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Bioengineering

Medição da dinâmica de força-sensível da proteína em células vivas, usando uma combinação de técnicas fluorescentes

doi: 10.3791/58619 Published: November 2, 2018

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para a utilização simultânea de ressonância Förster, sensores de tensão baseados na transferência de energia para medir proteína carga e fluorescência recuperação após fotobranqueamento para medir a dinâmica da proteína, permitindo a medição de força-sensível dinâmica da proteína dentro de células vivas.

Abstract

Células detetam e respondem às pistas físicas em seu ambiente, convertendo estímulos mecânicos em sinais bioquimicamente detectável em um processo chamado mechanotransduction. Um passo crucial no mechanotransduction é a transmissão de forças entre os ambientes internos e externos. Para transmitir forças, deve haver um enlace físico sustentado e contínuo, criado por uma série de interações da proteína-proteína. Para uma interação da proteína-proteína dada, carga mecânica ou não pode ter nenhum efeito sobre a interação, levar a uma dissociação mais rápida da interação, ou mesmo estabiliza a interação. Compreensão molecular como carga dita rotatividade de proteína em pilhas vivas pode fornecer informações valiosas sobre o estado mecânico de uma proteína, por sua vez, elucidar seu papel na mechanotransduction. Técnicas existentes para medição dinâmica força-sensível da proteína ou faltam de medições directas da carga de proteína ou dependem as medições realizadas fora do contexto celular. Aqui, descrevemos um protocolo para a recuperação de fluorescência-transferência de energia de ressonância de Förster depois fotobranqueamento (FRET-FRAP) técnica, que permite a medição da dinâmica de força-sensível da proteína dentro de células vivas. Esta técnica é potencialmente aplicável a qualquer sensor de tensão baseado no traste, facilitando o estudo da dinâmica de proteínas sensíveis à força em uma variedade de estruturas subcelulares e em diferentes tipos de células.

Introduction

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O ambiente extracelular é uma rica fonte de sinais bioquímicos e físicos que ditar o comportamento da célula. Em particular, a natureza física do microambiente pode mediar principais funções celulares, incluindo o crescimento celular, migração e diferenciação1,2,3,4. Desregulação da mecânica do microambiente é um componente crítico para muitas doenças que ainda não dispõem de tratamentos adequados, tais como câncer5, aterosclerose6e fibrose7. Uma compreensão completa de como as células convertem a estímulos físicos em sinais bioquimicamente detectável, um processo denominado mechanotransduction, requer a elucidação dos mecanismos moleculares mediando a transmissão de força, tanto dentro e fora das células e dentro de várias estruturas subcelulares.

Dentro de estruturas subcelulares, proteínas estão constantemente ligados; vinculação e desvinculação baseado na força de suas interações com parceiros8de vinculação. Para as forças ser transmitida com sucesso através de uma distância física, devem haver uma cadeia ininterrupta de interações proteína-proteína, significa que o volume de negócios de uma proteína deve ser lenta o suficiente para sustentar e transmitir a força de sua vinculação parceiro9. Enquanto as interações da proteína-proteína geralmente consistem de vários não-covalentes entre os domínios da proteína, a interação é muitas vezes conceituada como um estado ligado que pode a transição para um estado desacoplado sob diferentes condições10, 11. para uma interação da proteína-proteína dada, é possível que a força pode ter n efeito sobre o tempo de vida da interação, conhecido como um vínculo"ideal", reduzir o tempo de vida da interação, conhecido como uma "ligação de deslizamento" ou aumentar o tempo de vida da interação , conhecido como um "laço de captura"10. Assim, há uma intrincada relação entre carga de proteína e proteína dinâmica, que nos referimos como sensíveis à força dinâmica.

Para compreender o efeito da carga sobre a dinâmica do vínculo, uma série de experimentos altamente informativos foram realizada no nível único-molécula. Usando proteínas isoladas, ou fragmentos de proteínas e de técnicas de manipulação como uma pinça magnética, pinça óptica e microscopia de força atômica, estes estudos têm demonstrado as interações da proteína-proteína de força-sensível para vários relevantes proteínas11,12. Ambas as integrinas13 caderinas e14, que são proteínas transmembrana importantes para a formação de interações célula-matriz e célula-célula, respectivamente, demonstraram alterações na dinâmica devido ao carregar. Dentro da célula, vinculina é recrutada para ambos talin15 e α-catenina16 de forma dependente da força e pode formar um vínculo de capturas com actina17, indicando um papel crucial para vinculina aderências focais (FAs) e entroncamentos adherens (AJs ) sob carga. Único-molécula estudos permitem o isolamento de interações proteína-proteína específica e produzem resultados ambíguos, mas eles não representam a complexidade do ambiente celular.

Experimentos de Marco demonstraram que várias estruturas subcelulares, incluindo FAs e AJs, são mechanosensitive e apresentam montagem reforçada em resposta às cargas geradas internamente ou externamente aplicado18,19, 20,21,22. Além disso, vários modelos teóricos sugeriram que mechanosensitive montagem poderia ser movida pela força-sensível proteína dinâmica23,24,25. Para examinar essas dinâmicas de força-sensível dentro de células vivas, foram tomadas algumas abordagens indiretas. FRAP e técnicas relacionadas fornecem uma metodologia relativamente simples para medir a dinâmica da proteína em células26,,27,28,29. No entanto, a medição da carga de proteína tem sido mais limitada. Uma abordagem típica é comparar a dinâmica da proteína nas células com e sem a exposição a um inibidor do citoesqueleto, usado para reduzir o total celular contratilidade8,30,31. Conceitualmente, esta é uma comparação entre uma carga alta e baixa carga de estado. No entanto, há não há quantificação da carga em toda a proteína em nenhum dos Estados, e pode haver efeitos bioquímicos não intencionais do inibidor, tal a perda dos sítios de ligação chave ao longo de um filamento de F-Actina. Uma outra abordagem, específica para FAs, tem sido para medir a força total de esforço sobre o substrato pela FA usando microscopia de força de tração para aproximar a carga molecular e examinar a relação com a dinâmica de uma única proteína dentro da FA32. Enquanto essa abordagem permite a quantificação da força total, ele não fornece informação molecular específica. FAs são constituídos por mais de 200 diferentes proteínas, muitas das quais podem suportar carga33. Assim, medindo a força total de saída de um FA potencialmente obscurece a possibilidade de vários caminhos de transmissão de força e não confiável fornece uma medida da carga em uma proteína específica.

Ao contrário de abordagens anteriores em mechanobiology, o advento dos sensores de tensão baseado em FRET permite direto34,35,36células de medição de cargas vivida por proteínas específicas dentro da vida. Aqui, apresentamos um protocolo que combina sensores de tensão baseado em FRET com medida FRAP-baseado da dinâmica da proteína. Nos referimos a esta técnica como FRET-FRAP. Esta abordagem permite a medição simultânea de carga de proteína e proteína dinâmica, permitindo assim a avaliação da dinâmica força-sensível proteína em células vivas (Figura 1). Já, a FRET-FRAP técnica foi aplicada para o estudo da dinâmica da mecânica vinculador proteína vinculina37força-sensível. Sensores de tensão foram desenvolvidos por inúmeras proteínas que são relevantes em uma variedade de estruturas subcelulares. Por exemplo, os sensores foram desenvolvidos para vinculina34 e talin38,39 no FAs, as caderinas e catenins em AJs40,41,42, nesprin no LINC nuclear complexo 43, α-actinin44 e FBLIM136 no citoesqueleto e MUC-1 nos glicocálix45, entre outros46. Da mesma forma, FRAP é que uma técnica comumente utilizada tem sido utilizada em proteínas mechanosensitive dentro as aderências focais8,31, aderente junções47, actina córtex26e núcleo48. Seguindo em frente, que a técnica de FRET-FRAP deve ser amplamente aplicável a qualquer destes sensores existente ou recém desenvolvido sensores, permitindo as medições de força-sensível dinâmica em uma ampla variedade de contextos e estruturas subcelulares. Nesse sentido, nós fornecemos um protocolo detalhado, generalizado para implementar a técnica FRET-FRAP aplicável nestes sistemas diferentes. Esperemos que isto irá permitir uma grande variedade de experimentos para elucidar o papel de várias proteínas mechanosensitive na regulação da transmissão de força e na mediação do comportamento celular.

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Protocol

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1. gerar amostras para a imagem latente

  1. Construção de sensor tensão estàvel expressa no tipo de célula desejada.
    1. Clone construção de sensor de tensão em vetor pRRL ou outro plasmídeo de expressão viral.
      Nota: Várias ferramentas de clonagem moleculares diferentes estão disponíveis para realizar essa etapa, incluindo o uso de enzimas de restrição, se sobrepõem a extensão e montagem Gibson35. O vetor pRRL é usado na transdução viral lenti e permite um elevado grau de produção de proteínas através da utilização do promotor humana citomegalovírus (CMV). Diferentes vetores podem ser necessários para um determinado contexto. Por exemplo, o promotor CMV é silenciado em alguns tipos de célula49. Além disso, somente sensores baseados em FRET contendo proteína fluorescente que falta a sequência forte homologia, como mTFP1 e A206K de Venus, pode ser usada para criar linhas de célula estável. Sensores que contém proteína fluorescente ciana e amarela fluorescente proteína provavelmente será sujeito a recombinação homóloga50.
    2. Gere lentivirus em células de rim embrionário humano (HEK) 293T usando psPax2 e plasmídeos de empacotamento de pMD2.G usando de métodos de produção de vírus padrão51.
      Cuidado: Lentivirus só devem ser manuseadas por pessoal devidamente treinado em um ambiente de laboratório de nível 2 de biossegurança.
      Nota: Esta combinação de células e plasmídeos de empacotamento é apropriada para uso com pRRL. Outros sistemas podem ser exigidos com outros vetores.
    3. Transduce desejadas células com vírus usando protocolos de transdução padrão52 e usar citometria de fluxo para classificar células53 selecionando uma população homogénea, expressando cada construção em níveis endógenos aproximadamente37. Após a seleção de células, experimentos podem ser realizados imediatamente, ou células podem ser criogenicamente congeladas para uso posterior. Não exceda 2 ciclos de congelamento e descongelamento de uma linha determinada célula estável.
      Nota: O uso de linhas de células deficientes na proteína a ser estudado (por exemplo, MEFs vinculina- / - para o uso com o sensor de tensão vinculina) aumentará o sinal para ruído proporção em experimentos de traste, bem como limitar artefatos sobre-expressão. Tais linhas de fibroblasto embrionário (MEF) estável do mouse podem ser usadas para aproximadamente 15 passagens antes de perda significativa de expressão ou degradação dos sensores é aparente. Se viral baseado em métodos não são desejados, uma infinidade de reagentes comerciais pode ser usada de acordo com o protocolo do fabricante para transitoriamente, transfect uma variedade de tipos de células com sensores de tensão em um plasmídeo adequado, tais como pcDNA3.1. Expressão ideal será 24-48 h, seguindo do transfection.
  2. Prepare substratos para semeadura de célula.
    1. Adquira 4, pratos de 35mm com fundo de vidro.
    2. Trabalhando em uma capa de cultura celular, em um tubo de 15 mL canônico, faça 4 mL de 10 µ g/mL de fibronectina em tampão fosfato (PBS) fisiológico usando PBS estéril do capuz de cultura de células. Inverta suavemente o tubo de uma vez para misturar e deixe a solução descansar por 5 minutos do bairro de cultura de células.
      Nota: A concentração ou o tipo de proteína de ECM pode ter de ser ajustado para outros tipos de células. As condições fornecidas são apropriadas para MEFs.
    3. Pipete 1 mL da solução de fibronectina em cada prato com fundo de vidro.
    4. Deixe a solução de fibronectina sobre os pratos por 1h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C.
    5. Aspirar a solução de fibronectina, lave uma vez com PBS e adicione 1 mL de PBS.
  3. As células para substratos preparados de semente.
    1. Comece com as células de interesse a uma percentagem de confluência apropriada para subcultura em um prato de cultura de 6 cm.
      Nota: Diferentes tipos de células exigirá condições de cultura celular distinta e protocolos de subcultura. Esta seção fornece diretrizes apropriadas para MEFs. Normalmente, MEFs são cultivadas para a confluência de 85% antes de subcultura.
    2. Trabalhando dentro de um capuz de cultura celular, enxágue as células uma vez com 3 mL de PBS. Adicionar 1 mL de 0.05% Trypsin-EDTA e incubar durante 5 min a 37 ° C.
    3. Adicionar 3 mL de mídia completa para o prato de 6cm, recolher as pilhas e coloque em um tubo cônico de 15 mL.
      Nota: Composição para mídia completa dependerá do tipo de célula a ser usado. Por MEFs, mídia completa é muitas vezes definida como meio a glicose alta Dulbecco Eagle modificado com 10% de soro bovino fetal, 1% antibiótico-antimicótico (contendo anfotericina B, penicilina e estreptomicina) e uma solução de aminoácidos não-essenciais (timina) 1%.
    4. Gire as células para baixo a 1000 x g por 5 min.
    5. Aspirar a mídia e ressuspender as células em 1 mL de mídia completa.
    6. Remova o PBS de pratos de vidro revestido de fibronectina. Contar as células e 30.000 células para cada prato de vidro fibronectina revestido com a mídia adequada e completa para um volume final de 1,5 mL de semente.
      Nota: Esta densidade celular é apropriada para MEFs e conduzirá a uma população de células que não estão tocando, mas não excessivamente esparsas. O número exato de célula talvez precise ser ajustado para outros tipos de célula ou outra câmara de imagens.
    7. Permitir que as células a se espalhar para 4h após a semeadura. A 2 h de propagação, aspirar a mídia de crescimento e lave uma vez com a mídia, deixando 1,5 mL de mídia de imagem de imagem.
      Nota: Este tempo de propagação é apropriado para MEFs, mas talvez precise ser alterado para outras células. No entanto, períodos de incubação de mais de 6-8 h levará à deposição significativa de proteína de ECM do soro na mídia completa. Mídia de imagem deve conter as mesmas adições como mídia completa mas deve ser opticamente clara e não conter quaisquer compostos que fluorescem em canais de imagem, tais como flavinas ou saciar a fluorescência, como o vermelho de fenol. Uma mídia de imagem geralmente útil é DMEM-gfp viver célula visualização mídia suplementada com solução de timina FBS e 1% de 10%. Se o fundo autofluorescência é inaceitavelmente elevada, a quantidade de soro pode ser reduzida. Se não for possível uma mudança de mídia após o chapeamento inicial, as células podem ser resuspended diretamente em meios suplementados com um inibidor de tripsina por imagens.

2. configurar microscópio para a imagem latente

  1. Ligue o microscópio.
    1. Ligue a lâmpada de arco primeiro.
      Nota: Uma lâmpada de arco irá lançar um pulso eletromagnético, que pode danificar outros equipamentos que já vem.
    2. Ligue o filtro roda controller, controlador de palco automatizado, interface do microscópio-computador e câmera.
    3. Ligue o FRAP laser e laser controladores de posição.
      Cuidado: Lasers de alta potência podem ser prejudicial para os olhos se visualizado diretamente. Recomenda-se configurar o sistema de microscópio para bloquear a excitação do laser de ser dirigido para as peças do olho, que podem ser feitas movendo-se um espelho para o caminho do feixe FRAP durante o branqueamento para refletir o laser em direção a amostra e prevenir a transmissão para a ocular.
    4. Ligue o computador e o software de controle aberto microscópio.
    5. Permitir que 15 min para a lâmpada de arco e FRAP laser para aquecer.
  2. Calibre o laser FRAP.
    1. Abra a janela de configuração do laser. Definir Configuração de iluminação (durante o pulso) para as configurações de iluminação FRAP apropriadas para exposição do laser para a amostra. Definir a Configuração de iluminação (durante a imagem latente) para as configurações de iluminação apropriado para apenas o fluoróforo aceitador de imagem.
    2. Selecione o objetivo de calibrar na Configuração de sistema de coordenadas. Desmarque a opção Manualmente clique em pontos de calibração e verificar exibir imagens durante a calibração.
    3. Defina o tempo de interrupção para 10.000 µs e o número de pulsos de 100.
    4. Coloque o slide de calibração, feito de brometo de etídio selado entre uma lâmina de vidro e uma lamela, no adaptador de estágio com o lamela de lado para baixo.
      Atenção: O brometo de etídio é um agente mutagénico e deve ser manuseado usando luvas. Se o slide estiver comprometido, descarte de acordo com as diretrizes da instituição.
    5. Use as configurações de iluminação do aceitador para concentrar-se na superfície da lâmina, identificável como o plano focal com o sinal mais brilhante. Pequenos defeitos no revestimento será visíveis para auxiliar em foco.
    6. Deslocar o carro para uma área com fluorescência uniforme em todo o plano de imagem.
    7. Clique em criar a configuração. O software irá inicializar o processo de calibração, branqueamento e automaticamente detectar a posição do ponto de celulose branqueada.
    8. Garantir uma calibração bem sucedida avaliando a imagem final, que será uma grade de 3x3 de celulose branqueados pontos que devem ser distribuídos uniformemente e em foco. Salve a imagem de calibração para referência futura.
    9. Retirar a lâmina de calibração e armazenar com segurança. Calibração deve ser realizada antes do início de cada experimento, mas não precisa ser executada entre as amostras.

3. escolher parâmetros para a imagem latente de FRET

  1. Que uma das amostras de células expressando o sensor de tensão com paraformaldeído 4% durante 10 min. solução de paraformaldeído geradas deve ser metanol livre, muitas vezes referida como EM-grade, para evitar a desnaturação das proteínas fluorescentes. Coloque em PBS após a fixação.
    Cuidado: Paraformaldehyde soluções são tóxicas. Esta etapa deve ser executada em uma coifa e a solução deve ser eliminada segundo políticas institucionais.
    Nota: Essa otimização não depende de dinâmica da proteína, e uma amostra fixa permite tempo máximo de imagens sem se preocupar com a saúde da célula.
  2. Enxagúe a amostra três vezes com PBS e deixe em PBS.
    Nota: Uso de meios de montagem mais comercialmente disponíveis afetará o fluoróforo Propriedades, tornando a amostra inadequada para FRET imagem54. Idealmente, as células vão ser fotografadas imediatamente, mas podem ser deixadas durante a noite a 4 ° C. Tempos de espera mais tempo irão resultar em deterioração da amostra.
  3. Coloque a amostra no suporte de palco do microscópio para a imagem latente.
  4. Abra a ferramenta de aquisição de multi-dimensional (MDA). Estabelecer uma imagem sequencial de três canais: excitação única aceitador e emissão (canal aceitador), excitação de doador e aceitador de emissão (FRET canal) e excitação único doador e emissão (canal de doador).
    Nota: Há uma variedade de maneiras para amostras de imagem FRET. O método de três canais ou "três-cubo" da imagem latente emparelhado com meios de calibrar o sistema para medir a eficiência FRET é recomendado para sensores de tensão baseado em FRET55,56. Esta abordagem é rápido, simples, não-destrutiva, requer apenas uma fluorescência padrão de imagem de microscópio e permite a comparação de experimentos em dias diferentes e configurações de imagem.
  5. Examinar a amostra usando o tempo de exposição de 500 ms e um filtro de densidade neutra (ND) de 10%. Encontre uma célula expressando o sensor de tensão com a clara localização para uma estrutura de interesse.
  6. Selecione o tempo de exposição de 500 ms ou o comprimento desejado para cada canal de imagem e um filtro ND de 100% e adquirir uma sequência de imagens de traste.
  7. Estime a intensidade média do sensor em estruturas subcelulares de interesse em cada canal da imagem latente. Sinais de baixa podem levar a resultados imprecisos devido a estimativas de correção inadequada, não-linearidades em detectores ou contribuição significativa dos sinais de fundo. Uma orientação aproximada é de apontar para as intensidades acima de 10% do intervalo dinâmico da câmera (i. e., para uma câmera de 16 bits, intensidades devem estar acima de 6.000).
    Nota: Configurações ópticas idênticas (tempos de exposição, filtros, objectivos e outras variáveis tais como o ganho da câmera ou binning) devem ser usadas para todos os experimentos de traste que serão comparados. Alterar qualquer uma dessas configurações, conduzirá a uma alteração no montante de traste que é gerada ou detectado na confi guração do microscopia. FRET medições de eficiência são independentes desses configuração, mas não são os fatores de calibração utilizados para determinar a eficiência de traste. Em teoria, vários conjuntos de fatores de calibração poderiam ser usados para gerar eficiências FRET entre diferentes configurações de ópticas, mas isso não é recomendado. Branqueamento ou fototoxicidade pode ser diferente entre os vários ajustes, criando resultados espúrios.
  8. Adquira uma segunda sequência de imagens de traste do mesmo campo de visão. Estimativa fotobranqueamento entre quadros, comparando a intensidade média do sensor em cada canal da imagem latente. Fotobranqueamento deve ser mantido a um mínimo, de preferência inferior a 15% de perda de sinal.
  9. Ajuste os parâmetros de imagem para maximizar a intensidade minimizando fotobranqueamento. Para ajustes grosseiros, mude o filtro ND, sendo usado durante a aquisição. Para ajustes mais finos, altere o tempo de exposição em etapas de 250 ms.
  10. Repita as etapas de 3.5 – 3.8 até sinal adequado pode ser obtido minimizando fotobranqueamento.
    Nota: Normalmente, as configurações para o sensor de tensão vinculina vinculina- / - MEFs são 1.500 ms, ms 1.500 e 1.000 ms para os doador, FRET e aceitador canais respectivamente. Os valores óptimos variará com o tipo de sistema de iluminação, objetivo, conjuntos de filtros e nível de expressão do sensor.

4. escolha de parâmetros para FRAP Imaging

  1. Otimize as configurações de laser para garantir a completa clareamento da região de interesse (ROI) sem branqueamento a área circundante ou causando Fotodano.
    1. Fixe uma das amostras geradas das células expressando o sensor de tensão com paraformaldeído 4% por 10 min.
      Nota: Essa otimização não depende de dinâmica da proteína, e uma amostra fixa permite tempo máximo de imagens sem se preocupar com a saúde da célula. Isto impedirá também a recuperação de branqueamento por proteínas móveis, permitindo o isolamento do efeito de clareamento, evitando os efeitos da recuperação de fluorescência rápida, mediada por difusão, ocorrendo entre a incidência de branqueamento e levando o primeira imagem do post-alvejante.
      Cuidado: Paraformaldehyde soluções são tóxicas. Esta etapa deve ser executada em uma coifa e a solução deve ser eliminada segundo políticas institucionais.
    2. Enxagúe a amostra 3 vezes com PBS e deixe em PBS.
      Nota: O uso dos meios de montagem mais comercialmente disponíveis afetará fluoróforo Propriedades, tornando a amostra inadequada para FRAP imagem54. Idealmente, as células vão ser fotografadas imediatamente, mas podem ser deixadas durante a noite a 4 ° C. Tempos de espera mais tempo irão resultar em deterioração da amostra.
    3. Coloque a amostra no suporte de palco do microscópio para a imagem latente.
    4. Abra a janela de configuração do laser. Começar com a criação de um tempo de interrupção do laser de 10 pulsos, significando que cada ponto no scan do outro lado o ROI receberá 10.000 µs de laser de energia plena e 1.000 µs
      Nota: Um 500 mW, 515 nm do laser foi utilizado para o branqueamento. Isto foi escolhido para branquear seletivamente Venus A206K, o aceitador em vinculina sensor de tensão, com máxima eficiência. Se os sensores de tensão baseado em FRET com outras proteínas fluorescentes são usados, outro tipo de laser pode ter que ser empregado.
    5. Encontrar uma célula expressando o sensor de tensão com a clara localização para uma estrutura de interesse e adquirir uma imagem.
    6. Desenha um Retangular ROI delineando a área para branquear e armazenar a localização de ROI. O laser de pulso. Encaixe a outra imagem da amostra.
      Nota: O tamanho da caixa deve ser aproximadamente o tamanho da FA toda. Cuidado deve ser tomado que o tamanho da caixa não varia drasticamente através de experimentos. A área branqueada deve ser cuidadosamente monitorizada em proteínas cuja dinâmica é afetada por difusão. Esta é uma preocupação potencial em proteínas transmembrana, tais como as caderinas47, ou proteínas que difundem lentamente27,57.
    7. Verifica a qualidade de fotobranqueamento, verificando que o ROI inteiro é descorado, tal que a intensidade é perto de níveis de plano de fundo. Além disso, certifique-se de não há nenhum clareamento fora o ROI.
    8. Ajuste as configurações do laser conforme necessário para atingir uma quantidade significativa de branqueamento dentro o ROI sem induzir clareamento significativo fora o ROI. Para ajustes grosseiros, aumentar e diminuir o tempo de interrupção em passos de 100 µs e para ajustes finos, aumentar e diminuir o número de pulsos em passos de 5 pulsos.
    9. Repita as etapas 4.1.5 – 4.1.8 até atingir as configurações mínimas a que o ROI é totalmente branqueado sem fotobranqueamento fora do alvo.
      Nota: Alcançar um valor substancial de branqueamento inicial sem induzir fototoxicidade é um aspecto-chave de análise FRAP. Use as configurações do laser que resultam em um alvejante completo nas amostras fixas. Em geral, o número mínimo de fótons deve ser usado para atingir o nível desejado de branqueamento. Além disso, o protocolo clareador deve ser mantido relativamente consistente durante as experiências, como alterações podem afetar as medições de proteína dinâmica58.
  2. Otimize os parâmetros de lapso de tempo para capturar totalmente a dinâmica da proteína de interesse, minimizando o fotobranqueamento.
    1. Prepare a afinação de microscopia para a imagem latente de células vivas, de preferência com uma fase aquecida e objectivo, bem como controle de CO2 . Permitem equilibrar por 20 min.
      Nota: Para manter a saúde das células de imagem, temperatura e pH devem ser mantidos no vaso de imagem. Uma variedade de fases aquecidas e aquecedores objetivas prontamente pode manter a temperatura da célula a 37 ° C. O controle do pH para muitos tipos de mídia pode ser realizado através da utilização de uma bomba peristáltica para pass humedecida 5% CO2 da amostra em 15 mL/min. como alternativa, se CO2 controle estiver indisponível, ao vivo de imagens mídia contendo HEPES devem ser usado para impedir alterações de pH grande.
    2. Lugar dentre as amostras geradas das células expressando o sensor de tensão no suporte de palco do microscópio para a imagem latente. Permitem equilibrar por 10 min.
    3. Usando a ferramenta MDA, configure um lapso de tempo para adquirir imagens pre-bleach, bleach o ROI e continuam a tomar 10-60 imagens de 3-5.
      Nota: Para vinculina no FAs, imagem a cada 5 s para pós-lixívia 5 min é suficiente para observar a dinâmica sem introduzir clareamento excessivo31. Pontos de partida útil para taxa de geração de imagens e duração para muitas outras proteínas podem ser encontrados na literatura47,,48,59,60.
    4. Use o aceitador de imagem configurações que minimizam a exposição da amostra à luz, mantendo uma relação sinal / ruído suficiente, para a estrutura de interesse da imagem. Um bom ponto de partida é a metade do ND filtro e exposição tempo necessário para a imagem latente do aceitador durante FRET.
    5. Encontrar uma célula expressando o sensor de tensão com a clara localização para uma estrutura de interesse e ajustar uma imagem.
    6. Desenha um Retangular ROI para destacar onde branquear e armazenar a localização de ROI. Inicie o lapso de tempo.
    7. Examine o conjunto resultante de imagens para possíveis problemas.
      1. Se não houver substanciais saltos (maiores que 10% da intensidade inicial) na recuperação de fluorescência entre quadros, reduza o tempo-passo entre os quadros.
      2. Se houver uma perda global significativa de fluorescência ao longo do tempo (maior que 5-10% da intensidade inicial), reduzir o número de imagens tiradas pós-água sanitária e/ou alterar as configurações de imagem para reduzir a exposição da amostra à luz.
      3. Se a recuperação de fluorescência não estacionou no final do lapso de tempo, aumente o comprimento total do lapso de tempo.
    8. Ajustar os parâmetros de lapso de tempo da mesma forma e repita etapas 4.2.5 – 4.2.7 até a recuperação de fluorescência é capturada adequadamente sem foto-dano global para a amostra.

5. adquirir dados FRET-FRAP

  1. Prepare a afinação de microscopia para a imagem latente de células vivas, de preferência com uma fase aquecida e objectivo, bem como controle de CO2 . Permitem equilibrar por 20 min.
    1. Para garantir a saúde das células de imagem, manter a temperatura a 37 ° C, na câmara de imagens. Uso uma bomba peristáltica para passar humedecidas 5% CO2 da amostra a 15 mL/min para manter o pH.
    2. Alternativamente, se CO2 controle não estiver disponível, use mídia de imagens ao vivo, contendo HEPES para impedir alterações de pH grande.
  2. Abra a ferramenta MDA e configurar com FRET parâmetros, incluindo os conjuntos de diferentes filtros de imagem.
  3. Salve este MDA experimental na pasta com o nome de MDA_FRET_Date.
  4. Configure outro MDA com FRAP parâmetros, incluindo os conjuntos de filtro diferente, as configurações de lapso de tempo e o diário de imagem para o laser de pulso após aquisição pré-alvejante.
  5. Salve este MDA experimental na pasta com o nome de MDA_FRAP_Date. Feche a janela do MDA.
  6. Na barra de ferramentas na parte superior da tela, selecione Journal | Iniciar gravação.
  7. Abra a janela MDA, carregar o estado de MDA_FRET_Date e clique em Acquire. Então carregar o estado de MDA_FRAP_Date e clique em Acquire.
  8. No final da aquisição, na barra de ferramentas na parte superior da tela, selecione Journal | Parar a gravação de.
  9. Salvar este jornal experimental na pasta com o nome de FRETFRAP_Date e adicioná-lo para uma barra de ferramentas para facilitar o acesso. Feche a janela do MDA.
  10. Lugar dentre as amostras geradas das células expressando o sensor de tensão no suporte do microscópio para a imagem latente. Permitem equilibrar por 10 min.
  11. Navegue a amostra usando a aquisição de imagem sob adquirir | Adquirir com exposição mínima de tempo e ND filtram para identificar as células de interesse.
  12. Definir o autofocus contínuo navegando para dispositivos | Foco. Manualmente o foco sobre a amostra até atingir o avião de imagem correto.
  13. Clique em Definir foco contínuo, aguarde o sistema ajustar e clique em Iniciar o foco contínuo.
    Nota: Isto não é necessário, mas melhora significativamente a qualidade das curvas de recuperação FRAP porque impede que a amostra à deriva fora de foco.
  14. Encontrar uma célula expressando o sensor de tensão com a clara localização para uma estrutura de interesse e ajustar uma imagem.
  15. Desenha um Retangular ROI para destacar onde a lixívia. Armazene a localização de ROI.
  16. Inicialize o jornal FRETFRAP_Date , que começará a aquisição de imagens FRET seguido a inicialização de lapso de tempo o FRAP.
  17. Repita as etapas 5.14-5.16 até 10-15 conjuntos de imagens são adquiridos.
    Nota: A medida não pode ser repetida na mesma cela. Uma vez que ocorre fotobranqueamento, FRET dados não são confiáveis.

6. analisar os dados do FRET-FRAP

  1. Analise as imagens FRET usando o software de escolha.
    Nota: Existem várias maneiras para a imagem e dosar FRET61, incluindo ratiometric FRET62 e FRET índice34,35. No entanto, é altamente recomendável usar as estimativas de FRET eficiência55,63 para a interpretação dos dados FRET-FRAP. Consulte a discussão para maior exploração deste tópico. Para emissão sensibilizada e cálculo da eficiência FRET, software personalizado está disponível do laboratório Hoffman no https://gitlab.oit.duke.edu/HoffmanLab-Public.
  2. Quantificar os parâmetros relevantes para cada estrutura subcelular que foi descorado. Isto deve incluir FRET índice/eficiência e média aceitador inicial intensidade média (proporcional à concentração), mas também poderia incluir parâmetros físicos tais como tamanho do ROI.
  3. Analise as FRAP imagens usando o software de escolha.
    Nota: Existem várias maneiras para dosar FRAP26,,27,28,29. Chave experimental incluem contabilidade para branqueamento durante pós-alvejante imaging, alterações na intensidade de fundo e translocação de estruturas subcelulares altamente dinâmicas, como aderências focais. Branqueamento, correções e variações na iluminação de fundo pode ser realizado através da análise das regiões não-branqueada e não-fluorescente das imagens. Altamente dinâmicas estruturas subcelulares, particularmente aqueles mostrando a dinâmica de crescimento ou desmontagem excessiva são incompatíveis com o padrão FRAP análises e não devem ser analisados. Além disso, há uma variedade de maneiras para normalizar os dados. As orientações fornecidas são para a análise mais simples.
  4. Corrigir a recuperação de dados para efeitos de branqueamento e depois normalizar para pre-branquear intensidades. Quantificar o tempo de recuperação e a fração móvel de acordo com a seguinte equação28,34:
    MF - (MF - Ró) e-kt
    onde MF é a fração móvel, Ró é a recuperação inicial, e k é a taxa de recuperação. O intervalo de recuperação é determinado por:
    Τ1/2 = ln 2/k.
    Nota: Há uma variedade de pacotes de software disponíveis publicamente para completar estas análises64 , bem como uma variedade de plugins ImageJ. Software personalizado está disponível a partir do laboratório de Hoffman, em https://gitlab.oit.duke.edu/HoffmanLab-Public. Análises mais devem ser usadas para as situações onde a difusão afeta a dinâmica da proteína de interesse, de múltiplas escalas de tempo são aparentes na recuperação, ou geometrias de branqueamento não-padrão são usadas.

7. interpretar dados FRET-FRAP

  1. Compilar informações relevantes para cada ROI incluem: FRET índice/eficiência, fração móvel FRAP intensidade aceitador, FRAP meia-hora.
    Nota: FRET índice ou eficiência é usada para determinar a carga média através da proteína dentro o ROI. Intensidade de aceitador mede a concentração local da proteína. A metade do tempo de recuperação é uma medida da dinâmica da proteína. Um intervalo menor indica o volume de negócios mais rápido. FRAP fração móvel mede a quantidade de proteína dentro do ROI que ativamente está virando. Uma fração maior móvel indica que uma porcentagem maior da proteína dentro o ROI está virando.
  2. Para investigar o efeito da concentração local na taxa de rotatividade de proteínas e quantidade, plotar FRAP fração de meia-hora e móvel contra intensidade aceitador inicial.
  3. Para investigar o efeito da carga de proteína na taxa de rotatividade de proteínas e quantidade, plotar FRAP fração de meia-hora e móvel contra FRET índice/eficiência.
    Nota: Dependendo da proteína ou estrutura, também pode ser interessante examinar os efeitos de parâmetros físicos, tais como o tamanho da estrutura ou excentricidade, na carga de proteína ou volume de negócios.

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Representative Results

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FRET-FRAP é feito da combinação de duas técnicas fluorescentes, FRET e FRAP. Como enfocamos os efeitos da carga de proteína, usamos sensores de tensão baseado em FRET34,46. Estes sensores baseiam-se frequentemente uma tensão de sensoriamento módulo constituído por duas proteínas fluorescentes, tais como mTFP1 e VenusA206K, ligados por um vinculador flagelliform (figura 1A). Quando o módulo é colocado entre os domínios de cabeça e caudos de uma proteína, é possível medir a carga exercida através da proteína. Ao analisar dados FRET, imagens tiradas no canal aceitador são utilizadas para avaliar a localização do sensor de tensão e concentração, como este sinal é independente do traste (figura 1B). Após o cálculo da eficiência FRET, carga de proteína pode ser visualizada em uma escala colorimétrica onde uma diminuição da eficiência do traste em direção a cores mais frias indica um aumento na carga de proteína, e eficiências de traste na faixa vermelha indicam carga baixa proteína ( Figura 1B). Imagem latente FRAP é realizado usando um laser para branquear o fluoróforo aceitador em um único subcellular estrutura e monitor de recuperação ao longo do tempo (Figura 1). A curva resultante de FRAP normalizada pode ser analisada para extrair parâmetros descrevendo a dinâmica da proteína, incluindo o intervalo de recuperação e fração móvel (Figura 1). Porque FRET e FRAP análises foram realizadas na mesma célula, a proteína média carga e volume de negócios em uma estrutura subcelular podem ser plotados como um único ponto. Várias células de imagem produz vários pontos e uma tendência emergente pode indicar se uma proteína é desestabilizado (Figura 1E) ou estabilizada por carga molecular (Figura 1F).

O sensor de tensão vinculina (VinTS) expressado estàvel em vinculina nulos MEFs localiza-se muito claramente aos FAs se espalhou por toda a célula, como pode ser visto olhando para a imagem do canal aceitador (Figura 2A). A imagem do canal aceitador é usada para criar uma máscara de segmentação que identifica cada FA individual com uma ID exclusiva, visualmente, designada por cores diferentes (Figura 2B). O algoritmo de segmentação é baseado no método de "água" e rotula os FAs aproximadamente em ordem de brilho, como descrito anteriormente34,65. Os resultados de segmentação são convertidos em uma máscara binária que é então aplicada para os resultados de eficiência FRET (Figura 2), e é calculada a eficiência média de traste dentro de cada único FA (Figura 2D). Propriedades adicionais podem ser calculadas para cada FA de maneira similar, incluindo aceitador de média intensidade, tamanho, excentricidade e localização dentro da célula. Desta forma, consoante o que FA é escolhido para FRAP pode ser combinado para o ID exclusivo do FA e as propriedades associadas.

Análise e imagem latente FRAP é sensível a vários fatores que podem ser controlados, incluindo laser e imagem parâmetros, e alguns fatores que não podem ser controladas, tais como global FA estabilidade26,,27,28, 29. Por exemplo, excesso de exposição à luz durante a lapso de tempo de imagem pode levar a grandes problemas na interpretação dos dados FRAP. Embora a análise de controle FAs que não foram branqueados pode ser usada para normalizar para fotobranqueamento menor ao longo do tempo, com muita exposição da amostra à luz, a curva resultante da FRAP mostra uma recuperação inicial seguida de um mergulho em intensidade normalizada que Não posso estar com precisão em forma com uma função exponencial. Se este efeito é consistentemente observado nos dados, é necessário re-otimizar os parâmetros de imagem para diminuir o tempo de exposição, aumentar o tempo-passo entre os quadros de imagem ou diminuir o comprimento do lapso de tempo para reduzir a exposição da amostra à luz.

Outro exemplo de dados FRAP que são difíceis de interpretar, é quando a FA que era foto translocates rapidamente durante a recuperação,28. Um caso representativo de translocação excessiva é mostrado na Figura 3. A imagem inicial, onde o ROIs é escolhido, não dá uma indicação da estabilidade FA (Figura 3A). Monitoramento da FA branqueada ao longo do tempo, ele rapidamente se afasta da posição inicial e o rastreamento automatizado é incapaz de seguir imediatamente devido ao baixo sinal fluorescente seguindo fotobranqueamento (Figura 3A). A curva resultante da FRAP mostra uma fase inicial de recuperação ligeira com um salto quando a fluorescência é recuperado o suficiente para o software detectar a FA e mover o ROI (Figura 3B). Esta curva não pode ser cabida com sucesso por uma função exponencial. A translocação rápida da FA também sugere que a estrutura de FA é instável. Assim, FAs instáveis não devem ser incluídos na mesma análise FRET-FRAP como FAs estáveis, devido a problemas técnicos e biológicos.

Com dados satisfatórios FRET e FRAP, o próximo passo é completar a análise FRET-FRAP avaliando simultaneamente a dinâmica e a carga de proteína. A figura 4A mostra os mapas de eficiência do FRET de três vinculina nula MEFs estàvel expressando VinTS. Os FAs delineados em branco foram escolhidas para análise FRAP, e as intensidades de aceitador são mostradas ao longo do tempo. Estes três FAs tem vinculina sob diferentes quantidades de carregar e exibir um perfil de recuperação diferentes vinculina. Quantificar estas propriedades calculando o intervalo de recuperação e conspirando contra a eficiência média do traste em cada FA demonstra a tendência geral da vinculina sendo estabilizada por aumento da carga (Figura 4B). No entanto, a fração móvel plotada contra FRET eficiência não mostra nenhuma tendência, sugerindo que essa fração móvel não é regulada pela carga molecular (Figura 4). Introduzir um ponto de mutação para o VinTS no ácido aminado 50 (A50I) foi mostrado para impedir a ligação de vinculina para um parceiro de grande vinculação dentro FAs, talin66. A alteração dessa interação da proteína-proteína afeta vinculina dinâmica de força-sensível. Vinculina nulos MEFs estàvel expressando VinTS A50I tem célula diferente e morfologias FA, diferente vinculina carregando perfis e vinculina diferentes dinâmicas (Figura 4). Quantificando os meio-tempos de recuperação e FRET eficiências e plotagem mostram que quando a interação vinculina-talin é perturbada, vinculina na FAs é desestabilizada por aumento da carga (Figura 4E) enquanto a fração móvel não mostra nenhuma tendência (Figura 4F ).

Figure 1
Figura 1: princípios da técnica de FRET-FRAP. (A) diagrama esquemático do módulo de sensor de tensão FRET-baseado (TSMod) inserido em uma proteína de interesse e o efeito da tensão do sinal de traste. (B) para quantificar o FRET usando emissão sensibilizada, as imagens são tiradas para captura de sinal de doador (não mostrado), sinal de aceitador e FRET sinal. Com as correções adequadas, a imagem FRET pode ser atribuída uma escala colorimétrica para visualizar quanto tensão está sendo aplicada para o sensor. (C) FRAP é realizado usando o sinal de aceitador, que é diretamente proporcional à concentração. Análise de imagens de FRAP (D) produz curvas de intensidade de fluorescência ao longo do tempo que pode ser cabido com o uso de modelos matemáticos para determinar a dinâmica da proteína. (E, F) Quando FRET e FRAP são combinados, força e volume de negócios em um único FA podem ser medidos. Medição múltiplo FAs em várias células produz uma relação entre a carga de proteína e proteína rotatividade. Nesta análise, uma relação na qual correlaciona-se aumento da carga com maior volume de negócios é referida como um estado de força-desestabilizado (E). Nesta análise, uma relação na qual correlaciona-se com o aumento da carga diminuir o volume de negócios é referida como um estado de força estabilizada (F). Esta figura foi modificada de Rothenberg et al 37. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: FA identificação e análise FRET. (A) uma vinculina nula MEF expressando o VinTS visualizado no canal aceitador, onde a intensidade indica a concentração local da vinculina. Barra de escala = 30 µm. (B) FAs são segmentados com base no canal aceitador para criar uma máscara de FA ID onde cada FA é atribuído uma ID exclusiva, aqui mostrada como cores diferentes, aproximadamente em ordem de brilho. (C) a máscara de FA ID é convertida em uma máscara binária e aplicada à imagem de eficiência do FRET para mostrar os valores de eficiência do FRET só no FAs. (D) a eficiência de traste dentro de cada FA é em média para obter um valor único para cada FA, que está associado com o ID de FA na tabela de dados de saída. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: exemplo de uma FA translocating. (A) uma vinculina MEF nulo expressando o sensor de VinTS A50I mutante é visualizado no canal aceitador, com a tabela de cores invertida para maior clareza. Barra de escala = 30 µm. A FA delineada em preto foi selecionada para o branqueamento. Zoom-in imagens mostram a progressão de FA ao longo do tempo com o contorno vermelho indicando onde o software identificado o FA. Barra de escala = 2 µm. (B) a curva resultante de FRAP normalizada de dados em (A). Há um ponto de aproximadamente de 5% salto no seguinte intensidade 3 resultantes da FA se rapidamente antes de recuperação suficiente para o software detectar a alteração em local de FA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: representante FRET-FRAP resulta. (A) vinculina nulos MEFs expressando o VinTS exibido como imagens de eficiência médias FRET de toda a célula (barra de escala = 30 µm) com zoom-in invertido imagens canal aceitador, mostrando a progressão de recuperação FRAP (barra de escala = 2 µm). (B) FRAP intervalo de recuperação plotados contra FRET eficiência para 32 células, com os pontos que representam células em (A) destacadas em vermelho. (C) FRAP móvel fração plotada contra FRET eficiência para as mesmas células em (B). (D) vinculina nulos MEFs expressando o sensor mutante VinTS A50I exibido como imagens de eficiência médias FRET de toda a célula (barra de escala = 30 µm) com zoom-in invertido imagens canal aceitador, mostrando a progressão de recuperação FRAP (barra de escala = 2 µm). (E) FRAP intervalo de recuperação plotados contra FRET eficiência para 21 células, com os pontos que representam células em (D) destacadas em vermelho. (F) FRAP móvel fração plotada contra FRET eficiência para as mesmas células na alínea E. Dados foram originalmente publicados em Rothenberg et al 37 e são visualizaram aqui em um novo formato. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

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O método FRET-FRAP permite a medida direta da dinâmica de força-sensível da proteína, uma propriedade que tem sido difícil sondar diretamente dentro de células vivas. A sensibilidade da dinâmica de proteínas de carga molecular é fundamental para a função da proteína, como uma força transmissor ou transdutor. Carregamento é necessário para a transmissão de ambos gerado internamente e forças aplicadas externamente, chamado mechanotransmission e para a conversão dessas forças em sinais detectáveis por bioquimicamente, chamado mechanotransduction. No entanto, as alterações na carga podem afetar a duração de que uma proteína permanece ligada, assim, quanto menos tempo uma proteína passa a carga do rolamento, menor a força tem de ser transmitida a outras proteínas ou transformados em um sinal detectável bioquimicamente e sentiu o risco. O método FRET-FRAP preenche a lacuna entre o nível molecular e celular, permitindo que as medições de escala molecular da dinâmica de força-sensível a ser acessado dentro de um contexto mais amplo de celular. Além disso, ele permite que estas medidas a serem tomadas enquanto perturbando o ambiente intracelular ou extracelular ou bioquimicamente ou mecanicamente. Esta técnica deve ser aplicável a qualquer sensor de tensão baseado no traste, permitindo a investigação do estado mecânico de proteína em uma variedade de estruturas subcelulares e contextos extracelulares.

Passos críticos no sentido de garantir que as medições FRET-FRAP desejadas são obtidas envolvem otimizando os parâmetros de imagem e realizando a interpretação e análise de dados. Otimização dos parâmetros de imagem, conforme descrito no âmbito do protocolo, é necessário limitar o Fotodano à amostra, permitindo para o desejado estruturas e dinâmica para ser distinguido e para a força de sinal suficiente para o cálculo do FRET. Estabelecer esses parâmetros de imagem para uma linha celular particular e a proteína de interesse no início irá facilitar a comparação direta entre diferentes grupos experimentais. É interessante notar que alterações ao sistema, tais como a mutação da proteína de interesse ou introdução de inibidores, podem levar a mudanças na localização de proteína (assim, alteração da intensidade de sinal) e dinâmica. Os parâmetros otimizados devem permitir medidas claras e precisas através de todas as condições experimentais. Portanto, é recomendável escolher os parâmetros que não são no extremo fim de ser útil, por exemplo, ser capazes de distinguir mal sinal de ruído.

Enquanto a imagem neste protocolo foi descrita por um microscópio de epifluorescência e módulo de laser anexado FRAP, FRET-FRAP é aplicável a outros sistemas de imagem. Por exemplo, essa técnica pode ser adaptada para microscópios confocal de varredura de linha, bem como microscópios confocal de disco giratório com um módulo de fotobranqueamento anexado. Configurações de imagem deve ser otimizada de forma análoga para conseguir sinal-para-ruído adequado sem causar Fotodano ou fotobranqueamento excessivo. Particularmente no que se refere FRET imagem, detectores de eficiência quântica alta são necessários para obter sinal suficiente para cálculo de FRET bem sucedido sem induzir danos fluoróforo. Há uma série de publicações descrevendo a imagem FRET ou FRAP separada, usando um microscópio confocal67,68,69, que pode ser usado para orientar a otimização para a imagem latente FRET-FRAP.

Após o experimento, a análise dos dados deve ser tratada com cuidado e executada de forma reprodutível, de preferência automatizada. Devido à incapacidade para branquear mais que 2 ou 3 subcellular regiões em uma única célula antes demais o branqueamento da piscina de proteína disponível, a taxa de transferência desta técnica é relativamente limitada. Assim, conjuntos de dados são muitas vezes combinados em vários dias da imagem, que exigem tratamento consistente dos dados. Tanto o traste e o FRAP oferecem desafios com análise de dados. Índice FRET e medições de eficiência FRET permitem uma quantificação da carga de proteína. FRET índice é uma medida relativa que é altamente dependente de configurações de microscópio, enquanto FRET medições de eficiência são absolutos e independentes do microscópio configurações55,70. Recentemente mostramos que um método previamente desenvolvido utilizando imagens de "três-cubo" pode ser usado para determinar a eficiência do FRET de medições da emissão sensibilizada que normalmente são quantificados com índice de traste ao usar sensores de tensão baseado em FRET56 . As medições de eficiência FRET são necessárias se as medições da experiência absoluta de forças pelos sensores de tensão devem ser calculados34. As células expressando os sensores de tensão baseado no traste, células especialmente estáveis em números de passagem elevada, podem recombinar ou degradar os sensores, levando a inutilizável FRET dados50. Isso é facilmente identificado quando calcular rácios de doador-para-aceitador durante o cálculo do FRET eficiência37,56 , mas podem ser difícil de detectar usando o índice do FRET. Ao iniciar com um sensor de tensão baseado no traste, pode ser útil obter um conjunto de dados grande (> 50 células) de apenas FRET dados para as construções de interesse para identificar a eficiência esperada gama de traste. Além disso, dados FRAP podem ser difícil extrair de estruturas que são muito móveis, tais como FAs que são rapidamente deslizando ou desmontagem. Selecionando uma subpopulação de estruturas ou otimizar as condições de chapeamento de célula para atenuar este efeito pode ajudar a minimizar esse problema.

Em conceito, FRET-FRAP pode ser aplicado a qualquer sensor baseado em FRET em qualquer região subcellular, com otimização adequada. Na prática, pode ser difícil de capturar sensíveis à força dinâmica de proteínas que não estão sob carga mecânica substancial ou que têm meio-tempos de recuperação, na escala de tempo muito curta de alguns segundos ou a longa escala temporal de dezenas de minutos. Resultados de estudos de único-molécula podem apontar para as proteínas que podem demonstrar força-sensível dinâmica dentro de células vivas. Até então, isto inclui muitos FA e AJ proteínas13,14,15,16 , bem como alguns elementos do citoesqueleto71,72,73. Fortuitamente, baseada em FRET sensores foram projetados para muitas destas proteínas46. Estes resultados podem orientar a seleção de uma proteína de interesse; no entanto, deve não presumir-se que dados FRET-FRAP espelhará exatamente os resultados destes estudos de único-molécula. Na verdade, regulamento bioquímico, interações com outras proteínas e a estrutura do citoesqueleto local pode obscurecer ou alter, os efeitos das forças sobre as interações da proteína-proteína. A capacidade de observar essas complexidades é uma força original da abordagem FRET-FRAP.

Uma combinação de manipulações para a célula e a proteína de interesse podem ser usados para elucidar os fatores importantes na regulação da dinâmica da proteína. Por exemplo, pode ser útil ter um sensor que é força de diferenciação, por meio da exclusão ou mutação de um domínio de força vinculativa35,74 , como não deve haver nenhuma dependência da dinâmica de volume de negócios de proteína na força relatada por o sensor. Além disso, as mutações de outros locais obrigatórios de crítica ou sítios de fosforilação da proteína podem fornecer uma imagem mais completa de como a proteína de interesse é ser regulamentada. Fazer alterações globais para a célula ou o ambiente por meio de inibidores do citoesqueleto ou alterando as propriedades de carcaça (ex. matriz extracelular ou rigidez), respectivamente, podem ajudar a determinar como a dinâmica de força-sensível da proteína responde a perturbações mecânicas. Combinar as informações sobre a carga de proteína e força-sensível dinâmica com outras propriedades biofísicas da proteína pode ajudar a estabelecer o estado mecânico da proteína de interesse. Isso pode incluir a localização e interações da proteína-proteína local dentro de uma estrutura subcelular75,76. Além disso, a proteína pode residir nos Estados de conformação diferente, mesmo dentro da mesma estrutura subcellular, dependendo do contexto76,77. Carga de proteínas, dinâmica, localização e tudo pode de conformação simultaneamente ser afetado por forças gerado internamente e externamente aplicado37,76,78,79, ditando um papel da proteína em transmissão de força e mechanotransduction. A versatilidade do método FRET-FRAP e sua potencial compatibilidade com uma variedade de proteínas e manipulações deve permitir a elucidação da interação entre massa mecânica e dinâmica da proteína mechanosensitive sinalização.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado por um prêmio da National Science Foundation carreira (NSF-CMMI-14-54257), bem como subvenções do American Heart Association (16GRNT30930019) e do National Institutes of Health (R01GM121739-01), atribuído ao Dr. Brenton Hoffman e nacional Ciência Foundation Graduate Research Fellowship atribuído a Katheryn Rothenberg. O conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial da NSF ou NIH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin-EDTA Thermo Fisher 25300062
16% Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 30525-89-4
60x Objective NA1.35 Olympus UPLSAPO 60XO
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) Gibco 15240-062
Automated Stage Prior Scientific H117EIX3
Custom Dichroic Mirror Chroma Technology Corp T450/514rpc
Custom mTFP1 Emission Filter Chroma Technology Corp ET485/20m
Custom mTFP1 Excitation Filter Chroma Technology Corp ET450/30x
Custom Venus Excitation Filter Chroma Technology Corp ET514/10x
DMEM-gfp Live Cell Visualization Medium Sapphire MC102
Dulbecco's Modified Eagle's Medium  Sigma Aldrich D5796 with L-glutamine and sodium bicarbonate
Fetal Bovine Serum HyClone SH30396.03
Fibronectin, Human Corning 47743-654
FRAPPA Calibration Slide Andor provided along with FRAPPA unit
FRAPPA System with 515 nm Laser Andor
Glass-bottomed Fluoro Dishes World Precision Instruments FD35
HEK293-T Cells ATCC CRL-3216
Hexadimethrine Bromide, Polybrene Sigma Aldrich H9268-5G
High-glucose Dulbecco's Modified Eagle's Medium Sigma Aldrich D6429
Inverted Fluorescent Microscope Olympus IX83
JMP Pro Software SAS
Lambda 10-3 Motorized Filter Wheels Sutter Instruments LB10-NW
LambdaLS Arc Lamp with 300W Ozone-Free Xenon Bulb Sutter Instruments LS/OF30
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-027
MATLAB Software Mathworks
MEM Non-Essential Amino Acids Thermo Fisher 11140050
MetaMorph for Olympus Olympus
Micro-Humidification System Bioptechs 130708
MoFlo Astrios EQ Cell Sorter Beckman Coulter B25982
Objective Heater Medium Bioptechs 150819-13
OptiMEM Thermo Fisher 31985070
Phosphate Buffered Saline Sigma Aldrich D8537
pMD2.G Envelope Plasmid Addgene 12259
pRRL Vector gift from Dr. Kam Leong (Columbia University)
psPax2 Packaging Plasmid Addgene 12260
sCMOS ORCA-Flash4.0 V2 Camera Hamamatsu Photonics C11440-22CU
Sorvall Legend XT/XF Centrifuge Thermo Fisher 75004505
Stable Z Stage Warmer Bioptechs 403-1926
Venus Emission Filter Semrock FF01-571/72

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Medição da dinâmica de força-sensível da proteína em células vivas, usando uma combinação de técnicas fluorescentes
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Rothenberg, K. E., Puranam, I., Hoffman, B. D. Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques. J. Vis. Exp. (141), e58619, doi:10.3791/58619 (2018).More

Rothenberg, K. E., Puranam, I., Hoffman, B. D. Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques. J. Vis. Exp. (141), e58619, doi:10.3791/58619 (2018).

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