Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Måling af kraft-følsom Protein Dynamics i levende celler ved hjælp af en kombination af fluorescerende teknikker

Published: November 2, 2018 doi: 10.3791/58619
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, Duke University

Summary

Vi præsenterer her, en protokol til den samtidige brug af Förster resonans energi transfer-baseret spænding sensorer til at måle protein belastning og fluorescens opsving efter photobleaching til at måle protein dynamics muliggør måling af kraft-følsom protein dynamikken i levende celler.

Abstract

Celler fornemme og reagere på fysiske signaler i deres miljø ved at konvertere mekaniske stimuli til biokemisk påviselige signaler i en proces kaldet mechanotransduction. Et afgørende trin i mechanotransduction er overførslen af styrker mellem de eksterne og interne miljøer. Overføre kræfter, der skal være en vedvarende, ubrudt fysiske kobling lavet af en serie af protein-protein interaktioner. For en given protein-protein interaktion, mekanisk belastning kan enten har ingen indvirkning på samspillet, føre til hurtigere afstandtagen af interaktionen, eller endda stabilisere interaktionen. Forstå hvordan molekylære belastning dikterer protein omsætning i levende celler kan give værdifulde oplysninger om den mekaniske stat af et protein, igen belyse dens rolle i mechanotransduction. Eksisterende teknikker til måling af kraft-følsom protein dynamics enten mangler direkte målinger af protein belastning eller stole på målinger foretaget uden for den trådløse forbindelse. Her, beskriver vi en protokol for Förster resonans overførsel-fluorescens energiudnyttelse efter photobleaching (FRET-FRAP) teknik, som giver mulighed for måling af kraft-følsom protein dynamikken i levende celler. Denne teknik er potentielt relevant for enhver FRET-baserede spænding sensor, lette undersøgelsen af kraft-følsom protein dynamics i række subcellulært strukturer og i forskellige celletyper.

Introduction

Det ekstracellulære miljø er en rig kilde af biokemiske og fysiske signaler, der dikterer celle adfærd. Navnlig kan den fysiske natur af mikromiljø mægle cellulære funktioner, herunder cellevækst, migrering og differentiering1,2,3,4. Dysregulering af mekanikken i mikromiljø er et afgørende element til mange sygdomme, der endnu ikke har tilstrækkelig behandlinger, såsom kræft5, åreforkalkning6og fibrose7. Fuld forståelse for, hvordan celler konvertere fysiske stimuli til biokemisk påviselige signaler, en proces, der kaldes mechanotransduction, kræver udredning af de molekylære mekanismer mægle kraft transmission, både ind og ud af cellerne og inden for flere subcellulært strukturer.

Inde subcellulært strukturer, proteiner konstant drejning over; bindende og adskillelsen baseret på styrken af deres interaktioner med bindende partnere8. For styrker indberettes med succes på tværs af en fysisk afstand, skal der være en ubrudt kæde af protein-protein interaktioner, hvilket betyder, at et protein omsætning skal være langsomt nok til at opretholde og overføre kraft til dets bindende partner9. Mens protein-protein interaktioner består som regel af flere ikke-kovalente bindinger mellem protein domæner, er samspillet ofte udtænkt som en bundne stat, der kan overgang til en ubundet stat under forskellige betingelser10, 11. for et givet protein-protein interaktion, er det muligt at styrke kan har ingen effekt på levetiden for interaktion, kendt som en "ideel bond", reducere levetiden for interaktion, kendt som en "slip bond", eller øge levetiden for interaktionen , kendt som en "catch bond"10. Der er således en indviklede forhold mellem protein belastning og protein dynamik, som vi refererer til som kraft-følsom dynamics.

Mod forståelse effekten af belastningen på bond dynamics, har en række yderst informativ eksperimenter udført på enkelt-molekyle niveau. Ved hjælp af isolerede proteiner eller fragmenter af proteiner og manipulation teknikker såsom magnetiske pincet, Optisk pincet og atomic force mikroskopi, viste disse undersøgelser kraft-følsom protein-protein interaktioner for flere relevante proteiner11,12. Begge integriner13 og cadherins14, som er transmembrane proteiner, der er vigtige for at danne celle-matrix og celle-celle interaktioner, henholdsvis, har vist ændringer i dynamics grund til at indlæse. Inden for cellen, vinculin er rekrutteret til både Kamilla15 og α-catenin16 i en kraft-afhængige måde og kan danne en fangst obligation med aktin17, der angiver en afgørende rolle for vinculin på både fokal sammenvoksninger (FAs) og adherens vejkryds (AJs ) under belastning. Enkelt-molekyle studier tillader dyrkning af specifikke protein-protein interaktioner og give entydige resultater, men de højde ikke for kompleksiteten af den cellulære miljø.

Landmark eksperimenter viste, at flere subcellulært strukturer, herunder FAs og AJs, er mechanosensitive, og udviser forøget forsamling i svar til internt genereret eller eksternt anvendt belastninger18,19, 20,21,22. Flere teoretiske modeller har derudover foreslået, at mechanosensitive forsamling kunne være drevet af kraft-følsom protein dynamics23,24,25. For at undersøge disse kraft-følsom dynamikken i levende celler, har et par indirekte strategier truffet. FRAP og relaterede teknikker giver en relativt enkel metode til måling af protein dynamics i celler26,27,28,29. Måling af protein belastning har imidlertid været mere begrænset. En typisk metode er at sammenligne protein dynamics i celler med og uden udsættelse for en cytoskeletal inhibitor anvendes til at reducere overordnede celle kontraktilitet8,30,31. Begrebsmæssigt, er dette en sammenligning mellem en høj last og lav belastning tilstand. Men der er ingen kvantificering af belastningen på tværs af proteinet i enten tilstand, og der kan være utilsigtede biokemiske effekter af inhibitor, sådanne tab af vigtige bindingssteder langs en F-actin glødetråd. En anden tilgang, specifikke for FAs, har været at måle samlede kraft anstrengelse på underlag af FA benytter trækkraft force mikroskopi til at tilnærme molekylære belastning og undersøge forholdet med dynamikken i en enkelt protein inden for FA32. Mens denne tilgang giver mulighed for kvantificering af samlede kraft, giver det ikke molekylemæssigt specifikke oplysninger. FAs består af over 200 forskellige proteiner, hvoraf mange kan bære belastning33. Således måler den samlede kraft output af en FA potentielt tilslører muligheden for flere kraft transmission veje og pålideligt giver ikke en foranstaltning af belastningen på et specifikt protein.

I modsætning til tidligere tilgange i mechanobiology, fremkomsten af FRET-baserede spænding sensorer giver mulighed for direkte måling af belastninger opleves af specifikke proteiner i levende celler34,35,36. Vi præsenterer her, en protokol, der kombinerer FRET-baserede spænding sensorer med FRAP-baserede mål for protein dynamics. Vi henviser til denne teknik som FRET-FRAP. Denne tilgang gør det muligt samtidig måling af protein belastning og protein dynamik, således at vurderingen af kraft-følsom protein dynamikken i levende celler (figur 1). Allerede, er FRET-FRAP teknik blevet anvendt til undersøgelse af kraft-følsom dynamikken i mekanisk linker protein vinculin37. Spænding sensorer er blevet udviklet for mange proteiner, der er relevante i en lang række subcellulært strukturer. For eksempel er sensorer udviklet til vinculin34 og Kamilla38,39 i FAs, cadherins og catenins i AJs40,41,42, nesprin i den nukleare Anna komplekse 43, α-actinin44 og filamin36 i cytoskeleton, og MUC-1 i glycocalyx45, blandt andre46. FRAP er ligeledes et almindeligt anvendte teknik er blevet brugt på mechanosensitive proteiner i fokale sammenvoksninger8,31, adherens vejkryds47, actin cortex26og nucleus48. Bevæger sig fremad, FRET-FRAP teknik bør generelt gælder for nogen af disse eksisterende sensorer eller nyligt udviklet sensorer, giver mulighed for målinger af force-følsomme dynamik i en bred vifte af subcellulært strukturer og sammenhænge. I denne retning leverer vi en detaljeret, generaliseret protokol for at gennemføre de FRET-FRAP teknik gælder i disse forskellige systemer. Forhåbentlig, dette vil give en lang række eksperimenter belyse roller i forskellige mechanosensitive proteiner i regulere kraft transmission og mægle celle adfærd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. generere prøver til billedbehandling

  1. Stabilt udtrykkelige spænding sensor konstruktion i ønskede celletype.
    1. Klon spænding sensor konstruktion i pRRL vektor eller andre virale udtryk plasmid.
      Bemærk: Flere forskellige molekylære kloning værktøjer er tilgængelige til at opnå dette skridt, herunder anvendelse af restriktionsenzymer, overlappe forlængelse og Gibson forsamling35. PRRL vektor bruges i lenti viral transduktion og giver mulighed for en betydelig grad af protein produktion ved hjælp af menneskelige cytomegalovirus (CMV) promotor. Forskellige vektorer kan være behov for en bestemt kontekst. For eksempel, er CMV promotor tavshed i nogle celle typer49. Derudover kan kun FRET-baserede sensorer der indeholder fluorescerende proteiner at manglende stærk sekvens homologi, som mTFP1 og Venus A206K, bruges til at skabe stabile cellelinjer. Sensorer der indeholder cyan fluorescerende proteiner og gul fluorescerende proteiner vil sandsynligvis være underlagt homologe rekombination50.
    2. Generere lentivirus i menneskelige embryonale nyre (HEK) 293T celler ved hjælp af psPax2 og pMD2.G emballage plasmider ved hjælp af standard virus produktion metoder51.
      Forsigtig: Lentivirus bør kun håndteres af ordentligt uddannet personale i en biosikkerhed niveau 2 laboratoriemiljø.
      Bemærk: Denne kombination af celler og emballage plasmider er egnet til brug med pRRL. Andre systemer kan være nødvendigt med andre vektorer.
    3. Transduce ønskede celler med virus ved hjælp af standard transduktion protokoller52 og bruge flowcytometri sortere cellerne53 at vælge en homogen befolkning at udtrykke hver konstruktion på ca endogene niveauer37. Efter cellemarkeringen, eksperimenter kan gennemføres umiddelbart eller celler cryogenically kan fryses til senere brug. Ikke overstige 2 fryse-tø cykler for en given stabil cellelinie.
      Bemærk: Brugen af cellelinjer mangelfuld i protein til at blive undersøgt (f.eks.vinculin- / - MEFs til brug med vinculin spænding sensor) vil øge signal-støj-forhold i FRET eksperimenter samt begrænse overdreven udtryk artefakter. Sådanne stabile mus embryonale fibroblast (MEF) linjer kan bruges til ca 15 passager før betydelige tab af udtryk eller nedbrydning af sensorer er tilsyneladende. Hvis viral baseret metoder ikke er ønsket, kan en overflod af kommercielle reagenser bruges efter producentens protokol til forbigående transfect en lang række celletyper med spænding sensorer i en passende plasmidet, som pcDNA3.1. Optimal udtryk vil være 24-48 h efter Transfektion.
  2. Forberede substrater til celle såning.
    1. Erhverve 4, 35 mm glas-bund retter.
    2. Arbejder i en celle kultur hætte, i en 15 mL kanoniske tube, gøre 4 mL af 10 µg/mL fibronektin i phosphat bufferet saltvand (PBS) løsning ved hjælp af steril PBS i celle kultur hood. Forsigtigt invertere tube én gang for at blande og lad opløsningen sidde i 5 min. i celle kultur hætte.
      Bemærk: Koncentration eller type af ECM proteiner kan have tilpasses til andre celletyper. Betingelserne er velegnet til MEFs.
    3. Der afpipetteres 1 mL fibronektin løsning på hver glas-bund fad.
    4. Forlade fibronektin løsning på retter i 1 time ved stuetemperatur eller natten over ved 4 ° C.
    5. Opsug fibronektin løsning, skylles en gang med PBS, og der tilsættes 1 mL PBS.
  3. Frø celler på tilberedte substrater.
    1. Start med celler af interesse på sammenløbet procent til bikulturer i en 6 cm kultur parabol.
      Bemærk: Forskellige celletyper vil kræve særskilt celle kultur betingelser og bikulturer protokoller. Dette afsnit indeholder retningslinjer egner sig til MEFs. Typisk er MEFs vokset til 85% sammenløbet før bikulturer.
    2. Arbejder inden for en celle kultur hætte, skyl cellerne en gang med 3 mL PBS. Der tilsættes 1 mL 0,05% Trypsin-EDTA og Inkuber i 5 min. ved 37 ° C.
    3. Tilføj 3 mL af komplette medier til 6 cm parabol, indsamle cellerne, og placere i en 15 mL konisk slange.
      Bemærk: Sammensætning for komplet media vil afhænge af typen celle bliver brugt. MEFs, komplet media ofte defineres som høje glukose Dulbecco ændret Eagle Medium med 10% føtal bovint serum, 1% antibiotikum-antimykotikum (indeholdende Amphotericin B, Penicillin og Streptomycin), og en 1% ikke-essentiel aminosyre (NEAA) løsning.
    4. Spin cellerne ned ved 1000 x g i 5 min.
    5. Opsug mediet og celle resuspenderes i 1 mL af komplette medier.
    6. Fjerne PBS fra fibronektin-belagt glas retter. Tælle cellerne og frø 30.000 celler på hver fibronektin-belagt glasfad med de passende komplette medier til en afsluttende bind af 1,5 mL.
      Bemærk: Denne celle tæthed er passende for MEFs og vil føre til en befolkning på celler, ikke der er rørende, men ikke overordentlig meget sparsom. Nøjagtige celle nummer skal muligvis tilpasses til andre celletyper eller andre billeddiagnostiske afdeling.
    7. Tillad cellerne at sprede for 4 h efter såning. 2 h for spredning, Aspirér vækst medier og skylles en gang med imaging medier, forlader 1,5 mL imaging medier.
      Bemærk: Denne spredende tid er passende til MEFs men skal måske ændres til andre celler. Inkubation perioder af længere end 6-8 h vil imidlertid føre til betydelige aflejring af ECM proteiner fra serum i den komplette medier. Imaging medier bør indeholde de samme tilføjelser som komplet media men bør optisk klare og ikke indeholder nogen forbindelser, der fluorescerer i imaging kanaler som biokemi, eller slukke fluorescens, såsom phenol rød. Et generelt nyttige imaging medier er DMEM-NGL Live celle visualisering media suppleret med 10% FBS og 1% NEAA løsning. Hvis baggrunden autofluorescence er uacceptabelt høj, reduceres mængden af serum. Hvis en ændring af medier ikke er muligt efter den indledende plating, kan cellerne direkte genopslemmes i imaging media suppleret med en trypsin hæmmer.

2. oprette mikroskop til billedbehandling

  1. Tænde mikroskopet.
    1. Drej på arc lamp første.
      Bemærk: En arc lamp vil frigive en elektromagnetisk puls, som kan skade andet udstyr, der findes i forvejen.
    2. Slå filteret hjulet controller, automatiserede fase controller, mikroskop-computer interface, og kamera.
    3. Tænd FRAP laser og laser holdning controllere.
      Forsigtig: High-powered lasere kan være skadelige for øjnene, hvis set direkte på. Det anbefales at konfigurere mikroskop system til at blokere laser excitation fra at være rettet mod øjet stykker, som kan opnås ved at flytte et spejl i strålegangen FRAP under blegning for at afspejle laser mod prøven og forhindre overførsel til okularet.
    4. Tænd computeren og åbne mikroskop kontrol software.
    5. Tillad 15 min til arc lamp og FRAP laser til at varme op.
  2. Kalibrere FRAP laser.
    1. Åbn vinduet laser konfiguration. Angiv Belysning indstilling (under puls) til de relevante FRAP belysningsstyrke indstillinger for laser eksponering til prøven. Angive Belysning indstilling (under imaging) til belysning indstillinger passer til imaging kun acceptor fluorophore.
    2. Vælg målsætningen at kalibrere under Koordinatsystem indstilling. Fjerne markeringen Manuelt Klik kalibreringspunkter og tjekke Display billeder under kalibreringen.
    3. Indstil hviletid til 10.000 µs og antallet af impulser til 100.
    4. Sted diasset kalibrering af ethidiumbromid forseglet mellem et glas dias og en coverslip, i den fase adapter med coverslip side ned.
      Forsigtig: Ethidiumbromid er et mutagen og skal håndteres ved hjælp af handsker. Hvis skydemekanismen er kompromitteret, afhænde ifølge institutionens retningslinjer.
    5. Bruge acceptor belysningsstyrke indstillinger til at fokusere på overfladen af det dias, kan identificeres som brændplanet med den lyseste signal. Små defekter i belægningen vil være synligt for støtte i fokus.
    6. Flytte diaset til et område med ensartet fluorescens på tværs af imaging flyet.
    7. Klik på Opret indstilling. Softwaren vil initialisere kalibreringsprocessen, blegning og afsløre placeringen af bleget punkt automatisk.
    8. Sikre vellykkede kalibrering ved vurderingen af det endelige billede, som vil være et 3 x 3 gitter af bleget punkter, der skal fordeles ligeligt og i fokus. Gemme kalibrering billedet for fremtidig reference.
    9. Fjern kalibrering dias og sikkert gemme. Kalibreringen bør udføres før begynder hvert forsøg men behøver ikke at udføres mellem prøver.

3. Vælg parametre for FRET Imaging

  1. Fix, en af de genererede prøver af de celler, der udtrykker spænding sensoren med 4% PARAFORMALDEHYD for 10 min. PARAFORMALDEHYD løsning bør være methanol gratis, ofte omtalt som EM-grade, at forhindre denaturering af fluorescerende proteiner. Sted i PBS efter fiksering.
    Forsigtig: PARAFORMALDEHYD løsninger er giftige. Dette trin skal udføres i et stinkskab og opløsningen skal bortskaffes efter institutionelle politikker.
    Bemærk: Denne optimering afhænger ikke om protein dynamik, og en fast prøven giver mulighed for maksimal imaging tid uden bekymrende omkring celle sundhed.
  2. Skyl prøve tre gange med PBS og forlade i PBS.
    Bemærk: Brug af de fleste kommercielt tilgængelige montering medier vil påvirke fluorophore egenskaber, at prøven uegnet til FRET imaging54. Ideelt set celler vil blive afbildet straks, men kan stå natten over ved 4 ° C. Længere ventetider vil resultere i forringelse af prøven.
  3. Prøven anbringes i mikroskop fase holderen til billedbehandling.
  4. Åbn værktøjet flerdimensionel erhvervelse (MDA). Oprette en sekventiel billeddannelse af tre kanaler: acceptor eneste excitation og emission (acceptor kanal), donor excitation og acceptor emission (FRET kanal), og donor kun excitation og emission (donor kanal).
    Bemærk: Der er en række måder at billedet FRET prøver. De tre kanaler eller "tre-cube" metode Imaging parret med middel til kalibrering af systemet til at måle FRET effektivitet anbefales til FRET-baserede spænding sensorer55,56. Denne tilgang er hurtig, enkle, ikke-destruktiv, kræver kun en standard fluorescens imaging mikroskop, og giver mulighed for sammenligning af eksperimenter på tværs af forskellige dage og billedbehandling opsætninger.
  5. Skan prøven ved hjælp af en eksponering på 500 ms og et filter med neutral tæthed (ND) på 10%. Find en celle udtrykker spænding sensor med klare lokalisering til en struktur af interesse.
  6. Vælg en eksponeringstid 500 ms eller den ønskede længde for hver tænkelig kanal og en ND filter på 100% og erhverve en FRET billedsekvens.
  7. Anslå den gennemsnitlige intensitet af sensoren på de subcellulært strukturer af interesse i hver tænkelig kanal. Lav signaler kan medføre unøjagtige resultater på grund af forkert korrektion skøn, ikke-linearities i detektorer eller væsentligt bidrag af baggrunden signaler. En omtrentlig retningslinje er at sigte for intensiteter over 10% af det dynamiske område af kameraet (dvs., for en 16-bit kamera, intensiteter skal være over 6.000).
    Bemærk: Identisk optisk indstillinger (eksponeringstider, filtre, mål og andre variabler såsom kamera gevinst eller binning) skal bruges til alle FRET eksperimenter, der skal sammenlignes. Ændre disse indstillinger vil føre til en ændring i beløbet FRET, der er enten genereret eller opdaget i mikroskopi set-up. FRET effektivitet målinger er uafhængige af disse opsætning, men kalibrering faktorer bruges til at bestemme FRET effektivitet er ikke. I teorien, forskellige sæt af kalibrering faktorer kunne bruges til at generere FRET virkningsgrader fra forskellige optiske indstillinger, men dette kan ikke anbefales. Blegning eller fototoksicitet kan være forskellige mellem de forskellige indstillinger, for at skabe falske resultater.
  8. Erhverve en anden FRET billedsekvens i samme synsfelt. Skøn photobleaching mellem rammer ved at sammenligne gennemsnitlige intensitet af sensoren i hver tænkelig kanal. Photobleaching skal holdes på et minimum, fortrinsvis mindre end 1-5% tab af signal.
  9. Justere parametrene imaging for at maksimere intensiteten og minimere photobleaching. For grove justeringer, ændre ND filter anvendes under erhvervelse. For finere justeringer at ændre eksponering i trin af 250 ms.
  10. Gentag trin 3,5-3,8 indtil tilstrækkeligt signal kan fås samtidig minimere photobleaching.
    Bemærk: Typisk, indstillinger for vinculin spændinger sensor i vinculin- / - MEFs henholdsvis 1.500 ms, 1.500 ms, og 1.000 ms for donor, FRET og acceptor kanalerne. Den optimale værdier varierer med typen af belysning system, mål, filter sæt og sensor udtryk niveau.

4. Vælg parametre for FRAP Imaging

  1. Optimere indstillingerne laser for at sikre komplet blegning af region af interesse (ROI) uden blegning det omkringliggende område eller forårsager solskader.
    1. Lave en af de genererede prøver af de celler, der udtrykker spænding sensor med 4% PARAFORMALDEHYD i 10 min.
      Bemærk: Denne optimering afhænger ikke om protein dynamik, og en fast prøven giver mulighed for maksimal imaging tid uden bekymrende omkring celle sundhed. Dette vil også undgå tilbagebetaling af blegning af mobile proteiner, giver mulighed for dyrkning af effekten af blegning, undgå eventuelle virkninger af hurtige, diffusion-medieret fluorescens opsving forekommer mellem forekomsten af blegning og tager de første post blegemiddel billede.
      Forsigtig: PARAFORMALDEHYD løsninger er giftige. Dette trin skal udføres i et stinkskab og opløsningen skal bortskaffes efter institutionelle politikker.
    2. Skyl prøve 3 gange med PBS og forlade i PBS.
      Bemærk: Brugen af de fleste kommercielt tilgængelige montering medier vil påvirke egenskaber for fluorophore, at gøre prøven uegnet for FRAP imaging54. Ideelt set celler vil blive afbildet straks, men kan stå natten over ved 4 ° C. Længere ventetider vil resultere i forringelse af prøven.
    3. Prøven anbringes i mikroskop fase holderen til billedbehandling.
    4. Åbn vinduet laser konfiguration. Start med at fastsætte en laser hviletiden 1.000 µs og 10 pulser, hvilket betyder, at hver plet i scan på tværs af ROI vil modtage 10.000 µs af fuld-magt laser
      Bemærk: En 500 mW, 515 nm laser blev brugt til blegning. Dette blev valgt til selektivt blegemiddel Venus A206K, acceptor i vinculin spænding sensor, med maksimal effektivitet. Hvis FRET-baserede spænding sensorer med andre fluorescerende proteiner er anvendt, muligvis en anden type laser at være ansat.
    5. Find en celle udtrykker spænding sensor med klare lokalisering til en struktur af interesse og erhverve et billede.
    6. Tegn et rektangulært ROI skitserer området for at blege og ROI placering af meddelelseslager. Puls laser. Fastgøre et andet billede af prøven.
      Bemærk: Box størrelse skal være omtrent på størrelse med hele FA. Bør udvises forsigtighed, at boksens størrelse ikke varierer drastisk på tværs af eksperimenter. Det blegede område skal overvåges nøje i proteiner hvis dynamics påvirkes ved diffusion. Det er et potentiel problem i transmembrane proteiner, såsom cadherins47, eller proteiner, diffuse langsomt27,57.
    7. Kontrollere kvaliteten af photobleaching ved at kontrollere, at den hele ROI er bleget, intensiteten er nær baggrundsværdier. Derudover Sørg for der er ingen blegning uden for ROI.
    8. Justere indstillingerne laser, som kræves for at opnå en betydelig mængde af blegning inden for Investeringsafkastet uden inducerende betydelig blegning udenfor ROI. For grove justeringer, hæve og sænke hviletiden i trin af 100 µs og for finjusteringer, hæve og sænke antallet af pulser i trin af 5 impulser.
    9. Gentag trin 4.1.5 – 4.1.8 indtil nå minimumindstillingerne hvor Investeringsafkastet er fuldt bleget uden off-mål photobleaching.
      Bemærk: At opnå en betydelig indledende blegning værdi uden inducerende fototoksicitet er et nøgleaspekt i FRAP analyse. Bruge indstillingerne laser, der resulterer i en komplet blegemiddel i de faste prøver. Generelt er bør det minimale antal fotoner anvendes til at opnå den ønskede blegning. Også, blegning protokollen bør holdes relativt ensartet under eksperimenter, da ændringer kan påvirke målinger af protein dynamics58.
  2. Optimere time-lapse parametre for at fuldt ud fange dynamikken i protein af interesse og minimere photobleaching.
    1. Forberede mikroskopi set-up for levende celle imaging, helst med en opvarmet fase og mål samt CO2 kontrol. Lad blandingen henstår i 20 min.
      Bemærk: For at bevare sundheden for de afbildede celler, temperatur og pH skal holdes i imaging fartøjet. En række opvarmet faser og objektive varmeapparater kan let fastholde prøverummets temperatur på 37 ° C. Kontrol af pH for mange medietyper kan opnås ved brug af en peristaltisk pumpe til pass fugtet 5% CO2 over prøven på 15 mL/min. Alternativt, hvis CO2 kontrol er ikke tilgængelig, live imaging medier indeholdende HEPES bør anvendes til at undgå store pH-ændringer.
    2. Placer en af de genererede prøver af de celler, der udtrykker spænding sensor i mikroskop fase holderen til billedbehandling. Lad blandingen henstår i 10 min.
    3. Bruger værktøjet MDA, definere en time-lapse erhverve 3-5 billeder pre bleach bleach ROI og fortsætte med at tage 10-60 billeder.
      Bemærk: For vinculin på FAs, imaging hver 5 s til 5 min efter blegemiddel er tilstrækkeligt til at overholde dynamikken uden at indføre overdreven blegning31. Nyttige udgangspunkter for billedbehandling sats og varighed for mange andre proteiner kan findes i litteraturen47,48,59,60.
    4. Bruge acceptor imaging indstillinger for at minimerer eksponering af prøven til lys, samtidig bevare en tilstrækkelig signal-støj-forholdet for at billede struktur af interesse. Et godt udgangspunkt er halvdelen af de ND filter og eksponering tid nødvendige for billeddannelse af acceptoren under FRET.
    5. Find en celle udtrykker spænding sensor med klare lokalisering til en struktur af interesse og snap et billede.
    6. Tegn et rektangulært ROI for at fremhæve hvor blegemiddel og ROI placering af meddelelseslager. Indlede den time-lapse.
    7. Undersøge det resulterende sæt af billeder for potentielle problemer.
      1. Hvis der er betydelige hopper (større end 10% af indledende intensitet) i fluorescens opsving mellem rammer, reducere tid-trin mellem rammer.
      2. Hvis der er en betydelig global tab af fluorescens over tid (mere end 5-10% af indledende intensitet), reducere antallet af billeder taget post blegemiddel og/eller ændre de indstillinger for at reducere eksponeringen af prøven til lys.
      3. Hvis fluorescens opsving ikke har plateaued ved udgangen af den time-lapse, øge den samlede længde af de time-lapse.
    8. Justere parametrene time-lapse i overensstemmelse hermed og Gentag trin 4.2.5 – 4.2.7 indtil fluorescens opsving er tilstrækkeligt fanget uden global foto-skader på prøven.

5. erhverve FRET-FRAP data

  1. Forberede mikroskopi set-up for levende celle imaging, helst med en opvarmet fase og mål samt CO2 kontrol. Lad blandingen henstår i 20 min.
    1. For at sikre sundheden for de afbildede celler, holde temperaturen ved 37 ° C i den billeddiagnostiske afdeling. Brug en peristaltisk pumpe til at passere fugtet 5% CO2 over prøven på 15 mL/min. at opretholde pH.
    2. Alternativt, hvis CO2 kontrol ikke er tilgængelig, brug live imaging medier indeholdende HEPES for at forhindre store pH-ændringer.
  2. Åbn værktøjet MDA og sat op med FRET imaging parametre, herunder de forskellige filter sæt.
  3. Gem denne MDA i eksperimentelle mappe med navnet på MDA_FRET_Date.
  4. Oprette et andet MDA med FRAP imaging parametre, herunder de forskellige filter sæt, time-lapse indstillingerne og kladden til puls laser efter pre blegemiddel erhvervelse.
  5. Gem denne MDA i eksperimentelle mappe med navnet på MDA_FRAP_Date. Luk vinduet MDA.
  6. I værktøjslinjen øverst på skærmen, Vælg Journal | For at starte optagelsen.
  7. Åbn vinduet MDA, indlæse MDA_FRET_Date tilstand og trykke på erhverve. Derefter indlæse MDA_FRAP_Date tilstand, og tryk på erhverve.
  8. I slutningen af erhvervelse i værktøjslinjen øverst på skærmen, Vælg Journal | Stop optagelse.
  9. Gem denne kladde til den eksperimentelle mappe med navnet på FRETFRAP_Date og føje den til en værktøjslinje for nem adgang. Luk vinduet MDA.
  10. Placer en af de genererede prøver af de celler, der udtrykker spænding sensor i mikroskop holderen til billedbehandling. Lad blandingen henstår i 10 min.
  11. Navigere prøven ved hjælp af billede erhvervelse under erhverve | Erhverve med minimal eksponering tid og ND filter for at identificere celler af interesse.
  12. Indstille kontinuerlig autofokus ved at navigere til enheder | Fokus. Manuelt fokus på prøve indtil nå det korrekte tænkelig plan.
  13. Klik på Angiv kontinuerlig fokus, vente på systemet til at justere, og klik på Starte kontinuerlig fokus.
    Bemærk: Dette er ikke påkrævet, men væsentligt forbedrer kvaliteten af FRAP opsving kurver, fordi det forhindrer prøven fra drivende ud-af-fokus.
  14. Find en celle udtrykker spænding sensor med klare lokalisering til en struktur af interesse og snap et billede.
  15. Tegn et rektangulært ROI for at fremhæve hvor til at afblege. ROI placering af meddelelseslager.
  16. Initialiser FRETFRAP_Date journal, som vil begynde erhvervelse af FRET billeder efterfulgt af initialisering af FRAP time-lapse.
  17. Gentag trin 5.14-5.16 indtil 10-15 billede sæt er erhvervet.
    Bemærk: Måling kan ikke gentages i den samme celle. Når photobleaching opstår, er FRET data upålidelige.

6. analysere FRET-FRAP data

  1. Analysere FRET billeder ved hjælp af software valg.
    Bemærk: Der er flere måder at billede og kvantificere FRET61, herunder ratiometric FRET62 og FRET indeks34,35. Det anbefales dog stærkt at bruge estimater af FRET effektivitet55,63 for fortolkningen af FRET-FRAP data. Se diskussion for yderligere udforskning af dette emne. Overfølsomme over emissioner og beregning af FRET effektivitet er brugerdefinerede software tilgængelig fra Hoffman Lab på https://gitlab.oit.duke.edu/HoffmanLab-Public.
  2. Kvantificere relevante parametre for hver subcellulært struktur, der var bleget. Dette bør omfatte gennemsnitlige FRET indeks/effektivitet og gennemsnit indledende acceptor intensitet (proportional med koncentration), men kan også omfatte fysiske parametre såsom ROI størrelse.
  3. Analysere de FRAP billeder ved hjælp af softwaren valg.
    Bemærk: Der er flere måder at kvantificere FRAP26,27,28,29. Centrale eksperimenterende bekymringer omfatter regnskab for blegning under post blegemiddel imaging, ændringer i baggrunden intensitet og omplantning af højdynamiske subcellulært strukturer, såsom fokale sammenvoksninger. Blegning korrektioner og variationer i baggrunden belysning kan opnås gennem en analyse af ikke-bleget og ikke-fluorescerende regioner af billederne. Højdynamiske subcellulært strukturer, især dem, der viser overdreven vækst eller demontering dynamik er uforenelig med standard FRAP analyser og analyseres ikke. Derudover er der en række måder til at normalisere dataene. De angivne retningslinjer er den enkleste analyse.
  4. Rette recovery data for blegning effekter og derefter normalisere at pre blegemiddel intensiteter. Kvantificere halvleg af opsving og den mobile fraktion efter følgende ligning28,34:
    MF - (MF - Ro) e-kt
    hvor MF er den mobile brøkdel, Ro er den oprindelige opsving, og k er genfindingsprocenten. Halvleg af opsvinget bestemmes af:
    Τ1/2 = ln 2/k.
    Bemærk: Der er en række offentligt tilgængelige software-pakker for at gennemføre disse analyser64 samt en række ImageJ plugins. Brugerdefinerede software er tilgængelig fra Hoffman Lab på https://gitlab.oit.duke.edu/HoffmanLab-Public. Flere analyser bør anvendes til situationer hvor diffusion påvirker dynamikken i protein af interesse, flere tidsskalaer er synlige i opsving, eller ikke-standard betalingsnumre blegning geometrier bruges.

7. fortolke FRET-FRAP data

  1. Indsamle relevante oplysninger for hver ROI herunder: FRET indeks/effektivitet, acceptor intensitet, FRAP halvleg, FRAP mobile brøkdel.
    Bemærk: FRET indeks eller effektivitet bruges til at bestemme gennemsnitlige belastning på tværs af protein i ROI. Acceptor intensitet måler den lokale koncentration af protein. Halvleg af recovery er et mål for protein dynamics. En mindre halv-tid angiver mere hurtig omsætning. FRAP mobile brøkdel måler mængden af protein i ROI, der er aktivt at dreje over. En større mobil brøkdel angiver, at en større procentdel af protein i ROI drejning over.
  2. For at sonde effekten af lokale koncentration på protein omsætningshastighed og størrelsen, plot FRAP halv tid og mobile brøkdel mod indledende acceptor intensitet.
  3. For at sonde effekten af protein belastning på protein omsætningshastighed og størrelsen, plot FRAP halv tid og mobile brøkdel mod FRET indeks/effektivitet.
    Bemærk: Afhængigt af protein eller struktur, det kan også være interessant at undersøge virkningerne af fysiske parametre, såsom strukturen størrelse eller excentricitet, på protein belastning eller omsætning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

FRET-FRAP består af en kombination af to fluorescerende teknikker, ÆRGRE og FRAP. Vi fokuserede på virkningerne af protein belastning, brugte vi FRET-baserede spænding sensorer34,46. Disse sensorer er ofte baseret på en spænding sensing modul består af to fluorescerende proteiner, såsom mTFP1 og VenusA206K, forbundet af en flagelliform linker (figur 1A). Når modulet er placeret mellem hoved og hale domæner af et protein, er det muligt at måle belastningen på tværs af proteinet. Når FRET dataanalyse, billeder taget i acceptoren kanal bruges til at vurdere spænding sensor lokalisering og koncentration, som dette signal er uafhængig af FRET (figur 1B). Efter beregningen af FRET effektivitet, kan protein belastning visualiseres på en kolorimetrisk skala hvor et fald i FRET effektivitet mod køligere farver indikerer en stigning i protein belastning, og FRET effektivitetsgevinster i det røde område indikerer lav protein belastning ( Figur 1B). FRAP imaging er udført ved hjælp af en laser til at blege acceptor fluorophore i en enkelt subcellulært struktur og overvåge opsving over tid (figur 1 c). Den resulterende normaliserede FRAP kurve kan analyseres for at udtrække parametre, som beskriver den protein dynamik, herunder halvleg af recovery og mobile brøkdel (fig. 1 d). Fordi FRET og FRAP analyser blev udført på den samme celle, den gennemsnitlige protein belastning og omsætning i en subcellulært struktur kan afbildes som et enkelt punkt. Imaging flere celler giver flere point og en spirende tendens kan angive, om et protein er destabiliseret (figur 1E) eller stabiliseres af molekylære belastning (figur 1F).

Vinculin spænding sensor (VinTS) stabilt udtrykt i vinculin null MEFs meget klart lokaliserer til FAs spredt over hele cellen, som det ses ved at kigge på acceptor kanal billede (figur 2A). Acceptor kanal billede bruges til at oprette en segmentering maske, der identificerer hver enkelt FA med et entydigt ID, visuelt udpeget af forskellige farver (figur 2B). Segmentering algoritme er baseret på metoden "vand" og etiketter FAs ca i rækkefølgen af lysstyrke, som tidligere beskrevet34,65. Segmentering resultaterne konverteres til en binær maske, som derefter anvendes på FRET effektivitet resultater (figur 2 c), og den gennemsnitlige FRET effektivitet inden for hver unique FA beregnes (figur 2D). Yderligere egenskaber kan beregnes for hver FA i en lignende måde, herunder gennemsnitlige acceptor intensitet, størrelse, excentricitet og placering i cellen. Denne måde, kan uanset hvilken FA er valgt for FRAP matches til den entydige ID til FA og de tilknyttede egenskaber.

FRAP billedbehandling og analyse er følsomme over for flere faktorer, der kan styres, herunder laser og imaging parametre, og nogle faktorer, som ikke kan kontrolleres, som samlede FA stabilitet26,27,28, 29. For eksempel, kan for meget udsættelse for lys under den time-lapse imaging føre til store problemer med at fortolke FRAP data. Selvom analysen af kontrol FAs, der ikke var bleget kan bruges til at normalisere for mindre photobleaching over tid, med for meget eksponering af prøven til lys, den resulterende FRAP kurve viser en indledende inddrivelsen efterfulgt af en dukkert i normaliseret intensitet, ikke kan være præcist passer til en eksponentiel funktion. Hvis denne effekt er konsekvent observeret i data, er det nødvendigt at re optimere imaging parametrene for at enten formindske eksponeringstid, øge tiden-trin mellem imaging rammer, eller mindske længden af den time-lapse at reducere eksponeringen af prøven til lys.

Et andet eksempel på FRAP data, der er uninterpretable, når den FA, der blev photobleached translocates hurtigt under opsving28. Repræsentative tilfælde af overdreven translokation er vist i figur 3. Det første billede, giver hvor ROIs er valgt, ikke en indikation af FA stabilitet (figur 3A). Overvågning af bleget FA over tid, det bevæger sig hurtigt væk fra den oprindelige holdning og den automatiske tracking er ude af stand til at følge umiddelbart efter på grund af den lave fluorescerende signal efter photobleaching (figur 3A). Den resulterende FRAP kurve viser en indledende fase af lille opsving med en hoppe når Fluorescens er genvundet nok for softwaren at registrere FA og flytte ROI (figur 3B). Denne kurve kan ikke med held passe af en eksponentiel funktion. Hurtig omplantning af FA foreslår også, at FA struktur er ustabil. Ustabile FAs bør således ikke medtages i den samme FRET-FRAP analyse som stabil FA'er, på grund af både tekniske og biologiske problemer.

Med tilfredsstillende FRET og FRAP data, er det næste skridt at udfylde FRET-FRAP analyse af samtidig vurdere protein belastning og dynamik. Figur 4A viser FRET effektivitet kortene af tre vinculin null MEFs stabilt udtrykker VinTS. Bedriftsrådgivningsordningen skitseret i hvid blev valgt for FRAP analyse, og acceptor intensiteter er vist over tid. Disse tre FAs har vinculin under forskellige mængder af indlæse og vise en anden vinculin recovery profil. Kvantificere disse egenskaber ved at beregne halvleg af recovery og konspirere mod den gennemsnitlige FRET effektivitet i hver FA viser den generelle tendens til vinculin bliver stabiliseret ved øget belastning (figur 4B). Den mobile brøkdel plottes FRET effektivitet viser imidlertid ingen tendens, hvilket tyder på, at mobil brøkdel ikke er reguleret af molekylære belastning (figur 4 c). At indføre et punkt mutation i VinTS på aminosyre 50 (A50I) har vist sig at forebygge vinculin binding til en større bindende partner inden for FAs, Kamilla66. Ændring af dette protein-protein interaktion påvirker vinculin kraft-følsom dynamics. Vinculin null MEFs stabilt udtrykker VinTS A50I har forskellige celler og FA morfologier, forskellige vinculin loading profiler, og forskellige vinculin dynamics (figur 4D). Kvantificere halv-times opsving og FRET effektivitetsgevinster og plotte viser, at når vinculin-Kamilla interaktion er forstyrret, vinculin på FAs er destabiliseret ved øget belastning (regne 4E) mens mobile brøkdel viser ingen tendens (figur 4F ).

Figure 1
Figur 1: principper af FRET-FRAP teknik. (A) skematisk af FRET-baserede spænding sensor modul (TSMod) indsat i et protein af interesse og effekten af spænding på FRET signal. (B) for at kvantificere FRET bruger overfølsomme over emissioner, er billeder taget til fange donor signal (ikke vist), acceptor signal og FRET signal. Med passende korrektioner, kan FRET billedet tildeles en kolorimetrisk skala til at visualisere, hvor meget spændingen anvendes på sensoren. C FRAP udføres ved hjælp af acceptoren signal, som er direkte proportional med koncentrationen. (D) FRAP imaging analyse producerer kurver af fluorescens intensitet over tid, der kan blive plads til ved hjælp af matematiske modeller til at bestemme protein dynamics. (E, F) Når FRET og FRAP kombineres, kan kraft og omsætning i en enkelt FA måles. Måling af flere FAs i flere celler giver et forhold mellem protein belastning og protein omsætning. I denne analyse omtales et forhold i som øget belastning korrelerer med øget omsætning som en kraft-destabiliseret stat (E). I denne analyse, er et forhold, hvor øget belastning korrelerer med mindske omsætning omtales som en kraft-stabiliseret tilstand (F). Dette tal er blevet ændret fra Rothenberg et al. 37. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: FA identifikation og FRET analyse. (A) en vinculin null MEF udtrykker VinTS visualiseres i acceptoren kanal, hvor intensiteten angiver lokale koncentration af vinculin. Skalalinjen = 30 µm. (B) FAs er segmenteret baseret på acceptor kanal til at oprette en FA ID maske hvor hver FA er tildelt et entydigt ID, her vist som forskellige farver, ca i rækkefølgen af lysstyrke. C FA ID maske konverteres til en binær maske og anvendes til FRET effektivitet billede at vise FRET effektivitet værdier kun på FAs. (D) FRET effektiviteten inden for hver FA er gennemsnit for at opnå en indre værdi for hver FA, som er forbundet med FA-ID i tabellen output data. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: eksempel på en translocating FA. (A) en vinculin null MEF udtrykker VinTS A50I mutant sensor er visualiseret i acceptoren kanal, med farvetabellen inverteret for klarhed. Skalalinjen = 30 µm. FA skitseret i sort blev valgt for blegning. Zoomes i billederne viser FA progression over tid med den røde kontur, der angiver, hvor softwaren identificeret FA. Skalalinjen = 2 µm. (B) den resulterende normaliseret FRAP kurve fra data i (A). Der er et ca 5% hoppe i intensitet følgende punkt 3 som følge af FA translocating hurtigt før tilstrækkelig helbredelse for softwaren at registrere ændringen i Anlægslokation. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: repræsentant FRET-FRAP resultater. (A) Vinculin null MEFs udtryk for VinTS vises som gennemsnitlige FRET effektivitet billeder af hele cellen (skalalinjen = 30 µm) med zoomet i inverteret acceptor kanal billeder viser FRAP opsving progression (skalalinjen = 2 µm). (B) FRAP halvleg af recovery plottes FRET effektivitet for 32 celler, med de punkter, der repræsenterer celler i (A) fremhævet med rødt. C FRAP mobile brøkdel plottes FRET effektivitet for de samme celler i (B). (D) Vinculin null MEFs udtrykker den VinTS A50I mutant sensor vises som gennemsnitlige FRET effektivitet billeder af hele cellen (skalalinjen = 30 µm) med zoomet i inverteret acceptor kanal billeder viser FRAP opsving progression (skalalinjen = 2 µm). (E) FRAP halvleg af recovery plottes FRET effektivitet for 21 celler, med de punkter, der repræsenterer celler i (D) fremhævet med rødt. F FRAP mobile brøkdel plottes FRET effektivitet for de samme celler i (E). Data blev oprindeligt offentliggjort i Rothenberg et al. 37 og er visualiseret her i et nyt format. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Metoden FRET-FRAP giver mulighed for direkte måling af kraft-følsom protein dynamics, en egenskab, der har været vanskelige at direkte sonde indeni levende celler. Følsomheden af protein dynamics til molekylære belastning er afgørende for proteinets funktion som en kraft senderen eller transducer. Læsning er nødvendige til transmission af både internt genereret og eksternt anvendt styrker, kaldet mechanotransmission, og en konvertering af disse styrker til biokemisk påviselige signaler, kaldet mechanotransduction. Men ændringer i belastning kan påvirke varigheden en protein forbliver bundet, dermed, jo mindre tid et protein tilbringer forsynet med belastning, jo mindre chance, kraften der skal sendes til andre proteiner eller transduced til en biokemisk påviselige signal og fornemmede. Metoden FRET-FRAP bygger bro mellem det molekylære og cellulære niveau ved at tillade Molekylær-skala målinger af kraft-følsom dynamics adgang inden for en bredere cellulære sammenhæng. Desuden gør det muligt for disse målinger skal tages under prøvningen intracellulære eller ekstracellulære miljø biokemisk eller mekanisk. Denne teknik bør finde anvendelse på enhver FRET-baserede spænding sensor, giver mulighed for undersøgelse af protein mekanisk tilstand i en række subcellulært strukturer og ekstracellulære sammenhænge.

Kritiske trin i at sikre, der ønskede FRET-FRAP målingerne er opnået inddrage optimere de billeddiagnostiske parametre og udføre dataanalyse og fortolkning. Optimere imaging parametrene, som beskrevet i protokollen, er nødvendigt at begrænse solskader til prøven, mens giver mulighed for den ønskede strukturer og dynamik kan skelnes og tilstrækkelig signalstyrke til beregning af FRET. Oprettelse af disse billeddannelse parametre for en bestemt cellelinje og protein af interesse tidligt vil lette direkte sammenligning mellem forskellige eksperimentelle grupper. Det er værd at bemærke, at ændringer i systemet, såsom muterer protein af interesse eller indfører hæmmere, kan føre til ændringer i protein lokalisering (dermed ændre signal intensitet) og dynamik. De optimerede parametre bør give klare, nøjagtige målinger på tværs af alle forsøgsbetingelser. Det anbefales derfor, at vælge de parametre, der ikke ekstreme enden af nyttige, for eksempel, at kunne næppe skelne signal fra støj.

Mens imaging i denne protokol blev beskrevet for et epifluorescensmikroskop og vedlagte FRAP laser modul, er FRET-FRAP gældende for andre billeddiagnostiske systemer. For eksempel, kan denne teknik tilpasses scanning af linje Konfokal mikroskoper samt spinning-disk Konfokal mikroskoper med en vedhæftet photobleaching modul. Imaging indstillinger skal optimeres på en tilsvarende måde at opnå tilstrækkelig signal til støj uden at forårsage solskader eller overdreven photobleaching. Navnlig hvad angår FRET imaging er høj kvante effektivitet detektorer forpligtet til at opnå tilstrækkelig signal for vellykket FRET beregning uden inducerende fluorophore skader. Der er en række publikationer, der beskriver separat FRET eller FRAP imaging ved hjælp af en Konfokal mikroskop67,68,69, som kan bruges til at guide optimering af FRET-FRAP billeddannelse.

Efter forsøget, dataanalyse bør behandles omhyggeligt og udført på en reproducerbar, helst automatiseret måde. På grund af den manglende evne til at afblege mere end 2-3 subcellulært regioner i en enkelt celle før blegning for meget af den tilgængelige pulje af protein, overførselshastigheden af denne teknik er relativt begrænset. Datasæt kombineres således ofte over flere dage af imaging, der kræver konsekvent behandling af data. Både FRET og FRAP tilbyder udfordringer med dataanalyse. FRET indeks og FRET effektivitet målinger giver mulighed for kvantificering af protein belastning. FRET indeks er en relativ foranstaltning, der er stærkt afhængige af mikroskop indstillinger, mens FRET effektivitet målinger er absolut og uafhængigt af mikroskop indstillinger55,70. Vi har for nylig vist, at en tidligere udviklet metode ved hjælp af "tre-cube" billedbehandling kan bruges til at bestemme FRET effektivitet fra målinger af overfølsomme over emissioner, der er typisk kvantificeret med FRET indeks, når du bruger FRET-baserede spænding sensorer56 . Målinger af FRET effektivitet er påkrævet, hvis målingerne af absolutte styrker oplevelsen af spænding sensorer skal være beregnede34. De celler, der udtrykker FRET-baserede spænding sensorer, kan især stabil celler på høj passage numre, kombinere eller forringe sensorer, fører til ubrugelig FRET data50. Dette er let identificeres når beregning af donor til acceptoren nøgletal i beregning af FRET effektivitet37,56 , men kan være sværere at opdage ved hjælp af FRET indeks. Når du starter med en FRET-baserede spænding sensor, det kan være nyttigt at få et stort datasæt (> 50 celler) kun FRET data for konstruktioner af interesse til at identificere de forventede vifte af FRET effektivitetsgevinster. Derudover kan FRAP data være vanskeligt at udtrække fra strukturer, der er meget mobile, såsom FAs, der hurtigt glidende eller demontering. At vælge en delpopulation af strukturer eller optimere celle plating betingelser for at afbøde denne virkning kan bidrage til at minimere problemet.

I koncept, kan FRET-FRAP anvendes på enhver FRET-baseret sensor i enhver subcellulært region, med ordentlig optimering. I praksis kan det være svært at fange kraft-følsom dynamics af proteiner, der ikke er under betydelig mekanisk belastning, eller som har halv-times opsving på den meget korte tidsfrist på et par sekunder eller snese minutter lang tidshorisont. Resultater fra enkelt-molekyle studier kan pege på de proteiner, der kan demonstrere kraft-følsom dynamikken i levende celler. Hidtil, omfatter dette mange FA og AJ proteiner13,14,15,16 samt nogle cytoskeletal elementer71,72,73. Tilfældigvis er FRET-baserede sensorer blevet designet for mange af disse proteiner46. Disse resultater kan guide udvælgelse af et protein af interesse; Det bør dog ikke forventes, at FRET-FRAP data præcis vil afspejle resultaterne fra disse enkelt-molekyle studier. Faktisk kan biokemiske forordning, interaktioner med andre proteiner, og lokale cytoskeletal struktur tilsløre, eller ændre, virkninger af kræfter på protein-protein interaktioner. Evnen til at iagttage disse kompleksiteter er en unik styrke af FRET-FRAP tilgang.

En kombination af manipulationer til cellen og protein af interesse kan bruges til at belyse de vigtige faktorer for reguleringen af protein dynamics. For eksempel, kan det være nyttigt at have en sensor, der er kraft-ufølsom, enten ved sletning eller mutation af en kraft-bindende domæne35,74 , som bør der ingen afhængighed af protein omsætning dynamics kraft rapporteret af sensor. Desuden kan mutationer andre kritiske bindingssteder eller fosforylering sites i protein give et mere komplet billede af hvordan protein af interesse er at blive reguleret. At foretage globale ændringer i cellen eller miljøet gennem cytoskeletal hæmmere eller ved at ændre egenskaberne substrat (ex. ekstracellulære matrix eller stivhed), henholdsvis kan hjælpe med at bestemme, hvordan kraft-følsom dynamikken af protein reagere på mekanisk perturbationer. Kombinere oplysninger om protein belastning og force-følsomme dynamik med andre biofysiske egenskaber af protein kan hjælpe til at etablere mekanisk staten protein af interesse. Dette kan omfatte lokalisering og lokale protein-protein interaktioner i en subcellulært struktur75,76. Derudover kunne proteinet opholde sig i forskellige kropsbygning stater, selv inden for samme subcellulært struktur, afhængig af kontekst76,77. Protein belastning, dynamics, lokalisering og kropsbygning kan alle blive samtidig påvirket af internt genereret og eksternt anvendt styrker37,76,78,79, dikterer en proteins rolle i kraft transmission og mechanotransduction. Alsidigheden af metoden FRET-FRAP og dens potentielle kompatibilitet med en bred vifte af proteiner og manipulationer bør aktiverer belysning af samspillet mellem bulk mekanik, protein dynamik og mechanosensitive signalering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af en National Science Foundation karriere Award (NSF-CMMI-14-54257) samt tilskud fra American Heart Association (16GRNT30930019) og National Institutes of Health (R01GM121739-01) tildeles Dr. Brenton Hoffman og en National Science Foundation Graduate Research Fellowship tildeles Katheryn Rothenberg. Indholdet er udelukkende ansvarlig for forfattere og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter af NSF eller NIH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin-EDTA Thermo Fisher 25300062
16% Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 30525-89-4
60x Objective NA1.35 Olympus UPLSAPO 60XO
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) Gibco 15240-062
Automated Stage Prior Scientific H117EIX3
Custom Dichroic Mirror Chroma Technology Corp T450/514rpc
Custom mTFP1 Emission Filter Chroma Technology Corp ET485/20m
Custom mTFP1 Excitation Filter Chroma Technology Corp ET450/30x
Custom Venus Excitation Filter Chroma Technology Corp ET514/10x
DMEM-gfp Live Cell Visualization Medium Sapphire MC102
Dulbecco's Modified Eagle's Medium  Sigma Aldrich D5796 with L-glutamine and sodium bicarbonate
Fetal Bovine Serum HyClone SH30396.03
Fibronectin, Human Corning 47743-654
FRAPPA Calibration Slide Andor provided along with FRAPPA unit
FRAPPA System with 515 nm Laser Andor
Glass-bottomed Fluoro Dishes World Precision Instruments FD35
HEK293-T Cells ATCC CRL-3216
Hexadimethrine Bromide, Polybrene Sigma Aldrich H9268-5G
High-glucose Dulbecco's Modified Eagle's Medium Sigma Aldrich D6429
Inverted Fluorescent Microscope Olympus IX83
JMP Pro Software SAS
Lambda 10-3 Motorized Filter Wheels Sutter Instruments LB10-NW
LambdaLS Arc Lamp with 300W Ozone-Free Xenon Bulb Sutter Instruments LS/OF30
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-027
MATLAB Software Mathworks
MEM Non-Essential Amino Acids Thermo Fisher 11140050
MetaMorph for Olympus Olympus
Micro-Humidification System Bioptechs 130708
MoFlo Astrios EQ Cell Sorter Beckman Coulter B25982
Objective Heater Medium Bioptechs 150819-13
OptiMEM Thermo Fisher 31985070
Phosphate Buffered Saline Sigma Aldrich D8537
pMD2.G Envelope Plasmid Addgene 12259
pRRL Vector gift from Dr. Kam Leong (Columbia University)
psPax2 Packaging Plasmid Addgene 12260
sCMOS ORCA-Flash4.0 V2 Camera Hamamatsu Photonics C11440-22CU
Sorvall Legend XT/XF Centrifuge Thermo Fisher 75004505
Stable Z Stage Warmer Bioptechs 403-1926
Venus Emission Filter Semrock FF01-571/72

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DuFort, C. C., Paszek, M. J., Weaver, V. M. Balancing forces: architectural control of mechanotransduction. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (5), 308-319 (2011).
  2. Mammoto, T., Ingber, D. E. Mechanical control of tissue and organ development. Development. 137 (9), 1407-1420 (2010).
  3. Sun, Y., Chen, C. S., Fu, J. Forcing stem cells to behave: a biophysical perspective of the cellular microenvironment. Annual Review of Biophysics. 41, 519-542 (2012).
  4. Wozniak, M. A., Chen, C. S. Mechanotransduction in development: a growing role for contractility. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (1), 34-43 (2009).
  5. Broders-Bondon, F., Nguyen Ho-Bouldoires, T. H., Fernandez-Sanchez, M. E., Farge, E. Mechanotransduction in tumor progression: The dark side of the force. The Journal of cell biology. 217 (5), 1571-1587 (2018).
  6. Simmons, R. D., Kumar, S., Jo, H. The role of endothelial mechanosensitive genes in atherosclerosis and omics approaches. Archives of Biochemistry and Biophysics. 591, 111-131 (2016).
  7. Wells, R. G. Tissue mechanics and fibrosis. Biochimica et Biophysica Acta. 1832 (7), 884-890 (2013).
  8. Lele, T. P., et al. Mechanical forces alter zyxin unbinding kinetics within focal adhesions of living cells. Journal of Cellular Physiology. 207 (1), 187-194 (2006).
  9. Hoffman, B. D., Grashoff, C., Schwartz, M. A. Dynamic molecular processes mediate cellular mechanotransduction. Nature. 475 (7356), 316-323 (2011).
  10. Dembo, M., Torney, D. C., Saxman, K., Hammer, D. The reaction-limited kinetics of membrane-to-surface adhesion and detachment. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 234 (1274), 55-83 (1988).
  11. LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Hoffman, B. D. Molecular-Scale Tools for Studying Mechanotransduction. Annual Review of Biomedical Engineering. 17, 287-316 (2015).
  12. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
  13. Kong, F., Garcia, A. J., Mould, A. P., Humphries, M. J., Zhu, C. Demonstration of catch bonds between an integrin and its ligand. The Journal of Cell Biology. 185 (7), 1275-1284 (2009).
  14. Rakshit, S., Zhang, Y., Manibog, K., Shafraz, O., Sivasankar, S. Ideal catch, and slip bonds in cadherin adhesion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (46), 18815-18820 (2012).
  15. del Rio, A., et al. Stretching Single Talin Rod Molecules Activates Vinculin Binding. Science. 323 (5914), 638-641 (2009).
  16. Seddiki, R., et al. Force-dependent binding of vinculin to alpha-catenin regulates cell-cell contact stability and collective cell behavior. Molecular Biology of the Cell. 29 (4), 380-388 (2018).
  17. Huang, D. L., Bax, N. A., Buckley, C. D., Weis, W. I., Dunn, A. R. Vinculin forms a directionally asymmetric catch bond with F-actin. Science. 357 (6352), 703-706 (2017).
  18. Chrzanowska-Wodnicka, M., Burridge, K. Rho-stimulated contractility drives the formation of stress fibers and focal adhesions. The Journal of Cell Biology. 133 (6), 1403-1415 (1996).
  19. Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin-cytoskeleton linkages. Cell. 88 (1), 39-48 (1997).
  20. Liu, Z., et al. Mechanical tugging force regulates the size of cell-cell junctions. Proceedings of the National Academy of Science. 107 (22), 9944-9949 (2010).
  21. Riveline, D., et al. Focal contacts as mechanosensors: externally applied local mechanical force induces growth of focal contacts by an mDia1-dependent and ROCK-independent mechanism. The Journal of Cell Biology. 153 (6), 1175-1186 (2001).
  22. Brevier, J., Vallade, M., Riveline, D. Force-extension relationship of cell-cell contacts. Physical Review Letters. 98 (26), 268101 (2007).
  23. Bershadsky, A., Kozlov, M., Geiger, B. Adhesion-mediated mechanosensitivity: a time to experiment, and a time to theorize. Current opinion in cell biology. 18 (5), 472-481 (2006).
  24. Chan, C. E., Odde, D. J. Traction dynamics of filopodia on compliant substrates. Science. 322 (5908), 1687-1691 (2008).
  25. Wu, Z., Plotnikov, S. V., Moalim, A. Y., Waterman, C. M., Liu, J. Two distinct actin networks mediate traction oscillations to confer focal adhesion mechanosensing. Biophysical Journal. 112 (4), 780-794 (2017).
  26. Fritzsche, M., Charras, G. Dissecting protein reaction dynamics in living cells by fluorescence recovery after photobleaching. Nature Protocols. 10 (5), 660-680 (2015).
  27. McNally, J. G. Quantitative FRAP in analysis of molecular binding dynamics in vivo. Methods of Cell Biology. 85, 329-351 (2008).
  28. Wehrle-Haller, B. Analysis of integrin dynamics by fluorescence recovery after photobleaching. Methods in Molecular Biology. 370, 173-202 (2007).
  29. Carisey, A., Stroud, M., Tsang, R., Ballestrem, C. Fluorescence recovery after photobleaching. Methods of Molecular Biology. 769, 387-402 (2011).
  30. Carisey, A., et al. Vinculin regulates the recruitment and release of core focal adhesion proteins in a force-dependent manner. Current Biology. 23 (4), 271-281 (2013).
  31. Wolfenson, H., Bershadsky, A., Henis, Y. I., Geiger, B. Actomyosin-generated tension controls the molecular kinetics of focal adhesions. Journal of Cell Science. 124, 1425-1432 (2011).
  32. Dumbauld, D. W., et al. How vinculin regulates force transmission. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (24), 9788-9793 (2013).
  33. Zaidel-Bar, R., Itzkovitz, S., Ma'ayan, A., Iyengar, R., Geiger, B. Functional atlas of the integrin adhesome. Nature Cell Biology. 9 (8), 858-867 (2007).
  34. Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
  35. LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Berginski, M. E., Urs, A. N., Hoffman, B. D. Construction, imaging, and analysis of FRET-based tension sensors in living cells. Biophysical Methods in Cell Biology. 125, 161-186 (2015).
  36. Meng, F., Suchyna, T. M., Sachs, F. A fluorescence energy transfer-based mechanical stress sensor for specific proteins in situ. The FEBS Journal. 275 (12), 3072-3087 (2008).
  37. Rothenberg, K. E., Scott, D. W., Christoforou, N., Hoffman, B. D. Vinculin Force-Sensitive Dynamics at Focal Adhesions Enable Effective Directed Cell Migration. Biophysical journal. 114 (7), 1680-1694 (2018).
  38. Austen, K., et al. Extracellular rigidity sensing by talin isoform-specific mechanical linkages. Nature Cell Biology. 17 (12), 1597-1606 (2015).
  39. Kumar, A., et al. Talin tension sensor reveals novel features of focal adhesion force transmission and mechanosensitivity. The Journal of Cell Biology. 213 (3), 371-383 (2016).
  40. Acharya, B. R., et al. Mammalian Diaphanous 1 Mediates a Pathway for E-cadherin to Stabilize Epithelial Barriers through Junctional Contractility. Cell Reports. 18 (12), 2854-2867 (2017).
  41. Borghi, N., et al. E-cadherin is under constitutive actomyosin-generated tension that is increased at cell-cell contacts upon externally applied stretch. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (31), 12568-12573 (2012).
  42. Conway, D. E., Williams, M. R., Eskin, S. G., McIntire, L. V. Endothelial cell responses to atheroprone flow are driven by two separate flow components: low time-average shear stress and fluid flow reversal. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298 (2), H367-H374 (2010).
  43. Arsenovic, P. T., et al. Nesprin-2G, a Component of the Nuclear LINC Complex, Is Subject to Myosin-Dependent Tension. Biophysical Journal. 110 (1), 34-43 (2016).
  44. Ye, N., et al. Direct observation of alpha-actinin tension and recruitment at focal adhesions during contact growth. Experimental Cell Research. 327 (1), 57-67 (2014).
  45. Paszek, M. J., et al. The cancer glycocalyx mechanically primes integrin-mediated growth and survival. Nature. 511 (7509), 319-325 (2014).
  46. Gayrard, C., Borghi, N. FRET-based Molecular Tension Microscopy. Methods. 94, 33-42 (2016).
  47. de Beco, S., Gueudry, C., Amblard, F., Coscoy, S. Endocytosis is required for E-cadherin redistribution at mature adherens junctions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (17), 7010-7015 (2009).
  48. Östlund, C., et al. Dynamics and molecular interactions of linker of nucleoskeleton and cytoskeleton (LINC) complex proteins. Journal of Cell Science. 122 (22), 4099-4108 (2009).
  49. Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. The interactions of retroviruses and their hosts. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor (NY). (1997).
  50. Komatsubara, A. T., Matsuda, M., Aoki, K. Quantitative analysis of recombination between YFP and CFP genes of FRET biosensors introduced by lentiviral or retroviral gene transfer). Scientific Reports. 5, 13283 (2015).
  51. Nasri, M., Karimi, A., Farsani, M. A. Production purification and titration of a lentivirus-based vector for gene delivery purposes. Cytotechnology. 66 (6), 1031-1038 (2014).
  52. Addgene, Generating Stable Cell Lines with Lentivirus. , Available from: https://www.addgene.org/protocols/generating-stable-cell-lines (2016).
  53. Roederer, M. Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats. Cytometry: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 45 (3), 194-205 (2001).
  54. Malkani, N., Schmid, J. A. Some secrets of fluorescent proteins: distinct bleaching in various mounting fluids and photoactivation of cyan fluorescent proteins at YFP-excitation. PLoS One. 6 (4), e18586 (2011).
  55. Chen, H., Puhl, H. L. 3rd, Koushik, S. V., Vogel, S. S., Ikeda, S. R. Measurement of FRET efficiency and ratio of donor to acceptor concentration in living cells. Biophysical journal. 91 (5), L39-L41 (2006).
  56. Rothenberg, K. E., Neibart, S. S., LaCroix, A. S., Hoffman, B. D. Controlling Cell Geometry Affects the Spatial Distribution of Load Across Vinculin. Cellular and Molecular Bioengineering. 8 (3), 364-382 (2015).
  57. Carnell, M., Macmillan, A., Whan, R. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP): acquisition, analysis, and applications. Methods of Molecular Biology. 1232, 255-271 (2015).
  58. Trembecka, D. O., Kuzak, M., Dobrucki, J. W. Conditions for using FRAP as a quantitative technique--influence of the bleaching protocol. Cytometry A. 77 (4), 366-370 (2010).
  59. Lavelin, I., et al. Differential effect of actomyosin relaxation on the dynamic properties of focal adhesion proteins. PLoS One. 8 (9), e73549 (2013).
  60. Foote, H. P., Sumigray, K. D., Lechler, T. FRAP analysis reveals stabilization of adhesion structures in the epidermis compared to cultured keratinocytes. PLoS One. 8 (8), e71491 (2013).
  61. Zal, T., Gascoigne, N. R. Photobleaching-corrected FRET efficiency imaging of live cells. Biophysical Journal. 86 (6), 3923-3939 (2004).
  62. Hodgson, L., Shen, F., Hahn, K. Biosensors for characterizing the dynamics of rho family GTPases in living cells. Current Protocols in Cell Biology. 46 (1), (2010).
  63. Day, R. N. Measuring protein interactions using Förster resonance energy transfer and fluorescence lifetime imaging microscopy. Methods. 66 (2), 200-207 (2014).
  64. Rapsomaniki, M. A., et al. easyFRAP: an interactive, easy-to-use tool for qualitative and quantitative analysis of FRAP data. Bioinformatics. 28 (13), 1800-1801 (2012).
  65. Zamir, E., et al. Molecular diversity of cell-matrix adhesions. Journal of cell science. 112 (11), 1655-1669 (1999).
  66. Bakolitsa, C., et al. Structural basis for vinculin activation at sites of cell adhesion. Nature. 430 (6999), 583-586 (2004).
  67. De Los Santos, C., Chang, C. W., Mycek, M. A., Cardullo, R. FRAP, FLIM, and FRET: Detection and analysis of cellular dynamics on a molecular scale using fluorescence microscopy. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 587-604 (2015).
  68. Periasamy, A., Wallrabe, H., Chen, Y., Barroso, M. Chapter 22: Quantitation of protein-protein interactions: confocal FRET microscopy. Methods in Cell Biology. 89, 569-598 (2008).
  69. Stehbens, S., Pemble, H., Murrow, L., Wittmann, T. Imaging intracellular protein dynamics by spinning disk confocal microscopy. Methods in Enzymology. , 293-313 (2012).
  70. Zeug, A., Woehler, A., Neher, E., Ponimaskin, E. G. Quantitative intensity-based FRET approaches--a comparative snapshot. Biophysical Journal. 103 (9), 1821-1827 (2012).
  71. Ehrlicher, A. J., Nakamura, F., Hartwig, J. H., Weitz, D. A., Stossel, T. P. Mechanical strain in actin networks regulates FilGAP and integrin binding to filamin A. Nature. 478 (7368), 260-263 (2011).
  72. Guo, B., Guilford, W. H. Mechanics of actomyosin bonds in different nucleotide states are tuned to muscle contraction. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (26), 9844-9849 (2006).
  73. Lee, C. Y., et al. Actin depolymerization under force is governed by lysine 113:glutamic acid 195-mediated catch-slip bonds. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (13), 5022-5027 (2013).
  74. Cost, A. L., Ringer, P., Chrostek-Grashoff, A., Grashoff, C. How to Measure Molecular Forces in Cells: A Guide to Evaluating Genetically-Encoded FRET-Based Tension Sensors. Cellular and Molecular Bioengineering. 8 (1), 96-105 (2015).
  75. Bertocchi, C., et al. Nanoscale architecture of cadherin-based cell adhesions. Nature Cell Biology. 19 (1), 28-37 (2017).
  76. Case, L. B., et al. Molecular mechanism of vinculin activation and nanoscale spatial organization in focal adhesions. Nature Cell Biology. 17 (7), 880-892 (2015).
  77. Chen, H., Cohen, D. M., Choudhury, D. M., Kioka, N., Craig, S. W. Spatial distribution and functional significance of activated vinculin in living cells. The Journal of Cell Biology. 169 (3), 459-470 (2005).
  78. Kim, T. J., et al. Dynamic visualization of alpha-catenin reveals rapid, reversible conformation switching between tension states. Current Biology. 25 (2), 218-224 (2015).
  79. Yao, M., et al. Mechanical activation of vinculin binding to talin locks talin in an unfolded conformation. Scientific reports. 4, 4610 (2014).

Tags

Bioteknologi sag 141 Mechanobiology mechanotransduction Biofysik FRET-baserede spænding sensorer FRAP kraft-følsom protein dynamics
Måling af kraft-følsom Protein Dynamics i levende celler ved hjælp af en kombination af fluorescerende teknikker
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rothenberg, K. E., Puranam, I.,… More

Rothenberg, K. E., Puranam, I., Hoffman, B. D. Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques. J. Vis. Exp. (141), e58619, doi:10.3791/58619 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter