Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Bioengineering

قياس ديناميات حساسة لقوة البروتين في الخلايا الحية باستخدام مزيج من التقنيات الفلورسنت

doi: 10.3791/58619 Published: November 2, 2018

Summary

هنا، فإننا نقدم بروتوكول للاستخدام المتزامن لصدى فورستر الطاقة التوتر القائم على نقل أجهزة استشعار لقياس البروتين الأسفار وتحميل الانتعاش بعد فوتوبليتشينج لقياس ديناميات البروتين مما يتيح قياس حساسة للقوة ديناميات البروتين داخل الخلايا الحية.

Abstract

خلايا الإحساس والاستجابة للرموز المادية في البيئة الخاصة بهم عن طريق تحويل المنبهات الميكانيكية إلى إشارات قابلة للاكتشاف المتحلل في عملية تسمى ميتشانوترانسدوكشن. خطوة حاسمة في ميتشانوترانسدوكشن هو انتقال القوات بين البيئتين الداخلية والخارجية. لنقل القوات، ويجب أن تكون هناك صلة مادية مستمرة ومتواصلة تم إنشاؤها بواسطة سلسلة من تفاعلات البروتين البروتين. تفاعلاً بروتين-بروتين معين، تحميل الميكانيكية يمكن أن يكون أما أي تأثير على التفاعل، وتؤدي إلى عدم اقتران أسرع من التفاعل، أو حتى تستقر التفاعل. فهم كيف الجزيئية تحميل يملي دوران البروتين في الخلايا الحية يمكن أن توفر معلومات قيمة حول الحالة الميكانيكية للبروتين، بدوره في توضيح دورها في ميتشانوترانسدوكتيون. تفتقر إلى قياسات مباشرة لتحميل البروتين التقنيات الموجودة لقياس ديناميات البروتين المراعية للقوة أو الاعتماد على القياسات يؤديها خارج سياق الخلوية. هنا، نحن وصف بروتوكول لاسترداد fluorescence نقل الطاقة الرنين فورستر بعد تقنية فوتوبليتشينج (اربط الحنق)، التي تمكن من قياس ديناميات حساسة لقوة البروتين داخل الخلايا الحية. هذه التقنية التي يمكن تطبيقها على أي جهاز استشعار التوتر القائم على الحنق، تيسير دراسة ديناميات البروتين المراعية للقوة في مجموعة متنوعة من الهياكل سوبسيلولار وفي أنواع مختلفة من الخلايا.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

البيئة خارج الخلية هو مصدرا غنيا للإشارات البيوكيميائية والجسدي على السواء التي تملي سلوك الخلية. على وجه الخصوص، يمكن التوسط الطبيعة الفيزيائية المكروية الوظائف الخلوية الرئيسية، بما في ذلك نمو الخلايا، والهجرة، وتمايز1،2،،من34. التقلبات وميكانيكا المكروية هو عنصر حاسم للعديد من الأمراض التي لم تقم حتى الآن مثل السرطان5،6من تصلب الشرايين وتليف7العلاج الكافي. فهم كامل لكيفية تحويل الخلايا المحفزات المادية إلى إشارات قابلة للاكتشاف المتحلل، عملية تسمى ميتشانوترانسدوكتيون، ويتطلب الكشف عن الآليات الجزيئية بوساطة قوة الإرسال، سواء داخل وخارج الخلايا و داخل هياكل سوبسيلولار متعددة.

داخل هياكل سوبسيلولار والبروتينات يتحولون باستمرار؛ ملزمة وكائنة على أساس قوة تفاعلاتها مع ربط الشركاء8. للقوات بنجاح إرسالها عبر مسافة مادية، يجب أن يكون هناك سلسلة تفاعلات البروتين البروتين، مما يعني أن دوران للبروتين يجب أن تكون بطيئة ما يكفي لإدامة وإرسال قوة إلى شريك ملزم9غير منقطعة. بينما تفاعلات البروتين البروتين عموما تتكون من عدة غير تساهمية سندات بين المجالات البروتين، غالباً ما يتم تصور التفاعل كدولة منضمة يمكن الانتقال إلى حالة غير منضم تحت ظروف مختلفة10، 11-لوجود تفاعل بروتين-بروتين معين، فمن الممكن أن القوة يمكن أن يكون أي تأثير على عمر التفاعل، المعروف في "سندات مثالية"، وتقليل مدة التفاعل، المعروفة باسم "سند زلة"، أو زيادة عمر التفاعل ، المعروف باسم "سند قبض"10. ومن ثم، هناك علاقة معقدة بين ديناميات البروتين، الذي نشير إليه بوصفه ديناميات القوة الحساسة وتحميل البروتين.

نحو فهم تأثير الحمل على ديناميات بوند، تم إجراء عدد من التجارب الزاخرة على مستوى جزيء واحد. استخدام البروتينات المعزولة، أو أجزاء من البروتينات وتقنيات التلاعب مثل ملاقط مغناطيسية وملاقط بصرية ومجهر القوة الذرية، أثبتت هذه الدراسات تفاعلات البروتين البروتين المراعية للقوة لعدة ذات الصلة البروتينات11،12. كلا إينتيجرينس13 وكادهيرينس14، التي بروتينات transmembrane هام لتشكيل خلية خلية والخلية-مصفوفة التفاعلات، على التوالي، قد أثبتت التعديلات في ديناميات الواجب لتحميل. داخل الخلية، يتم تجنيده لكلا تالين15 و α-كاتينين16 بطريقة تعتمد على قوة فينكولين ويمكن تشكيل رابطة صيد مع الأكتين17، مشيراً إلى دور حاسم فينكولين في الالتصاقات المحورية (فاس) وتقاطعات أدهيرينس (عيس ) تحت تحميل. دراسات جزيء واحد تسمح لعزل تفاعلات البروتين البروتين محددة ويسفر عن نتائج لا لبس فيها، ولكن أنها لا تراعي الطابع المعقد للبيئة الخلوية.

التجارب التاريخية أظهرت أن العديد من الهياكل سوبسيلولار، بما في ذلك منظمة تضامن النساء الأفريقيات وعيس، ميتشانوسينسيتيفي، ومعرض الجمعية تعزيز استجابة للأحمال المولدة داخليا أو خارجياً تطبيقها18،19، 20،،من2122. بالإضافة إلى ذلك، اقترح عدة نماذج نظرية أن الجمعية ميتشانوسينسيتيفي يمكن أن يكون مدفوعا بروتين القوة الحساسة ديناميات23،،من2425. لفحص هذه الديناميات المراعية للقوة داخل الخلايا الحية، اتخذت النهج غير المباشرة قليلة. فراب والتقنيات ذات الصلة توفر منهجية بسيطة نسبيا لقياس ديناميات البروتين في خلايا26،27،،من2829. ومع ذلك، قد قياس البروتين تحميل أكثر محدودية. نهج نموذجي مقارنة ديناميات البروتين في الخلايا مع أو بدون التعرض مثبط سيتوسكيليتال المستخدمة للحد عموما خلية contractility،8،،من3031. وهذا من الناحية المفاهيمية، مقارنة بين تحميل عالي والدوله تحميل منخفض. ومع ذلك، هناك لا التحديد الكمي للتحميل عبر البروتين في أي دولة، وقد تكون هناك آثار غير مقصودة البيوكيميائية للمانع، هذه خسارة مواقع الربط الرئيسية على طول خيوط أكتين و. نهج آخر، خاصة بفاس، تم قياس مجموع قوة كشفه على الركيزة باستخدام مجهر القوة الجر التقريبي التحميل الجزيئية ودراسة العلاقة مع القوى المحركة للبروتين وحيد داخل اتحاد كرة القدم32اتحاد كرة القدم. في حين يسمح هذا النهج للتحديد الكمي لمجموع القوة، أنه لا يقدم معلومات محددة جزيئيا. منظمة تضامن النساء الأفريقيات تتكون من البروتينات المختلفة ما يزيد على 200، وكثير منها يمكن أن تحمل حمولة33. وهكذا، قياس ناتج مجموع القوة FA يحتمل أن يحجب إمكانية مسارات انتقال القوة متعددة ولا توفر مقياسا لتحميل موثوق على بروتين معين.

خلافا للنهج السابق في ميتشانوبيولوجي، ظهور أجهزة استشعار التوتر القائم على الحنق يسمح مباشرة قياس الأحمال التي تعانيها بروتينات محددة داخل الحية الخلايا34،،من3536. نقدم هنا، بروتوكول الذي يجمع بين أجهزة استشعار التوتر القائم على الحنق مع التدبير القائم على فراب لديناميات البروتين. ونشير إلى هذا الأسلوب اربط الحنق. ويمكن هذا النهج المتزامن قياس حمولة البروتين وديناميات البروتين، مما يتيح تقييم ديناميات حساسة لقوة البروتين في الخلايا الحية (الشكل 1). بالفعل، طبق تقنية اربط الحنق على دراسة ديناميات القوة الحساسة فينكولين بروتين رابط الميكانيكية37. وقد وضعت أجهزة استشعار التوتر للعديد من البروتينات ذات الصلة في مجموعة متنوعة من الهياكل سوبسيلولار. على سبيل المثال، وضعت أجهزة الاستشعار فينكولين34 وتالين38،39 في فاس، وكادهيرينس، وكاتينينس في عيس40،،من4142، نيسبرين في اللغوي النووية المعقدة 43و α-أكتينين44 و فيلامين36 في سيتوسكيليتون، و MUC-1 في جليكوكاليكس45، بين أمور أخرى46. وبالمثل، فراب وقد استخدمت تقنية شائعة استخدام في البروتينات ميتشانوسينسيتيفي داخل الالتصاقات التنسيق8،31و تقاطعات أدهيرينس47، أكتين اللحاء26، ونواة48. ووضع أجهزة الاستشعار، والسماح للقياسات لديناميات القوة الحساسة في مجموعة متنوعة من السياقات وهياكل سوبسيلولار المضي قدما، ينبغي أن يكون الأسلوب اربط الحنق نطاق واسع ينطبق على أي من هذه المجسات الموجودة أو حديثا. تحقيقا لهذه الغاية، نحن نقدم بروتوكول مفصلاً، والمعمم لتنفيذ الأسلوب اربط الحنق المطبقة في هذه النظم المختلفة. ونأمل أن هذا سيمكن مجموعة متنوعة واسعة من التجارب توضيح أدوار مختلف البروتينات ميتشانوسينسيتيفي في تنظيم انتقال القوة وفي التوسط في سلوك الخلية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1-توليد عينات لتصوير

  1. التوتر ثابت صريح في نوع الخلايا المطلوب بناء أجهزة الاستشعار.
    1. استنساخ بناء جهاز استشعار التوتر إلى ناقل برل أو بلازميد التعبير الفيروسية الأخرى.
      ملاحظة: تتوفر العديد من أدوات الاستنساخ الجزيئي مختلفة لتحقيق هذه الخطوة بما في ذلك استخدام إنزيمات التقييد، وتتداخل مع التمديد، و "الجمعية جيبسون"35. ناقل برل يستخدم في توصيل لينتي الفيروسية، ويتيح قدرا كبيرا من إنتاج البروتين من خلال استخدام المروج البشرية الفيروس المضخم للخلايا (CMV). ناقلات مختلفة قد تكون ضرورية لسياق معين. على سبيل المثال، هو إسكات المروج CMV في بعض أنواع الخلايا49. بالإضافة إلى ذلك، فقط أجهزة الاستشعار المستندة إلى الحنق يحتوي على بروتين فلوري أن التماثل تسلسل قوي نقص، مثل mTFP1 و A206K فينوس، يمكن استخدامها لإنشاء خطوط الخلايا مستقرة. أجهزة الاستشعار التي تحتوي على بروتين فلوري السماوي وبروتين فلوري الصفراء سيكون على الأرجح خاضعة جزئ مثلى50.
    2. توليد لينتيفيروس في خلايا الكلي الجنينية البشرية (HEK) 293T باستخدام psPax2 و pMD2.G والبلازميدات التغليف باستخدام أساليب إنتاج الفيروسات القياسية51.
      تنبيه: فقط ينبغي أن تكون معالجة Lentivirus موظفون مدربون بشكل صحيح في بيئة مختبر مستوى 2 السلامة الأحيائية.
      ملاحظة: هذا الجمع بين الخلايا والتغليف والبلازميدات مناسبة للاستخدام مع برل. أنظمة أخرى قد تكون مطلوبة مع ناقلات أخرى.
    3. ترانسدوسي الخلايا المطلوب مع الفيروس باستخدام البروتوكولات القياسية توصيل52 واستخدام التدفق الخلوي لفرز الخلايا53 تحديد عدد سكان متجانسة معربا عن كل بناء على المستويات المحلية حوالي37. بعد تحديد الخلية، يمكن إجراء تجارب مباشرة، أو من الخلايا يمكن أن تجمد جثمان لاستخدامها في وقت لاحق. لا تتجاوز 2 تجميد أذاب دورات لخط معين خلية مستقرة.
      ملاحظة: استخدام خطوط الخلايا نقص في البروتين يكون درس (مثلاً، ميفس فينكولين--/--للاستخدام مع جهاز استشعار التوتر فينكولين) ستزيد إشارة إلى نسبة في تجارب الحنق الضوضاء، فضلا عن الحد من القطع الأثرية التعبير المفرط. مثل الخطوط تنتجها الخلايا الليفية الجنينية (MEF) الماوس مستقر يمكن أن تستخدم لحوالي 15 مقاطع قبل فقدان كبير للتعبير أو تدهور من أجهزة الاستشعار الظاهر. إذا الفيروسية استناداً إلى أساليب غير المرغوب فيها، يمكن استخدام عدد كبير كواشف التجارية وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة لعابر ترانسفيكت مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا مع أجهزة استشعار التوتر في بلازميد مناسبة، مثل pcDNA3.1. وسيكون التعبير الأمثل ح 24-48 بعد تعداء.
  2. تعد ركائز لبذر الخلية.
    1. الحصول على 4، 35 ملم أطباق زجاجية.
    2. تعمل في غطاء ثقافة خلية، في أنبوب الكنسي 15 مل، جعل 4 مل من 10 ميكروغرام/مل فيبرونيكتين في مخزنة الفوسفات (PBS) المحلول الملحي باستخدام برنامج تلفزيوني العقيمة في هود ثقافة الخلية. برفق عكس الأنبوب مرة واحدة لخلط واسمحوا الحل الجلوس لمدة 5 دقائق في هود ثقافة الخلية.
      ملاحظة: قد يكون تركيز أو نوع من البروتين ECM يتعين تعديلها لأنواع الخلايا الأخرى. الشروط المنصوص عليها مناسبة ميفس.
    3. "الماصة؛" 1 مل محلول فيبرونيكتين على كل طبق زجاجية.
    4. اترك الحل فيبرونيكتين على الأطباق ح 1 في درجة حرارة الغرفة أو بين ليلة وضحاها في 4 درجات مئوية.
    5. نضح الحل فيبرونيكتين وشطف مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني، وإضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني.
  3. بذور الخلايا على استعداد الطبقات السفلية.
    1. بدء تشغيل مع خلايا الفائدة نسبة التقاء مناسبة سوبكولتيفيشن في صحن ثقافة 6 سم.
      ملاحظة: أنواع الخلايا المختلفة يتطلب شروط الثقافة خلية متميزة وبروتوكولات سوبكولتيفيشن. يوفر هذا المقطع إرشادات مناسبة ميفس. وتزرع عادة، ميفس لالتقاء 85% قبل سوبكولتيفيشن.
    2. تعمل داخل غطاء ثقافة خلية، شطف الخلايا مرة واحدة مع 3 مل من برنامج تلفزيوني. أضف 1 مل من 0.05% يدتا التربسين واحتضان لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
    3. أضف 3 مل من وسائل الإعلام الكامل للطبق 6 سم وجمع الخلايا، ووضع في أنبوب مخروطي 15 مل.
      ملاحظة: تكوين للوسائط كاملة يعتمد على نوع الخلية المستخدمة. الإعلامية الكاملة ل MEFs، غالباً ما يعرف بأنه "تعديل النسر المتوسطة" ارتفاع الجلوكوز دولبيكو مع 10% مصل بقرى الجنين، 1% فطري المضادات الحيوية (التي تحتوي على الامفوتريسين ب والبنسلين وستربتوميسين)، وحل غير الضرورية من الأحماض الأمينية (نيا) 1%.
    4. تدور الخلايا لأسفل في 1000 غ س لمدة 5 دقائق.
    5. نضح وسائط الإعلام وريسوسبيند بيليه الخلية في 1 مل من وسائل الإعلام كاملة.
    6. قم بإزالة برنامج تلفزيوني من أطباق الزجاج فيبرونيكتين المغلفة. عد الخلايا والبذور 30,000 الخلايا على كل طبق زجاج فيبرونيكتين المغلفة مع الوسائط المناسبة كاملة لوحدة تخزين نهائي 1.5 مل.
      ملاحظة: هذه الكثافة خلية يناسب ميفس وسوف يؤدي إلى عدد خلايا غير مؤثر، ولكن ليس الغاية متفرق. عدد الخلايا الدقيقة قد تحتاج إلى تعديل لأنواع الخلايا الأخرى أو غيرها غرفة التصوير.
    7. السماح بانتشار ل 4 ح بعد البذر الخلايا. 2 ح لنشر، نضح وسائط الاستنبات وشطف مرة مع التصوير وسائط الإعلام، وترك 1.5 مل من تصوير وسائل الإعلام.
      ملاحظة: هذه المرة نشر يتناسب مع ميفس ولكن قد تحتاج إلى تغيير للخلايا الأخرى. بيد فترات حضانة أطول من 6-8 ح سيؤدي إلى ترسب بروتين ECM كبيرة من المصل في وسائل الإعلام كاملة. تصوير وسائل الإعلام ينبغي أن تحتوي على إضافات نفسه كوسائط كاملة، لكن ينبغي أن يكون بصريا واضحة ولا تحتوي على أي مركبات فلوريس في قنوات التصوير، مثل فلافينس، أو إخماد الأسفار، مثل الفينول الحمراء. وسائط تصوير مفيدة عموما هو "التصور خلية يعيش" دميم-التجارة والنقل وسائل الإعلام وتستكمل مع الحل نيا FBS و 1% 10%. إذا كان أوتوفلوريسسينسي الخلفية مرتفعة، ثم يمكن تخفيض كمية المصل. إذا لم يكن ممكناً تغيير وسائط بعد الطلاء الأولى، يمكن حراكه الخلايا مباشرة في تصوير وسائل الإعلام وتستكمل مع مثبط التربسين.

2-إعداد المجهر للتصوير

  1. قم بتشغيل المجهر.
    1. قم بتشغيل مصباح القوس الأول.
      ملاحظة: مصباح قوس ستفرج نبض الكهرومغناطيسي، التي يمكن أن تتلف المعدات الأخرى التي قيد التشغيل بالفعل.
    2. قم بتشغيل تصفية عجلة تحكم وتحكم المرحلة الآلي، واجهة الكمبيوتر المجهر، وكاميرا.
    3. قم بتشغيل الليزر فراب والليزر وحدات تحكم الموقف.
      تنبيه: يمكن أن يكون مدمراً أشعة الليزر ذات الطاقة العالية للعيون إذا كان ينظر إلى مباشرة. من المستحسن تكوين نظام المجهر لمنع الإثارة الليزر من توجه إلى القطع العين، الذي يمكن أن يتحقق عن طريق تحريك مرآة في مسار الشعاع فراب أثناء تبيض يعكس الليزر تجاه العينة ومنع انتقال للعدسة.
    4. قم بتشغيل الكمبيوتر وبرنامج حاسوبي لمراقبة مجهر مفتوحة.
    5. السماح لمدة 15 دقيقة لمصباح القوس والليزر فراب الحارة.
  2. معايرة الليزر فراب.
    1. فتح نافذة تكوين ليزر. تعيين إعداد الإضاءة (خلال النبضة) إلى الإعدادات المناسبة في الإضاءة فراب الليزر التعرض للعينة. تعيين الإعداد الإضاءة (أثناء التصوير) على إعدادات الإضاءة المناسبة للتصوير فقط فلوروفوري يقبلون.
    2. حدد هدف لمعايرة تحت الإعداد نظام الإحداثيات. إلغاء يدوياً انقر فوق نقطة المعايرة والتحقق من عرض الصور أثناء المعايرة.
    3. تعيين الوقت يسكن المايكروثانيه 10,000 وعدد النبضات إلى 100.
    4. مكان الشريحة المعايرة، أدلى اثيديوم بروميد مختومة بين شريحة زجاجية وساترة، في مرحلة محول مع الجانب ساترة إلى أسفل.
      تنبيه: اثيديوم بروميد مطفر وينبغي التعامل معها باستخدام القفازات. إذا تم اختراق الشريحة، تتصرف وفقا للمبادئ التوجيهية للمؤسسة.
    5. استخدام إعدادات الإضاءة يقبلون على التركيز على سطح الشريحة، يمكن تحديدها كالطائرة التنسيق مع إشارة ألمع. ستكون مرئية للمساعدة في التركيز على العيوب الصغيرة في الطلاء.
    6. نقل الشريحة إلى منطقة مع الأسفار موحدة عبر الطائرة التصوير.
    7. انقر فوق إنشاء الإعداد. البرنامج سيتم تهيئة عملية المعايرة، تبيض والكشف عن موضع النقطة المبيضة تلقائياً.
    8. ضمان نجاح المعايرة بتقييم الصورة النهائية، والتي سوف تكون شبكة 3 × 3 نقاط المبيضة التي ينبغي أن توزع بالتساوي، وفي التركيز. حفظ الصورة المعايرة للرجوع إليها في المستقبل.
    9. إزالة الشريحة المعايرة وتخزينها بأمان. يجب أن يتم تنفيذ قبل بداية كل تجربة المعايرة لكن لا تحتاج إلى إجراء بين العينات.

3. اختر معلمات لتصوير الحنق

  1. وينبغي إصلاح واحدة من العينات التي تم إنشاؤها الخلايا معربا عن استشعار التوتر مع بارافورمالدهيد 4% للحد الأدنى 10 حل بارافورمالدهيد الميثانول الحرة، غالباً ما يشار إلى الرتبة م، منع يشوه البروتينات الفلورية. مكان في برنامج تلفزيوني بعد التثبيت.
    تنبيه: حلول بارافورمالدهيد مواد سامة. يجب أن يتم تنفيذ هذه الخطوة في غطاء دخان والحل ينبغي أن يتم التخلص من وفقا للسياسات المؤسسية.
    ملاحظة: لا يعتمد هذا التحسين على ديناميات البروتين، وعينه ثابتة يسمح للحد الأقصى لوقت التصوير دون القلق بشأن صحة الخلية.
  2. شطف العينة ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني وترك في برنامج تلفزيوني.
    ملاحظة: استخدام أكثر تجارياً-تركيب وسائل الإعلام المتاحة سوف تؤثر على خصائص فلوروفوري، جعل العينة غير مناسب لبكي التصوير54. ومن الناحية المثالية، سوف يتم تصويرها مباشرة الخلايا، ولكن قد يكون ترك بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. أوقات الانتظار أطول سيؤدي إلى تدهور في العينة.
  3. ضع العينة في حامل مرحلة مجهر للتصوير.
  4. افتح أداة اكتساب متعدد الأبعاد (MDA). إنشاء تصوير متسلسل من القنوات الثلاث: يقبلون فقط الإثارة والانبعاثات (قناة يقبلون) والإثارة المانحين ويقبلون الانبعاثات (الحنق القناة)، والإثارة الوحيدة المانحة والانبعاثات (قناة الجهات المانحة).
    ملاحظة: توجد مجموعة متنوعة من الطرق لعينات الحنق صورة. ينصح بطريقة تصوير يقترن وسيلة لمعايرة النظام لقياس كفاءة الحنق ثلاث قنوات أو "ثلاثة-المكعب" للتوتر القائم على الحنق أجهزة استشعار،من5556. هذا النهج هو سريعة وبسيطة، غير تدميري ويتطلب فقط الأسفار قياسية التصوير المجهر، ويمكن مقارنة التجارب عبر أيام مختلفة وإعدادات التصوير.
  5. مسح العينة باستخدام وقت تعرض 500 مللي ومرشح كثافة محايدة (ND) بنسبة 10%. العثور على خلية معربا عن استشعار التوتر مع الترجمة واضحة لهيكل للفائدة.
  6. حدد وقت تعرض من 500 مللي ثانية أو الطول المطلوب لكل قناة التصوير وعامل تصفية ND 100% والحصول على تسلسل صورة الحنق.
  7. تقدير متوسط كثافة أجهزة الاستشعار في بنيات سوبسيلولار للفائدة في كل قناة التصوير. الإشارات المنخفضة قد تؤدي إلى نتائج غير دقيقة بسبب تصحيح سوء التقديرات، غير linearities في الكشف عن، أو إسهاما كبيرا من الإشارات الخلفية. على مبدأ توجيهي تقريبي لهدف لكثافة أعلى من 10% النطاق الديناميكي للكاميرا (أي.، لكاميرا 16 بت، يجب أن تكون كثافة أعلاه 6,000).
    ملاحظة: يجب استخدام مطابقة إعدادات البصرية (مرات التعرض والمرشحات، والأهداف والمتغيرات الأخرى مثل كسب الكاميرا أو binning) لجميع التجارب الحنق التي سيتم مقارنة. تغيير أي من هذه الإعدادات تؤدي إلى تغيير في كمية الحنق الذي هو أما إنشاء و/أو الكشف عنها في التشكيل مجهرية. قياسات الكفاءة الحنق مستقلة من هذه الإعداد، لكن ليست عوامل المعايرة المستخدمة لتحديد كفاءة الحنق. ومن الناحية النظرية، يمكن أن تستخدم مجموعات مختلفة من العوامل المعايرة لتوليد كفاءات الحنق من إعدادات البصرية المختلفة، ولكن هذا غير مستحسن. تبيض أو الضيائية يمكن أن تختلف بين الإعدادات المختلفة، خلق نتائج زائفة.
  8. الحصول على تسلسل الحنق صورة ثانية لنفس الحقل للعرض. تقدير فوتوبليتشينج بين الإطارات بمقارنة متوسط كثافة من أجهزة الاستشعار في كل قناة التصوير. ينبغي أن تظل فوتوبليتشينج إلى الحد أدنى، يفضل أن تكون أقل من % 1-5 فقدان الإشارة.
  9. ضبط معلمات التصوير إلى أقصى حد الكثافة مع التقليل من فوتوبليتشينج. لتسويات الخشنة، تغيير عامل تصفية ND المستخدمة أثناء اقتناء. بالنسبة للتعديلات الدقيقة، تغيير وقت التعرض في الخطوات من 250 مللي ثانية.
  10. كرر الخطوات من 3.5-3.8 حتى يمكن الحصول على إشارة كافية مع التقليل من فوتوبليتشينج.
    ملاحظة: عادة الإعدادات لاستشعار التوتر فينكولين في ميفس فينكولين-/-هي 1,500 ms و 1,500 مرض التصلب العصبي المتعدد ms 1,000 لقنوات الجهات المانحة، والحنق، ويقبلون على التوالي. ستختلف القيم المثلى مع نوع نظام الإضاءة، والهدف، مجموعات التصفية، واستشعار مستوى التعبير.

4-اختر اربط المعلمات للتصوير

  1. تحسين إعدادات الليزر لضمان تبيض كامل المنطقة من الفائدة (ROI) دون تبييض المنطقة المحيطة بها أو التسبب في د.
    1. إصلاح واحدة من العينات التي تم إنشاؤها من الخلايا معربا عن استشعار التوتر مع بارافورمالدهيد 4% لمدة 10 دقائق.
      ملاحظة: لا يعتمد هذا التحسين على ديناميات البروتين، وعينه ثابتة يسمح للحد الأقصى لوقت التصوير دون القلق بشأن صحة الخلية. كما سيمنع هذا الانتعاش تبيض بالبروتينات المتنقلة، والسماح لعزل تأثير التبييض، تجنب أي آثار من الأسفار السريعة، ونشر بوساطة الاسترداد التي تحدث بين حالات ابيضاض وأخذ الصورة الأولى ما بعد التبييض.
      تنبيه: حلول بارافورمالدهيد مواد سامة. يجب أن يتم تنفيذ هذه الخطوة في غطاء دخان والحل ينبغي أن يتم التخلص من وفقا للسياسات المؤسسية.
    2. شطف العينة 3 مرات مع برنامج تلفزيوني وترك في برنامج تلفزيوني.
      ملاحظة: استخدام أكثر تجارياً-تركيب وسائل الإعلام المتاحة سوف يؤثر على خصائص فلوروفوري، مما يجعل العينة غير مناسب للتصوير54فراب. ومن الناحية المثالية، سوف يتم تصويرها مباشرة الخلايا، ولكن قد يكون ترك بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. أوقات الانتظار أطول سيؤدي إلى تدهور في العينة.
    3. ضع العينة في حامل مرحلة مجهر للتصوير.
    4. فتح نافذة تكوين ليزر. ابدأ بتحديد وقت يسكن ليزر المايكروثانيه 1,000 والبقول 10، بمعنى أن كل بقعة في المسح الضوئي عبر العائد على الاستثمار سوف تتلقى المايكروثانيه 10,000 الليزر الطاقة الكاملة
      ملاحظة: 500 ميغاواط، 515 نانومتر الليزر كان يستخدم للتبييض. واختير هذا التبييض فينوس A206K، يقبلون في استشعار التوتر فينكولين، بشكل انتقائي مع الكفاءة القصوى. إذا كان يتم استخدام أجهزة استشعار التوتر القائم على الحنق مع البروتينات الفلورية الأخرى، قد يكون نوع آخر من الليزر التي ستستخدم.
    5. العثور على خلية معربا عن استشعار التوتر مع الترجمة واضحة لهيكل للفائدة والحصول على صورة.
    6. رسم عائد مستطيل يحدد المنطقة للتبييض وتخزين الموقع العائد على الاستثمار. نبض الليزر. قم بالتقاط صورة أخرى للعينة.
      ملاحظة: يجب أن يكون حجم مربع بحجم كرة القدم كاملة تقريبا. وينبغي الحرص أن حجم مربع لا تختلف جذريا عبر التجارب. ويجب رصد منطقة المبيضة بعناية في البروتينات الديناميات التي تتأثر بنشرها. وهذا هو مصدر قلق محتمل في البروتينات transmembrane، مثل كادهيرينس47، أو البروتينات التي منتشر ببطء27،57.
    7. التحقق من جودة فوتوبليتشينج بالتحقق من أن عائد الاستثمار الكامل هو مقصور مثل أن الكثافة بالقرب من مستويات الخلفية. بالإضافة إلى ذلك، تأكد من أن هناك لم تبيض خارج العائد على الاستثمار.
    8. ضبط إعدادات الليزر حسب الحاجة لتحقيق قدرا كبيرا من تبيض داخل دوروا دون حمل تبيض كبيرة خارج العائد على الاستثمار. لتسويات الخشنة، رفع وخفض الوقت يسكن في خطوات المايكروثانيه 100، وتعديلات دقيقة ورفع وخفض عدد النبضات في خطوات البقول 5.
    9. كرر الخطوات 4.1.5 – 4.1.8 حتى وصلت إلى الحد الأدنى من الإعدادات التي دوروا هو مقصور تماما دون فوتوبليتشينج خارج الهدف.
      ملاحظة: تحقيق قيمة تبيض أولية كبيرة دون حمل لالضيائيه أحد جوانب رئيسية لتحليل فراب. استخدام إعدادات الليزر التي تؤدي التبييض كامل في عينات ثابتة. وبوجه عام، ينبغي استخدام أقل عدد ممكن من الفوتونات لتحقيق المستوى المطلوب تبيض. أيضا، البروتوكول تبيض ينبغي أن تظل متسقة نسبيا خلال التجارب، كما يمكن أن تؤثر التعديلات على قياسات للبروتين ديناميات58.
  2. تحسين الوقت الفاصل بين المعلمات التقاط ديناميات بروتين الفائدة تماما مع التقليل من فوتوبليتشينج.
    1. تعد طريقة إعداد الفحص المجهري للتصوير خلية حية، ويفضل أن يكون ذلك مع مرحلة ساخنة والهدف، فضلا عن مراقبة2 CO. واسمحوا أن حجته لمدة 20 دقيقة.
      ملاحظة: للحفاظ على صحة الخلايا المصورة، درجة الحرارة ودرجة الحموضة يجب الحفاظ على السفينة التصوير. مجموعة متنوعة من مراحل ساخنة وسخانات موضوعية يمكن سهولة الحفاظ على درجة حرارة الخلية عند 37 درجة مئوية. السيطرة على درجة الحموضة للعديد من أنواع الوسائط يمكن إنجازها باستخدام مضخة تمعجية لتمرير هوميديفيد 5% CO2 على العينة في 15 مل/دقيقة بدلاً من ذلك، إذا كان أول أكسيد الكربون2 عنصر التحكم غير متوفر، ويعيش التصوير الوسائط التي تحتوي على هيبيس ينبغي أن تستخدم على منع إجراء تغييرات كبيرة من الأس الهيدروجيني.
    2. مكان واحد من العينات التي تم إنشاؤها الخلايا معربا عن استشعار التوتر إلى صاحب المرحلة المجهر للتصوير. واسمحوا أن حجته لمدة 10 دقائق.
    3. باستخدام أداة جمعية نجمة داود الحمراء، قم بإعداد مرور الزمن للحصول على 3-5 الصور قبل التبييض والتبييض العائد على الاستثمار، ومواصلة اتخاذ الصور 10-60.
      ملاحظة: فينكولين في فاس، التصوير كل 5 ثانية للتبييض بعد 5 دقائق غير كافية لمراقبة الديناميات دون إدخال تبيض المفرط31. يمكن العثور على نقطة انطلاق مفيدة لمعدل التصوير والمدة للعديد من البروتينات الأخرى في الأدب47،48،،من5960.
    4. استخدام يقبلون التصوير الإعدادات التي تقلل تعرض العينة للضوء، مع المحافظة على نسبة إشارة إلى الضجيج كافية، صورة بنية الفائدة. نقطة انطلاق جيدة نصف ND التصفية والتعرض الوقت اللازم للتصوير يقبلون خلال الحنق.
    5. العثور على خلية معربا عن استشعار التوتر مع الترجمة واضحة لهيكل للفائدة والتقط صورة.
    6. رسم عائد مستطيلة لتسليط الضوء على أين التبييض وتخزين الموقع العائد على الاستثمار. الشروع مرور الزمن.
    7. دراسة المجموعة من الصور للقضايا المحتملة.
      1. إذا كان هناك كبير يقفز (أكبر من 10% كثافة الأولية) في استرداد الأسفار بين الإطارات، تقليل الوقت الخطوة بين الإطارات.
      2. إذا كان هناك خسارة عالمية كبيرة من الأسفار مع مرور الوقت (أكثر من 5-10% كثافة الأولية)، تقليل عدد الصور التي اتخذت بعد التبييض و/أو تغيير إعدادات التصوير للحد من التعرض للعينة للضوء.
      3. إذا لم قد استقرت الانتعاش الأسفار بنهاية مرور الزمن، زيادة إجمالي طول مرور الزمن.
    8. ضبط معلمات الوقت الفاصل بين تبعاً لذلك، وكرر الخطوات 4.2.5 – 4.2.7 حتى استرداد الأسفار يتم التقاطها على نحو كاف دون الأضرار الصورة العالمية للعينة.

5-الحصول على بيانات اربط الحنق

  1. تعد طريقة إعداد الفحص المجهري للتصوير خلية حية، ويفضل أن يكون ذلك مع مرحلة ساخنة والهدف، فضلا عن مراقبة2 CO. واسمحوا أن حجته لمدة 20 دقيقة.
    1. للتأكد من صحة الخلايا المصورة، المحافظة على درجة حرارة 37 درجة مئوية في قاعة التصوير. استخدام مضخة تمعجية لتمرير هوميديفيد 5% CO2 على العينة في 15 مل/دقيقة للحفاظ على درجة الحموضة.
    2. بدلاً من ذلك، إذا لم يتوفر التحكم2 CO، استخدام الوسائط التصوير حية تتضمن حبيس للحيلولة دون تغييرات كبيرة من الأس الهيدروجيني.
  2. فتح أداة جمعية نجمة داود الحمراء وإعداد بالحنق التصوير المعلمات، بما في ذلك مجموعات تصفية مختلفة.
  3. حفظ هذا جمعية نجمة داود الحمراء إلى المجلد تجريبية باسم MDA_FRET_Date.
  4. إعداد MDA أخرى مع فراب التصوير المعلمات، بما في ذلك مجموعات التصفية مختلفة وإعدادات الوقت الفاصل بين دفتر اليومية لنبض الليزر بعد اكتساب ما قبل التبييض.
  5. حفظ هذا جمعية نجمة داود الحمراء إلى المجلد تجريبية باسم MDA_FRAP_Date. قم بإغلاق إطار جمعية نجمة داود الحمراء.
  6. في شريط الأدوات في أعلى الشاشة، حدد اليومية | بدء تسجيل.
  7. فتح نافذة جمعية نجمة داود الحمراء، وتحميل الدولة MDA_FRET_Date واضغط الحصول على. ثم تحميل الدولة MDA_FRAP_Date واضغط على الاكتساب.
  8. في نهاية اقتناء، في شريط الأدوات في أعلى الشاشة، حدد اليومية | إيقاف تسجيل.
  9. حفظ هذه المجلة إلى المجلد تجريبية باسم FRETFRAP_Date وإضافتها إلى شريط أدوات لتسهيل الوصول إليها. قم بإغلاق إطار جمعية نجمة داود الحمراء.
  10. مكان واحد من العينات التي تم إنشاؤها من الخلايا معربا عن استشعار التوتر إلى صاحب المجهر للتصوير. واسمحوا أن حجته لمدة 10 دقائق.
  11. انتقل العينة باستخدام اقتناء الصورة تحت الحصول على | الحصول على مع الحد الأدنى من التعرض الوقت ووفيات المواليد تصفية لتحديد خلايا الفائدة.
  12. تعيين اوتوفوكس المستمر عن طريق الانتقال إلى الأجهزة | التركيز. التركيز يدوياً على العينة حتى وصلت إلى الطائرة التصوير الصحيح.
  13. انقر فوق تعيين التركيز المستمروالانتظار للنظام لضبط، وانقر فوق بدء التركيز المستمر.
    ملاحظة: هذا غير مطلوب، ولكن يحسن بشكل ملحوظ نوعية منحنيات استرداد فراب لأنه يمنع العينة من الانجراف خارج نطاق التركيز.
  14. العثور على خلية معربا عن استشعار التوتر مع الترجمة واضحة لهيكل للفائدة والتقط صورة.
  15. رسم عائد مستطيلة لتسليط الضوء على مكان التبييض. تخزين الموقع العائد على الاستثمار.
  16. تهيئة FRETFRAP_Date اليومية، التي سوف تبدأ في الحصول على صور الحنق متبوعاً بتهيئة فراب الوقت الفاصل بين.
  17. كرر الخطوات من 5.14-5.16 حتى يتم الحصول على 10-15 صورة مجموعات.
    ملاحظة: لا يمكن تكرار القياس في نفس الخلية. بمجرد حدوث فوتوبليتشينج الحنق البيانات لا يمكن الاعتماد عليها.

6-تحليل البيانات اربط الحنق

  1. تحليل الصور الحنق باستخدام برمجيات الاختيار.
    ملاحظة: هناك عدة طرق للصورة، والحنق61، بما في ذلك راتيوميتريك الحنق62 والحنق الفهرس34،35كوانتيتاتي. ومع ذلك، ينصح باستخدام تقديرات الحنق الكفاءة55،63 لتفسير البيانات اربط الحنق. انظر المناقشة لمزيد من الاستكشاف لهذا الموضوع. لانبعاث وعي وحساب كفاءة الحنق، تتوفر برامج مخصصة من "مختبر هوفمان" في https://gitlab.oit.duke.edu/HoffmanLab-Public.
  2. تحديد المعلمات ذات الصلة لكل هيكل سوبسيلولار الذي كان أبيض. وهذا ينبغي أن تشمل متوسط الحنق مؤشر/الكفاءة ومتوسط يقبلون الأولى كثافة (يتناسب مع تركيز) لكن يمكن أن تشمل أيضا البارامترات الفيزيائية مثل حجم العائد على الاستثمار.
  3. تحليل الصور فراب باستخدام برمجيات الاختيار.
    ملاحظة: هناك عدة طرق كوانتيتاتي فراب26،27،،من2829. وتشمل الشواغل التجريبية الرئيسية المحاسبة للتبييض خلال التبييض بعد انتهاء التصوير، والتغيرات في كثافة الخلفية وازفاء هياكل سوبسيلولار ديناميكية للغاية، مثل الالتصاقات المحورية. تبيض التصويبات والاختلافات في الإضاءة الخلفية يمكن أن يتحقق من خلال تحليل المناطق غير مقصور وغير الفلورية للصور. هياكل سوبسيلولار ديناميكية للغاية، لا سيما تلك التي تظهر ديناميات النمو أو التفكيك المفرط غير متوافقة مع معيار فراب تحاليل ولم يتم تحليلها. بالإضافة إلى ذلك، هناك مجموعة متنوعة من الطرق لتطبيع البيانات. المبادئ التوجيهية المقدمة لتحليل أبسط.
  4. تصحيح بيانات الاسترداد للتبييض الآثار وتطبيع ثم مرحلة ما قبل التبييض الكثافات. التحديد الكمي النصف الوقت للانتعاش والكسر المتنقلة وفقا للمعادلة التالية28،34:
    وسط-(وسط-Ro) ﻫ-كيه
    أين هو وسط الكسر المتنقلة، Rس هو الانتعاش الأولى، وهو ك معدل الاسترداد. يتحدد النصف الوقت للاسترداد:
    Τ1/2 = ln 2/ك.
    ملاحظة: توجد مجموعة متنوعة من حزم البرمجيات المتاحة للعموم لإكمال هذه التحليلات64 ، فضلا عن مجموعة متنوعة من الإضافات إيماجيج. تتوفر برامج مخصصة من "مختبر هوفمان" في https://gitlab.oit.duke.edu/HoffmanLab-Public. ينبغي استخدام مزيد من التحليلات للحالات حيث يؤثر على نشر القوى المحركة لبروتين الفائدة، جداول زمنية متعددة تتجلى في الانتعاش، أو تستخدم الهندسات تبيض غير قياسي.

7-تفسير البيانات اربط الحنق

  1. تجميع المعلومات ذات الصلة لكل العائد على الاستثمار بما في ذلك: الحنق مؤشر/الكفاءة، كثافة يقبلون، فراب بنصف دوام، وكسر الجوال فراب.
    ملاحظة: يتم استخدام مؤشر الحنق أو الكفاءة لتحديد متوسط الحمولة عبر البروتين داخل العائد على الاستثمار. كثافة يقبلون التدابير المحلية تركز البروتين. نصف الوقت للتعافي مقياس لديناميات البروتين. أصغر نصف وقت يشير إلى معدل دوران أسرع. كسر الجوال فراب تدابير كمية البروتين داخل العائد على الاستثمار التي تحول بفعالية أكثر. كسر الجوال أكبر تشير إلى أن نسبة كبيرة من البروتين داخل العائد على الاستثمار هو تقليب.
  2. للتحقيق في تأثير التركيز المحلي على معدل دوران البروتين وكمية، مؤامرة كسر نصف الوقت والمتنقلة فراب ضد كثافة يقبلون الأولية.
  3. للتحقيق في تأثير تحميل البروتين على معدل دوران البروتين وكمية، مؤامرة كسر نصف الوقت والمتنقلة فراب ضد الحنق مؤشر/الكفاءة.
    ملاحظة: اعتماداً على البروتين أو بنية، كما لعله مثيرة للاهتمام لدراسة آثار البارامترات الفيزيائية، مثل حجم البنية أو الانحراف، على تحميل البروتين أو الدوران.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

بكى--فراب تتكون من المزيج من اثنين من التقنيات الفلورسنت، وتآكل وفراب. كما ركزنا على آثار الحمل البروتين، استخدمنا التوتر القائم على الحنق مجسات34،46. أجهزة الاستشعار هذه كثيرا ما تستند إلى توتر الاستشعار عن الوحدة تتألف من اثنين من البروتينات الفلورية، مثل mTFP1 و VenusA206K، متصلة بواسطة رابط فلاجيليفورم (الشكل 1A). عندما يتم وضع الوحدة النمطية بين المجالات رأس وذيل من البروتين، من الممكن لقياس الحمولة التي تمارس عبر البروتين. عند تحليل البيانات الحنق، الصور التي التقطت في قناة يقبلون تستخدم لتقييم التعريب استشعار التوتر والتركيز، وهذه إشارة مستقلة عن الحنق (الشكل 1B). بعد حساب الكفاءة الحنق، يمكن تصور تحميل البروتين على نطاق اللونية انخفاضا في كفاءة الحنق تجاه الألوان برودة يدل على زيادة في الحمولة البروتين، حيث الكفاءة الحنق في النطاق الأحمر تشير إلى تحميل منخفض البروتين ( الشكل 1B). ويجري تصوير فراب باستخدام ليزر للتبييض fluorophore يقبلون في انتعاش هيكل ورصد سوبسيلولار واحدة على مر الزمن (الشكل 1). يمكن تحليل المنحنى فراب تطبيع الناتجة لاستخراج المعلمات وصف ديناميات البروتين، بما في ذلك النصف الوقت للانتعاش وكسر الجوال (الشكل 1). لأنه أجريت التحاليل الحنق وفراب في نفس الخلية، يمكن رسم البروتين متوسط الحمولة وتبدل في بنية سوبسيلولار كنقطة واحدة. التصوير متعددة الخلايا يؤدي إلى نقاط متعددة واتجاه ناشئ يمكن أن تشير إلى ما إذا كان بروتين زعزعة استقرار (الشكل 1E) أو استقرت بتحميل الجزيئية (الشكل 1F).

استشعار التوتر فينكولين (فينتس) وأعرب عن ستابلي في فينكولين يموضع MEFs فارغة واضح جداً لمنظمة تضامن النساء الأفريقيات منتشرة في جميع أنحاء الخلية، كما يتضح من خلال النظر في الصورة قناة يقبلون (الشكل 2A). صورة قناة يقبلون يستخدم لإنشاء قناع تجزئة يعرف كل اتحاد كرة القدم الفردية مع معرف فريد، عينت بصريا بألوان مختلفة (الشكل 2). استناداً إلى أسلوب "المياه" خوارزمية التجزئة وتسميات منظمة تضامن النساء الأفريقيات تقريبا من أجل السطوع، كما هو موضح سابقا34،65. يتم تحويل نتائج الانقسام إلى قناع ثنائي ثم تطبيقها على نتائج الكفاءة الحنق (الشكل 2)، ويتم حساب متوسط الكفاءة الحنق داخل كل اتحاد كرة القدم فريدة من نوعها (الشكل 2D). يمكن حساب خصائص إضافية لكل اتحاد كرة القدم بطريقة مماثلة، بما في ذلك يقبلون متوسط كثافة وحجم وانحراف ومكان داخل الخلية. بهذه الطريقة، يمكن أن يقابل أيهما يتم اختيار اتحاد كرة القدم من أجل فراب FA المعرف الفريد والخصائص المقترنة.

تصوير فراب وتحليل حساس للعديد من العوامل التي يمكن السيطرة عليها، بما في ذلك الليزر والتصوير المعلمات، وبعض العوامل التي لا يمكن التحكم بها، مثل الكلي فا الاستقرار26،،من2728، 29. على سبيل المثال، يمكن أن يؤدي أكثر من اللازم التعرض للضوء خلال الوقت الفاصل بين التصوير للقضايا الرئيسية في تفسير البيانات فراب. على الرغم من أن يمكن استخدام تحليل مراقبة منظمة تضامن النساء الأفريقيات، التي كانت غير مقصور على تطبيع للقصر فوتوبليتشينج على مر الزمن، مع تعرض الكثير من العينة للضوء، يبين المنحنى فراب الناتجة انتعاش أولى متبوعة بتراجع في كثافة طبيعية أن لا يمكن أن يكون لائقاً بدقة مع دالة آسيه. إذا كان من الملاحظ استمرار هذا التأثير في البيانات، من الضروري إعادة تحسين المعلمات التصوير لتقليل زمن التعرض للضوء، وزيادة الوقت الخطوة بين إطارات التصوير، أو تقليل طول الوقت الفاصل للحد من التعرض للعينة للضوء.

مثال آخر للبيانات فراب أونينتيربريتابل، وهو عند اتحاد كرة القدم الذي كان فوتوبليتشيد ترانسلوكاتيس سرعة أثناء استرداد28. يتم عرض حالة ممثلة إزفاء المفرط في الشكل 3. الصورة الأولى، حيث يتم اختيارها رويس، لا تعطي مؤشرا لاتحاد كرة القدم الاستقرار (الشكل 3A). رصد اتحاد كرة القدم المبيضة على مر الزمن، فإنه يتحرك بسرعة بعيداً عن الموقف المبدئي والتتبع الآلي قادر على تتبع مباشرة بسبب إشارة الفلورية منخفضة بعد فوتوبليتشينج (الشكل 3A). ويبين المنحنى فراب الناتجة عن مرحلة أولية من انتعاش طفيف مع القفز الأسفار عند استرداد ما يكفي للبرنامج للكشف عن اتحاد كرة القدم ونقل العائد على الاستثمار (الشكل 3B). لا يمكن أن يكون لائقاً هذا المنحنى بنجاح قبل دالة آسيه. إزفاء السريع لاتحاد كرة القدم يوحي أيضا بأن هيكل اتحاد كرة القدم غير مستقرة. وهكذا، ينبغي إدراج فاس غير مستقرة لا في نفس التحليل اربط الحنق كفاس مستقرة، بسبب القضايا التقنية والبيولوجية على حد سواء.

مع بيانات الحنق وفراب مرضية، هو استكمال الخطوة التالية تحليل الحنق-فراب بتقييم في الوقت نفسه تحميل البروتين والديناميات. يظهر الشكل 4A خرائط الكفاءة الحنق فينكولين الثلاثة فارغة MEFs ستابلي الإعراب عن فينتس. واختيرت منظمة تضامن النساء الأفريقيات المبينة باللون الأبيض لتحليل فراب، وتظهر كثافات يقبلون على مر الزمن. هذه منظمة تضامن النساء الأفريقيات الثلاثة قد فينكولين تحت كميات مختلفة من تحميل وعرض ملف استرداد فينكولين مختلفة. التحديد الكمي لهذه الخصائص بحساب النصف الوقت للتعافي والتآمر ضد متوسط الكفاءة الحنق في كل اتحاد كرة القدم يوضح الاتجاه العام من فينكولين التي استقرت بزيادة التحميل (الشكل 4 باء). بيد أن الكسر المتنقلة تآمروا ضد الكفاءة الحنق يبين لا الاتجاه، مما يوحي بأن كسر الجوال لا ينظم تحميل الجزيئية (الشكل 4). إدخال نقطة تحول فينتس في 50 من الأحماض الأمينية (A50I) قد ثبت لمنع الربط فينكولين إلى شريك ربط رئيسية داخل منظمة تضامن النساء الأفريقيات، تالين66. يؤثر تغيير هذا التفاعل البروتين-بروتين ديناميات القوة الحساسة فينكولين. وقد ميفس فارغة فينكولين ستابلي معربا عن A50I فينتس خلية مختلفة واتحاد كرة القدم مورفولوجيس، فينكولين مختلفة تحميل التشكيلات الجانبية، وديناميات مختلفة فينكولين (الشكل 4). التحديد الكمي للنصف-أوقات الانتعاش والكفاءة الحنق والتآمر ويبين أنه عند تفاعل فينكولين-تالين منزعجة، فينكولين في فاس هو تؤدي إلى زعزعة زيادة التحميل (الرقم 4E) حين كسر الجوال يظهر أي اتجاه (4F الشكل ).

Figure 1
رقم 1: مبادئ تقنية اربط الحنق. (أ) التخطيطي وحدة استشعار التوتر القائم على الحنق (تسمود) إدراج في وتين اهتمام وتأثير التوتر على إشارة الحنق. (ب) لتحديد حجم الحنق استخدام الانبعاثات توعية، يتم أخذ صور لالتقاط إشارة الجهات المانحة (غير معروضة) ويقبلون إشارة وإشارة الحنق. مع التصحيحات المناسبة، يمكن تعيين الصورة الحنق مقياس قياس ألوان لتصور مدى التوتر يتم تطبيقها على أجهزة الاستشعار. (ج) فراب يجري استخدام إشارة يقبلون، الذي طرديا مع التركيز. (د) تحليل التصوير فراب ينتج منحنيات شدة الأسفار مع مرور الوقت يمكن أن يكون لائقاً باستخدام النماذج الرياضية لتحديد الديناميات البروتين. (ه، و) عندما يتم الجمع بين الحنق وفراب، ويمكن قياس قوة والدوران في FA واحد. قياس متعددة منظمة تضامن النساء الأفريقيات في خلايا متعددة غلة علاقة بين تحميل البروتين ودوران البروتين. في هذا التحليل، هو علاقة في التي يرتبط زيادة التحميل مع زيادة معدل دوران المشار إليها كدولة تؤدي إلى زعزعة قوة (ه). في هذا التحليل، وهو علاقة التي يرتبط زيادة التحميل مع انخفاض معدل دوران المشار إليها كدولة استقرت القوة (F). وقد تم تعديل هذا الرقم من روثنبرغ et al. 37- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: تحديد اتحاد كرة القدم وتحليل الحنق. (أ) فينكولين فارغة MEF معربا عن فينتس تصور في القناة يقبلون، حيث يشير إلى الشدة تركيز فينكولين المحلية. شريط المقياس = 30 ميكرومتر. (ب) فاس هي مجزأة استناداً إلى القناة يقبلون لإنشاء قناع "معرف اتحاد كرة القدم" حيث كل اتحاد كرة القدم يتم تعيين معرف فريد، كما هو موضح هنا بألوان مختلفة، تقريبا في الترتيب للسطوع. (ج) قناع "معرف فا" تحويله إلى قناع ثنائي وتطبيق صورة الكفاءة الحنق لإظهار قيم الكفاءة الحنق فقط في فاس. (د) كفاءة الحنق داخل كل اتحاد كرة القدم هو المتوسط للحصول على قيمة واحدة لكل اتحاد كرة القدم، ومقترنة "معرف اتحاد كرة القدم" في جدول بيانات الإخراج. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: مثال على فا ترانسلوكاتينج. (أ) فينكولين هو تصور MEF فارغة معربا عن استشعار متحولة A50I فينتس في القناة يقبلون، مع جدول الألوان المقلوب للوضوح. شريط المقياس = 30 ميكرومتر. واختير اتحاد كرة القدم المبينة باللون الأسود للتبييض. التكبير في الصور تظهر تطور كرة القدم على مر الزمن مع الإطار الأحمر تشير إلى حيث حددت البرنامج اتحاد كرة القدم. شريط المقياس = 2 ميكرومتر. (ب) المنحنى فراب طبيعية الناتجة من البيانات في (ألف). هناك حوالي 5% في القفز في أعقاب كثافة النقطة 3 الناتجة عن اتحاد كرة القدم ترانسلوكاتينج بسرعة قبل استرداد كافية للبرنامج للكشف عن التغيير في موقع اتحاد كرة القدم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: الممثل الحنق اربط نتائج. (A) فينكولين ميفس فارغة معربا عن فينتس عرضها كصور الكفاءة الحنق متوسط الخلية بأكملها (شريط مقياس = 30 ميكرومتر) مع التكبير في مقلوب يقبلون قناة الصور التي تبين تطور الانتعاش فراب (شريط مقياس = 2 ميكرومتر). (ب) فراب نصف الوقت لاسترداد رسم مقابل الكفاءة الحنق للخلايا 32، مع النقاط التي تمثل الخلايا في (أ) تمييز باللون الأحمر. (ج) فراب كسر الجوال تآمروا ضد الكفاءة الحنق لنفس الخلايا في (ب). (د) فينكولين ميفس فارغة معربا عن استشعار متحولة A50I فينتس عرضها كصور الكفاءة الحنق متوسط الخلية بأكملها (شريط مقياس = 30 ميكرومتر) مع التكبير في مقلوب يقبلون قناة الصور التي تبين تطور الانتعاش فراب (مقياس بار = 2 ميكرومتر). (ه) فراب نصف الوقت لاسترداد رسم مقابل الكفاءة الحنق للخلايا 21، مع النقاط التي تمثل الخلايا في (د) تمييز باللون الأحمر. (و) اربط الجوال كسر تآمروا ضد الكفاءة الحنق لنفس الخلايا في (ه). وصدرت بيانات أصلاً في روثنبرغ et al. 37 وهي تصور هنا في شكل جديد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

يسمح أسلوب اربط الحنق للقياس المباشر لديناميات بروتين القوة الحساسة، خاصية التي كان من الصعب لمباشرة التحقيق داخل الخلايا الحية. حساسية البروتين ديناميات لتحميل الجزيئية أمر حاسم لوظيفة البروتين كقوة جهاز الإرسال أو محول الطاقة. تحميل مطلوب لنقل المولدة داخليا على حد سواء وقوات تطبيق خارجياً، يسمى ميتشانوترانسميشن، لتحويل تلك القوات إلى إشارات قابلة للاكتشاف المتحلل، يسمى ميتشانوترانسدوكشن. بيد التعديلات في الحمل يمكن أن تؤثر على مدة بروتين يبقى منضم، وبالتالي، أقل وقت تنفق بروتين تحمل حمولة، فرصة أقل القوة قد أحال إلى غيرها من البروتينات أو ترانسدوسيد إلى إشارة المتحلل القابلة للاكتشاف ولمست. طريقة اربط الحنق يسد الفجوة بين مستوى الجزيئية والخلوية بالسماح لقياسات الحجم الجزيئي لديناميات القوة الحساسة يمكن الوصول إليها ضمن سياق أوسع خلوية. وعلاوة على ذلك، فإنه يسمح لهذه المقاييس الواجب اتخاذها أثناء مقاومة البيئة داخل الخلايا أو خارج الخلية أما كيميائيا أو ميكانيكيا. ينبغي أن تكون هذه التقنية المطبقة على أي جهاز استشعار التوتر القائم على الحنق، مما يسمح لتحقيق الدولة البروتين الميكانيكية في مجموعة متنوعة من الهياكل سوبسيلولار وسياقات خارج الخلية.

خطوات حاسمة في ضمان أن يتم الحصول على القياسات المطلوبة اربط الحنق تنطوي على الاستفادة المثلى من تصوير المعلمات والقيام بتحليل البيانات وتفسيرها. الأمثل المعلمات التصوير، كما هو موضح في البروتوكول، من الضروري أن يحد د للعينة، بينما تسمح للهياكل المطلوبة وديناميات ينبغي تمييز وقوة إشارة كافية لحساب الحنق. وسيسهل إنشاء هذه المعلمات التصوير لخط خلية معينة والبروتين من الفائدة في وقت مبكر مقارنة مباشرة بين مختلف المجموعات التجريبية. تجدر الإشارة إلى أن إدخال تغييرات على النظام، مثل تحور بروتين الفائدة أو الأخذ بمثبطات، يمكن أن يؤدي إلى التغيرات في ديناميات والتعريب البروتين (وبالتالي تغيير كثافة إشارة). ينبغي تمكين المعلمات الأمثل مقاييس واضحة ودقيقة عبر كافة الشروط التجريبية. لذلك، من المستحسن اختيار المعلمات التي لا نهاية المدقع كونها مفيدة، على سبيل المثال، يجري قادرة بالكاد يميز الإشارات من الضوضاء.

في حين وصف المجهر ابيفلوريسسينسي ووحدة الليزر فراب المرفقة بالتصوير في هذا البروتوكول، الحنق-فراب ينطبق على نظم التصوير الأخرى. على سبيل المثال، هذا الأسلوب يمكن تكييفه على خط المسح مجاهر [كنفوكل]، فضلا عن القرص الغزل مجاهر [كنفوكل] مع وحدة نمطية فوتوبليتشينج مرفقة. ينبغي أن يكون الأمثل إعدادات التصوير بطريقة مماثلة لتحقيق إشارة كافية إلى الضوضاء دون التسبب في د أو فوتوبليتشينج المفرطة. وبخاصة فيما يتعلق بتصوير الحنق، الكم عالية الكفاءة للكشف عن مطالبون بالحصول على إشارة كافية لنجاح الحنق الحساب دون أحداث أضرار fluorophore. وهناك عدد من المنشورات التي تصف التصوير الحنق أو فراب منفصلة باستخدام مجهر [كنفوكل]67،68،69، التي يمكن استخدامها لتوجيه الأمثل لتصوير الحنق-فراب.

بعد التجربة، ينبغي أن تعامل بعناية وتؤدي بطريقة استنساخه، ويفضل أن يكون ذلك الآلي، تحليل البيانات. بسبب عجز عن التبييض أكثر من 2-3 المناطق سوبسيلولار في خلية واحدة قبل تبيض كثيرا تجمع المتوفرة من البروتين، الإنتاجية من هذا الأسلوب محدودة نسبيا. وبالتالي، غالباً ما الجمع بين مجموعات البيانات عبر عدة أيام للتصوير، والتي تتطلب العلاج متسقة من البيانات. الحنق وفراب عرض التحديات مع تحليل البيانات. فهرس الحنق وقياسات الكفاءة الحنق تسمح بإجراء تقييم كمي لتحميل البروتين. فهرس الحنق هو قياس نسبي أن تعتمد اعتماداً كبيرا على إعدادات المجهر، في حين بكى قياسات الكفاءة مطلقة ومستقلة عن مجهر إعدادات55،70. ونحن قد أظهرت مؤخرا أن أسلوب المتقدمة سابقا باستخدام تصوير "الثلاثة-المكعب" يمكن استخدامها لتحديد كفاءة الحنق من قياسات للانبعاثات توعية عادة ما تحدد كمياً مع مؤشر الحنق عند استخدام أجهزة استشعار التوتر القائم على الحنق56 . قياسات الكفاءة الحنق مطلوبة إذا أريد أن تكون محسوب34قياسات تجربة القوات المطلق بأجهزة استشعار التوتر. الخلايا معربا عن أجهزة استشعار التوتر القائم على الحنق، قد إعادة تجميع خلايا مستقرة خصوصا في أرقام المرور عالية، أو الحط من أجهزة الاستشعار، وتؤدي إلى بيانات غير صالحة للاستعمال في الحنق50. وهذا يسهل التعرف عند حساب نسب المانحين إلى يقبلون أثناء الحساب تآكل الكفاءة37،56 ولكن قد يكون من الصعب الكشف عن استخدام الفهرس الحنق. عند بدء تشغيل مع جهاز استشعار توتر القائم على الحنق، يمكن أن تكون مفيدة للحصول على مجموعة كبيرة من البيانات (> 50 الخلايا) من الحنق البيانات فقط على بنيات ذات الأهمية لتحديد كفاءات النطاق المتوقع للحنق. بالإضافة إلى ذلك، قد يكون من الصعب على استخراج من الهياكل التي جداً المتنقلة، مثل منظمة تضامن النساء الأفريقيات سرعة الانزلاق أو تفكيك البيانات فراب. تحديد يتدنى هياكل أو تحسين ظروف طلاء الخلية للتخفيف من هذا الأثر يمكن أن تساعد للتقليل من هذه المشكلة.

في المفهوم، اربط الحنق يمكن تطبيقها على أي جهاز استشعار تستند إلى الحنق في أي منطقة سوبسيلولار، مع التحسين الصحيح. في الممارسة العملية، قد يكون من الصعب على التقاط ديناميات القوة الحساسة من البروتينات التي ليست تحت تحميل ميكانيكية كبيرة أو أن يكون النصف-أوقات الانتعاش في مقياس الوقت قصير جداً لبضع ثوان أو على المقياس الزمني الطويل لعشرات الدقائق. نتائج دراسات جزيء واحد يمكن الإشارة إلى أن البروتينات التي قد تثبت ديناميات القوة الحساسة داخل الخلايا الحية. حتى الآن، وهذا يشمل العديد من اتحاد كرة القدم وجعفر البروتينات13،14،،من1516 ، فضلا عن بعض العناصر سيتوسكيليتال71،72،73. مصادفة، تم تصميم أجهزة الاستشعار المستندة إلى الحنق للعديد من هذه البروتينات46. هذه النتائج يمكن توجيه اختيار بروتين اهتمام؛ ومع ذلك، ينبغي أن لا يتوقع أن اربط الحنق البيانات ستعكس تماما النتائج التي تسفر عنها هذه الدراسات جزيء واحد. في الواقع، قد يحجب البيوكيميائية التنظيم، التفاعل مع البروتينات، وهيكل cytoskeletal المحلية الأخرى، أو تغيير، تأثير قوي على تفاعلات البروتين البروتين. القدرة على مراقبة هذه التعقيدات قوة فريدة من نوعها لنهج اربط الحنق.

يمكن استخدام مزيج من التلاعب بالخلية والبروتين من الفائدة لتوضيح العوامل الهامة في تنظيم ديناميات البروتين. على سبيل المثال، يمكن أن تكون مفيدة لأجهزة استشعار التي قوة غير متحسسة، أما عن طريق الحذف أو طفرة قوة ملزمة المجال35،74 كما ينبغي أن يكون هناك لا اعتماد ديناميات دوران البروتين على القوة التي أبلغت عنها أجهزة الاستشعار. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن توفر الطفرات الأخرى مواقع الربط الحرجة أو مواقع الفسفرة في البروتين صورة أكثر اكتمالا عن كيف يجري تنظم بروتين الفائدة. إجراء تغييرات عالمية للخلية أو بالبيئة عن طريق مثبطات سيتوسكيليتال أو بواسطة تغيير خصائص الركازة (مثلاً: المصفوفة خارج الخلية أو تصلب)، على التوالي، يمكن أن يساعد في تحديد كيفية الاستجابة ديناميات القوة الحساسة من البروتين الاضطرابات الميكانيكية. الجمع بين المعلومات المتعلقة بتحميل البروتين وديناميات القوة الحساسة مع الخصائص الفيزيائية الحيوية الأخرى من البروتين يمكن أن تساعد إقامة دولة الميكانيكية من بروتين الفائدة. يمكن أن يشمل هذا التعريب والتفاعلات المحلية البروتين-بروتين داخل75،هيكل سوبسيلولار76. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تتواجد البروتين في تشكيل مختلف الدول، حتى داخل نفس الهيكل سوبسيلولار، تبعاً لسياق76،77. تحميل البروتين، وديناميات، والترجمة، ويمكن أن تكيف جميع تتأثر في الوقت نفسه القوى المولدة داخليا وخارجياً تطبيقها37،76،،من7879، يملي دور البروتين في انتقال القوة وميتشانوترانسدوكشن. ينبغي أن تمكن براعة الأسلوب اربط الحنق وتوافقه المحتملة مع مجموعة متنوعة من البروتينات والتلاعب في توضيح التفاعل بين الميكانيكا السائبة، وديناميات البروتين، ومما يشير إلى ميتشانوسينسيتيفي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

وأيده هذا العمل جائزة "المهنة مؤسسة العلوم الوطنية" (NSF-CMMI-14-54257) فضلا عن المنح المقدمة من جمعية القلب الأمريكية (16GRNT30930019)، والمعاهد الوطنية للصحة (R01GM121739-01) منحت للدكتور عبدالله حسين هوفمان ووطنية العلوم مؤسسة الدراسات العليا البحوث منحة "الزمالة" إلى روثنبرغ كاترين. المحتوى هي المسؤولة الوحيدة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية لجبهة الخلاص الوطني أو المعاهد الوطنية للصحة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin-EDTA Thermo Fisher 25300062
16% Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 30525-89-4
60x Objective NA1.35 Olympus UPLSAPO 60XO
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) Gibco 15240-062
Automated Stage Prior Scientific H117EIX3
Custom Dichroic Mirror Chroma Technology Corp T450/514rpc
Custom mTFP1 Emission Filter Chroma Technology Corp ET485/20m
Custom mTFP1 Excitation Filter Chroma Technology Corp ET450/30x
Custom Venus Excitation Filter Chroma Technology Corp ET514/10x
DMEM-gfp Live Cell Visualization Medium Sapphire MC102
Dulbecco's Modified Eagle's Medium  Sigma Aldrich D5796 with L-glutamine and sodium bicarbonate
Fetal Bovine Serum HyClone SH30396.03
Fibronectin, Human Corning 47743-654
FRAPPA Calibration Slide Andor provided along with FRAPPA unit
FRAPPA System with 515 nm Laser Andor
Glass-bottomed Fluoro Dishes World Precision Instruments FD35
HEK293-T Cells ATCC CRL-3216
Hexadimethrine Bromide, Polybrene Sigma Aldrich H9268-5G
High-glucose Dulbecco's Modified Eagle's Medium Sigma Aldrich D6429
Inverted Fluorescent Microscope Olympus IX83
JMP Pro Software SAS
Lambda 10-3 Motorized Filter Wheels Sutter Instruments LB10-NW
LambdaLS Arc Lamp with 300W Ozone-Free Xenon Bulb Sutter Instruments LS/OF30
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-027
MATLAB Software Mathworks
MEM Non-Essential Amino Acids Thermo Fisher 11140050
MetaMorph for Olympus Olympus
Micro-Humidification System Bioptechs 130708
MoFlo Astrios EQ Cell Sorter Beckman Coulter B25982
Objective Heater Medium Bioptechs 150819-13
OptiMEM Thermo Fisher 31985070
Phosphate Buffered Saline Sigma Aldrich D8537
pMD2.G Envelope Plasmid Addgene 12259
pRRL Vector gift from Dr. Kam Leong (Columbia University)
psPax2 Packaging Plasmid Addgene 12260
sCMOS ORCA-Flash4.0 V2 Camera Hamamatsu Photonics C11440-22CU
Sorvall Legend XT/XF Centrifuge Thermo Fisher 75004505
Stable Z Stage Warmer Bioptechs 403-1926
Venus Emission Filter Semrock FF01-571/72

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DuFort, C. C., Paszek, M. J., Weaver, V. M. Balancing forces: architectural control of mechanotransduction. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12, (5), 308-319 (2011).
  2. Mammoto, T., Ingber, D. E. Mechanical control of tissue and organ development. Development. 137, (9), 1407-1420 (2010).
  3. Sun, Y., Chen, C. S., Fu, J. Forcing stem cells to behave: a biophysical perspective of the cellular microenvironment. Annual Review of Biophysics. 41, 519-542 (2012).
  4. Wozniak, M. A., Chen, C. S. Mechanotransduction in development: a growing role for contractility. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, (1), 34-43 (2009).
  5. Broders-Bondon, F., Nguyen Ho-Bouldoires, T. H., Fernandez-Sanchez, M. E., Farge, E. Mechanotransduction in tumor progression: The dark side of the force. The Journal of cell biology. 217, (5), 1571-1587 (2018).
  6. Simmons, R. D., Kumar, S., Jo, H. The role of endothelial mechanosensitive genes in atherosclerosis and omics approaches. Archives of Biochemistry and Biophysics. 591, 111-131 (2016).
  7. Wells, R. G. Tissue mechanics and fibrosis. Biochimica et Biophysica Acta. 1832, (7), 884-890 (2013).
  8. Lele, T. P., et al. Mechanical forces alter zyxin unbinding kinetics within focal adhesions of living cells. Journal of Cellular Physiology. 207, (1), 187-194 (2006).
  9. Hoffman, B. D., Grashoff, C., Schwartz, M. A. Dynamic molecular processes mediate cellular mechanotransduction. Nature. 475, (7356), 316-323 (2011).
  10. Dembo, M., Torney, D. C., Saxman, K., Hammer, D. The reaction-limited kinetics of membrane-to-surface adhesion and detachment. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 234, (1274), 55-83 (1988).
  11. LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Hoffman, B. D. Molecular-Scale Tools for Studying Mechanotransduction. Annual Review of Biomedical Engineering. 17, 287-316 (2015).
  12. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5, (6), 491-505 (2008).
  13. Kong, F., Garcia, A. J., Mould, A. P., Humphries, M. J., Zhu, C. Demonstration of catch bonds between an integrin and its ligand. The Journal of Cell Biology. 185, (7), 1275-1284 (2009).
  14. Rakshit, S., Zhang, Y., Manibog, K., Shafraz, O., Sivasankar, S. Ideal catch, and slip bonds in cadherin adhesion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, (46), 18815-18820 (2012).
  15. del Rio, A., et al. Stretching Single Talin Rod Molecules Activates Vinculin Binding. Science. 323, (5914), 638-641 (2009).
  16. Seddiki, R., et al. Force-dependent binding of vinculin to alpha-catenin regulates cell-cell contact stability and collective cell behavior. Molecular Biology of the Cell. 29, (4), 380-388 (2018).
  17. Huang, D. L., Bax, N. A., Buckley, C. D., Weis, W. I., Dunn, A. R. Vinculin forms a directionally asymmetric catch bond with F-actin. Science. 357, (6352), 703-706 (2017).
  18. Chrzanowska-Wodnicka, M., Burridge, K. Rho-stimulated contractility drives the formation of stress fibers and focal adhesions. The Journal of Cell Biology. 133, (6), 1403-1415 (1996).
  19. Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin-cytoskeleton linkages. Cell. 88, (1), 39-48 (1997).
  20. Liu, Z., et al. Mechanical tugging force regulates the size of cell-cell junctions. Proceedings of the National Academy of Science. 107, (22), 9944-9949 (2010).
  21. Riveline, D., et al. Focal contacts as mechanosensors: externally applied local mechanical force induces growth of focal contacts by an mDia1-dependent and ROCK-independent mechanism. The Journal of Cell Biology. 153, (6), 1175-1186 (2001).
  22. Brevier, J., Vallade, M., Riveline, D. Force-extension relationship of cell-cell contacts. Physical Review Letters. 98, (26), 268101 (2007).
  23. Bershadsky, A., Kozlov, M., Geiger, B. Adhesion-mediated mechanosensitivity: a time to experiment, and a time to theorize. Current opinion in cell biology. 18, (5), 472-481 (2006).
  24. Chan, C. E., Odde, D. J. Traction dynamics of filopodia on compliant substrates. Science. 322, (5908), 1687-1691 (2008).
  25. Wu, Z., Plotnikov, S. V., Moalim, A. Y., Waterman, C. M., Liu, J. Two distinct actin networks mediate traction oscillations to confer focal adhesion mechanosensing. Biophysical Journal. 112, (4), 780-794 (2017).
  26. Fritzsche, M., Charras, G. Dissecting protein reaction dynamics in living cells by fluorescence recovery after photobleaching. Nature Protocols. 10, (5), 660-680 (2015).
  27. McNally, J. G. Quantitative FRAP in analysis of molecular binding dynamics in vivo. Methods of Cell Biology. 85, 329-351 (2008).
  28. Wehrle-Haller, B. Analysis of integrin dynamics by fluorescence recovery after photobleaching. Methods in Molecular Biology. 370, 173-202 (2007).
  29. Carisey, A., Stroud, M., Tsang, R., Ballestrem, C. Fluorescence recovery after photobleaching. Methods of Molecular Biology. 769, 387-402 (2011).
  30. Carisey, A., et al. Vinculin regulates the recruitment and release of core focal adhesion proteins in a force-dependent manner. Current Biology. 23, (4), 271-281 (2013).
  31. Wolfenson, H., Bershadsky, A., Henis, Y. I., Geiger, B. Actomyosin-generated tension controls the molecular kinetics of focal adhesions. Journal of Cell Science. 124, 1425-1432 (2011).
  32. Dumbauld, D. W., et al. How vinculin regulates force transmission. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, (24), 9788-9793 (2013).
  33. Zaidel-Bar, R., Itzkovitz, S., Ma'ayan, A., Iyengar, R., Geiger, B. Functional atlas of the integrin adhesome. Nature Cell Biology. 9, (8), 858-867 (2007).
  34. Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466, (7303), 263-266 (2010).
  35. LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Berginski, M. E., Urs, A. N., Hoffman, B. D. Construction, imaging, and analysis of FRET-based tension sensors in living cells. Biophysical Methods in Cell Biology. 125, 161-186 (2015).
  36. Meng, F., Suchyna, T. M., Sachs, F. A fluorescence energy transfer-based mechanical stress sensor for specific proteins in situ. The FEBS Journal. 275, (12), 3072-3087 (2008).
  37. Rothenberg, K. E., Scott, D. W., Christoforou, N., Hoffman, B. D. Vinculin Force-Sensitive Dynamics at Focal Adhesions Enable Effective Directed Cell Migration. Biophysical journal. 114, (7), 1680-1694 (2018).
  38. Austen, K., et al. Extracellular rigidity sensing by talin isoform-specific mechanical linkages. Nature Cell Biology. 17, (12), 1597-1606 (2015).
  39. Kumar, A., et al. Talin tension sensor reveals novel features of focal adhesion force transmission and mechanosensitivity. The Journal of Cell Biology. 213, (3), 371-383 (2016).
  40. Acharya, B. R., et al. Mammalian Diaphanous 1 Mediates a Pathway for E-cadherin to Stabilize Epithelial Barriers through Junctional Contractility. Cell Reports. 18, (12), 2854-2867 (2017).
  41. Borghi, N., et al. E-cadherin is under constitutive actomyosin-generated tension that is increased at cell-cell contacts upon externally applied stretch. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, (31), 12568-12573 (2012).
  42. Conway, D. E., Williams, M. R., Eskin, S. G., McIntire, L. V. Endothelial cell responses to atheroprone flow are driven by two separate flow components: low time-average shear stress and fluid flow reversal. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298, (2), H367-H374 (2010).
  43. Arsenovic, P. T., et al. Nesprin-2G, a Component of the Nuclear LINC Complex, Is Subject to Myosin-Dependent Tension. Biophysical Journal. 110, (1), 34-43 (2016).
  44. Ye, N., et al. Direct observation of alpha-actinin tension and recruitment at focal adhesions during contact growth. Experimental Cell Research. 327, (1), 57-67 (2014).
  45. Paszek, M. J., et al. The cancer glycocalyx mechanically primes integrin-mediated growth and survival. Nature. 511, (7509), 319-325 (2014).
  46. Gayrard, C., Borghi, N. FRET-based Molecular Tension Microscopy. Methods. 94, 33-42 (2016).
  47. de Beco, S., Gueudry, C., Amblard, F., Coscoy, S. Endocytosis is required for E-cadherin redistribution at mature adherens junctions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, (17), 7010-7015 (2009).
  48. Östlund, C., et al. Dynamics and molecular interactions of linker of nucleoskeleton and cytoskeleton (LINC) complex proteins. Journal of Cell Science. 122, (22), 4099-4108 (2009).
  49. Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. The interactions of retroviruses and their hosts. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor (NY). (1997).
  50. Komatsubara, A. T., Matsuda, M., Aoki, K. Quantitative analysis of recombination between YFP and CFP genes of FRET biosensors introduced by lentiviral or retroviral gene transfer). Scientific Reports. 5, 13283 (2015).
  51. Nasri, M., Karimi, A., Farsani, M. A. Production purification and titration of a lentivirus-based vector for gene delivery purposes. Cytotechnology. 66, (6), 1031-1038 (2014).
  52. Addgene, Generating Stable Cell Lines with Lentivirus. Available from: https://www.addgene.org/protocols/generating-stable-cell-lines (2016).
  53. Roederer, M. Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats. Cytometry: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 45, (3), 194-205 (2001).
  54. Malkani, N., Schmid, J. A. Some secrets of fluorescent proteins: distinct bleaching in various mounting fluids and photoactivation of cyan fluorescent proteins at YFP-excitation. PLoS One. 6, (4), e18586 (2011).
  55. Chen, H., Puhl, H. L. 3rd, Koushik, S. V., Vogel, S. S., Ikeda, S. R. Measurement of FRET efficiency and ratio of donor to acceptor concentration in living cells. Biophysical journal. 91, (5), L39-L41 (2006).
  56. Rothenberg, K. E., Neibart, S. S., LaCroix, A. S., Hoffman, B. D. Controlling Cell Geometry Affects the Spatial Distribution of Load Across Vinculin. Cellular and Molecular Bioengineering. 8, (3), 364-382 (2015).
  57. Carnell, M., Macmillan, A., Whan, R. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP): acquisition, analysis, and applications. Methods of Molecular Biology. 1232, 255-271 (2015).
  58. Trembecka, D. O., Kuzak, M., Dobrucki, J. W. Conditions for using FRAP as a quantitative technique--influence of the bleaching protocol. Cytometry A. 77, (4), 366-370 (2010).
  59. Lavelin, I., et al. Differential effect of actomyosin relaxation on the dynamic properties of focal adhesion proteins. PLoS One. 8, (9), e73549 (2013).
  60. Foote, H. P., Sumigray, K. D., Lechler, T. FRAP analysis reveals stabilization of adhesion structures in the epidermis compared to cultured keratinocytes. PLoS One. 8, (8), e71491 (2013).
  61. Zal, T., Gascoigne, N. R. Photobleaching-corrected FRET efficiency imaging of live cells. Biophysical Journal. 86, (6), 3923-3939 (2004).
  62. Hodgson, L., Shen, F., Hahn, K. Biosensors for characterizing the dynamics of rho family GTPases in living cells. Current Protocols in Cell Biology. 46, (1), (2010).
  63. Day, R. N. Measuring protein interactions using Förster resonance energy transfer and fluorescence lifetime imaging microscopy. Methods. 66, (2), 200-207 (2014).
  64. Rapsomaniki, M. A., et al. easyFRAP: an interactive, easy-to-use tool for qualitative and quantitative analysis of FRAP data. Bioinformatics. 28, (13), 1800-1801 (2012).
  65. Zamir, E., et al. Molecular diversity of cell-matrix adhesions. Journal of cell science. 112, (11), 1655-1669 (1999).
  66. Bakolitsa, C., et al. Structural basis for vinculin activation at sites of cell adhesion. Nature. 430, (6999), 583-586 (2004).
  67. De Los Santos, C., Chang, C. W., Mycek, M. A., Cardullo, R. FRAP, FLIM, and FRET: Detection and analysis of cellular dynamics on a molecular scale using fluorescence microscopy. Molecular Reproduction and Development. 82, (7-8), 587-604 (2015).
  68. Periasamy, A., Wallrabe, H., Chen, Y., Barroso, M. Chapter 22: Quantitation of protein-protein interactions: confocal FRET microscopy. Methods in Cell Biology. 89, 569-598 (2008).
  69. Stehbens, S., Pemble, H., Murrow, L., Wittmann, T. Imaging intracellular protein dynamics by spinning disk confocal microscopy. Methods in Enzymology. 293-313 (2012).
  70. Zeug, A., Woehler, A., Neher, E., Ponimaskin, E. G. Quantitative intensity-based FRET approaches--a comparative snapshot. Biophysical Journal. 103, (9), 1821-1827 (2012).
  71. Ehrlicher, A. J., Nakamura, F., Hartwig, J. H., Weitz, D. A., Stossel, T. P. Mechanical strain in actin networks regulates FilGAP and integrin binding to filamin A. Nature. 478, (7368), 260-263 (2011).
  72. Guo, B., Guilford, W. H. Mechanics of actomyosin bonds in different nucleotide states are tuned to muscle contraction. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103, (26), 9844-9849 (2006).
  73. Lee, C. Y., et al. Actin depolymerization under force is governed by lysine 113:glutamic acid 195-mediated catch-slip bonds. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, (13), 5022-5027 (2013).
  74. Cost, A. L., Ringer, P., Chrostek-Grashoff, A., Grashoff, C. How to Measure Molecular Forces in Cells: A Guide to Evaluating Genetically-Encoded FRET-Based Tension Sensors. Cellular and Molecular Bioengineering. 8, (1), 96-105 (2015).
  75. Bertocchi, C., et al. Nanoscale architecture of cadherin-based cell adhesions. Nature Cell Biology. 19, (1), 28-37 (2017).
  76. Case, L. B., et al. Molecular mechanism of vinculin activation and nanoscale spatial organization in focal adhesions. Nature Cell Biology. 17, (7), 880-892 (2015).
  77. Chen, H., Cohen, D. M., Choudhury, D. M., Kioka, N., Craig, S. W. Spatial distribution and functional significance of activated vinculin in living cells. The Journal of Cell Biology. 169, (3), 459-470 (2005).
  78. Kim, T. J., et al. Dynamic visualization of alpha-catenin reveals rapid, reversible conformation switching between tension states. Current Biology. 25, (2), 218-224 (2015).
  79. Yao, M., et al. Mechanical activation of vinculin binding to talin locks talin in an unfolded conformation. Scientific reports. 4, 4610 (2014).
قياس ديناميات حساسة لقوة البروتين في الخلايا الحية باستخدام مزيج من التقنيات الفلورسنت
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rothenberg, K. E., Puranam, I., Hoffman, B. D. Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques. J. Vis. Exp. (141), e58619, doi:10.3791/58619 (2018).More

Rothenberg, K. E., Puranam, I., Hoffman, B. D. Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques. J. Vis. Exp. (141), e58619, doi:10.3791/58619 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter