS (dag 21). Samla in blodprover innan den dagliga stress regimen.
- Samla en sista stammen blodprov under dödshjälp (dag 25) för RIA och genomisk DNA-extraktion.
- Centrifugera alla blodprov (600 x g, 4 ° C, 10 min) för att separera plasma från blodkropparna. Pipettera ut plasma (supernatanten) och lagra proverna vid-80 ° C.
- Tina och använda plasma för att bestämma CORT nivåer genom radioimmunoassay (RIA). Se till att 3 veckors CORT plasmanivåerna är förhöjda i stressade djur att verifiera robustheten av stress-regimen.
4. beteende
- Efter den CVS-regimen (dagar 23 – 24), bedöma varje djur för ångest-liknande beteende på högstämt plus labyrint (EPM)14.
- Med en videokamera, post djuren på EPM apparaten för 300 s och Poäng tid som tillbringas i centrum, stängd armar och öppna armar.
5. utformningen av den råtta metyl-Seq
- I webbläsaren UCSC genomet, få icke-redundant genomisk koordinater (råtta Nov 2004 rn4 församling) för CpG öar och ön stränder (± 1 kb flankerande CpG öar), främjare (± 1 kb varje TSS) av varje RefSeq-gen, och andra sekvenser som kan fås från relevant litteratur.
Obs: För råtta metyl-Seq, ytterligare GC-rika sekvenser från en tidigare arraybaserade metylering plattform lades12. För regioner som är större än 5 kbps, var alternerande regioner av 500 bps urvalet följt av 1 kbps som hoppades över. Slutliga råtta metyl-Seq konstruktionen består av 111 Mbps, 2,3 miljoner CpGs; och en genomsnittlig regionen storlek 594 bps. Det riktar 228,800 unika loci. - Träda en lista med genomiska koordinater i en kommersiellt tillgänglig target capture design mjukvara för lämpliga sonden design.
6. konstruktion av råtta metyl-Seq biblioteket från genomiskt DNA
Obs: För att eliminera batch effekter, bearbeta flera prover samtidigt och skala upp master mixar med detta. Extrahera DNA använder en kommersiellt tillgänglig DNA extraktion kit. Kolumn - eller nederbörd-baserade metoder både ge högkvalitativa genomiskt DNA (260/280 förhållandet ~ 1,8). Användningen av fenol-baserade metoder rekommenderas inte. Eluera eller Återsuspendera DNA i låga TE buffert (10 mM TE, 0,1 mM EDTA, pH 8,0).
- Provberedning
För varje steg med hjälp av DNA-bindande magnetiska pärlor, kontrollera pärlorna är acklimatiserad till rumstemperatur i minst 30 min och väl blandas före användning.- Skjuvning DNA
- Använd en fluorometer för att fastställa ursprungliga dubbelsträngat DNA koncentrationen av varje prov. Späd > 1 µg av gDNA till 50 µL med låg TE buffert (10 mM TE, 0,1 mM EDTA, pH 8,0) i låg DNA-bindande mikrocentrifugrör.
- Skeva exempel med en isotermiska någon sonikator (10% intermittens, 5 intensitet, 200 cykler per Burst, 6 cykler av 60 s, frekvens sotning, 4 ° C).
- Bedöma kvaliteten på DNA använder en elektrofores-baserat system som mäter DNA storlek och kvantitet.
Obs: Den DNA-dos som rekommenderas är 1 µg eller 3 µg. Om det finns begränsade utgångsmaterial, det lägsta ingående beloppet bör vara > 500 ng, som lägre belopp kommer att negativt påverka kvantitet och kvalitet av de bibliotek som genereras.
- Reparera DNA slutar.
- Använda råtta metyl-Seq kit för att förbereda slutet-reparation Master Mix på is. Tillsätt 52 µL mix i varje prov och inkubera i en termocykel utan uppvärmd lock (20 ° C i 30 min, 4 ° C håll).
Slutet-reparation Master Mix (per prov):
35,2 µL av vatten
10 µL slutet reparation buffert (10 x)
1.6 µL av dNTP Mix
1 µL T4 DNA-polymeras
2 µL Klenow DNA-polymeras
2.2 µL av T4 Polynucleotide Kinase - Rena exempel med 180 µL av DNA-bindande magnetiska pärlor och 400 µL av nylagade 70% etanol per prov. Tillsätt 180 µL pärlor i varje prov och inkubera i 5 min i rumstemperatur. Pellet pärlor, avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 200 µL av 70% etanol. Ta bort etanol och upprepa tvätta en gång.
- Använda en magnetisk platta och pellet pärlor som du kan ta bort så mycket etanol som möjligt. Torrt i en 37 ° C heatblock för 3 – 5 min tills pärla pelleten är helt torr. Återsuspendera i 44 µL nuclease-gratis vatten och samla ca 42 µL av supernatanten.
Rastplats: Efter reparera DNA avslutas, prover kan förseglas och förvaras vid-20 ° C.
- Använda råtta metyl-Seq kit för att förbereda slutet-reparation Master Mix på is. Tillsätt 52 µL mix i varje prov och inkubera i en termocykel utan uppvärmd lock (20 ° C i 30 min, 4 ° C håll).
- Hypofysadenylatecyclase 3na ' slutar.
- Förbereda adenylering Master Mix på is. Lägga till 9 µL mix i varje prov och inkubera i en termocykel utan uppvärmd lock (37 ° C i 30 min, 4 ° C håll).
Adenylering Master Mix (per prov):
5 µL Klenow buffert
1 µL av dATP
3 µL av Klenow DNA-polymeras - Rena exempel med 90 µL av DNA-bindande magnetiska pärlor och 400 µL av nylagade 70% etanol per prov. Lägga till 90 µL av pärlor i varje prov och inkubera i 5 min i rumstemperatur. Pellet pärlor, avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 200 µL av 70% etanol. Ta bort etanol och upprepa tvätta en gång.
- Använda en magnetisk platta och pellet pärlor som du kan ta bort så mycket etanol som möjligt. Torrt i en 37 ° C heatblock för 3 – 5 min tills pärla pelleten är helt torr. Återsuspendera i 35 µL nuclease-gratis vatten och samla ca 33,5 µL av supernatanten.
- Förbereda adenylering Master Mix på is. Lägga till 9 µL mix i varje prov och inkubera i en termocykel utan uppvärmd lock (37 ° C i 30 min, 4 ° C håll).
- Ligera metylerade adaptern.
- Förbereda Ligation Master Mix på is och tillsätt 16,5 µL mix i varje prov. Inkubera i en termocykel utan uppvärmd lock (20 ° C i 15 min, 4 ° C håll).
Ligatur Master Mix (per prov):
2,5 µL av vatten
2,5 µL av metyl-Seq metylerat Adapter
10 µL av T4 DNA-Ligase buffert (5 x)
1,5 µL av T4 DNA-Ligase - Rena exempel med 90 µL av DNA-bindande magnetiska pärlor och 400 µL av nylagade 70% etanol per prov. Lägga till 90 µL av pärlor i varje prov och inkubera i 5 min i rumstemperatur. Pellet pärlor, avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 200 µL av 70% etanol. Ta bort etanol och upprepa tvätta en gång.
- Använda en magnetisk platta och pellet pärlor som du kan ta bort så mycket etanol som möjligt. Torrt i en 37 ° C heatblock för 3 – 5 min tills pärla pelleten är helt torr. Återsuspendera i 22 µL nuclease-gratis vatten och samla ca 22 µL av supernatanten. Bedöma kvalitet med hjälp av en bioanalyzer.
Obs: Om den totala mängden DNA är mindre än 500 ng, skjuvning och processen ytterligare DNA innan du fortsätter med de efterföljande stegen. Om den genomsnittliga DNA-storleken inte ökar med mer än 30 bps, kontrollera att reagenserna är nya, som T4 DNA-polymeras, Klenow eller T4 ligase kan vara gammal.
Rastplats: Efter ligating metylerade adapter, prover kan förseglas och förvaras vid-20 ° C.
- Förbereda Ligation Master Mix på is och tillsätt 16,5 µL mix i varje prov. Inkubera i en termocykel utan uppvärmd lock (20 ° C i 15 min, 4 ° C håll).
- Skjuvning DNA
- Hybridisering
- Överföra prover till låg DNA-bindande mikrocentrifugrör och använda en uppvärmd vakuum koncentrator för att reducera provvolymen till mindre än 3,4 µL. Rekonstituera prover till 3,4 µL.
Obs: Koncentrat av proven till ca ~ 3 µL att säkerställa prover tas bort från vakuum koncentrator innan all vätska avdunstar. - Förbereda hybridisering buffert vid rumstemperatur och metyl-Seq Block Mix på is. Lägga till 5,6 µL av metyl-Seq Block Mix i varje prov och inkubera i termocykel (95 ° C i 5 min, 65 ° C i 2 min, 65 ° C håll).
Hybridisering buffert (per prov):
6.63 µL av metyl-Seq Hyb 1
0,27 µL av metyl-Seq Hyb 2
2.65 µL av metyl-Seq Hyb 3
3,45 µL av metyl-Seq Hyb 4
Metyl-Seq Block Mix (per prov):
2,5 µL av metyl-Seq indexering Block 1
2,5 µL av metyl-Seq Block 2
0.6 µL av metyl-Seq Block 3 - Förbereda RNase Block Mix och fånga bibliotek hybridisering blandning. Tillsätt 20 µL av fånga bibliotek hybridisering Mix i varje prov och inkubera vid 65 ° C i minst 16 h.
RNase Block Mix (per prov):
0,5 µL av RNase Block
1,5 µL av vatten
Fånga bibliotek hybridisering Mix (per prov):
13 µL av hybridisering buffert
2 µL av RNase blockera Mix
5 µL råtta metyl-Seq fånga bibliotek
Obs: hålla reaktioner vid 65 ° C när du lägger till hybridisering Mix för att förhindra icke-specifik bindning. - Alikvotens 50 µL av streptividin magnetiska pärlor per prov i en ny 8-väl strip-tub. Tvätta pärlor med 200 µL av metyl-Seq bindande buffert. Använda magnetbordet och pellet pärlor som du kan ta bort supernatanten mellan varje tvätt för sammanlagt 3 tvättar. Efter den sista tvättningen, Återsuspendera streptividin pärlor i 200 µL av metyl-Seq bindande buffert.
- Lägg till prover till 200 µL tvättade streptividin magnetiska pärlor och odla i rumstemperatur i 30 min med en roterande mixer. Under omrörning, alikvotens 200 µL metyl-Seq Wash Buffer 2 i tre exemplar brunnar i en plattan med 96 brunnar per prov och plats i en termocykel pre värmas upp till 65 ° C.
- Efter inkubation, pellet streptividin magnetiska pärlor med magnetbordet och återsuspendera pärlorna i 200 µL metyl-Seq Wash Buffer 1. Inkubera i 15 min i rumstemperatur. Använd en magnetisk platta till pellet och Kassera supernatanten.
- Tvätta pärlor 3 gånger med metyl-Seq tvätta buffert 2: återsuspendera pelleten pärla i 200 µL tvätta buffert 2 (pre värmde i steg 6.2.5.), inkubera pärlor i termocykel (65 ° C, 10 min) och pellet pärlor. Kassera supernatanten efter varje tvätt med hjälp av en magnetisk platta.
Obs: Upprätthålla hybridisering reaktioner vid 65 ° C när du lägger till Wash Buffer 2 för att förhindra icke-specifik bindning. - Tillsätt 20 µL av metyl-Seq eluering buffert i tvättad pärlorna och inkubera i rumstemperatur i 20 min. Använd en magnetisk platta till pellet pärlor och överför supernatanten till en ny strip-tub. Kassera pärlorna.
Obs: Medan ruvning, förbereda bisulfite konvertering reagens.
- Överföra prover till låg DNA-bindande mikrocentrifugrör och använda en uppvärmd vakuum koncentrator för att reducera provvolymen till mindre än 3,4 µL. Rekonstituera prover till 3,4 µL.
- Bisulfite konvertering
Obs: Utföra bisulfite omvandlingen av de eluerade ssDNA med lämpligt reagens och instruktioner från en kommersiellt tillgänglig bisulfite konverteringssats.- Lägga till 130 µL beredda bisulfite konvertering reagens i supernatanten från föregående steg. Dela var och en av de 150 µL reaktionerna lika i två brunnar. Inkubera i en termocykel (64 ° C för 2,5 h, 4 ° C håll).
Obs: 150 µL reaktionen delas lika i två separata brunnar att garantera homogen temperatur. Efter inkubation för 2,5 h, genast fortsätta till nästa steg. - Binda prover att snurra kolumner genom att lägga till 600 µL av bindande buffert och tvätta en gång med 100 µL av tvättbuffert. Centrifugera kolumner (15 000 x g, 1 min) mellan alla bisulfite konverteringssteg och kasta flödet genom.
- Desulphonate prover genom att tillsätta 200 µL Desulphonation buffert till kolumner. Odla i rumstemperatur för 15-20 min. Upprepa centrifugering och kasta flödet genom.
- Tvätta kolonnerna två gånger med 200 µL tvätta buffert. Eluera varje prov genom att lägga till 10 µL av eluering buffert kolumnen inkubation för 3 min i rumstemperatur och centrifugering (15 000 x g, 1 min). Eluering upprepa för sammanlagt 20 µL.
- Förbered PCR-reaktionen Master Mix 1 på isen. Tillsätt 82 µL mix i varje prov. Inkubera i en termocykel med följande program.
PCR-reaktionen Master Mix 1 (per prov):
30 µL av vatten
50 µL av metyl-Seq PCR Master Mix
1 µL av metyl-Seq PCR1 Primer F
1 µL av metyl-Seq PCR1 Primer R
Termocykel Program:
Etapp 1, 1 cykel: 95 ° C 2 min
Etapp 2, 8 cykler: 95 ° C 30 s, 60 ° C 30 s, 72 ° C 30 s
Etapp 3, 1 cykel: 72 ° C 7 min
Etapp 4, 1 cykel: 4 ° C Håll - Rena exempel med 180 µL av DNA-bindande magnetiska pärlor och 400 µL av nylagade 70% etanol per prov. Tillsätt 180 µL pärlor i varje prov och inkubera i 5 min i rumstemperatur. Pellet pärlor, avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 200 µL av 70% etanol. Ta bort etanol och upprepa tvätta en gång.
- Använda en magnetisk platta och pellet pärlor som du kan ta bort så mycket etanol som möjligt. Torrt i en 37 ° C heatblock för 3 – 5 min tills pärla pelleten är helt torr. Återsuspendera i 21 µL nuclease-gratis vatten och samla ca 19,5 µL av supernatanten.
- Lägga till 130 µL beredda bisulfite konvertering reagens i supernatanten från föregående steg. Dela var och en av de 150 µL reaktionerna lika i två brunnar. Inkubera i en termocykel (64 ° C för 2,5 h, 4 ° C håll).
- Indexering av
- Förbered PCR-reaktionen Master Mix 2 på is. Tillsätt 25,5 µL Master Mix 2 till varje prov. Tillsätt 5 µL kommersiella indexering grundfärger till enskilda prover och inkubera i en termocykel.
PCR-reaktionen Master Mix 2 (per prov):
25 µL metyl-Seq PCR Master Mix
0,5 µL metyl-Seq gemensamma indexering Primer
Termocykel Program:
Etapp 1, 1 cykel: 95 ° C 2 min
Etapp 2, 6 cykler: 95 ° C 30 s, 60 ° C 30 s, 72 ° C 30 s
Etapp 3, 1 cykel: 72 ° C 7 min
Etapp 4, 1 cykel: 4 ° C Håll
Obs: Ytterligare cykler (2-3) kan vara nödvändigt om den börja DNA-koncentrationen är under rekommenderade värden. - Rena exempel med 90 µL av DNA-bindande magnetiska pärlor och 400 µL av nylagade 70% etanol per prov. Lägga till 90 µL av pärlor i varje prov och inkubera i 5 min i rumstemperatur. Pellet pärlor, avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 200 µL av 70% etanol. Ta bort etanol och upprepa tvätta en gång.
- Använda en magnetisk platta och pellet pärlor som du kan ta bort så mycket etanol som möjligt. Torrt i en 37 ° C heatblock för 3 – 5 min tills pärla pelleten är helt torr. Återsuspendera i 24 µL nuclease-gratis vatten och samla ca 24 µL av supernatanten.
- Bedöma koncentration och bp storlek med högkänslig DNA upptäckt reagens på en bioanalyzer.
Obs: Om bioanalyzer inte kan upptäcka förekomsten av biblioteket DNA, upprepa förberedelsesteg med ytterligare DNA.
Stoppläget: efter rening, indexerade prover kan förseglas och förvaras vid-20 ° C. - Pooling prover för lämplig nästa generations sekvensering plattformen används.
- Med koncentration data från den bioanalyzer, som bestämmer DNA molariteten baserat på bibliotek storlek och kvantitet i en given volym, späd med låg TE buffert (6.1.1.1) och kombinera alla prover till en slutlig koncentration av 15 pM.
Obs: En mer känslig metod för att kvantifiera biblioteket är av kvantitativ realtids-PCR med primers som är inriktade på de ligated adaptrarna. - Kör samlingsprover på antalet körfält som är tillräckliga för 4 prover per körfält på en nästa generations sequencer.
Obs: exempelvis om 16 bibliotek prover har unikt indexeras och kombinerade, köra biblioteken över 4 körfält, motsvarande 4 prover per körfält.
- Med koncentration data från den bioanalyzer, som bestämmer DNA molariteten baserat på bibliotek storlek och kvantitet i en given volym, späd med låg TE buffert (6.1.1.1) och kombinera alla prover till en slutlig koncentration av 15 pM.
- Förbered PCR-reaktionen Master Mix 2 på is. Tillsätt 25,5 µL Master Mix 2 till varje prov. Tillsätt 5 µL kommersiella indexering grundfärger till enskilda prover och inkubera i en termocykel.
7. sekvensering på en nästa generations Sequencer
- Skicka proverna till institutionella sekvensering kärnan för klustring av metyl-Seq bibliotek, följt av sekvensering på en nästa generations sekvensering maskin.
8. analys identifiera Jespers
- Implementera Bismark15, som åberopar Bowtie 2.0 som en inre sekvens aligner16,17, om du vill justera raw input läsningar bisulfite-konverterade, plus-strand genomet. Efter justering, Använd Bismark_methylation_extractor att utföra kvalitetskontroll och genom att tilldela varje CpG en uppskattad metylering värde.
- Generera en lista med Jespers med BS-Seq paketet18 i Bioconductor. Filter till Jespers utifrån att ha större än 3 på varandra följande CpGs och P-värdet < 0,05.
Obs: Generera en DMR-lista som innehåller genomisk koordinater, avstånd till närmaste RefSeq-genen, antal CpGs inom varje DMR, genomsnitt % CpG metylering värde över DMR för två jämförelsegrupperna (t.ex. betonade vs. obetonade), P-värdet, och FDR (false discovery rate) värdet. Använd listan DMR, dvs., genomisk koordinater, att utforma pyrosekvensering primers för validering.
9. validering av Bisulfite pyrosekvensering
-
Primer Design
- Design primers för bisulfite PCR och pyrosequencing. Utforma två uppsättningar av PCR primers (utanför och kapslade) så att nästlade PCR kommer förstärka 150 – 400 bps av en DMR.
Obs: I allmänhet utformade grundfärger är minst 24 baser lång med minst 4 – 5 spridda G's (CS för reverse primer) till konto för minskat glödgning temperatur från förlust av sekvens-komplexitet. En av kapslade primers blir biotin-märkt och HPLC-renat. Dock bör standard primers beställas först att optimera PCR steget genom att lösa reaktionerna på en agarosgel.- Design av pyrosekvensering assay primer så att det riktar den kompletterande biotinylerade strand bara 1 – 2 baser uppströms CpGs att analyseras. Designa flera pyrosekvensering primers som behövs, som varje pyrosekvensering primer kan tillförlitligt test 30 bps nedströms.
- För Rt1-m4, Använd följande:
rRT1M4 utanför – F TGTAYGATTTTGGTTATYGTAAAT
rRT1M4 utanför – R AACTTACAAATTTCACCAACTCA
rRT1M4 kapslade – F GTGGGTTAYGTGGATAATATATAG
rRT1M4 kapslade – R AATCACTTACCATTCTCTCTCTAACTA
rRT1M4 Pyro1 TAYGTGGATAATATATAGAT
rRT1M4 Pyro2 GATAGTTATTTGGYGAGTTAG
rRT1M4 Pyro3 GAGTATTTGGAGGAGTTGAT
rRT1M4 Pyro4 GGATTTTAATATTTGGT
- Design primers för bisulfite PCR och pyrosequencing. Utforma två uppsättningar av PCR primers (utanför och kapslade) så att nästlade PCR kommer förstärka 150 – 400 bps av en DMR.
-
Använd en kommersiellt tillgänglig kit för bisulfite konvertering av råtta blod gDNA.
Obs: Bisulfite konverteringen stegen har anpassats från kommersiellt tillgängliga kit med följande ändringar: I steg 1, lägga till 50 – 100 ng av blod gDNA och späd med vatten till 20 µL. I steg 9, eluera 20 µL per prov.- Förbereda bisulfite konvertering reagens enligt tillverkarens protokollet och kombinera med utspädda gDNA. Inkubera i termocykel (64 ° C för 2,5 h, 4 ° C håll).
- Lägga till bindande buffert konverterade gDNA i spin kolumner och centrifugera (15 000 x g, 1 min). Tvätta kolumner en gång sedan lägga Desulphonation buffert till kolumner och inkubera i 15 min i rumstemperatur. Centrifugera (15 000 x g, 1 min).
- Tvätta kolonnen med tvätta buffert och centrifugera (15 000 x g, 1 min). Upprepa tvättningen med centrifugering (15 000 x g, 2 min). Tillsätt 20 µL eluering buffert och centrifugera (15 000 x g, 1 min) för att eluera.
-
PCR-amplifiering
- Förbereda utanför PCR Master Mix. Lägga till 21,5 µL av Master Mix 3,5 µL bisulfite-konverterade gDNA och köra termocykel program.
Utanför PCR Master Mix:
16.25 µL av vatten
2,5 µL av polymeras buffert [10 x]
0,5 µL av dNTP [10 mM]
1 µL framåt Primer [0.1 µM]
1 µL Reverse Primer [0.1 µM]
0,25 µL av Taq-DNA polymeras [5000 E/mL].
Termocykel program:
Etapp 1, 1 cykel: 94 ° C 4 min
Etapp 2, 47 cykler: 94 ° C 1 min, 53 ° C 30 s, 72 ° C 1 min
Etapp 3, 1 cykel: 72 ° C 8 min, 4 ° C Håll - Förbereda nästlade PCR Master Mix. Lägga till 23 µL av Master Mix 2 µL prov från utanför PCR och upprepa utanför PCR termocykel programmet. Bedöma PCR-produktkvalitet genom gelelektrofores (1 x TAE buffert, 1% agarosgel).
Nästlade PCR Master Mix:
17.75 µL av vatten
2,5 µL av polymeras buffert [10 x]
0,5 µL av dNTP [10 mM]
1 µL framåt Primer [0.1 µM]
1 µL Reverse Primer [0.1 µM]
0,25 µL av Taq-DNA polymeras [5000 E/mL]
Obs: För nästlade PCR, antingen framåt eller reverse primer måste vara biotinylerade.
- Förbereda utanför PCR Master Mix. Lägga till 21,5 µL av Master Mix 3,5 µL bisulfite-konverterade gDNA och köra termocykel program.
-
Pyrosekvensering
- Gör en master mix som innehåller 38 µL av bindande buffert, 35 µL av vatten och 2 µL av streptividin-belagda sepharose pärlor per prov. I en plattan med 96 brunnar, lägga till 75 µL master mix och 5 µL nästlade PCR-produkten. Skaka på en tallrik shaker för 15-60 min.
- Under omskakning, tillsätt 12 µL av primer (0,5 µM, utspädda i glödgning buffert) i brunnarna pyrosekvensering assay platta.
- Efter omskakning, utför tvätt steg med hjälp av bindande reaktion tvätta buffertar. Placera vakuum verktyg i tråg fylld med vatten och sedan samla in prover från plattan. Dränka vakuum verktyg i halv-fyllda tråg innehållande 70% etanol, NaOH (0,2 M) och Tris acetatbuffert (10 mM, pH 7,4). Koppla från vakuum och place vakuum redskap i HS assay plattan att överföra pärlor.
- Placera plattan på värme block och inkubera vid 80 ° C under 2 min. Tillåt tallrik att svalna i 5 min sedan börja pyro program.
Representative Results
Ett framgångsrikt genomförande av råtta metyl-Seq plattformen beror på flera kriterier. Figur 1 visar det totala arbetsflödet för studien och belyser särskilda kvalitetskontroll (QC) steg som behövs innan man går framåt. En av de första faktorerna att överväga är robustheten i en djurmodell och den stress regimen, som bestämmer omfattningen av epigenetiska förändringar som sker över methylome. Eftersom våra djur arbete bygger på vår tidigare observation som kortikosteron (CORT) exponering kan leda till förändringar i DNA metylering19,20, vår kronisk variabeln stress (CVS) regim behövde vara av tillräcklig noggrannhet att producera betonade råttor med förhöjda plasmanivåer CORT. En typisk vecka CVS regim är visas i tabell 1 och bestod av dagliga stressfaktorer på morgonen, eftermiddagen, och under natten som ständigt ändras för att förhindra tillvänjning och minskat stressreaktionen. Hela den 3-veckors regimen, de stressade djur uppvisade signifikant förhöjda nivåer av genomsnittlig plasma CORT [dagar 4 – 21, kontrollerar: 32,7 3,7 ng/mL, Stress: 103,0 11,9 ng/mL (medelvärde SEM), P = 2,2 x 10-4, figur 2A] än obetonade, djuren i kontrollgruppen. Konsekvent, dessa djur visade också större ångest-liknande beteende på högstämt plus labyrint (EPM), som indikeras av den betydligt mer tid i stängda armarna för EPM och mindre tid i de öppna armarna (figur 2B). Dessa resultat visar att CVS exponering lett till betydande endokrina och beteendemässiga förändringar, som leder oss att undersöka huruvida dessa förändringar var associerade med specifika DNA metylering signaturer.
Vi betonar flera kontrollpunkter som är avgörande för framgångsrika byggandet av metyl-Seq biblioteket. Börjar med en tillräcklig mängd DNA är nödvändigt, som ultraljudsbehandling, flera tvätt/rening, target anrikning och bisulfite konverteringssteg minskar successivt mängden DNA i det färdiga biblioteket. Även om flera PCR-amplifiering steg lindra förlusten av DNA-mall, kan Överdriven PCR cykel nummer införa högre dubblerade läsningar. För den aktuella råtta metyl-Seq studien användes 2 g av blod gDNA per råtta. Vi noterar att metyl-Seq bibliotek kan göras med utgångsbeloppet i DNA till en så lågt som 500 ng. Mindre utgångsmaterial tillåter användare att generera bibliotek från DNA isolerat av FACS (fluorescens-aktiverad cell sortering) eller nål slag, även om det finns ökad risk för att producera en otillräcklig mängd bibliotek för efterföljande sekvensering. QC utförs genom elektrofores av 1 L av provet på en bioanalyzer, som ger DNA molekylvikt, kvantitet och molariteten. Tre kritiska steg som kräver användning av bioanalyzer är: 1) efter ultraljudsbehandling steg för att säkerställa tillräcklig klippning av DNA (~ 170 bp, röd, figur 3); (2) följande adapter ligering steg indikeras av en förskjutning i den genomsnittliga storleken på klippt DNA (~ 200 bp, blå, figur 3) att säkerställa deras efterföljande förstärkning vid PCR. och 3) efter sista bibliotek reningssteg för att säkerställa kvantitet och storlek på biblioteket för sekvensering.
R-paket BSSeq och BSmooth i Bioconductor användes för att analysera den bisulfite sekvensering data18. De inkluderar verktyg och metoder för att rikta den sekvens läser, utför kvalitetskontroll, och identifiera differentially metylerat regioner (Jespers). BSmooth programvara åberopar Bowtie 2.016,17 som en inre sekvens aligner för CpG-nivå mätning sammanfattningar, justering av raw input läser till bisulfite-konverterade genomsekvenser. Den justerade läser filtreras sedan genom rigorösa kvalitetskontroll som syftar till att identifiera systematisk sekvensering och base-ringer fel som kan förvränga nedströms analyser. En rad tomter skapas för att visuellt stöd i denna process av filtrering. Sekvensering statistik genereras också till dokument relevant information såsom antal justerad läsningar, %-målet, och per CpG täckning, bland annat (tabell 2). När data filtreras, en algoritm för utjämning/normalisering utförs, där varje CpG tilldelas en uppskattad metylering värde baserat på alla QC läser från varje prov och uppskattningar från närliggande CpGs för att säkerställa mer korrekt kallelse metylering status även i fall där sekvensen täckningen är låg. Detta värde ger en utjämnad uppskattning av sannolikheten för metylering på varje CpG plats. Genom att jämföra medelvärdet av de utjämnade metylering uppskattningarna av varje prov mellan de två behandlingsgrupperna och ranking genomisk regionerna från de mest markant olika till minst, genereras en lista över Jespers (tabell 3).
Topp DMR mellan betonade och obetonade grupper var belägen i arrangören av råtta större histocompatibility genen Rt1-m4, med betonade djur uppvisar högre metylering nivåer över alla CpGs än obetonade djur (figur 4A). För att bekräfta framgångsrikt genomförande av metyl-Seq plattformen och dataanalys, utformades primers mot DMR och blodet DNA metylering i hela kohorten av betonade och obetonade djur (8 sekvenserade av metyl-Seq och 8 inte sekvenserade) bedömdes av bisulfite pyrosequencing. Resultaten visar betydande ökning av DNA metylering över 10 av de 12 CpGs analyseras (5.1 – 10,4 förändring i % metylering, P < 0,037, figur 4B). KEGG väg analys utfördes på alla de nominellt betydande Jespers att identifiera vägar i samband med stress. Konsekvent, inblandad DMR-associerade vägar sjukdomar associerade med kronisk stress exponering, såsom diabetes, hjärt-kärlsjukdomar och cancer (tabell 4). 21 , 22 , 23 för att visa en association mellan epigenetiska data och graden av exponering på stress, metylering nivåer CpG-10 var jämfört med medelvärdet 3-veckors CORT nivåerna för varje djur. Resultaten visade en blygsam korrelation mellan endokrina och metylering (R2= 0,54, P = 0,001, figur 5).
Figur 1: övergripande Schematisk arbetsflöde för råtta metyl-Seq plattformen. Ett g av genomisk DNA utvinns ur blod betonade och kontroll råttor behandlas först för att konstruera de metyl-Seq-biblioteken för sekvensering, analys och target identifiering. Ytterligare 100 ng DNA används för oberoende verifiering av de fastställda epigenetiska mål av bisulfite pyrosequencing. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: exponering för kronisk variabeln stress (CVS) leder till endokrina och beteendemässiga förändringar i råttor. (A) flera provtagningar av kortikosteron (CORT) demonstrera robustheten i 3 veckan CVS regim. Blodprov samlades på morgonen innan den dagliga stress regimen. (B) stressad djur tillbringat mer tid i stängda armarna och mindre tid i högstämt öppna armar plus labyrint (EPM). Boxplots med datapunkt för varje djur visas. Students T-test utfördes för statistisk signifikans. * P < 0,05, ** P < 0,01, och *** P < 0,001. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: kvantitering av klippt och adapter-sammanskrivna råtta DNA på en bioanalyzer. De röda och blå kurvorna visar antalet och storleken av genomisk DNA (röd) efter klippning i en isotermiska någon sonikator och adapter ligatur, respektive. Varje rad representerar ett prov och röda och blå kurvor återspeglar både förlust av DNA under de flera steg (slutet-reparation, 3'-adenylering och prov cleanup) och ökning av bp storlek på grund av ligering av adaptrarna. Skarpa toppar 25 bp och 1500 bp är standard markörer som har lagts till lastning bufferten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: CVS-inducerad epigenetiska förändringar upptäcks av råtta metyl-följande punkter (A) analys av råtta metyl-Seq data inblandad arrangören av genen Rt1m4 som en differentially metylerade region (DMR) mellan stressad (röd) och kontroll (blå) råttor. Grafiska utdata för den Rt1m4 DMR (rosa skuggade regionen) visar varje CpG (vertikal grå linje), de fyra proverna i varje grupp (röda eller blå linjer) och de % metylering nivåerna för varje djur (röd eller blå punkt). (B) tolv CpGs inom DMR validerades av bisulfite pyrosequencing. I stapeldiagram är representerade som betyder SEM, och students T-test utfördes för statistisk signifikans. * P < 0,05. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: linjär regressionsanalys visade en blygsam korrelation mellan % DNA metylering CpG-10 av Rt1m4 och 3 veckan menar plasma CORT nivåer av både stressad och kontrolldjuren (N = 16). Data från stressade djur representeras av röda cirklar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Vecka | Dag 1 | Dag 2 | Dag 3 | Dag 4 | Dag 5 | Dag 6 | Dag 7 |
| AM | Återhållsamhet | Simma | Kallt rum | Simma | Återhållsamhet | Shaker | Simma |
| PM | Shaker | Cage Tilt | Återhållsamhet | Shaker | Kallt rum | Återhållsamhet | Kallt rum |
| Övernattning | Mat begränsa | Blöta sängkläder | Isolering | Ljus på | Trängs | Ljus på | Blöta sängkläder |
Tabell 1: En typisk veckoschema av kronisk variabeln stress-regimen (CVS).
| Sekvensering mätvärden | Stress1 | Kontroll1 |
| (n = 4) | (n = 4) | |
| Parat slutet läsningar (PER) | 89,290,397 | 80,165,674 |
| Unikt mappade Parade slutet läser (Jumper) | 39,200,255 | 35,013,406 |
| Anpassningen klassar/kartläggning effektivitet (Jumper / PER) | 44% | 44% |
| Duplicera läser (% av Jumper) | 73% | 65% |
| Deduplicerade Jumper | 10,481,031 | 12,306,018 |
| Genomsnittlig Läs djup täckning (x) (ARDC) | 6 x | 6 x |
| CpGs (N) | 12,056,878 | 12,056,878 |
| ARDC (x) av CpGs | 2 x | 2 x |
| CpGs med minst 10 läser (N) | 481,383 | 595,850 |
| ARDC (X) av CpGs med minst 10 läser | 19 | 19 |
| På Target CpGs (komplett överlappningen med Probe målregionerna) | 1,923,872 | 2,007,638 |
| På målet ARDC (x) av CpGs | 7 x | 8 x |
| På Target CpGs med minst 10 läser (N) | 428,249 | 531,419 |
| På Target ARDC (x) av CpGs med minst 10 läser | 18 x | 18 x |
| På målet (PER med 1 eller flera baspar överlappning med Probe målregionerna) (Jumper) | 8,277,715 | 9,369,523 |
| % På målet (av deduplicerade Jumper) | 78% | 77% |
| På målet (totala baser mappas) Mb | 125 mb | 128 mb |
| På Target genomsnittliga Läs djup täckning (x) (ARDC) | 9 x | 10 x |
| 1 Sekvensering mätvärden baserat på medelvärden över ämnen i varje grupp |
Tabell 2: Sekvensering mätvärden erhålls från råtta metyl-Seq plattformen.
| Chr | Starta | slutet | gen | avstånd | areaStat | meanDiff | stress | kontroll | riktning |
| chr20 | 1,644,246 | 1,644,390 | RT1-M4 | in_gene | 93.03 | 0,22 | 0,33 | 0,11 | vinst |
| chr5 | 160,361,352 | 160,361,564 | LOC690911 | in_gene | -70.75 | -0,19 | 0,72 | 0,91 | förlust |
| chr3 | 61,138,281 | 61,138,330 | RGD1564319 | 265569 | 61.79 | 0,21 | 0,94 | 0,72 | vinst |
| ChR2 | 143,064,811 | 143,065,010 | Ufm1 | 8569 | -59.48 | -0,11 | 0,13 | 0,24 | förlust |
| chr7 | 30,764,111 | 30,764,284 | Ntn4 | in_gene | 57.04 | 0,21 | 0,94 | 0,73 | vinst |
| chr17 | 12,469,112 | 12,469,218 | Idnk | 41996 | -50.91 | -0,13 | 0,74 | 0,88 | förlust |
| chr7 | 47,101,725 | 47,101,930 | Pawr | in_gene | -50.54 | -0,12 | 0,64 | 0,76 | förlust |
| chr5 | 76,111,248 | 76,111,822 | Txndc8 | 151703 | -50.38 | -0,11 | 0,85 | 0,96 | förlust |
| chr11 | 80,640,132 | 80,640,356 | Dgkg | in_gene | -50.07 | -0,16 | 0,73 | 0,89 | förlust |
| chr8 | 71,759,248 | 71,759,411 | Mir190 | 210226 | -47.84 | -0,17 | 0,58 | 0,75 | förlust |
Tabell 3: topp 10 differentially metylerat regioner. För varje DMR, utdatatabellen visar från vänster till höger kolumn: kromosomala läge (chr), koordinater (start/avslutning), gen namn, avstånd från transkriptionen starta webbplats, differentiell statistik mellan betonade och kontrollerar grupper (areaStat), menar differentiell metylering (meanDiff), genomsnittlig metylering nivåer över varje DMR för stressad och kontrollgrupper (stress/kontroll) och riktningen av metylering ändra från kontroller.
| KEGG Pathway villkor | Gen Count | % | P-värde | Benjamini |
| Diabetes | ||||
| Diabetes mellitus typ II | 12 | 0,1 | 3,6 x 10-4 | 9,8 x 10-3 |
| Hjärt-kärlsjukdom | ||||
| Vaskulär glatt muskulatur kontraktion | 18 | 0,1 | 1.6 x 10-3 | 3,6 x 10-2 |
| Högerkammarfunktion höger kammare kardiomyopati (ARVC) | 13 | 0,1 | 4.0 x 10-3 | 7,1 x 10-2 |
| Dilaterad kardiomyopati | 14 | 0,1 | 7,6 x 10-3 | 1,2 x 10-1 |
| Neuron funktion | ||||
| Långsiktig potentiering | 11 | 0,1 | 1,5 x 10-2 | 1,4 x 10-1 |
| Signalering | ||||
| MAPK signalväg | 35 | 0,2 | 2.4 x 10-4 | 9,9 x 10-3 |
| Kalcium signalväg | 22 | 0,1 | 1,2 x 10-2 | 1,4 x 10-1 |
| Chemokine signalväg | 21 | 0,1 | 1,2 x 10-2 | 1.3 x 10-1 |
| Cancer | ||||
| Vägar i cancer | 42 | 0,3 | 4.1 x 10-5 | 3.4 x 10-3 |
| Gliom | 15 | 0,1 | 4.4 x 10-5 | 2.4 x 10-3 |
| Icke-småcellig lungcancer | 10 | 0,1 | 7,9 x 10-3 | 1.1 x 10-1 |
| Kolorektal cancer | 13 | 0,1 | 8,4 x 10-3 | 1.1 x 10-1 |
| Kronisk myeloisk leukemi | 12 | 0,1 | 1,2 x 10-2 | 1.3 x 10-1 |
Tabell 4: KEGG väg analys av Jespers identifierade från råtta metyl-följande punkter
Discussion
I denna studie vi utformas och genomförs metyl-Seq plattformen för råtta genomet. Genom att visa dess nytta med en råtta modell av stress, visat vi att rörledningen experimentella och analytiska kan ge differentially metylerade regioner mellan två jämförelsegrupper.
För att säkerställa ett framgångsrikt genomförande av plattformen, behöver flera kritiska steg observeras. Första, inledande DNA kvalitet och kvantitet har en betydande inverkan på kvaliteten och kvantiteten av det slutliga metyl-Seq-biblioteket. Vi använde en fluorometer, snarare än en spektrofotometer, för att säkerställa att vår DNA mätning återspeglas kvantiteten av dubbelsträngat DNA närvarande. Bioanalyzer användes för att mäta molekylär storlek och mängden DNA efter klippning och efter adapter ligering. Verifiera den molekylära storleken ”shift” mellan stegen är avgörande för att bekräfta förekomsten av adaptrar i ändarna av varje DNA-fragment som kommer att genomgå adapter-medierad PCR i efterföljande steg. Mängden DNA kvar i slutet av steget adapter ligatur är också viktigt, eftersom minst 100 ng av produktens bibliotek behövs i detta steg att säkerställa tillräcklig mängd finns efter målet anrikning och bisulfite konverteringen stegen. En sista högkänslig mätning utfördes på Byggyta metyl-Seq biblioteket så att biblioteket kan spädas ordentligt för efterföljande klustring på nästa generations sequencer. Slutligen var bisulfite pyrosekvensering anställd som en mycket-kvantitativa, oberoende metod att bedöma riktigheten av rörledningen analytisk. Den slutliga validering med den ursprungliga prover och replikering med ytterligare djur är avgörande steg för att säkerställa att experimentet kan detektera biologiskt signifikanta förändringar i DNA-metylering.
Vi har även flera riktlinjer vid avvikelse från protokollet eller om problem påträffas. Först, är det möjligt att förlora alltför mycket DNA under slutet-reparation, adapter ligatur eller magnetiska pärla reningssteg. Alternativt starta mängder DNA kan vara liten (< 200 ng) på grund av begränsad vävnad/DNA tillgänglighet eller genomförandet av olika anrikningsmetoder såsom fluorescens aktiverad cell sortering. Ökande antalet cykel under två bibliotek förstärkning stegen kanske kunna kompensera för överdriven förlusten av DNA eller låg DNA utgångsbeloppet i hela biblioteket konstruktion protokollet. Dock rekommenderas inte mer än ytterligare 2 – 3 cykler, eftersom överdriven mall förstärkning är sannolikt att leda till en ökning av antalet duplicerade läsningar är sekvenserade. Dessa dubbletter är undantagna under justering steg att förhindra partiskhet i procent metylering beräkningar. För det andra, om den genomsnittliga DNA-storleken inte ökar med mer än 30 bps, kontrollera att reagenserna är nya, som T4 DNA-polymeras, Klenow eller T4 ligase kan vara gammal. Kommersiellt tillgängliga byte reagenser kan användas.
Dessutom är det möjligt att de förutspådda Jespers inte kan validera genom pyrosequencing, där DNA metylering skillnader existerar inte eller är betydligt mindre än de förutspådde genom analys. Stackars validering av kandidat regioner är ett problem som är alltför vanligt för många genome-wide analyser, till exempel när pyrosekvensering resultat bekräftar inte differentiell metylering eller effekt storlek är mycket mindre än vad som förutspåddes av analysen. BSmooth är ett analyspaket som ”slätar ut” metylering nivåer över ett fönster av flera CpGs. För aktuella experimentet inblandad BSmooth en DMR vars metylering nivåer validerades av bisulfite pyrosequencing. Dock kommer det sannolikt att avvikelser mellan metylering nivåer förutsägs av BSmooth och de kontrolleras av pyrosekvensering. Skillnaderna uppstår från den utjämnande funktion som uppskattar de genomsnittliga metylering värdena över alla CpGs inom en DMR, inklusive konsekutiva CpGs som kan skilja sig i DNA-metylering av mer än 50% eller CpGs vars metylering värden exkluderades på grund sub tröskel Läs djup. R-paket såsom MethylKit24 kan användas för att identifiera mindre fönster CpGs eller ens enda CpGs vars metylering nivåer korrelerar starkt med de validerade genom pyrosequencing. Genomföra olika paket och testa deras förväntade regioner eller CpGs av differentiell metylering av pyrosekvensering kommer att säkerställa robustheten hos data. Alternativt, ursprungliga metyl-Seq bibliotek kan vara resequenced och tillsätts Läs filerna att öka Läs djup. Eftersom fastställandet av metylering nivåer är semikvantitativt och dikterade av antalet läsningar [(# of CpGs) / (# av TpGs + CpGs)], öka Läs djupet för en given CpG kommer att öka noggrannheten i dess procent metylering värde. I denna studie ansåg vi endast CpGs vars metylering värden bestämdes av minst tio läsningar och uppnådde en övergripande Läs täckning av 19 x för varje CpG.
Rat metyl-Seq plattformen är inte utan sina begränsningar. Det är mer kostnadseffektivt än helgenom-bisulfite sekvensering, är det betydligt dyrare än andra metoder. Ändå var merparten av kostnaden för att köpa körfält på sequencer och inte för capture-systemet. Beroende på Läs djupet behövs med cross-vävnad jämförelser som kräver mindre på grund av stora (25-70%) skillnader12 i DNA-metylering, kan kostnaderna minskas genom multiplexing fler prover per körfält och använda en högre kapacitet plattform. Provberedningen är också mer tidskrävande än andra metoder. Samtidigt som liknar andra pulldown tillvägagångssätt som innehåller nästa generations sekvensering, lägga extra bisulfite konvertering och rening stegen till arbetsbördan. Övergripande, metyl-Seq plattformen är ett kostnadseffektivt alternativ till helgenom-sekvensering och ger baspar upplösning på mer än 2,3 miljoner CpGs, vilket är betydligt mer än de analyseras av microarray-baserade plattformar. Hittills, de kommersiellt tillgängliga mänskliga och mus har metyl-Seq plattformar använts för att dokumentera alkohol-anhörig ändringar i den makak hjärna25,26, utvecklingsrelaterade gener i mus hjärnan9och blod-hjärn mål av glukokortikoider10. Vidare är gör förmågan att rikta specifika regioner oberoende sekvens erkännande av restriktionsenzym det en idealisk plattform för cross-arter jämförelser. För denna studie utformat vi metyl-Seq plattformen för råtta, som många farmakologiska, metaboliska och beteendemässiga experiment utförs utan förmånen av en genome-wide methylomic verktyg. Våra data visar att det kan användas för att upptäcka Jespers i en råtta modell av stress och andra fysiologiska parametrar såsom totala plasmanivåerna CORT.
Metyl-Seq plattformen är idealisk för epigenetiska experiment på djur med sekvenserat genomet som inte kanske har tillräckligt experimentella bevis som dokumenterar regulatoriska regioner. När sådana regioner görs tillgänglig, kan ytterligare regioner vara skräddarsydda och kopplade till den aktuella versionen. Plattformen är dessutom idealisk för komparativ genomik, eftersom målet berikning inte begränsas av restriktionsenzym erkännande. Exempelvis kan Arrangören regionen någon gen av intresse fångas oavsett om det hamnar en specifik begränsning webbplats. På samma sätt kan eventuella regulatoriska regioner, såsom de som identifierats i musen eller människor, som är bevarad i genomet av intresse fångas.
Disclosures
Manuskriptet är en del av en tävling utlottning från Agilent Technologies.
Acknowledgments
Denna studie har finansierats av NIH grant MH101392 (RSL) och stöd från följande utmärkelser och stiftelser: en publicerade Young Investigator Award, Margaret Ann pris utredare fonden, James Wah humör störningar Scholar fonden via the Charles T. Bauer Foundation, Baker Stiftelsen och stiftelsen Project Match (RSL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Radioimmuno assay (RIA) | MP Biomedicals | 7120126 | Corticosterone, 125I labeled |
| Master Pure DNA Purification Kit | Epicentre/Illumina | MC85200 | |
| Thermal-LOK 2-Position Dry Heat Bath | USA Scientific | 2510-1102 | Used with 1.5 mL tubes |
| Vortex Genie 2 | Fisher | 12-812 | Vortex Mixer |
| Ethyl alcohol, Pure | Sigma-Aldrich | E7023 | 100% Ethanol, molecular grade |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | - | Must be capable of 20,000 x g |
| Qubit 2.0 | ThermoFisher Scientific | Q32866 | Fluorometer |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | ThermoFisher Scientific | Q32851 | High sensitivity DNA detection reagents |
| Qubit Assay Tubes | ThermoFisher Scientific | Q32856 | |
| SureSelectXT Rat Methyl-Seq Reagent Kit | Agilent Technologies | G9651A | Reagents for preparing the Methyl-Seq library |
| SureSelect Rat Methyl-Seq Capture Library | Agilent Technologies | 931143 | RNA baits for enrichment of rat targets |
| IDTE, pH 8.0 | IDT DNA | 11-05-01-09 | 10 mM TE, 0.1 mM EDTA |
| DNA LoBind Tube 1.5 mL | Eppendorf | 22431021 | |
| Covaris E-series or S-series | Covaris | - | Isothermal sonicator |
| microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm (25) | Covaris | 520045 | |
| Water, Ultra Pure (Molecular Biology Grade) | Quality Biological | 351-029-721 | |
| Veriti 96 Well-Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4375786 | |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63880 | DNA-Binding magnetic beads |
| 96S Super Magnet | ALPAQUA | A001322 | Magnetic plate for purification steps |
| 2200 TapeStation | Agilent Technologies | G2965AA | Electrophresis-based bioanalyzer |
| D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5582 | |
| D1000 ScreenTape High Sensitivity | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
| D1000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5583 | |
| D1000 Reagents High Sensitivity | Agilent Technologies | 5067-5585 | |
| DNA110 SpeedVac | ThermoFisher Scientific | - | Vacuum Concentrator |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 magnetic beads | Invitrogen | 65601 | Streptavidin magnetic beads |
| Labquake Tube Rotator | ThermoFisher Scientific | 415110Q | Nutator Mixer is also acceptable |
| EZ DNA Methylation-Gold Kit | Zymo Research | D5006 | Bisulfite conversion kit. Contains Binding, Wash, Desulphonation, and Elution buffers |
| Illumina Hi-Seq 2500 | Illumina | - | Next-generation sequencing machine |
| PCR and Pyrosequencing Primers | IDT DNA | Variable | |
| Taq DNA Polymerase with ThermoPol Buffer - 2,000 units | New England BioLabs | M0267L | |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set | New England BioLabs | N0446S | |
| Pyromark MD96 | QIAGEN | - | Pyrosequencing machine |
| Ethyl Alcohol 200 Proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | 70% Ethanol solution |
| Sodium Hydroxide Pellets | Sigma-Aldrich | 221465 | 0.2 M NaOH denature buffer solution |
| Tris (Base) from J.T. Baker | Fisher Scientific | 02-004-508 | 10 mM Tris Acetate Buffer wash buffer solution |
| PyroMark Gold Q96 Reagents (50x96) | QIAGEN | 972807 | Reagents required for pyrosequencing |
| PyroMark Annealing Buffer | QIAGEN | 979009 | |
| PyroMark Binding Buffer (200 mL) | QIAGEN | 979006 | |
| Streptavidin Sepharose High Performance Beads | GE Healthcare | 17-5113-01 | Streptavidin-coated sepharose beads |
| PyroMark Q96 HS Plate | QIAGEN | 979101 | Pyrosequencing assay plate |
| Eppendorf Thermomixer R | Fisher Scientific | 05-400-205 | Plate mixer. 96-well block sold separately (cat. No 05-400-207) |
| SureDesign Website | Agilent Technologies | - | Target capture design software (https://earray.chem.agilent.com/suredesign/) |
| UCSC Genome Browser | University of California Santa Cruz | - | rat Nov 2004 rn4 assembly |
| Agilent Methyl-Seq Protocol | Agilent Technologies | - | https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/G7530-90002.pdf |
References
- Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
- Meissner, A., et al. Genome-scale DNA methylation maps of pluripotent and differentiated cells. Nature. 454 (7205), 766-770 (2008).
- Bibikova, M., et al. High density DNA methylation array with single CpG site resolution. Genomics. 98 (4), 288-295 (2011).
- Naumov, V. A., et al. Genome-scale analysis of DNA methylation in colorectal cancer using Infinium HumanMethylation450 BeadChips. Epigenetics. 8 (9), 921-934 (2013).
- Wockner, L. F., et al. Genome-wide DNA methylation analysis of human brain tissue from schizophrenia patients. Translational Psychiatry. 4, e339 (2014).
- Meissner, A., et al. Reduced representation bisulfite sequencing for comparative high-resolution DNA methylation analysis. Nucleic Acids Research. 33 (18), 5868-5877 (2005).
- Smith, Z. D., Gu, H., Bock, C., Gnirke, A., Meissner, A. High-throughput bisulfite sequencing in mammalian genomes. Methods. 48 (3), 226-232 (2009).
- Slieker, R. C., et al. Identification and systematic annotation of tissue-specific differentially methylated regions using the Illumina 450k array. Epigenetics Chromatin. 6 (1), 26 (2013).
- Hing, B., et al. Adaptation of the targeted capture Methyl-Seq platform for the mouse genome identifies novel tissue-specific DNA methylation patterns of genes involved in neurodevelopment. Epigenetics. 10 (7), 581-596 (2015).
- Seifuddin, F., et al. Genome-wide Methyl-Seq analysis of blood-brain targets of glucocorticoid exposure. Epigenetics. 12 (8), 637-652 (2017).
- Irizarry, R. A., et al. The human colon cancer methylome shows similar hypo- and hypermethylation at conserved tissue-specific CpG island shores. Nature Genetics. 41 (2), 178-186 (2009).
- Lee, R. S., et al. Adaptation of the CHARM DNA methylation platform for the rat genome reveals novel brain region-specific differences. Epigenetics. 6 (11), 1378-1390 (2011).
- Jankord, R., et al. Stress vulnerability during adolescent development in rats. Endocrinology. 152 (2), 629-638 (2011).
- Pellow, S., Chopin, P., File, S. E., Briley, M. Validation of open:closed arm entries in an elevated plus-maze as a measure of anxiety in the rat. Journal of Neuroscience Methods. 14 (3), 149-167 (1985).
- Krueger, F., Andrews, S. R. Bismark: a flexible aligner and methylation caller for Bisulfite-Seq applications. Bioinformatics. 27 (11), 1571-1572 (2011).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 10 (3), R25 (2009).
- Hansen, K. D., Langmead, B., Irizarry, R. A. BSmooth: from whole genome bisulfite sequencing reads to differentially methylated regions. Genome Biology. 13 (10), R83 (2012).
- Lee, R. S., et al. Chronic corticosterone exposure increases expression and decreases deoxyribonucleic acid methylation of Fkbp5 in mice. Endocrinology. 151 (9), 4332-4343 (2010).
- Lee, R. S., et al. A measure of glucocorticoid load provided by DNA methylation of Fkbp5 in mice. Psychopharmacology. , (2011).
- Bose, M., Olivan, B., Laferrere, B. Stress and obesity: the role of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis in metabolic disease. Current Opinion in Endocrinology, Diabetes, and Obesity. 16 (5), 340-346 (2009).
- Brydon, L., Magid, K., Steptoe, A. Platelets, coronary heart disease, and stress. Brain, Behavior, and Immunity. 20 (2), 113-119 (2006).
- McKlveen, J. M., et al. Chronic Stress Increases Prefrontal Inhibition: A Mechanism for Stress-Induced Prefrontal Dysfunction. Biological Psychiatry. 80 (10), 754-764 (2016).
- Akalin, A., et al. methylKit: a comprehensive R package for the analysis of genome-wide DNA methylation profiles. Genome Biology. 13 (10), R87 (2012).
- Cervera-Juanes, R., Wilhelm, L. J., Park, B., Grant, K. A., Ferguson, B. Alcohol-dose-dependent DNA methylation and expression in the nucleus accumbens identifies coordinated regulation of synaptic genes. Translational Psychiatry. 7 (1), e994 (2017).
- Cervera-Juanes, R., Wilhelm, L. J., Park, B., Grant, K. A., Ferguson, B. Genome-wide analysis of the nucleus accumbens identifies DNA methylation signals differentiating low/binge from heavy alcohol drinking. Alcohol. 60, 103-113 (2017).
