Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Meting van de kracht-gevoelige eiwitten Dynamics in levende cellen met behulp van een combinatie van Fluorescent technieken

Published: November 2, 2018 doi: 10.3791/58619
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, Duke University

Summary

Hier presenteren we een protocol voor het gelijktijdig gebruik van Förster resonance energie overdracht gebaseerde spanning sensoren voor het meten van eiwit belasting en fluorescentie herstel na photobleaching voor het meten van de dynamiek van de eiwitten waardoor de meting van kracht-gevoelige eiwit dynamiek binnen levende cellen.

Abstract

Cellen voelen en reageren op lichamelijke signalen in hun omgeving door het omzetten van de mechanische prikkels in biochemically-detecteerbare signalen in een proces genaamd mechanotransduction. Een cruciale stap in mechanotransduction is de overdracht van krachten tussen de externe en interne omgevingen. Voor het verzenden van krachten, moet er een aanhoudende, ononderbroken fysieke koppeling gemaakt door een reeks van eiwit-eiwitinteractie. Voor een bepaald eiwit-eiwit interactie, mechanische belasting kan ofwel geen invloed hebben op de interactie, leiden tot sneller scheiding van de interactie, of zelfs stabiliseren de interactie. Begrip van hoe moleculaire belasting dicteert eiwit omzet in levende cellen kan waardevolle informatie bieden over de mechanische staat van een eiwit, op zijn beurt het ophelderen van haar rol in mechanotransduction. Bestaande technieken voor het meten van de kracht-gevoelige eiwitten dynamics gebrek aan directe metingen van eiwit lading of vertrouwen op de metingen uitgevoerd buiten de cellulaire context. Hier beschrijven we een protocol voor de terugwinning van Förster resonance energie overdracht-fluorescentie na photobleaching (FRET-FRAP) techniek, waarmee de meting van kracht-gevoelige eiwitten dynamiek binnen levende cellen. Deze techniek geldt potentieel voor elke FRET gebaseerde spanning sensor, bevordering van de studie van kracht-gevoelige eiwitten dynamiek in verscheidenheid van subcellular structuren en in verschillende soorten cellen.

Introduction

De extracellulaire omgeving is een rijke bron van zowel de fysieke als de biochemische signalen die cel gedrag bepalen. Met name kan de fysieke aard van de communicatie bemiddelen belangrijke cellulaire functies, met inbegrip van de celgroei, migratie en differentiatie1,,2,,3,4. Disregulatie van de mechanica van de communicatie is een essentieel onderdeel te veel ziekten die nog geen voldoende behandelingen, zoals kanker5, atherosclerose6en7van de fibrose. Een volledig inzicht in hoe cellen converteren naar fysieke stimuli biochemically-detecteerbare signalen, een proces genoemd mechanotransduction, vereist de opheldering van het moleculaire mechanismen bemiddelen force transmission, zowel in als buiten de cellen en binnen meerdere subcellular structuren.

Binnen subcellular structuren, zijn eiwitten voortdurend draaien; binding en vrijblijvend gebaseerd op de sterkte van hun interacties met bindende partners8. Voor krachten toegezonden met succes over een fysieke afstand, moeten er een ongebroken ketting van eiwit-eiwitinteractie, wat betekent dat het een eiwit omzet langzaam genoeg moet te houden en te zenden van kracht tot en met haar bindende partner9. Terwijl eiwit-eiwitinteractie in het algemeen bestaan van verscheidene niet-covalente bindingen, met tussen de domeinen van de eiwitten, is de interactie vaak geconceptualiseerd als een gebonden staat die kan de overgang naar een niet-afhankelijke staat onder verschillende omstandigheden10, 11. voor een bepaald eiwit-eiwit interactie, is het mogelijk dat de kracht geen effect op de levensduur van de interactie hebben kan, bekend als een "ideale band", vermindering van de levensduur van de interactie, bekend als een "slip bond", of verhogen de levensduur van de interactie , bekend als een "vangst bond"10. Er is dus een ingewikkelde relatie tussen eiwit belasting en eiwit dynamiek, die wij kracht-gevoelige dynamiek noemen.

Naar het begrip van het effect van belasting op bond dynamiek, zijn een aantal zeer informatieve experimenten uitgevoerd op het niveau van de single-molecuul. Met geïsoleerde eiwitten of fragmenten van eiwitten en manipulatie technieken zoals magnetische pincet, optisch pincet en atomic force microscopie, deze studies hebben aangetoond dat kracht-gevoelige eiwit-eiwitinteractie voor diverse relevante eiwitten11,12. Beide integrins13 en cadherinen14, die zijn belangrijk voor het vormen van cel-cel en cel-matrix interacties, respectievelijk transmembraan eiwitten, is gebleken dat wijzigingen in dynamics verschuldigde te laden. Binnen de cel, vinculin tot en met beide talin15 en α-catenine16 is aangeworven in een kracht-afhankelijke manier en kan vormen een band van de vangst met actine17, die een cruciale rol voor vinculin op zowel focal verklevingen (FAs) en adherens verbindingen (AJs ) onder belasting. Single-molecuul studies toestaan voor de isolatie van specifieke eiwit-eiwitinteractie en eenduidige resultaten opleveren, maar ze geen rekening met de complexiteit van de cellulaire omgeving.

Landmark experimenten aangetoond dat verschillende subcellular structuren, met inbegrip van FAs en AJs, mechanosensitive en uitgebreide vergadering in reactie op intern gegenereerde of extern toegepast ladingen18,19, vertonen 20,21,22. Bovendien hebben verschillende theoretische modellen voorgesteld dat mechanosensitive vergadering kon worden gedreven door kracht-gevoelige eiwitten dynamics23,24,25. Om te onderzoeken deze kracht-gevoelige dynamiek binnen de levende cellen, zijn een paar indirecte benaderingen genomen. FRAP en verwante technieken bieden een relatief eenvoudige methodiek voor het meten van de dynamiek van eiwitten in cellen26,27,28,29. Echter is de meting van eiwit belasting meer beperkt gebleven. Een typische aanpak is het vergelijken van de dynamiek van eiwitten in cellen met en zonder de blootstelling aan een cytoskeletal-remmer gebruikt ter vermindering van de algemene cel contractility8,30,31. Conceptueel is dit een vergelijking tussen een hoge belasting en lage belasting staat. Echter, er is geen kwantificering van de belasting over de proteïne in beide staat, en kunnen er onbedoelde biochemische effecten van de Inhibitor van de omwenteling, die het verlies van belangrijke bandplaatsen langs een F-actine-filamenten. Een andere aanpak, specifiek voor FAs, geweest voor het meten van de totaalkracht inspanning op de drager vervagen door de FA gebruiken om tractie kracht microscopie geschatte moleculaire belasting te buigen over de relatie met de dynamiek van een enkele eiwit binnen de FA-32. Terwijl deze aanpak maakt het mogelijk voor de kwantificering van de totaalkracht, biedt het geen moleculair specifieke informatie. FAs zijn samengesteld uit meer dan 200 verschillende eiwitten, veel van die belasting33kunnen dragen. Zo mogelijk meten van de output van de totaalkracht van een FA verduistert de mogelijkheid van meerdere kracht transmissie opleidingstrajecten en biedt geen betrouwbaar een zekere mate van belasting op een specifiek eiwit.

In tegenstelling tot eerdere benaderingen in mechanobiology, de komst van de FRET gebaseerde spanning sensoren kan direct meting van lasten ondervinden specifieke proteïnen in levende cellen3635,34,. Hier presenteren we een protocol dat FRET gebaseerde spanning sensoren met FRAP gebaseerde maatregel van eiwit dynamiek combineert. We noemen deze techniek FRET-FRAP. Deze aanpak maakt het mogelijk de gelijktijdige meting van eiwit lading en de dynamiek van het eiwit, waardoor de beoordeling van de dynamiek van de kracht-gevoelige eiwitten in levende cellen (Figuur 1). Al, is de FRET-FRAP-techniek toegepast op de studie van de kracht-gevoelige dynamiek van de mechanische linker eiwit vinculin37. Spanning sensoren zijn ontwikkeld voor talrijke proteïnen die relevant voor een verscheidenheid van subcellular structuren zijn. Bijvoorbeeld zijn sensoren ontwikkeld voor vinculin34 en talin38,39 in FAs, cadherinen en catenins in AJs40,41,42, nesprin in de nucleaire LINC complex 43, α-actinin44 en filamin36 in het cytoskelet en MUC-1 in de glycocalyx45, o.a.46. FRAP is ook dat een veelgebruikte techniek heeft geweest tweedehands voort mechanosensitive eiwitten binnen de focal verklevingen8,31, adherens kruispunten47actine cortex26en nucleus48. Vooruit, dat de FRET-FRAP techniek gelden in grote lijnen om het even welk van deze bestaande sensoren of nieuw ontwikkelde sensoren, waardoor voor de meting van de kracht-gevoelige dynamiek in een breed scala aan subcellular structuren en contexten. Voor dit doel bieden wij een gedetailleerde, gegeneraliseerde protocol voor de uitvoering van de FRET-FRAP techniek die van toepassing zijn in deze verschillende stelsels. Hopelijk, zal hierdoor een breed scala aan experimenten ophelderen van de functies van verschillende mechanosensitive eiwitten bij het reguleren van de transmissie van kracht en in het bemiddelen van cel gedrag.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. het genereren van monsters voor Imaging

  1. Sensor-constructie stabiel uitdrukkelijke spanning in gewenste celtype.
    1. Clone spanning sensor construct in pRRL vector- of andere virale expressie plasmide.
      Opmerking: Verscheidene verschillende moleculaire klonen hulpmiddelen zijn beschikbaar voor het bereiken van deze stap met inbegrip van het gebruik van enzymen van de beperking, extensie, en Gibson vergadering35laat overlappen. De vector pRRL wordt gebruikt in lenti virale transductie en kan een aanzienlijke mate van de productie van eiwitten door middel van de promotor van de menselijke cytomegalovirus (CMV). Verschillende vectoren kunnen nodig zijn voor een bepaalde context. Bijvoorbeeld, is de promotor CMV in sommige cel typen49tot zwijgen gebracht. Bovendien kan alleen FRET gebaseerde sensoren die fluorescerende eiwitten bevatten dat gebrek aan sterke reeks homologie, zoals mTFP1 en Venus A206K, worden gebruikt om stabiele cellijnen. Sensoren met cyaan fluorescent proteïne en gele fluorescerende proteïne zal waarschijnlijk onderworpen van homologe recombinatie50.
    2. Genereren lentivirus in menselijke embryonale nier (HEK) 293T cellen met behulp van psPax2 en pMD2.G verpakking plasmiden met behulp van standaard virus productie methoden51.
      Let op: Lentivirus moet alleen worden verwerkt door goed opgeleid personeel in een testomgeving voor bioveiligheid niveau 2.
      Opmerking: Deze combinatie van cellen en verpakking plasmiden is geschikt voor gebruik met pRRL. Andere systemen kunnen worden verlangd met andere vectoren.
    3. Transduce gewenste cellen met virus met behulp van standaard transductie protocollen52 en stroom cytometry gebruiken voor het sorteren van cellen53 selecteren een homogene bevolking uiting van elke constructie op ongeveer endogene niveaus37. Na de celselectie, experimenten kunnen onmiddellijk worden uitgevoerd of cellen kunnen diepgevroren ingevroren worden voor later gebruik. 2 bevriezen-ontdooien cycli voor een bepaalde stabiele cellijn niet overschrijden.
      Opmerking: Het gebruik van cellijnen tekort aan het eiwit te worden bestudeerd (bijvoorbeeldvinculin- / - MEFs voor het gebruik met de sensor van de spanning vinculin) zal het signaal ruisverhouding in FRET experimenten, alsmede het beperken van overmatige expressie artefacten toenemen. Dergelijke stabiele muis embryonale fibroblast (MEF) lijnen kunnen worden gebruikt voor ongeveer 15 passages voor verlies van meningsuiting of afbraak van sensoren is herkenbaar. Als virale gebaseerde methoden niet gewenst zijn, kan een overvloed aan commerciële reagentia volgens protocol van de fabrikant worden gebruikt voor Transient allerlei celtypes transfect met spanning sensoren in een passende plasmide, zoals pcDNA3.1. Optimale expressie zullen 24-48 h na transfectie.
  2. Voorbereiden op substraten cel zaaien.
    1. Verwerven 4, 35 mm glassbottom gerechten.
    2. Werken in een cel cultuur kap, in een canonieke tube van 15 mL, breng 4 mL 10 µg/mL fibronectine in-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) oplossing met behulp van steriele PBS in de cel cultuur kap. Voorzichtig omkeren de buis opnieuw om te mengen en laat de oplossing gedurende 5 min. in de cel cultuur kap zitten.
      Opmerking: De concentratie of de soort ECM eiwit wellicht worden aangepast voor andere celtypes. De voorwaarden zijn geschikt voor MEFs.
    3. Pipetteer 1 mL van fibronectine oplossing op elk gerecht glassbottom.
    4. Laat de fibronectine oplossing op de gerechten gedurende 1 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C.
    5. De fibronectine oplossing gecombineerd, spoel één keer met PBS en voeg 1 mL PBS.
  3. Zaad de cellen op de voorbereide ondergronden.
    1. Begin met de cellen van belang bij een samenvloeiing percentage geschikt is voor subcultivation in een 6 cm cultuur schotel.
      Opmerking: Verschillende soorten cellen zal vereisen verschillende cel kweekomstandigheden en subcultivation protocollen. Deze sectie bevat richtlijnen geschikt voor MEFs. MEFs worden meestal gekweekt tot 85% samenkomst vóór subcultivation.
    2. Werken binnen een cel cultuur kap, spoel de cellen een keer met 3 mL PBS. Voeg vervolgens 1 mL van 0,05% trypsine-EDTA en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 ° C.
    3. Voeg 3 mL van volledige media toe aan de 6 cm schotel, de cellen verzamelen en breng in een conische tube van 15 mL.
      Opmerking: Compositie voor volledige media zal afhangen van het celtype wordt gebruikt. Voor MEFs, volledige media vaak gedefinieerd als de hoge glucose Dulbecco bewerkt Eagle Medium met de foetale runderserum 10%, 1% antibioticum-Antimycotic (met amfotericine B, penicilline en streptomycine), en een 1%-oplossing van niet-essentiële aminozuur (NEAA).
    4. Draai de cellen naar beneden bij 1000 x g gedurende 5 min.
    5. De media gecombineerd en resuspendeer de cel pellet in 1 mL van de volledige media.
    6. Verwijderen van PBS van fibronectine beklede glas gerechten. Cellen tellen en zaad van 30.000 cellen op elk gerecht fibronectine-gecoat glas met de juiste volledige media voor een eindvolume van 1,5 mL.
      Opmerking: Deze celdichtheid is geschikt voor MEFs en zal leiden tot een bevolking van cellen die niet aanraken, maar niet buitengewoon schaars zijn. De exacte celaantal wellicht worden aangepast voor andere celtypes of andere imaging kamer.
    7. De cellen te verspreiden voor 4 h na zaaien toestaan. 2 h van verspreiding, gecombineerd de groei media en eens spoelen met imaging media, verlaten van 1,5 mL imaging media.
      Opmerking: Ditmaal verspreiding is geschikt voor MEFs, maar wellicht worden gewijzigd voor andere cellen. Echter zal incubatie perioden van langer dan 6-8 h leiden tot de belangrijke afzetting van ECM eiwit van serum in de volledige media. Imaging media moet bevatten de dezelfde toevoegingen als volledige media maar moet optisch duidelijk en niet alle verbindingen die in imaging kanalen, zoals flavins fluoresceren, bevatten of quench fluorescentie, zoals fenol rood. Een over het algemeen nuttig imaging media is DMEM-gfp Live cel Visualization media aangevuld met 10% FBS en 1% NEAA-oplossing. Als achtergrond autofluorescence onaanvaardbaar hoog is, dan is de hoeveelheid serum kan worden verminderd. Als een wijziging van de media niet mogelijk na het eerste laagje is, kunnen de cellen direct worden resuspended in de media, aangevuld met een trypsine-remmer imaging.

2. opzetten van Microscoop voor Imaging

  1. Inschakelen van de Microscoop.
    1. De booglamp eerst inschakelen.
      Opmerking: Een booglamp zal het vrijgeven van een elektromagnetische puls, die andere apparatuur die nog op kunnen beschadigen.
    2. Zet de filter wiel controller, geautomatiseerde fase controller, Microscoop-computer interface en camera.
    3. Zet de FRAP-laser en laser positie controllers.
      Let op: High-powered lasers kunnen schadelijk zijn voor ogen als direct bekeken. Het is aanbevolen om het systeem van de Microscoop te blokkeren laser excitatie van wordt omgeleid naar de stukken van het oog, die kunnen worden bereikt door het bewegen van een spiegel in de richting van de lichtbundel FRAP tijdens bleken te weerspiegelen de laser naar het monster en voorkoming van de overdracht configureren om het oculair.
    4. Zet de computer en de software van de controle open Microscoop.
    5. Laat 15 min. voor de booglamp en FRAP laser om op te warmen.
  2. Kalibreer de FRAP-laser.
    1. Open het venster van de configuratie van de laser. Instellen Verlichting (tijdens puls) naar de juiste FRAP verlichting instellingen voor laser blootstelling aan het monster. Stel Verlichting instelling (tijdens imaging) op de verlichting instellingen geschikt is voor alleen de acceptor fluorophore imaging.
    2. Selecteer het doel om te kalibreren onder Coördinatensysteem instelling. Uncheck Kalibratiepunten handmatig klikken en weergave beelden tijdens de kalibratiecontroleren.
    3. Stel de Nadruktijd aan 10.000 µs en het aantal pulsen tot 100.
    4. Plaats de kalibratie-dia, gemaakt van ethidiumbromide verzegeld tussen een glasplaatje en een dekglaasje aan, in de fase-adapter met het dekglaasje aan zijde naar beneden.
      Let op: Ethidiumbromide is een mutagene stof en moet worden behandeld met behulp van handschoenen. Als de dia wordt gecompromitteerd, afvoeren volgens de richtlijnen van de instelling.
    5. Gebruik de acceptor verlichting instellingen te richten op het oppervlak van de dia, identificeerbaar zijn als het brandvlak met het helderste signaal. Kleine gebreken in de coating is zichtbaar voor hulp bij het scherpstellen.
    6. De dia verplaatst naar een gebied met uniforme fluorescentie over de beeldvorming vliegtuig.
    7. Klik op het maken van de instelling. De software zal het kalibratieproces, automatisch bleken en opsporing van de positie van de gebleekte punt initialiseren.
    8. Zorgen voor succesvolle kalibratie door de beoordeling van het definitieve beeld, die zal worden een raster van 3 x 3 van gebleekte punten die moeten worden verdeeld en in beeld. De kalibratie afbeelding opslaan voor toekomstig gebruik.
    9. De kalibratie dia verwijderen en veilig opslaan. Kalibratie moet worden uitgevoerd voordat u begint met elk experiment maar hoeft niet te worden uitgevoerd tussen de monsters.

3. Kies Parameters voor FRET Imaging

  1. Fix een van de gegenereerde monsters van de cellen, uiting geven aan de sensor van de spanning met 4% paraformaldehyde voor 10 min. Paraformaldehyde oplossing moet methanol vrij, vaak aangeduid als EM-rang, om te voorkomen dat de denaturering van fluorescente proteïnen. Plaats in PBS na fixatie.
    Let op: Paraformaldehyde oplossingen zijn giftig. Deze stap moet worden uitgevoerd in een zuurkast en de oplossing volgens institutioneel beleid moet worden verwijderd.
    Opmerking: Deze optimalisatie niet afhankelijk proteïne dynamiek, en een vaste monster zorgt voor maximale imaging tijd zonder zorgen te maken over de gezondheid van de cel.
  2. Spoel het monster driemaal met PBS en laat in PBS.
    Opmerking: Gebruik van meest verkrijgbare montage media zal invloed hebben op fluorophore eigenschappen, het monster ongeschikt maken voor FRET imaging54. Idealiter de cellen direct beeld zal worden, maar 's nachts kunnen achterblijven bij 4 ° C. Langere wachttijden zal resulteren in de aantasting van het monster.
  3. Leg het monster in de Microscoop fase houder voor imaging.
  4. Open het hulpprogramma multidimensionale acquisitie (MDA). Vaststellen van een sequentiële beeldvorming van drie kanalen: acceptor enige excitatie en emissie (acceptor kanaal), excitatie van de donor en acceptor emissie (FRET kanaal), en donor enige excitatie en emissie (donor kanaal).
    Opmerking: Er zijn een verscheidenheid van manieren om beeld FRET monsters. De methode van het drie-kanaals of "drie-kubus" voor imaging gekoppeld aan middelen voor kalibratie van het systeem voor het meten van de FRET efficiëntie wordt aanbevolen voor FRET gebaseerde spanning sensoren55,56. Deze aanpak is snel, eenvoudig, niet-destructieve, alleen een standaard fluorescentie Microscoop imaging vereist en maakt de vergelijking van experimenten over verschillende dagen en imaging opstellingen.
  5. Scannen van het monster met behulp van een belichtingstijd van 500 ms en een filter met neutrale dichtheid (ND) van 10%. Een cel uiting van de spanning-sensor met duidelijke lokalisatie naar een structuur van belang vinden.
  6. Selecteer een belichtingstijd van 500 ms of de gewenste lengte voor elk imaging kanaal en een ND filter van 100% en het verwerven van een FRET Afbeeldingsvolgorde.
  7. Schatten de gemiddelde intensiteit van de sensor op de subcellular structuren van belang in elk imaging kanaal. Lage signalen kunnen leiden tot onjuiste resultaten als gevolg van onjuiste correctie schattingen, niet-lineariteiten in detectoren, of aanzienlijke bijdrage van achtergrond signalen. Een geschatte richtsnoer is te streven naar intensiteiten boven 10% van het dynamisch bereik van de camera (dwz., voor een 16-bits camera, intensiteiten moet boven 6000).
    Opmerking: Identieke optische instellingen (belichtingstijden, filters, doelstellingen en andere variabelen zoals camera winst of weggooien) moeten worden gebruikt voor alle FRET experimenten die moeten worden vergeleken. Wisseling ieder van deze instellingen zal leiden tot een wijziging in het bedrag van de FRET die is gegenereerd en/of gedetecteerd in de microscopie set-up. FRET efficiëntie metingen zijn onafhankelijk van deze instelling, maar de calibratie factoren gebruikt om te bepalen van de efficiëntie van de FRET zijn niet. In theorie, verschillende sets van kalibratie factoren kunnen worden gebruikt voor het genereren van FRET efficiëntie van verschillende optische instellingen, maar dit wordt niet aanbevolen. Bleken of fototoxiciteit kunnen verschillen tussen de diverse instellingen, maken valse resultaten zijn.
  8. Verwerven van een tweede reeks van de afbeeldingen van de FRET van het hetzelfde gezichtsveld. Schatting photobleaching tussen frames door het vergelijken van de gemiddelde intensiteit van de sensor in elke imaging kanaal. Photobleaching moet tot een minimum, bij voorkeur minder dan 1-5% verlies van signaal worden beperkt.
  9. Aanpassen van de imaging parameters om de intensiteit te maximaliseren terwijl het minimaliseren van photobleaching. Voor grof aanpassingen wijzigen de ND-filter tijdens de overname wordt gebruikt. Voor fijnere aanpassingen wijzigen de belichtingstijd in stappen van 250 ms.
  10. Herhaal de stappen 3.5 – 3,8 om voldoende signaal kan worden verkregen, terwijl het minimaliseren van photobleaching.
    Opmerking: Instellingen voor de vinculin spanning sensor in vinculin- / - MEFs zijn meestal 1.500 ms, 1.500 ms en 1000 ms voor de donor, FRET, en acceptor kanalen respectievelijk. De optimale waarden zal variëren met het soort verlichting systeem, doelstelling, filter sets en sensor expressie niveau.

4. Kies Parameters voor FRAP Imaging

  1. Optimaliseer de instellingen van de laser om ervoor te zorgen volledige bleken voor de regio van belang (ROI) zonder bleken de omgeving of photodamage te veroorzaken.
    1. Vast een van de gegenereerde monsters van de cellen, uiting geven aan de sensor van de spanning met 4% paraformaldehyde gedurende 10 minuten.
      Opmerking: Deze optimalisatie niet afhankelijk proteïne dynamiek, en een vaste monster zorgt voor maximale imaging tijd zonder zorgen te maken over de gezondheid van de cel. Hiermee wordt ook voorkomen dat het herstel van bleken door mobiele eiwitten, waardoor het isolement van het effect van het bleken, het vermijden van eventuele effecten van snelle, diffusie-gemedieerde fluorescentie herstel tussen de incidentie van bleken en het nemen van de eerste post bleekmiddel afbeelding.
      Let op: Paraformaldehyde oplossingen zijn giftig. Deze stap moet worden uitgevoerd in een zuurkast en de oplossing volgens institutioneel beleid moet worden verwijderd.
    2. Spoel het monster 3 keer met PBS en laat in PBS.
      Opmerking: Het gebruik van de meeste commercieel beschikbare montage media zal invloed hebben op fluorophore eigenschappen, waardoor het monster ongeschikt voor FRAP imaging54. Idealiter de cellen direct beeld zal worden, maar 's nachts kunnen achterblijven bij 4 ° C. Langere wachttijden zal resulteren in de aantasting van het monster.
    3. Leg het monster in de Microscoop fase houder voor imaging.
    4. Open het venster van de configuratie van de laser. Beginnen met het opzetten van een laser Nadruktijd van 1000 µs en 10 pulsen, wat betekent dat elke plek in de scan over de ROI 10.000 µs van full-power laser ontvangt
      Opmerking: Een 500 mW, 515 nm laser werd gebruikt voor het bleken. Dit werd gekozen om selectief bleekmiddel Venus A206K, de acceptor in vinculin spanning sensor, met maximale efficiëntie. Als FRET gebaseerde spanning sensoren met andere tl eiwitten worden gebruikt, kan een ander type laser moet worden ingezet.
    5. Een cel uiting van de spanning-sensor met duidelijke lokalisatie naar een structuur van belang vinden en het verwerven van een afbeelding.
    6. Teken een rechthoekige ROI waarin het gebied om te bleken en de ROI-locatie is opgeslagen. Pulse de laser. Een ander beeld van het monster worden uitgelijnd.
      Opmerking: De grootte van de doos moet ongeveer de grootte van de gehele FA. Worden moet gezorgd dat het vak grootte niet drastisch in experimenten verandert. Het gebleekte gebied moet zorgvuldig worden bewaakt in eiwitten waarvan dynamiek worden beïnvloed door diffusie. Dit is een potentiële zorg in transmembraan eiwitten, zoals cadherinen47, of eiwitten die diffuse langzaam27,,57.
    7. De kwaliteit van photobleaching controleren door te controleren dat de gehele ROI is gebleekt, zodanig dat de intensiteit in de buurt van achtergrondconcentraties is. Controleer ook of er is geen bleken buiten de ROI.
    8. De laser-instellingen aanpassen zoals die nodig zijn om een aanzienlijke hoeveelheid bleken binnen de ROI zonder significante bleken buiten de ROI. Voor grof aanpassingen, verhogen en verlagen van de nadruktijd in stappen van 100 µs en fijne aanpassingen, verhogen en verlagen van het aantal pulsen in stappen van 5 pulsen.
    9. Herhaal stap 4.1.5 – 4.1.8 tot het bereiken van de minimale instellingen waartegen de ROI volledig zonder af-target photobleaching gebleekt is.
      Opmerking: Het bereiken van een substantiële bleken beginwaarde zonder inducerende fototoxiciteit is een belangrijk aspect van FRAP analyse. De laser-instellingen gebruikt die leiden een volledige bleekmiddel in de vaste monsters tot. In het algemeen, moet het minimale aantal fotonen worden gebruikt om de gewenste bleken niveau te bereiken. Ook, het bleken protocol moet blijven relatief consistente tijdens experimenten, zoals wijzigingen kunnen invloed hebben op metingen van eiwit dynamics58.
  2. Time-lapse parameters om de dynamiek van de proteïne van belang volledig te vangen terwijl het minimaliseren van photobleaching optimaliseren.
    1. De microscopie set-up voorbereiden op levende cel imaging, bij voorkeur met een verwarmde fase en de doelstelling alsmede CO2 controle. Laat equilibreer gedurende 20 min.
      Opmerking: Om te handhaven van de gezondheid van de verbeelde cellen, temperatuur en pH moeten worden gehandhaafd in de beeldvorming vaartuig. Een verscheidenheid van verwarmde etappes en objectieve kachels kunt gemakkelijk de handhaving van de temperaturen van de cel bij 37 ° C. De controle van pH voor vele types van media kan worden bereikt door het gebruik van een peristaltische pomp tot pass bevochtigde 5% CO,2 over het monster bij 15 mL/min. als alternatief, als CO2 controle niet beschikbaar is, live media met HEPES imaging moet worden gebruikt om grote pH wijzigingen verhinderen.
    2. Plaats een van de gegenereerde monsters van de cellen, uiting van de spanning-sensor in de Microscoop fase houder voor imaging. Laat equilibreer gedurende 10 min.
    3. Met het gereedschap MDA instellen een time-lapse verwerven van 3-5 afbeeldingen vooraf bleekmiddel, bleken de ROI en blijven 10-60 opnamen.
      Opmerking: Voor vinculin op FAs, imaging elke 5 s voor 5 min na bleekmiddel is voldoende om de dynamiek te observeren zonder de invoering van buitensporige bleken31. Nuttige uitgangspunten voor imaging tarief en duur voor vele andere eiwitten kunnen worden gevonden in de literatuur47,48,59,60.
    4. Gebruik instellingen die het minimaliseren van de blootstelling van het monster aan het licht, met behoud van een voldoende signaal-ruisverhouding, naar de structuur van belang image imaging acceptor. Een goed startpunt is de helft van de ND filter en blootstelling tijd die nodig is voor de beeldvorming van de acceptor tijdens FRET.
    5. Zoek een uiting van de spanning-sensor met duidelijke lokalisatie naar een structuur van belang en uitlijnen van een afbeelding.
    6. Teken een rechthoekige ROI om te markeren waar het bleekmiddel en de ROI-locatie is opgeslagen. De time-lapse starten.
    7. De resulterende reeks beelden voor potentiële problemen te onderzoeken.
      1. Als er belangrijke sprongen (groter dan 10% van de initiële intensiteit) in fluorescentie herstel tussen frames, verminderen de tijd-stap tussen frames.
      2. Als er een wereldwijde verlies aan fluorescentie na verloop van tijd (meer dan 5-10% van de initiële intensiteit), verminderen van het aantal opnamen na bleekmiddel en/of wijzigen van de grafische instellingen ter vermindering van de blootstelling van het monster aan het licht.
      3. Als fluorescentie herstel heeft niet door het einde van de time-lapse plateaued, verhogen de totale lengte van de tijd-tijdspanne.
    8. De time-lapse parameters dienovereenkomstig aan te passen en herhaal stap 4.2.5 – 4.2.7 totdat het herstel van de fluorescentie adequaat zonder globale foto-schade aan het monster is gevangen.

5. het verwerven van gegevens FRET-FRAP

  1. De microscopie set-up voorbereiden op levende cel imaging, bij voorkeur met een verwarmde fase en de doelstelling alsmede CO2 controle. Laat equilibreer gedurende 20 min.
    1. Om te zorgen voor de gezondheid van de verbeelde cellen, handhaving van de temperaturen bij 37 ° C in de beeldvorming zaal. Gebruik een peristaltische pomp geschiedde bevochtigde 5% CO2 over het monster bij 15 mL/min te houden van de pH.
    2. Alternatief, als CO2 controle niet beschikbaar is, gebruiken levende imaging media met HEPES om te voorkomen dat grote pH-veranderingen.
  2. Open het hulpprogramma MDA en ingesteld met FRET imaging parameters, met inbegrip van de verschillende filter sets.
  3. Sla deze MDA naar de experimentele map met de naam van MDA_FRET_Date.
  4. Instellen een andere MDA met FRAP imaging parameters, waaronder de verschillende filter sets, de time-lapse-instellingen en het dagboek de laser pulse na de overname van de pre bleekmiddel.
  5. Sla deze MDA naar de experimentele map met de naam van MDA_FRAP_Date. Sluit het venster MDA.
  6. Selecteer in de werkbalk boven aan het scherm, Journal | De opname te starten.
  7. Open het venster MDA, laden van de MDA_FRET_Date staat en druk op ophalen. Dan laden de MDA_FRAP_Date staat en druk op ophalen.
  8. Aan het einde van de overname, in de werkbalk boven aan het scherm, selecteer Journal | Opname stoppen.
  9. Sla dit dagboek naar de experimentele map met de naam van FRETFRAP_Date en toevoegen aan een werkbalk voor gemakkelijke toegang. Sluit het venster MDA.
  10. Plaats een van de gegenereerde monsters van de cellen, uiting van de spanning-sensor in de houder van de Microscoop voor imaging. Laat equilibreer gedurende 10 min.
  11. Navigeren van het monster met behulp van de Beeldacquisitie onder ophaal | Verwerven met minimale blootstelling tijd en ND filter voor het identificeren van de cellen van belang.
  12. Continue autofocus ingesteld door te navigeren naar apparaten | Focus. Handmatig scherpstellen op het monster tot het bereiken van de juiste beeldvorming vliegtuig.
  13. Klik Continue scherpstelling ingesteld, wacht tot het systeem aan te passen en op Start continu scherpstellen.
    Opmerking: Dit is niet vereist, maar aanzienlijk verbetert kwaliteit van FRAP herstel curven omdat het voorkomt het monster dat van het drijven van out-of-focus.
  14. Zoek een uiting van de spanning-sensor met duidelijke lokalisatie naar een structuur van belang en uitlijnen van een afbeelding.
  15. Teken een rechthoekige ROI om te markeren waar te bleken. De ROI-locatie is opgeslagen.
  16. Het tijdschrift van de FRETFRAP_Date , die met de overname van beelden van de FRET gevolgd door de initialisatie van de time-lapse FRAP beginnen zal initialiseren.
  17. Herhaal stap 5.14-5.16 tot 10-15 afbeelding sets zijn verworven.
    Opmerking: Meting kan niet herhaald worden in dezelfde cel. Zodra photobleaching optreedt, is de FRET gegevens onbetrouwbaar.

6. Analyseer gegevens FRET-FRAP

  1. Het analyseren van de beelden van de FRET met behulp van de software van keuze.
    Opmerking: Er zijn verschillende manieren om beeld- en FRET61, met inbegrip van ratiometric FRET62 en FRET index34,35te kwantificeren. Het is echter sterk aanbevolen om het gebruik van de raming van de FRET efficiëntie55,63 voor de interpretatie van de FRET-FRAP gegevens. Zie het onderwerp voor verdere verkenning van dit onderwerp. Voor gesensibiliseerde emissie en berekening van de efficiëntie van de FRET is aangepaste software verkrijgbaar bij de Hoffman Lab op https://gitlab.oit.duke.edu/HoffmanLab-Public.
  2. Kwantificeren van relevante parameters voor elke subcellular structuur die werd gebleekt. Dit gemiddelde FRET index/efficiëntie en gemiddelde eerste acceptor intensiteit (evenredig aan concentratie) moet omvatten maar ook fysieke parameters zoals de grootte van de ROI.
  3. Het analyseren van de beelden van de FRAP met behulp van de software van keuze.
    Opmerking: Er zijn verschillende manieren om te kwantificeren FRAP26,27,28,29. Voornaamste experimentele zorgen zijn boekhouding voor bleken tijdens post bleekmiddel imaging, wijzigingen in de achtergrond intensiteit en translocatie van hoogdynamische subcellular structuren, zoals focal verklevingen. Bleken van correcties en variaties in de achtergrondverlichting kan worden bereikt door de analyse van niet-gebleekt en niet-belichting fluorescerende regio's van de beelden. Hoogdynamische subcellular structuren, met name de buitensporige groei of demontage dynamiek zijn niet compatibel met standaard FRAP analyses en moeten niet worden geanalyseerd. Daarnaast zijn er een aantal manieren om te normaliseren van de gegevens. De gegeven richtlijnen hebben betrekking op de eenvoudigste analyse.
  4. Corrigeer de terugwinning van gegevens voor effecten bleken en vervolgens normaliseren om vooraf bleekmiddel intensiteiten. De helft van de tijd van herstel en de mobiele fractie volgens de volgende vergelijking28,34te kwantificeren:
    MF - (MF - R-o) e-kt
    waar MF is de mobiele breuk, Ro is het eerste herstel, en k is terugbezorgd. De helft van de tijd van het herstel wordt bepaald door:
    Τ1/2 = ln 2/k.
    Opmerking: Er zijn een verscheidenheid van openbaar-beschikbare softwarepakketten voor het voltooien van deze analyses64 , evenals een scala aan ImageJ plugins. Aangepaste software is verkrijgbaar bij de Hoffman Lab op https://gitlab.oit.duke.edu/HoffmanLab-Public. Meer analyses moeten worden gebruikt voor de situaties waar de verspreiding van invloed is op de dynamiek van de proteïne van belang, meerdere tijdschema's zijn herkenbaar in het herstel, of niet-standaard bleken geometrieën worden gebruikt.

7. interpret FRET-FRAP gegevens

  1. Compileren van relevante informatie voor elke ROI, met inbegrip van: FRET index/efficiëntie, acceptor intensiteit, FRAP halftijds, FRAP mobiele gedeelte.
    Opmerking: FRET index of efficiëntie wordt gebruikt om te bepalen van de gemiddelde belasting over het eiwit binnen de ROI. Intensiteit van de acceptor meet de plaatselijke concentratie van het eiwit. De helft van de tijd van herstel is een maatregel van eiwit dynamiek. Een kleinere halftijds geeft sneller omzet. FRAP mobiele breuk meet de hoeveelheid eiwit binnen de ROI dat draait actief over. Een grotere mobiele fractie geeft aan dat een groter percentage van de eiwitten binnen de ROI is draaien.
  2. Om het effect van lokale concentratie op Verwerkingsfrequentie van eiwit en bedrag probe, plot FRAP halftijds en mobiele fractie tegen de eerste acceptor intensiteit.
  3. Om het effect van eiwit belasting op Verwerkingsfrequentie van eiwit en bedrag probe, plot FRAP halftijds en mobiele fractie tegen FRET index/prestatie.
    Opmerking: Afhankelijk van het eiwit of structuur, het kan ook zijn interessant om te onderzoeken van de effecten van fysieke parameters, zoals de grootte van de structuur of de excentriciteit, op eiwit belasting of omzet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

FRET-FRAP bestaat uit de combinatie van twee fluorescerende technieken, FRET en FRAP. Zoals we op de gevolgen van eiwit belasting gericht, we gebruikten FRET gebaseerde spanning sensoren34,46. Deze sensoren zijn vaak gebaseerd op een spanning sensing module bestaande uit twee fluorescente proteïnen, zoals mTFP1 en VenusA206K, verbonden door een flagelliform linker (figuur 1A). Wanneer de module wordt geplaatst tussen de kop en staart domeinen van een eiwit, is het mogelijk om te meten van de belasting over de proteïne. Bij het analyseren van gegevens van de FRET, beelden genomen in het kanaal van de acceptor worden gebruikt voor het beoordelen van spanningen sensor lokalisatie en concentratie, als dit signaal is onafhankelijk van de FRET (figuur 1B). Na de berekening van de efficiëntie van de FRET, kan eiwit belasting worden gevisualiseerd op een colorimetrische schaal waar een afname van de efficiëntie van de FRET naar koelere kleuren geeft een toename van eiwit belasting en FRET efficiëntie in het rode bereik geven laag eiwitgehalte belasting ( Figuur 1B). FRAP imaging wordt uitgevoerd met behulp van een laser om te bleken de acceptor-fluorophore in een enkele subcellular structuur en monitor herstel na verloop van tijd (Figuur 1 c). De resulterende genormaliseerde FRAP curve kan worden geanalyseerd om uit te pakken van de parameters met een beschrijving van de dynamiek van de eiwitten, met inbegrip van de helft van de tijd van herstel en mobiele breuk (Figuur 1 d). Omdat FRET en FRAP analyses werden uitgevoerd op dezelfde cel, de gemiddelde eiwit belasting en de omzet in een subcellular structuur kunnen worden uitgezet als één aanspreekpunt. Meerdere cellen Imaging levert meerdere punten en een opkomende trend kunt aangeven of een eiwit is gedestabiliseerd (figuur 1E) of gestabiliseerd door moleculaire belasting (figuur 1F).

De vinculin spanning sensor (VinTS) stabiel uitgedrukt in vinculin null MEFs heel duidelijk lokaliseert aan FAs verspreid over de cel, zoals gezien door te kijken naar de acceptor kanaal afbeelding (figuur 2A). De acceptor kanaal afbeelding wordt gebruikt voor het maken van een segmentatie masker waarmee elke afzonderlijke FA met een unieke ID, visueel aangewezen door verschillende kleuren (figuur 2B). Het algoritme van de segmentatie is gebaseerd op de "water"-methode en etiketten de FAs ongeveer in de volgorde van helderheid, als eerder beschreven34,65. De segmentatie resultaten worden geconverteerd naar een binair masker die vervolgens op de FRET efficiëntie resultaten (figuur 2C toegepast wordt), en de gemiddelde efficiëntie van de FRET binnen elke unieke FA wordt berekend (figuur 2D). Aanvullende eigenschappen kunnen worden berekend voor elk VA-op een vergelijkbare manier, met inbegrip van gemiddelde acceptor intensiteit, omvang, excentriciteit en locatie binnen de cel. Op deze manier kan welke FA is gekozen voor FRAP worden afgestemd op de unieke ID van de FA en de bijbehorende eigenschappen.

FRAP beeldvorming en analyse is gevoelig voor diverse factoren die kunnen worden gecontroleerd, met inbegrip van de laser en imaging parameters, en sommige factoren die niet kunnen worden gecontroleerd, zoals algemene FA stabiliteit26,27,28, 29. Bijvoorbeeld, kan teveel blootstelling aan het licht tijdens de time-lapse beeldvorming leiden tot grote problemen bij de interpretatie van FRAP gegevens. Hoewel de analyse van besturingselement FAs die waren niet gebleekt kan worden gebruikt om te normaliseren voor kleine photobleaching na verloop van tijd met teveel blootstelling van het monster aan het licht, de resulterende FRAP-curve toont een eerste herstel gevolgd door een duik in genormaliseerde intensiteit die niet worden nauwkeurig past met een exponentiële functie. Als dit effect consequent in de gegevens waargenomen wordt, is het noodzakelijk om opnieuw het optimaliseren van de imaging parameters te verminderen blootstellingstijd, de tijd-stap tussen imaging frames vergroten of verlagen van de lengte van de tijd-tijdspanne te verminderen van de blootstelling van het monster aan het licht.

Een ander voorbeeld van FRAP-gegevens die uninterpretable is, is wanneer de FA dat photobleached was translocates snel tijdens herstel28. Een representatieve geval van buitensporige translocatie is afgebeeld in Figuur 3. De eerste afbeelding, geeft waar de ROIs worden gekozen, geen indicatie van FA stabiliteit (figuur 3A). Monitoring van de gebleekte FA na verloop van tijd, het snel beweegt uit de buurt van de aanvankelijke positie en het geautomatiseerde volgen niet onmiddellijk volgen als gevolg van de lage fluorescent signaal na photobleaching (figuur 3A). De resulterende FRAP-curve toont een eerste fase van lichte herstel met een sprong wanneer de fluorescentie is voldoende voor de software op te sporen van de FA en verplaatsen van de ROI (figuur 3B) hersteld. Deze curve worden niet met succes past door een exponentiële functie. De snelle translocatie voor de FA suggereert ook dat de structuur van de FA unstable. Unstable FAs moeten dus niet worden opgenomen in dezelfde FRET-FRAP analyse als stabiele FAs, te wijten aan zowel de technische als de biologische problemen.

Met bevredigende FRET en FRAP gegevens, de volgende stap is de voltooiing van de FRET-FRAP-analyse door gelijktijdig beoordeling van eiwit belasting en dynamiek. Figuur 4A toont de FRET efficiëntie kaarten van drie vinculin null MEFs VinTS stabiel te uiten. De FAs geschetst in wit werden gekozen voor FRAP analyse en de intensiteit van de acceptor worden getoond na verloop van tijd. Deze drie FAs hebben vinculin onder verschillende hoeveelheden laden en weergeven van een herstel-Profiel van verschillende vinculin. Kwantificeren van deze eigenschappen door berekening van de helft van de tijd van herstel en samenzwering tegen de gemiddelde efficiëntie van de FRET in elk VA-toont de algemene trend van vinculin wordt gestabiliseerd door toegenomen belasting (figuur 4B). De mobiele breuk afgeplot tegen de FRET efficiëntie blijkt echter geen trend, suggereren dat mobiele breuk wordt niet geregeld door moleculaire belasting (figuur 4C). Invoering van een mutatie van de punt in de VinTS op aminozuur 50 (A50I) is gebleken om te voorkomen dat vinculin binding aan een belangrijke bindende partner binnen FAs, talin66. De wijziging van deze eiwit-eiwit interactie beïnvloedt vinculin kracht-gevoelige dynamiek. Null MEFs Vinculin stabiel uiten VinTS A50I hebben verschillende cellen en FA morphologies, verschillende vinculin laden profielen en verschillende vinculin dynamics (Figuur 4 d). Kwantificeren van de half-tijden van herstel en FRET efficiëntie en plotten toont aan dat wanneer de vinculin-talin interactie wordt verstoord, vinculin op FAs is gedestabiliseerd door de toegenomen belasting (figuur 4E) terwijl mobiele fractie geen trend (figuur 4F toont ).

Figure 1
Figuur 1: beginselen van FRET-FRAP techniek. (A) Schematische voorstelling van de FRET gebaseerde spanning Sensormodule (TSMod) ingevoegd in een proteïne van belang en het effect van de spanning op het signaal van de FRET. (B) om te kwantificeren FRET met behulp van de gesensibiliseerde emissie, zijn images geschoten opname donor signaal (niet afgebeeld), acceptor signaal en FRET signaal. Met de nodige correcties, kan het beeld van de FRET worden toegewezen een colorimetrische schaal om te visualiseren hoe veel spanning op de sensor wordt toegepast. (C) FRAP wordt geleid gebruikend het signaal van de acceptor, dat recht evenredig met de concentratie is. (D) FRAP imaging analyse produceert curven van de intensiteit van de fluorescentie na verloop van tijd die kan worden passen met behulp van wiskundige modellen om te bepalen eiwit dynamiek. (E, F) Wanneer FRET en FRAP worden gecombineerd, kunnen kracht en omzet in een enkele FA worden gemeten. Meten van meerdere FAs in meerdere cellen levert een relatie tussen belasting van eiwit en eiwit omzet. In deze analyse, is een relatie in welke correlaten van de toegenomen belasting met verhoogde omzet een kracht-gedestabiliseerd staat (E) genoemd. In deze analyse, is een relatie waarin toegenomen belasting correlaten met omzet verlagen een kracht-gestabiliseerde staat (F) genoemd. Dit cijfer is gewijzigd van Rothenberg et al. 37. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: FA identificatie en analyse van de FRET. (A) een vinculin null MEF uiten de VinTS gevisualiseerd in het kanaal van de acceptor, waar de intensiteit geeft aan plaatselijke concentratie van vinculin. Schaal bar = 30 µm. (B) FAs worden gesegmenteerd op basis van de acceptor kanaal om een masker van de FA ID waar elk VA-een unieke ID krijgt, hier weergegeven als verschillende kleuren, ongeveer in de volgorde van helderheid te maken. (C) de FA ID masker wordt omgezet in een binair masker en toegepast op de FRET efficiëntie afbeelding om te laten zien van de FRET efficiëntie waarden alleen bij FAs. (D) de doelmatigheid van de FRET binnen elk VA-is gemiddeld voor een enkele waarde voor elk VA-, die geassocieerd met de FA-ID in de uitvoertabel moeten gegevens worden opgenomen wordt. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: voorbeeld van een translocating FA. (A) een vinculin null MEF uiten de VinTS A50I mutant sensor is gevisualiseerd in het kanaal van de acceptor, met de kleurentabel omgekeerd voor de duidelijkheid. Schaal bar = 30 µm. De FA geschetst in het zwart werd geselecteerd voor het bleken. In-of uitgezoomd-in beelden tonen de FA progressie na verloop van tijd met de rode rand dat aangeeft waar de software geïdentificeerd de FA. Schaal bar = 2 µm. (B) de resulterende genormaliseerde FRAP curve van gegevens in (A). Er is een ongeveer 5% sprong in intensiteit volgende punt 3 als gevolg van de FA translocating snel vóór voldoende terugwinning voor de software te detecteren van de verandering in de VA-vestiging. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: vertegenwoordiger FRET-FRAP resultaten. (A) Vinculin null MEFs uiten de VinTS weergegeven als gemiddelde FRET efficiëntie beelden van de gehele cel (schaal bar = 30 µm) met in-of uitgezoomd-in omgekeerde acceptor kanaal afbeeldingen tonen FRAP herstel progressie (schaal bar = 2 µm). (B) FRAP halftijds van herstel afgeplot tegen de FRET efficiëntie voor 32 cellen, met de punten die cellen in (A) in het rood gemarkeerd. (C) FRAP mobiele breuk afgeplot tegen de FRET efficiëntie voor dezelfde cellen in (B). (D) Vinculin null MEFs uiten de VinTS A50I mutant sensor weergegeven als gemiddelde FRET efficiëntie beelden van de gehele cel (schaal bar = 30 µm) met in-of uitgezoomd-in omgekeerde acceptor kanaal afbeeldingen tonen FRAP herstel progressie (schaal bar = 2 µm). (E) FRAP halftijds van herstel afgeplot tegen de FRET efficiëntie voor 21 cellen, met de punten die cellen in (D) in het rood gemarkeerd. (F) FRAP mobiele breuk afgeplot tegen de FRET efficiëntie voor dezelfde cellen in (E). Gegevens waren oorspronkelijk gepubliceerd in Rothenberg et al. 37 en zijn gevisualiseerd hier in een nieuwe indeling. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De FRET-FRAP-methode zorgt voor directe meting van de kracht-gevoelige eiwitten dynamiek, een eigenschap die moeizaam direct sonde in levende cellen. De gevoeligheid van eiwit dynamiek met moleculaire belasting is cruciaal voor het eiwit de functie als een kracht zender of transducer. Laden is vereist voor de overdracht van zowel intern gegenereerde en extern toegepast krachten, genaamd mechanotransmission, en voor de omzetting van die krachten in biochemically-detecteerbare signalen, genaamd mechanotransduction. Echter, de wijzigingen in de belasting kunnen invloed hebben op de duur die een eiwit gebonden blijft, dus hoe minder tijd besteedt een eiwit invloed belasting, de minder kans de kracht moet worden doorgegeven aan andere eiwitten of getransduceerde in een biochemically-opspoorbaar signaal en voelde. De methode FRET-FRAP overbrugt de kloof tussen de moleculaire en cellulaire niveau doordat moleculaire schaal metingen van kracht-gevoelige dynamiek binnen een bredere context van de cellulaire worden benaderd. Bovendien, het staat voor deze metingen worden genomen tijdens de storing veroorzaakt het intracellulaire of extracellulaire milieu biochemically of mechanisch. Deze techniek dient te gelden tot een FRET gebaseerde spanning sensor, waardoor het onderzoek van de mechanische staat van de eiwitten in een verscheidenheid van subcellular structuren en extracellulaire contexten.

Kritische stappen om ervoor te zorgen dat de gewenste FRET-FRAP metingen worden verkregen omvatten het optimaliseren van de imaging parameters en uitvoeren van data-analyse en interpretatie. Optimaliseren van de imaging parameters, zoals beschreven in het protocol, is het noodzakelijk te beperken de photodamage aan het monster, terwijl voor de gewenste structuren en dynamiek te onderscheiden en voor voldoende signaalsterkte voor de berekening van de FRET. Tot oprichting van deze imaging parameters voor een bepaalde cellijn en de proteïne van belang tijdig vergemakkelijkt directe vergelijking tussen verschillende experimentele groepen. Het is vermeldenswaard dat wijzigingen aan het systeem, zoals muteert de proteïne van belang of in te voeren-remmers, tot veranderingen in de eiwitten lokalisatie leiden kunnen (daardoor veranderen signaal intensiteit) en dynamiek. De geoptimaliseerde parameters moeten duidelijke en nauwkeurige metingen over alle proefomstandigheden inschakelen. Daarom is het raadzaam om te kiezen van de parameters die zijn niet aan het uiterste einde van nuttig, bijvoorbeeld, zijnde kundig voor signaal nauwelijks te onderscheiden van lawaai.

Terwijl de beeldvorming in dit protocol beschreven voor een epifluorescence Microscoop en aangesloten FRAP laser module was, is FRET-FRAP van toepassing op andere imaging systemen. Bijvoorbeeld, kan deze techniek worden aangepast aan de lijn-scannen confocal microscopen evenals de confocal microscopen spinnen-schijf met een bijgevoegde photobleaching module. Imaging instellingen moet worden geoptimaliseerd in een analoge manier om voldoende signal-to-noise zonder photodamage of buitensporige photobleaching te veroorzaken. Met name wat betreft de beeldvorming van de FRET zijn hoge quantum efficiency detectoren vereist voor het verkrijgen van voldoende signaal voor succesvolle FRET berekening zonder fluorophore schade. Er zijn een aantal publicaties beschrijven van afzonderlijke FRET of FRAP geschikt zijn met behulp van een confocal microscoop67,68,69, dat kan worden gebruikt voor het begeleiden van optimalisatie voor FRET-FRAP imaging.

Na het experiment, data-analyse moet worden zorgvuldig behandeld en uitgevoerd in een reproduceerbare, bij voorkeur geautomatiseerde, manier. Als gevolg van het onvermogen om meer dan 2-3 subcellular regio's in één cel voordat bleken teveel bleekmiddel van de beschikbare pool van eiwitten, de doorvoer van deze techniek is relatief beperkt. Datasets worden dus vaak gecombineerd over meerdere dagen voor imaging, consequent behandeling van gegevens. FRET zowel FRAP bieden uitdagingen met data-analyse. FRET index en FRET efficiëntie metingen mogelijk een kwantificering van eiwit belasting. FRET-index is een relatieve maatstaf die is sterk afhankelijk van de instellingen van de Microscoop, terwijl FRET efficiëntie metingen zijn absolute en onafhankelijke van Microscoop instellingen55,70. We hebben onlangs aangetoond dat een eerder ontwikkelde methode met behulp van de "drie-kubus" imaging kan worden gebruikt om te bepalen van de efficiëntie van de FRET uit metingen van de gesensibiliseerde emissie die meestal worden gekwantificeerd met FRET Index bij het gebruik van de FRET gebaseerde spanning sensoren56 . De metingen van de efficiëntie van de FRET zijn vereist als de metingen van de ervaring van de absolute krachten door de spanning sensoren berekende34. De cellen uiten FRET gebaseerde spanning sensoren, kunnen vooral stabiele cellen bij hoge passage getallen, recombineren of degraderen de sensoren, wat leidt tot onbruikbaar FRET gegevens50. Dit is gemakkelijk geïdentificeerd wanneer de berekening donor-naar-acceptor-ratio's tijdens de berekening van de FRET efficiëntie37,56 maar wellicht moeilijker te detecteren met behulp van de index van de FRET. Bij het starten met een FRET gebaseerde spanning sensor, het kunnen nuttig zijn om een grote gegevensset (> 50 cellen) van alleen FRET gegevens voor de constructies van belang zijn voor het identificeren van de efficiëntie van het verwachte bereik van FRET. Bovendien kunnen er FRAP gegevens moeilijk te uittreksel van structuren die zijn erg mobiel, zoals FAs die snel glijden of demonteren. Selecteren van een subpopulatie van structuren of het optimaliseren van de cel plating voorwaarden te verzachten dit effect kan helpen om dit probleem te minimaliseren.

In concept, kunnen FRET-FRAP worden toegepast op elke FRET gebaseerde sensor in elke subcellular regio, met de juiste optimalisatie. In de praktijk, is het wellicht moeilijk te vangen kracht-gevoelige dynamiek van eiwitten die niet onder aanzienlijke mechanische belasting of die half-tijden van herstel op de zeer korte termijn van een paar seconden of op de lange termijn van tientallen minuten. Resultaten uit studies van de single-molecuul kunnen verwijzen naar de eiwitten die kracht-gevoelige dynamiek binnen levende cellen kunnen aantonen. Tot nu toe, omvat dit vele FA en AJ eiwitten13,14,15,16 , evenals sommige cytoskeletal elementen71,72,73. Toevalligerwijs, zijn FRET gebaseerde sensoren ontworpen voor veel van deze eiwitten-46. Deze resultaten kunnen begeleiden de selectie van een proteïne van belang; Er moet echter niet worden verwacht dat FRET-FRAP gegevens precies de resultaten van deze studies single-molecuul zal spiegel. Biochemische verordening, interacties met andere proteïnen, en lokale cytoskeletal structuur kan in feite onzichtbaar maken of wijzigen, de gevolgen van krachten voor eiwit-eiwitinteractie. De mogelijkheid om te observeren deze complexe situatie is een unieke kracht van de FRET-FRAP aanpak.

Een combinatie van manipulaties naar de cel en de proteïne van belang kunnen worden gebruikt het ophelderen van het belangrijke factoren bij het reguleren van eiwit dynamiek. Bijvoorbeeld, kunnen het nuttig zijn indien er een sensor die kracht-ongevoelig, hetzij via de schrapping of mutatie van een kracht-bindend domein35,74 zoals moet er geen afhankelijkheid van de eiwit omzet dynamiek van de force gerapporteerd door de sensor. Bovendien kunnen de mutaties van andere kritische bandplaatsen of fosforylatie sites in het eiwit bevatten een vollediger beeld van hoe de proteïne van belang geregeld wordt. Globale wijzigingen aanbrengen op de cel of het milieu door middel van cytoskeletal-remmers of door het wijzigen van de eigenschappen van het substraat (ex. extracellulaire matrix of stijfheid), respectievelijk, kunt u bepalen hoe de kracht-gevoelige dynamiek van de eiwitten reageren op mechanische verstoringen. De informatie over eiwit belasting en de kracht-gevoelige dynamiek te combineren met andere biofysische eigenschappen van het eiwit kan helpen om de mechanische staat van de proteïne van belang. Hierbij kan de lokalisatie en de lokale eiwit-eiwitinteractie binnen een subcellular structuur75,76. Bovendien kan het eiwit bevinden zich in verschillende conformatie Staten, zelfs binnen dezelfde subcellular structuur, afhankelijk van de context76,77. Eiwit belasting, dynamiek, lokalisatie en conformatie kan alle gelijktijdig worden beïnvloed door intern gegenereerde en extern toegepast krachten37,76,78,79, dicteren een eiwit van rol in de transmissie van de kracht- en mechanotransduction. De veelzijdigheid van de FRET-FRAP-methode en de potentiële verenigbaarheid ervan met een verscheidenheid van eiwitten en manipulaties in staat moet stellen de opheldering van de interactie tussen bulk mechanica, eiwit dynamiek en mechanosensitive signalering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door een National Science Foundation CAREER Award (NSF-CMMI-14-54257) en subsidies van de American Heart Association (16GRNT30930019) en de National Institutes of Health (R01GM121739-01) toegekend aan Dr. Brenton Hoffman en een nationale Science Foundation Graduate Research Fellowship uitgereikt aan Katheryn Rothenberg. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële standpunten van de NSF of NIH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin-EDTA Thermo Fisher 25300062
16% Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 30525-89-4
60x Objective NA1.35 Olympus UPLSAPO 60XO
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) Gibco 15240-062
Automated Stage Prior Scientific H117EIX3
Custom Dichroic Mirror Chroma Technology Corp T450/514rpc
Custom mTFP1 Emission Filter Chroma Technology Corp ET485/20m
Custom mTFP1 Excitation Filter Chroma Technology Corp ET450/30x
Custom Venus Excitation Filter Chroma Technology Corp ET514/10x
DMEM-gfp Live Cell Visualization Medium Sapphire MC102
Dulbecco's Modified Eagle's Medium  Sigma Aldrich D5796 with L-glutamine and sodium bicarbonate
Fetal Bovine Serum HyClone SH30396.03
Fibronectin, Human Corning 47743-654
FRAPPA Calibration Slide Andor provided along with FRAPPA unit
FRAPPA System with 515 nm Laser Andor
Glass-bottomed Fluoro Dishes World Precision Instruments FD35
HEK293-T Cells ATCC CRL-3216
Hexadimethrine Bromide, Polybrene Sigma Aldrich H9268-5G
High-glucose Dulbecco's Modified Eagle's Medium Sigma Aldrich D6429
Inverted Fluorescent Microscope Olympus IX83
JMP Pro Software SAS
Lambda 10-3 Motorized Filter Wheels Sutter Instruments LB10-NW
LambdaLS Arc Lamp with 300W Ozone-Free Xenon Bulb Sutter Instruments LS/OF30
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-027
MATLAB Software Mathworks
MEM Non-Essential Amino Acids Thermo Fisher 11140050
MetaMorph for Olympus Olympus
Micro-Humidification System Bioptechs 130708
MoFlo Astrios EQ Cell Sorter Beckman Coulter B25982
Objective Heater Medium Bioptechs 150819-13
OptiMEM Thermo Fisher 31985070
Phosphate Buffered Saline Sigma Aldrich D8537
pMD2.G Envelope Plasmid Addgene 12259
pRRL Vector gift from Dr. Kam Leong (Columbia University)
psPax2 Packaging Plasmid Addgene 12260
sCMOS ORCA-Flash4.0 V2 Camera Hamamatsu Photonics C11440-22CU
Sorvall Legend XT/XF Centrifuge Thermo Fisher 75004505
Stable Z Stage Warmer Bioptechs 403-1926
Venus Emission Filter Semrock FF01-571/72

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DuFort, C. C., Paszek, M. J., Weaver, V. M. Balancing forces: architectural control of mechanotransduction. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (5), 308-319 (2011).
  2. Mammoto, T., Ingber, D. E. Mechanical control of tissue and organ development. Development. 137 (9), 1407-1420 (2010).
  3. Sun, Y., Chen, C. S., Fu, J. Forcing stem cells to behave: a biophysical perspective of the cellular microenvironment. Annual Review of Biophysics. 41, 519-542 (2012).
  4. Wozniak, M. A., Chen, C. S. Mechanotransduction in development: a growing role for contractility. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (1), 34-43 (2009).
  5. Broders-Bondon, F., Nguyen Ho-Bouldoires, T. H., Fernandez-Sanchez, M. E., Farge, E. Mechanotransduction in tumor progression: The dark side of the force. The Journal of cell biology. 217 (5), 1571-1587 (2018).
  6. Simmons, R. D., Kumar, S., Jo, H. The role of endothelial mechanosensitive genes in atherosclerosis and omics approaches. Archives of Biochemistry and Biophysics. 591, 111-131 (2016).
  7. Wells, R. G. Tissue mechanics and fibrosis. Biochimica et Biophysica Acta. 1832 (7), 884-890 (2013).
  8. Lele, T. P., et al. Mechanical forces alter zyxin unbinding kinetics within focal adhesions of living cells. Journal of Cellular Physiology. 207 (1), 187-194 (2006).
  9. Hoffman, B. D., Grashoff, C., Schwartz, M. A. Dynamic molecular processes mediate cellular mechanotransduction. Nature. 475 (7356), 316-323 (2011).
  10. Dembo, M., Torney, D. C., Saxman, K., Hammer, D. The reaction-limited kinetics of membrane-to-surface adhesion and detachment. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 234 (1274), 55-83 (1988).
  11. LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Hoffman, B. D. Molecular-Scale Tools for Studying Mechanotransduction. Annual Review of Biomedical Engineering. 17, 287-316 (2015).
  12. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
  13. Kong, F., Garcia, A. J., Mould, A. P., Humphries, M. J., Zhu, C. Demonstration of catch bonds between an integrin and its ligand. The Journal of Cell Biology. 185 (7), 1275-1284 (2009).
  14. Rakshit, S., Zhang, Y., Manibog, K., Shafraz, O., Sivasankar, S. Ideal catch, and slip bonds in cadherin adhesion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (46), 18815-18820 (2012).
  15. del Rio, A., et al. Stretching Single Talin Rod Molecules Activates Vinculin Binding. Science. 323 (5914), 638-641 (2009).
  16. Seddiki, R., et al. Force-dependent binding of vinculin to alpha-catenin regulates cell-cell contact stability and collective cell behavior. Molecular Biology of the Cell. 29 (4), 380-388 (2018).
  17. Huang, D. L., Bax, N. A., Buckley, C. D., Weis, W. I., Dunn, A. R. Vinculin forms a directionally asymmetric catch bond with F-actin. Science. 357 (6352), 703-706 (2017).
  18. Chrzanowska-Wodnicka, M., Burridge, K. Rho-stimulated contractility drives the formation of stress fibers and focal adhesions. The Journal of Cell Biology. 133 (6), 1403-1415 (1996).
  19. Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin-cytoskeleton linkages. Cell. 88 (1), 39-48 (1997).
  20. Liu, Z., et al. Mechanical tugging force regulates the size of cell-cell junctions. Proceedings of the National Academy of Science. 107 (22), 9944-9949 (2010).
  21. Riveline, D., et al. Focal contacts as mechanosensors: externally applied local mechanical force induces growth of focal contacts by an mDia1-dependent and ROCK-independent mechanism. The Journal of Cell Biology. 153 (6), 1175-1186 (2001).
  22. Brevier, J., Vallade, M., Riveline, D. Force-extension relationship of cell-cell contacts. Physical Review Letters. 98 (26), 268101 (2007).
  23. Bershadsky, A., Kozlov, M., Geiger, B. Adhesion-mediated mechanosensitivity: a time to experiment, and a time to theorize. Current opinion in cell biology. 18 (5), 472-481 (2006).
  24. Chan, C. E., Odde, D. J. Traction dynamics of filopodia on compliant substrates. Science. 322 (5908), 1687-1691 (2008).
  25. Wu, Z., Plotnikov, S. V., Moalim, A. Y., Waterman, C. M., Liu, J. Two distinct actin networks mediate traction oscillations to confer focal adhesion mechanosensing. Biophysical Journal. 112 (4), 780-794 (2017).
  26. Fritzsche, M., Charras, G. Dissecting protein reaction dynamics in living cells by fluorescence recovery after photobleaching. Nature Protocols. 10 (5), 660-680 (2015).
  27. McNally, J. G. Quantitative FRAP in analysis of molecular binding dynamics in vivo. Methods of Cell Biology. 85, 329-351 (2008).
  28. Wehrle-Haller, B. Analysis of integrin dynamics by fluorescence recovery after photobleaching. Methods in Molecular Biology. 370, 173-202 (2007).
  29. Carisey, A., Stroud, M., Tsang, R., Ballestrem, C. Fluorescence recovery after photobleaching. Methods of Molecular Biology. 769, 387-402 (2011).
  30. Carisey, A., et al. Vinculin regulates the recruitment and release of core focal adhesion proteins in a force-dependent manner. Current Biology. 23 (4), 271-281 (2013).
  31. Wolfenson, H., Bershadsky, A., Henis, Y. I., Geiger, B. Actomyosin-generated tension controls the molecular kinetics of focal adhesions. Journal of Cell Science. 124, 1425-1432 (2011).
  32. Dumbauld, D. W., et al. How vinculin regulates force transmission. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (24), 9788-9793 (2013).
  33. Zaidel-Bar, R., Itzkovitz, S., Ma'ayan, A., Iyengar, R., Geiger, B. Functional atlas of the integrin adhesome. Nature Cell Biology. 9 (8), 858-867 (2007).
  34. Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
  35. LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Berginski, M. E., Urs, A. N., Hoffman, B. D. Construction, imaging, and analysis of FRET-based tension sensors in living cells. Biophysical Methods in Cell Biology. 125, 161-186 (2015).
  36. Meng, F., Suchyna, T. M., Sachs, F. A fluorescence energy transfer-based mechanical stress sensor for specific proteins in situ. The FEBS Journal. 275 (12), 3072-3087 (2008).
  37. Rothenberg, K. E., Scott, D. W., Christoforou, N., Hoffman, B. D. Vinculin Force-Sensitive Dynamics at Focal Adhesions Enable Effective Directed Cell Migration. Biophysical journal. 114 (7), 1680-1694 (2018).
  38. Austen, K., et al. Extracellular rigidity sensing by talin isoform-specific mechanical linkages. Nature Cell Biology. 17 (12), 1597-1606 (2015).
  39. Kumar, A., et al. Talin tension sensor reveals novel features of focal adhesion force transmission and mechanosensitivity. The Journal of Cell Biology. 213 (3), 371-383 (2016).
  40. Acharya, B. R., et al. Mammalian Diaphanous 1 Mediates a Pathway for E-cadherin to Stabilize Epithelial Barriers through Junctional Contractility. Cell Reports. 18 (12), 2854-2867 (2017).
  41. Borghi, N., et al. E-cadherin is under constitutive actomyosin-generated tension that is increased at cell-cell contacts upon externally applied stretch. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (31), 12568-12573 (2012).
  42. Conway, D. E., Williams, M. R., Eskin, S. G., McIntire, L. V. Endothelial cell responses to atheroprone flow are driven by two separate flow components: low time-average shear stress and fluid flow reversal. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298 (2), H367-H374 (2010).
  43. Arsenovic, P. T., et al. Nesprin-2G, a Component of the Nuclear LINC Complex, Is Subject to Myosin-Dependent Tension. Biophysical Journal. 110 (1), 34-43 (2016).
  44. Ye, N., et al. Direct observation of alpha-actinin tension and recruitment at focal adhesions during contact growth. Experimental Cell Research. 327 (1), 57-67 (2014).
  45. Paszek, M. J., et al. The cancer glycocalyx mechanically primes integrin-mediated growth and survival. Nature. 511 (7509), 319-325 (2014).
  46. Gayrard, C., Borghi, N. FRET-based Molecular Tension Microscopy. Methods. 94, 33-42 (2016).
  47. de Beco, S., Gueudry, C., Amblard, F., Coscoy, S. Endocytosis is required for E-cadherin redistribution at mature adherens junctions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (17), 7010-7015 (2009).
  48. Östlund, C., et al. Dynamics and molecular interactions of linker of nucleoskeleton and cytoskeleton (LINC) complex proteins. Journal of Cell Science. 122 (22), 4099-4108 (2009).
  49. Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. The interactions of retroviruses and their hosts. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor (NY). (1997).
  50. Komatsubara, A. T., Matsuda, M., Aoki, K. Quantitative analysis of recombination between YFP and CFP genes of FRET biosensors introduced by lentiviral or retroviral gene transfer). Scientific Reports. 5, 13283 (2015).
  51. Nasri, M., Karimi, A., Farsani, M. A. Production purification and titration of a lentivirus-based vector for gene delivery purposes. Cytotechnology. 66 (6), 1031-1038 (2014).
  52. Addgene, Generating Stable Cell Lines with Lentivirus. , Available from: https://www.addgene.org/protocols/generating-stable-cell-lines (2016).
  53. Roederer, M. Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats. Cytometry: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 45 (3), 194-205 (2001).
  54. Malkani, N., Schmid, J. A. Some secrets of fluorescent proteins: distinct bleaching in various mounting fluids and photoactivation of cyan fluorescent proteins at YFP-excitation. PLoS One. 6 (4), e18586 (2011).
  55. Chen, H., Puhl, H. L. 3rd, Koushik, S. V., Vogel, S. S., Ikeda, S. R. Measurement of FRET efficiency and ratio of donor to acceptor concentration in living cells. Biophysical journal. 91 (5), L39-L41 (2006).
  56. Rothenberg, K. E., Neibart, S. S., LaCroix, A. S., Hoffman, B. D. Controlling Cell Geometry Affects the Spatial Distribution of Load Across Vinculin. Cellular and Molecular Bioengineering. 8 (3), 364-382 (2015).
  57. Carnell, M., Macmillan, A., Whan, R. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP): acquisition, analysis, and applications. Methods of Molecular Biology. 1232, 255-271 (2015).
  58. Trembecka, D. O., Kuzak, M., Dobrucki, J. W. Conditions for using FRAP as a quantitative technique--influence of the bleaching protocol. Cytometry A. 77 (4), 366-370 (2010).
  59. Lavelin, I., et al. Differential effect of actomyosin relaxation on the dynamic properties of focal adhesion proteins. PLoS One. 8 (9), e73549 (2013).
  60. Foote, H. P., Sumigray, K. D., Lechler, T. FRAP analysis reveals stabilization of adhesion structures in the epidermis compared to cultured keratinocytes. PLoS One. 8 (8), e71491 (2013).
  61. Zal, T., Gascoigne, N. R. Photobleaching-corrected FRET efficiency imaging of live cells. Biophysical Journal. 86 (6), 3923-3939 (2004).
  62. Hodgson, L., Shen, F., Hahn, K. Biosensors for characterizing the dynamics of rho family GTPases in living cells. Current Protocols in Cell Biology. 46 (1), (2010).
  63. Day, R. N. Measuring protein interactions using Förster resonance energy transfer and fluorescence lifetime imaging microscopy. Methods. 66 (2), 200-207 (2014).
  64. Rapsomaniki, M. A., et al. easyFRAP: an interactive, easy-to-use tool for qualitative and quantitative analysis of FRAP data. Bioinformatics. 28 (13), 1800-1801 (2012).
  65. Zamir, E., et al. Molecular diversity of cell-matrix adhesions. Journal of cell science. 112 (11), 1655-1669 (1999).
  66. Bakolitsa, C., et al. Structural basis for vinculin activation at sites of cell adhesion. Nature. 430 (6999), 583-586 (2004).
  67. De Los Santos, C., Chang, C. W., Mycek, M. A., Cardullo, R. FRAP, FLIM, and FRET: Detection and analysis of cellular dynamics on a molecular scale using fluorescence microscopy. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 587-604 (2015).
  68. Periasamy, A., Wallrabe, H., Chen, Y., Barroso, M. Chapter 22: Quantitation of protein-protein interactions: confocal FRET microscopy. Methods in Cell Biology. 89, 569-598 (2008).
  69. Stehbens, S., Pemble, H., Murrow, L., Wittmann, T. Imaging intracellular protein dynamics by spinning disk confocal microscopy. Methods in Enzymology. , 293-313 (2012).
  70. Zeug, A., Woehler, A., Neher, E., Ponimaskin, E. G. Quantitative intensity-based FRET approaches--a comparative snapshot. Biophysical Journal. 103 (9), 1821-1827 (2012).
  71. Ehrlicher, A. J., Nakamura, F., Hartwig, J. H., Weitz, D. A., Stossel, T. P. Mechanical strain in actin networks regulates FilGAP and integrin binding to filamin A. Nature. 478 (7368), 260-263 (2011).
  72. Guo, B., Guilford, W. H. Mechanics of actomyosin bonds in different nucleotide states are tuned to muscle contraction. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (26), 9844-9849 (2006).
  73. Lee, C. Y., et al. Actin depolymerization under force is governed by lysine 113:glutamic acid 195-mediated catch-slip bonds. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (13), 5022-5027 (2013).
  74. Cost, A. L., Ringer, P., Chrostek-Grashoff, A., Grashoff, C. How to Measure Molecular Forces in Cells: A Guide to Evaluating Genetically-Encoded FRET-Based Tension Sensors. Cellular and Molecular Bioengineering. 8 (1), 96-105 (2015).
  75. Bertocchi, C., et al. Nanoscale architecture of cadherin-based cell adhesions. Nature Cell Biology. 19 (1), 28-37 (2017).
  76. Case, L. B., et al. Molecular mechanism of vinculin activation and nanoscale spatial organization in focal adhesions. Nature Cell Biology. 17 (7), 880-892 (2015).
  77. Chen, H., Cohen, D. M., Choudhury, D. M., Kioka, N., Craig, S. W. Spatial distribution and functional significance of activated vinculin in living cells. The Journal of Cell Biology. 169 (3), 459-470 (2005).
  78. Kim, T. J., et al. Dynamic visualization of alpha-catenin reveals rapid, reversible conformation switching between tension states. Current Biology. 25 (2), 218-224 (2015).
  79. Yao, M., et al. Mechanical activation of vinculin binding to talin locks talin in an unfolded conformation. Scientific reports. 4, 4610 (2014).

Tags

Bioengineering kwestie 141 Mechanobiology mechanotransduction Biofysica FRET gebaseerde spanning sensoren FRAP kracht-gevoelige eiwitten dynamics
Meting van de kracht-gevoelige eiwitten Dynamics in levende cellen met behulp van een combinatie van Fluorescent technieken
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rothenberg, K. E., Puranam, I.,… More

Rothenberg, K. E., Puranam, I., Hoffman, B. D. Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques. J. Vis. Exp. (141), e58619, doi:10.3791/58619 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter