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Bioengineering

Mesure de la dynamique des protéines sensibles à la Force dans les cellules vivantes à l’aide d’une combinaison de Techniques Fluorescent

Published: November 2, 2018 doi: 10.3791/58619
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, Duke University

Summary

Nous présentons ici un protocole pour l’utilisation simultanée de Förster resonance capteurs tension axée sur le transfert de l’énergie pour mesurer la récupération de charge et de fluorescence de protéine après photoblanchiment pour mesurer la dynamique des protéines permettant la mesure de force-sensibles dynamique des protéines dans des cellules vivantes.

Abstract

Les cellules détectent et répondent à des stimuli physiques dans leur environnement en convertissant des stimuli mécaniques en signaux biochimiquement détectables dans un processus appelé la mécanotransduction. Une étape cruciale dans la mécanotransduction est la transmission des forces entre les environnements externes et internes. Pour transmettre des forces, il doit y avoir une liaison physique soutenue et ininterrompue, créée par une série d’interactions protéine-protéine. Pour une interaction protéine-protéine donnée, charge mécanique ne peut non plus avoir aucun effet sur l’interaction, entraîner une dissociation plus rapide de l’interaction, ou même stabilise l’interaction. Comprendre comment moléculaire charge dicte de renouvellement des protéines dans les cellules vivantes peut fournir des informations précieuses sur l’état mécanique d’une protéine, à son tour élucider son rôle dans la mécanotransduction. Les techniques existantes pour mesurer la dynamique des protéines sensibles à la force n’ont pas des mesures directes de la charge protéique ou s’appuient sur les mesures effectuées en dehors du contexte cellulaire. Nous décrivons ici un protocole pour la récupération Förster resonance energy transfert-fluorescence après photoblanchiment (FRAP-frette) technique, qui permet la mesure de la dynamique des protéines sensibles à la force dans des cellules vivantes. Cette technique est potentiellement applicable à n’importe quel capteur de tension axée sur la frette, facilitant l’étude de la dynamique des protéines sensibles à la force dans diverses structures subcellulaires et dans différents types de cellules.

Introduction

L’environnement extracellulaire est une source riche d’indices biochimiques et physiques qui régissent le comportement de la cellule. En particulier, la nature physique du microenvironnement peut médier principales fonctions cellulaires, y compris la croissance cellulaire, migration et différenciation1,2,3,4. Le dérèglement de la mécanique du microenvironnement est une composante essentielle pour beaucoup de maladies qui n’ont pas encore de traitements adéquats, tels que le cancer5, athérosclérose6et7de la fibrose. Bien comprendre comment les cellules convertissent des stimuli physiques en signaux détectables biochimiquement, un processus appelé mécanotransduction, exige l’élucidation des mécanismes moléculaires médiation transmission de force, dans et hors des cellules et au sein de plusieurs structures subcellulaires.

À l’intérieur des structures subcellulaires, les protéines sont tournent constamment la liaison et la séparation basée sur la force de leurs interactions avec les partenaires8de fixation. Pour les forces à être transmis avec succès à travers une distance physique, il doivent y avoir une chaîne ininterrompue d’interactions protéine-protéine, ce qui signifie que le chiffre d’affaires de la protéine doit être suffisamment lente pour maintenir et transmettre la force à son partenaire de liaison9. Alors que les interactions protéines-protéines sont généralement consistent de plusieurs non-liaisons covalentes entre les domaines de la protéine, l’interaction est souvent conceptualisée comme un État lié qui peut passer à un État indépendant sous différentes conditions10, 11. pour une interaction protéine-protéine donnée, il est possible que la force peut avoir no effet sur la durée de vie de l’interaction, connue comme un « bond idéal », réduire la durée de vie de l’interaction, connue comme un « lien de glissement » ou augmenter la durée de vie de l’interaction , connu comme un « bond de capture »10. Ainsi, il y a une relation entre charge protéique et la dynamique des protéines que nous désignons comme sensibles à la force dynamique.

Vers la compréhension de l’effet de la charge sur la dynamique de liaison, un certain nombre d’expériences très instructifs ont été réalisé au niveau de la molécule unique. À l’aide de protéines isolées, ou fragments de protéines et de techniques de manipulation comme magnétique pincettes, pinces optiques et microscopie à force atomique, ces études ont démontré les interactions protéines sensibles à la force pour plusieurs pertinentes protéines11,12. Les deux intégrines13 et cadhérines14, qui sont des protéines transmembranaires importants pour former des interactions cellule-matrice et les cellules, respectivement, ont montré des altérations dans la dynamique due pour charger. Au sein de la cellule, vinculine est recruté pour les deux talin15 et α-caténine16 en fonction de la force et peut former une liaison de catch avec l’actine17, indiquant un rôle crucial pour la vinculine adhérences focales (FAs) et jonctions adherens (AJs ) sous charge. Études de molécules simples permettant l’isolement des interactions protéine-protéine spécifique et donnent des résultats sans ambiguïté, mais ils ne tiennent pas compte de la complexité de l’environnement cellulaire.

Point de repère expériences ont démontré que plusieurs structures subcellulaires, dont le syndrome et AJs, sont mécanosensibles et pièce Assemblée améliorée en réponse aux charges interne ou externe appliqué18,19, 20,21,22. En outre, plusieurs modèles théoriques ont suggéré que l’Assemblée mécanosensibles pourrait être pilotée par protéines sensibles à la force dynamique23,24,25. Pour examiner ces dynamiques sensibles à la force dans des cellules vivantes, quelques approches indirectes ont été prises. PAF et les techniques connexes fournissent une méthode relativement simple pour mesurer la dynamique des protéines en cellules26,27,28,29. Toutefois, la mesure de la charge de la protéine a été plus limitée. Une approche classique consiste à comparer la dynamique des protéines dans les cellules avec et sans l’exposition à un inhibiteur du cytosquelette utilisé pour réduire l’ensemble cellule contractilité8,30,31. Sur le plan conceptuel, il s’agit d’une comparaison entre une charge élevée et un état de faible charge. Cependant, il n’y a aucune quantification de la charge dans l’ensemble de la protéine dans aucun des États, et il peut y avoir des effets biochimiques involontaires de l’inhibiteur, telle la perte de sites de fixation clés le long d’un filament d’actine F. Une autre approche, spécifique au FAs, a consisté à mesurer l’effort de force totale sur le substrat par la FA à l’aide de la microscopie à force traction approximative charge moléculaire et d’examiner la relation avec la dynamique d’une seule protéine au sein de la FA32. Tandis que cette approche permet la quantification de l’ensemble de la population, il ne fournit pas des informations moléculaires spécifiques. SAF est constitués de plus de 200 protéines différentes, dont beaucoup peuvent supporter la charge33. Ainsi, mesurer l’intensité de la force totale d’une FA potentiellement obscurcit la possibilité de plusieurs voies de transmission de force et fiable, ne fournit pas une mesure de la charge sur une protéine spécifique.

Contrairement aux approches antérieures en mécanobiologie, l’avènement des capteurs de tension axée sur la frette permet directement les cellules de mesure des charges subies par les protéines spécifiques à l’intérieur de vie34,35,,36. Nous présentons ici un protocole qui associe des capteurs de tension axée sur la frette FRAP-mesure de la dynamique des protéines. Nous appelons cette technique FRAP-frette. Cette approche permet la mesure simultanée de la charge protéique et de la dynamique des protéines, ce qui permet l’évaluation de la dynamique des protéines sensibles à la force dans les cellules vivantes (Figure 1). Déjà, la frette-FRAP technique a été appliquée à l’étude de la dynamique de la force-sensibles de l’éditeur de liens mécaniques protéine vinculine37. Capteurs de tension ont été développées pour nombreuses protéines qui sont pertinentes dans une variété de structures subcellulaires. Par exemple, les capteurs ont été développés pour la vinculine34 et talin38,39 FAs, cadhérines et caténines AJs40,41,42, nesprin dans le complexe de LINC nucléaire 43, α-actinine44 et filamine36 dans le cytosquelette et MUC-1 dans le glycocalyx45, entre autres46. De même, le FRAP est qu'une technique couramment utilisée a été utilisée sur les protéines de mécanosensibles dans les adhérences focales8,31, adherens jonctions47, actine cortex26et noyau48. Aller de l’avant, que la frette-FRAP technique devrait être largement applicable à l’un de ces capteurs existants ou nouvellement développé capteurs, permettant les mesures de la dynamique de la force-sensibles dans une grande variété de contextes et de structures subcellulaires. À cette fin, nous fournissons un protocole détaillé, généralisé de mise en oeuvre de la technique de la frette-FRAP applicable dans ces différents systèmes. J’espère que cela permettra une grande variété d’expériences élucider les rôles de diverses protéines de mécanosensibles dans la régulation de transmission de la force et dans la médiation de comportement de la cellule.

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Protocol

1. générer des échantillons pour l’imagerie

  1. Stablement express tension capteur construct dans type de cellule souhaité.
    1. Cloner tension capteur construct dans pRRL vecteur ou autres plasmides d’expression virale.
      Remarque : Plusieurs outils de clonage moléculaires différents sont disponibles pour réaliser cette étape, y compris l’utilisation des enzymes de restriction, se chevauchent extension et Gibson Assemblée35. Le vecteur pRRL est utilisé dans lenti transduction virale et permet un degré substantiel de la production de protéines grâce à l’utilisation du promoteur humain cytomégalovirus (CMV). Différents vecteurs peuvent être nécessaires pour un contexte particulier. Par exemple, le promoteur du CMV est réduit au silence dans certains types de cellules49. En outre, uniquement axée sur la frette capteurs contenant la protéine fluorescente ce manque forte homologie, tels que mTFP1 et A206K de Vénus, peut servir à créer des lignées cellulaires stables. Capteurs contenant une protéine fluorescente cyan et protéine fluorescente jaune sera probablement soumis à50de la recombinaison homologue.
    2. Générer des lentivirus dans des cellules de rein humain embryonnaire (HEK) 293 t à l’aide de psPax2 et plasmides d’emballage de pMD2.G à l’aide de virus standard production méthodes51.
      ATTENTION : Lentivirus seulement doivent être manipulés que par du personnel qualifié dans un environnement de laboratoire de niveau 2 de biosécurité.
      Remarque : Cette combinaison de cellules et de plasmides d’emballage est conçue pour fonctionner au pRRL. Autres systèmes peuvent être nécessaires avec les autres vecteurs.
    3. Transduce cellules souhaitées par le virus à l’aide de protocoles standard de transduction52 et cytométrie permet de trier les cellules de53 en sélectionnant une population homogène exprimant chaque construction à taux endogènes environ37. Après la sélection de cellule, expériences peuvent être effectuées immédiatement, ou cellules peuvent être cryogéniquement congelés pour une utilisation ultérieure. Ne pas dépasser les 2 cycles de gel-dégel sur une lignée cellulaire stable donné.
      Remarque : L’utilisation de lignées cellulaires déficientes dans la protéine d’être étudiées (p. ex., MEFs vinculine- / - pour l’utilisation avec le capteur de tension vinculine) va augmenter le signal à bruit ratio dans les expériences de FRET ainsi que limiter les artefacts de la surexpression. Ces lignes de fibroblastes embryonnaires (MEF) de souris stable peuvent être utilisés pour environ 15 passages avant une perte significative de l’expression ou la dégradation des capteurs est apparente. Si vous ne désirez pas méthodes virales, une pléthore de réactifs commerciaux peut être utilisée selon le protocole du fabricant à transfecter transitoirement une variété de types de cellules avec des capteurs de tension dans un plasmide approprié, tel que pcDNA3.1. Une expression optimale sera de 24 à 48 h après la transfection.
  2. Préparation des substrats pour l’ensemencement de la cellule.
    1. Acquérir 4, plats de 35 mm à fond de verre.
    2. Travailler sous une hotte de culture cellulaire, dans un tube de 15 mL canonique, faire 4 mL de 10 µg/mL la fibronectine dans tamponnée au phosphate (PBS) du sérum physiologique à l’aide de PBS stérile dans la hotte de la culture cellulaire. Retourner doucement le tube une fois pour mélanger et laissez la solution reposer pendant 5 min dans le capot de la culture cellulaire.
      Remarque : La concentration ou le type de protéine, ECM peut avoir à régler pour les autres types de cellules. Les conditions prévues sont adaptées pour les MEFs.
    3. Pipette 1 mL de solution de la fibronectine sur chaque plat à fond de verre.
    4. Laisser la solution de la fibronectine sur la vaisselle pendant 1 h à température ambiante ou pendant la nuit à 4 ° C.
    5. Aspirer la solution de la fibronectine, rincez une fois avec du PBS et ajouter 1 mL de PBS.
  3. Les cellules sur des substrats préparés et des semences.
    1. Commencez par les cellules d’intérêt à un pourcentage de confluence approprié pour la sous-culture dans une boîte de Petri de 6 cm.
      Remarque : Différents types de cellules exigera des conditions de culture cellulaires distincts et protocoles de sous-culture. Cette section fournit des instructions permettant de MEFs. En général, MEFs sont cultivés jusqu'à 85 % confluence avant la sous-culture.
    2. Travaillant dans une hotte de culture cellulaire, rincer les cellules une fois avec 3 mL de PBS. Ajouter 1 mL de 0.05 % trypsine-EDTA et incuber pendant 5 min à 37 ° C.
    3. Ajouter 3 mL de support complet pour le plat de 6 cm, recueillir les cellules et placer dans un tube conique de 15 mL.
      NOTE : Composition des médias complète dépendra le type de cellule utilisé. Pour MEFs, les médias est souvent définie comme milieu Eagle de la modification de taux de glycémie élevé Dulbecco avec sérum de veau fœtal 10 %, 1 % antibiotique-antimycosiques (contenant l’amphotéricine B, la pénicilline et la streptomycine) et une solution d’acides aminés non essentiels (NEAA) de 1 %.
    4. Faire tourner les cellules vers le bas à 1000 x g pendant 5 min.
    5. Aspirer les médias et Resuspendre le culot dans 1 mL de médias complet.
    6. Enlever PBS de vaisselle de verre enduit de la fibronectine. Compter les cellules et 30 000 cellules sur chaque plat en verre enduit de fibronectine avec le support approprié et complet pour un volume final de 1,5 mL de graines.
      Remarque : Cette densité cellulaire convient pour MEFs et conduira à une population de cellules qui ne sont pas toucher, mais pas extrêmement clairsemée. Le nombre exact de cellules peut devoir être ajustée pour les autres types de cellules ou autre chambre d’imagerie.
    7. Laissez les cellules à se répandre pendant 4 h après l’ensemencement. A 2 h de propagation, aspirer les milieux de croissance et rincez une fois avec l’imagerie médiatique, laissant 1,5 mL d’imagerie des médias.
      Remarque : Ce temps de propagation est approprié pour les MEFs mais devrez peut-être être modifiées pour les autres cellules. Toutefois, les périodes d’incubation de plus de 6-8 h conduira aux dépôts importants de protéines ECM du sérum dans les médias complets. Imagerie des médias doit contenir les mêmes ajouts comme média complet mais devrait être optiquement clair et non contiennent des composés qui sont fluorescents dans les canaux d’imagerie, telles que des flavines ni étancher la fluorescence, comme le rouge de phénol. Un média d’imagerie n’est généralement utile est milieu DMEM-gfp Live cellule visualisation avec solution NEAA SVF et 1 % à 10 %. Si arrière-plan autofluorescence est trop élevé, alors la quantité de sérum peut être réduite. Si un changement de support n’est pas possible après les ensemencements initiaux, les cellules peuvent être charriés directement dans l’imagerie des milieux supplémentés avec un inhibiteur de la trypsine.

2. mettre en place le Microscope pour l’imagerie

  1. Allumez le microscope.
    1. Commencez par allumer la lampe à arc.
      Remarque : Une lampe à arc publiera une impulsion électromagnétique, qui peuvent endommager les autres appareils qui se trouve déjà.
    2. Activer le filtre roue contrôleur, contrôleur de scène automatisé, interface microscope-ordinateur et appareil photo.
    3. Allumer l’appareil FRAP et laser contrôleurs de position.
      ATTENTION : Lasers haute puissants peuvent être dommageable pour les yeux directement affichée. Il est recommandé de configurer le système de microscope pour bloquer l’excitation de laser d’être dirigé vers les pièces de l’oeil, qui peuvent être accomplis en déplaçant un miroir sur le trajet du faisceau FRAP pendant le blanchiment afin de refléter le laser vers l’échantillon et de prévenir la transmission à l’oculaire.
    4. Allumez l’ordinateur et le logiciel de contrôle de microscope ouvert.
    5. Laisser 15 min pour la lampe à arc et PAF laser pour se réchauffer.
  2. Calibrer le laser FRAP.
    1. Ouvrez la fenêtre de configuration de laser. Réglez Illumination (durant l’impulsion) sur les paramètres d’éclairage FRAP appropriés pour l’exposition de laser à l’échantillon. Réglé Éclairage réglage (imagerie) comme éclairage approprié pour l’imagerie seulement le fluorophore accepteur.
    2. Sélectionner l’objectif d’étalonner sous Paramétrage du système de coordonnées. Décochez la case Manuellement cliquez sur Points d’étalonnage et cochez afficher les images lors de l’étalonnage.
    3. Réglez le temps de pause sur µs 10 000 et le nombre d’impulsions à 100.
    4. Placez la diapositive d’étalonnage, de bromure d’éthidium scellé entre une lame de verre et d’un lamelle couvre-objet, dans l’adaptateur de la scène avec le côté de la lamelle vers le bas.
      ATTENTION : Le bromure d’éthidium est un agent mutagène et doit être manipulé avec des gants. Si la diapositive est compromise, éliminer conformément aux directives de l’institution.
    5. Utilisez les paramètres d’éclairage accepteur de se concentrer sur la surface de la lame, identifiable comme le plan focal avec le signal plus brillants. Petits défauts dans le revêtement sera visibles à l’aide à se concentrer.
    6. Déplacer la diapositive vers une zone avec une fluorescence homogène à travers le plan d’imagerie.
    7. Cliquez sur créer le paramètre. Le logiciel s’initialise le processus de calibrage, blanchiment et détecter la position du point blanchie automatiquement.
    8. Assurer une calibration réussie en évaluant l’image finale, qui sera une grille 3 x 3 points blanchie qui doit être répartie uniformément et mise au point. Enregistrer l’image de calibration pour référence ultérieure.
    9. Retirer la glissière de calibrage et de stocker en toute sécurité. Étalonnage doit être effectué avant le début de chaque expérience, mais n’a pas besoin d’être effectuée entre les échantillons.

3. Choisissez les paramètres pour l’imagerie de la frette

  1. Fixer un des échantillons générés des cellules exprimant le capteur de tension avec paraformaldéhyde à 4 % pendant 10 min. solution de paraformaldéhyde devrait être méthanol libre, souvent dénommé EM-grade, pour éviter la dénaturation des protéines fluorescentes. Placer dans du PBS après fixation.
    ATTENTION : Les solutions de paraformaldéhyde sont toxiques. Cette étape doit être effectuée sous une hotte et la solution devrait être disposée selon les politiques institutionnelles.
    NOTE : Cette optimisation ne dépend pas de la dynamique des protéines, et un échantillon fixe permet des temps d’imagerie maximum sans se soucier de la santé cellulaire.
  2. Rincer l’échantillon trois fois avec du PBS et laisser dans les PBS.
    Remarque : Utilisation des supports de montage plus disponible dans le commerce affectera propriétés fluorophore, rendant l’échantillon impropre pour imagerie54FRET. Idéalement, les cellules sont projetés immédiatement, mais peuvent être laissés toute la nuit à 4 ° C. Temps d’attente plus longs seront traduira par la détérioration de l’échantillon.
  3. Placer l’échantillon dans le porte-stade de microscope pour l’imagerie.
  4. Ouvrez l’outil Multi-Dimensional Acquisition (MDA). Mettre en place une imagerie séquentielle des trois canaux : excitation seul accepteur et des émissions (canal accepteur), excitation du donneur et émission de l’accepteur (canal frette) et excitation seul donneur et des émissions (canal de donateurs).
    Remarque : Il existe une variété de façons d’échantillons d’image frette. La méthode trois canaux ou « trois-cube » d’imagerie jumelé avec moyen de calibrer le système pour mesurer l’efficacité de la frette est recommandée pour capteurs de tension axée sur la frette55,56. Cette approche est simple, rapide et non destructive, requiert uniquement une norme fluorescence imaging microscope et permet la comparaison des expériences sur des jours différents et des installations d’imagerie.
  5. Analyse de l’échantillon à l’aide d’un temps d’exposition de 500 ms et un filtre de densité neutre (ND) de 10 %. Trouver une cellule exprimant le capteur de tension avec une localisation clairement vers une structure d’intérêt.
  6. Choisissez un temps d’exposition de 500 ms ou la longueur désirée pour chaque canal d’imagerie et un filtre ND de 100 % et acquérir une séquence d’images de frette.
  7. Estimer l’intensité moyenne du capteur les structures subcellulaires d’intérêt pour chaque voie d’imagerie. Les signaux faibles peuvent entraîner des résultats inexacts en raison d’une mauvaise correction des estimations, les non-linéarités dans les détecteurs, ou une contribution significative des signaux de fond. Une orientation approximative est de viser l’intensité supérieure à 10 % de la gamme dynamique de la caméra (i.e., pour un appareil de 16 bits, les intensités sera au-dessus de 6 000).
    Remarque : Les paramètres optiques identiques (temps d’exposition, des filtres, objectifs et autres variables telles que le gain de la caméra ou binning) doivent être utilisés pour toutes les expériences de la frette qui seront comparés. Changer le quelconque de ces paramètres donneront lieu à une altération de la quantité FRET qui est soit généré et/ou détectée dans la mise en place de la microscopie. Mesures d’efficacité FRET sont indépendantes de ces définissant, mais les facteurs d’étalonnage utilisées pour déterminer l’efficacité FRET ne sont pas. En théorie, les différents ensembles de facteurs d’étalonnage pourraient servir à générer des efficacités frette de différents paramètres optiques, mais cela n’est pas recommandé. Le blanchiment ou la phototoxicité peut différer entre les différents réglages, créant de fausses résultats.
  8. Acquérir une deuxième séquence d’images de frette du même champ de vision. Estimer le photoblanchiment entre les membrures en comparant l’intensité moyenne du capteur pour chaque voie d’imagerie. Photoblanchiment devrait être réduit au minimum, préférence inférieure à 1-5 % de perte de signal.
  9. Ajustez les paramètres d’imagerie afin de maximiser l’intensité tout en minimisant le photoblanchiment. Pour ajustement grossier, changer le filtre ND utilisé lors de l’acquisition. Pour des réglages plus fins, changer la durée d’exposition par incréments de 250 ms.
  10. Répétez les étapes 3,5 à 3,8 jusqu'à ce que le signal adéquat peut être obtenu tout en minimisant le photoblanchiment.
    Remarque : En général, les paramètres pour le capteur de tension de vinculine dans MEFs vinculine- / - sont 1 500 ms, ms 1 500 et 1 000 ms pour les canaux de la frette, le donneur et l’accepteur respectivement. Les valeurs optimales varient avec le type de système d’éclairage, objectif, jeux de filtres et niveau d’expression de capteur.

4. Choisissez paramètres pour FRAP imagerie

  1. Optimiser les paramètres du laser afin d’assurer un blanchiment complet de la région d’intérêt (ROI) sans blanchiment des environs ou provoquant le photovieillissement.
    1. Fixer un des échantillons générés des cellules exprimant le capteur de tension avec paraformaldéhyde à 4 % pendant 10 min.
      NOTE : Cette optimisation ne dépend pas de la dynamique des protéines, et un échantillon fixe permet des temps d’imagerie maximum sans se soucier de la santé cellulaire. Cela évitera également la récupération de blanchiment par les protéines mobiles, permettant d’isoler l’effet du blanchiment, éviter tout effet de récupération rapide, diffusion-mediated fluorescence ayant eu lieu entre l’incidence de blanchiment et de prendre la première image de l’eau de Javel.
      ATTENTION : Les solutions de paraformaldéhyde sont toxiques. Cette étape doit être effectuée sous une hotte et la solution devrait être disposée selon les politiques institutionnelles.
    2. Rincer l’échantillon 3 fois avec du PBS et laisser dans les PBS.
      Remarque : L’utilisation de supports de montage plus disponible dans le commerce affectera propriétés fluorophore, rendant l’échantillon impropre pour FRAP imagerie54. Idéalement, les cellules sont projetés immédiatement, mais peuvent être laissés toute la nuit à 4 ° C. Temps d’attente plus longs seront traduira par la détérioration de l’échantillon.
    3. Placer l’échantillon dans le porte-stade de microscope pour l’imagerie.
    4. Ouvrez la fenêtre de configuration de laser. Commencez par définir un temps de pause de laser de 1 000 µs et 10 impulsions, ce qui signifie que chaque point dans l’analyse à travers le ROI recevra 10 000 µs de pleine puissance laser
      Remarque : Une de 500 mW, laser à 515 nm a été utilisé pour le blanchiment. Cela a été retenu pour blanchir sélectivement la Vénus A206K, l’accepteur vinculine capteur de tension, avec une efficacité maximale. Si l'on utilise des capteurs de tension axée sur la frette avec d’autres protéines fluorescentes, un autre type de laser peut-être d’être employé.
    5. Trouver une cellule exprimant le capteur de tension avec une localisation clairement vers une structure d’intérêt et d’acquérir une image.
    6. Dessiner un ROI rectangulaire délimitant la zone pour blanchir et pour stocker l’emplacement du ROI. Impulsion du laser. Prenez une autre image de l’échantillon.
      Remarque : La taille de la boîte devrait être approximativement la taille de l’ensemble FA. Il faut que la taille de la boîte ne varie pas considérablement à travers des expériences. La zone blanchie doit être soigneusement contrôlée en protéines dont les dynamiques sont affectés par diffusion. Il s’agit d’un problème potentiel dans des protéines transmembranaires, tels que les cadhérines47, ou des protéines qui diffusent lentement27,57.
    7. Vérifiez la qualité de photoblanchiment en vérifiant que le ROI tout est blanchie, telle que l’intensité est proche des niveaux de fond. En outre, assurez-vous qu’il n’y a aucun blanchiment en dehors le retour sur investissement.
    8. Ajustez les réglages de laser si nécessaire pour atteindre une quantité importante de blanchiment dans le retour sur investissement sans provoquer de décoloration significative hors le ROI. Pour ajustement grossier, soulever et abaisser le temps de pause dans les étapes de 100 µs et pour un réglage, soulever et abaisser le nombre d’impulsions par incréments de 5 impulsions.
    9. Répétez les étapes 4.1.5 – 4.1.8 jusqu'à atteindre les paramètres minimaux au cours de laquelle le ROI est entièrement blanchie sans hors cible photobleaching.
      NOTE : Atteindre une valeur substantielle de blanchiment initiale sans provoquer de phototoxicité est un aspect clé de l’analyse de la PAF. Utilisez les paramètres laser qui donnent lieu à un produit de blanchiment complet dans les échantillons fixes. En général, le nombre minimal de photons devrait être utilisé pour atteindre le niveau souhaité de blanchiment. En outre, le protocole de blanchiment devrait être conservé relativement constant au cours d’expériences, tel altérations peuvent affecter les mesures de protéine dynamique58.
  2. Optimiser les paramètres Time-lapse pour saisir pleinement la dynamique de la protéine d’intérêt tout en minimisant le photoblanchiment.
    1. Préparer la mise en place de microscope pour l’imagerie de cellules vivantes, de préférence avec une platine chauffante et objectif ainsi que contrôle de CO2 . Laisser se pour équilibrer pendant 20 min.
      Remarque : Pour maintenir la santé des cellules imagés, pH et la température doivent être maintenues dans le vaisseau d’imagerie. Une variété de stades chauffées et chauffages objectives peut facilement maintenir la température à 37 ° C. Le contrôle du pH pour de nombreux types de médias peut être accompli par l’utilisation d’une pompe péristaltique à col humidifiée 5 % CO2 sur l’échantillon à 15 mL/min. par ailleurs, si CO2 contrôle n’est pas disponible, vivre d’imagerie milieux contenant HEPES devrait servir à empêcher la modification de pH important.
    2. Placez un des échantillons générés des cellules exprimant le capteur de tension dans le support de scène de microscope pour l’imagerie. Laisser se pour équilibrer pendant 10 min.
    3. À l’aide de l’outil MDA, mis en place un Time-lapse pour acquérir 3-5 images pré bleach, bleach le retour sur investissement et continuent de prendre des images de 10 à 60.
      Remarque : Pour la vinculine au FAs, imagerie toutes les 5 s d’eau de Javel après 5 min suffit d’observer la dynamique sans introduire de blanchiment excessif31. Les points de départ utiles pour taux d’imagerie et de la durée pour nombreuses autres protéines se trouvent dans la littérature47,48,,du5960.
    4. Utilisez accepteur d’imagerie paramètres qui réduisent au minimum l’exposition de l’échantillon à la lumière, tout en conservant un rapport signal-bruit suffisant, pour l’image de la structure d’intérêt. Un bon point de départ est la moitié de la ND filtre et exposition temps nécessaire pour l’imagerie de l’accepteur au cours de la frette.
    5. Trouver une cellule exprimant le capteur de tension avec une localisation clairement vers une structure d’intérêt et enclencher une image.
    6. Dessiner un ROI rectangulaire pour mettre en évidence où les blanchir et pour stocker l’emplacement du ROI. Initier le Time-lapse.
    7. Examiner le jeu d’images pour les problèmes potentiels.
      1. S’il y a des sauts substantielles (supérieure à 10 % de l’intensité initiale) dans la récupération de la fluorescence entre cadres, réduire le pas de temps entre les images.
      2. S’il y a une importante perte globale de fluorescence au fil du temps (plus de 5 à 10 % de l’intensité initiale), réduire le nombre d’images prises à l’eau de Javel et/ou modifier les paramètres d’imagerie afin de réduire l’exposition de l’échantillon à la lumière.
      3. Si la récupération de fluorescence n’a pas atteint un plateau avant la fin de la Time-lapse, augmenter la longueur totale de la Time-lapse.
    8. Ajustez les paramètres Time-lapse en conséquence et répétez les étapes 4.2.5 – 4.2.7 jusqu'à la récupération de la fluorescence est reflété adéquatement sans global photo-détérioration de l’échantillon.

5. acquisition de données frette-FRAP

  1. Préparer la mise en place de microscope pour l’imagerie de cellules vivantes, de préférence avec une platine chauffante et objectif ainsi que contrôle de CO2 . Laisser se pour équilibrer pendant 20 min.
    1. Afin d’assurer la santé des cellules imagés, maintenir la température à 37 ° C dans la salle d’imagerie. Utiliser une pompe péristaltique à passer humidifié 5 % CO2 sur l’échantillon à 15 mL/min pour maintenir le pH.
    2. Si CO2 contrôle n’est pas disponible, utiliser les média imageries direct contenant HEPES pour empêcher des changements de pH grand.
  2. Ouvrez l’outil MDA et mis en place avec l’imagerie des paramètres, y compris les jeux de filtres différents FRET.
  3. Enregistrez cet Assistant débogage MANAGÉ dans le dossier expérimental avec le nom de MDA_FRET_Date.
  4. Mettre en place un autre MDA avec FRAP paramètres, y compris les jeux de filtres différents, les paramètres de Time-lapse et le journal de l’imagerie d’impulsion du laser après l’acquisition de l’eau de Javel avant.
  5. Enregistrez cet Assistant débogage MANAGÉ dans le dossier expérimental avec le nom de MDA_FRAP_Date. Fermez la fenêtre de la MDA.
  6. Dans la barre d’outils en haut de l’écran, sélectionnez Journal | Commencer l’enregistrement.
  7. Ouvrez la fenêtre MDA, charger l’état de MDA_FRET_Date et appuyez sur acquérir. Charger l’état de MDA_FRAP_Date , puis appuyez sur acquérir.
  8. À la fin de l’acquisition, dans la barre d’outils en haut de l’écran, sélectionnez Journal | Arrêter l’enregistrement.
  9. Enregistrer ce journal dans le dossier expérimental avec le nom de FRETFRAP_Date et l’ajouter à une barre d’outils pour faciliter l’accès. Fermez la fenêtre de la MDA.
  10. Placez un des échantillons générés des cellules exprimant le capteur de tension dans le porte-microscope pour l’imagerie. Laisser se pour équilibrer pendant 10 min.
  11. Naviguez à l’aide de l’acquisition d’images sous Acquire | Acquisition de avec une exposition minimale de temps et ND filtrent pour identifier les cellules d’intérêt.
  12. Définir l’autofocus continu en accédant à appareils | Mise au point. Mise au point manuelle sur l’échantillon jusqu'à arriver à l’avion d’imagerie correcte.
  13. Cliquez sur Définir un accent continu, attendez que le système d’ajuster et cliquez Démarrer continue en se concentrant.
    NOTE : Ceci n’est pas nécessaire, mais il améliore significativement la qualité des courbes de récupération FRAP parce qu’elle empêche l’échantillon d’out-of-focus à la dérive.
  14. Trouver une cellule exprimant le capteur de tension avec une localisation clairement vers une structure d’intérêt et enclencher une image.
  15. Dessiner un ROI rectangulaire pour mettre en évidence où eau de Javel. Stocker l’emplacement de retour sur investissement.
  16. Initialiser le journal FRETFRAP_Date , qui commencera à l’acquisition d’images de frette suivie de l’initialisation de la PAF en Time-lapse.
  17. Répétez les étapes 5.14-5.16 jusqu'à 10-15 ensembles d’images sont acquises.
    Remarque : La mesure ne peut être répétée dans la même cellule. Une fois que le photoblanchiment se produit, données FRET ne sont pas fiables.

6. analyser les données de la frette-FRAP

  1. Analyser les images FRET en utilisant le logiciel de choix.
    Remarque : Il y a plusieurs façons d’image et de quantifier la frette61, y compris ratiométrique frette62 et frette indice34,35. Toutefois, il est fortement recommandé d’utiliser les estimations de la frette efficacité55,63 pour l’interprétation des données de FRET-FRAP. Voir la Discussion pour la poursuite de l’exploration de ce sujet. Pour émission sensibilisée et calcul du rendement de la frette, logiciel sur mesure est disponible chez le laboratoire Hoffman à https://gitlab.oit.duke.edu/HoffmanLab-Public.
  2. Quantifier les paramètres pertinents pour chaque structure subcellulaire qui a été blanchi. Cela devrait inclure la frette index/efficacité et moyenne initiale accepteur intensité moyenne (proportionnelle à la concentration), mais pourrait également inclure des paramètres physiques comme la taille ROI.
  3. Analyser les images de la PAF en utilisant le logiciel de choix.
    Remarque : Il existe plusieurs façons pour quantifier la FRAP26,27,28,29. Principales préoccupations expérimentales incluent comptables pour la décoloration au cours de l’eau de Javel après imaging, changements dans l’intensité du fond et la translocation des structures subcellulaires hautement dynamiques, tels que les adhérences focales. Blanchir les corrections et les variations du rétro-éclairage peut être accompli grâce à l’analyse des régions non blanchi et non fluorescent des images. Des structures subcellulaires très dynamiques, particulièrement ceux montrant la dynamique de croissance ou démontage excessive sont incompatibles avec les analyses FRAP standard et ne doivent pas être analysées. En outre, il y a une variété de moyens de normaliser les données. Les lignes directrices fournies sont pour l’analyse plus simple.
  4. Corriger les données de récupération pour la décoloration des effets et puis normaliser pour blanchir des intensités. Quantifier le temps de récupération et de la fraction mobile selon le suivant équation28,34:
    MF - (MF - Ro) e-kt
    où MF est la fraction mobile, Ro est la récupération initiale, et k est le taux de récupération. La demi-vie de la reprise est déterminée par :
    Τ1/2 = ln 2/k.
    Remarque : Il existe une variété de logiciels accessibles pour compléter ces analyses64 ainsi que divers plugins ImageJ. Logiciel personnalisé est disponible à partir du laboratoire Hoffman à https://gitlab.oit.duke.edu/HoffmanLab-Public. Des analyses plus doivent être utilisés pour les situations où la diffusion affecte la dynamique de la protéine d’intérêt, des échelles de temps multiples n’apparaissent pas dans la récupération, ou les géométries blanchiment non standards sont utilisées.

7. interpréter les données de FRET-FRAP

  1. Compiler les informations pertinentes pour chaque ROI, y compris : frette index/efficacité, intensité de l’accepteur, FRAP mi-temps FRAP fraction mobile.
    NOTE : Indice de FRET ou d’efficacité est utilisée pour déterminer la charge moyenne dans l’ensemble de la protéine dans le retour sur investissement. Intensité de l’accepteur mesure la concentration locale de la protéine. La moitié du temps de récupération est une mesure de la dynamique des protéines. Une petite pause indique la rotation plus rapide. FRAP fraction mobile mesure la quantité de protéine à l’intérieur du ROI qui est activement retournement. Une large fraction mobile indique qu’un pourcentage plus élevé de la protéine dans le retour sur investissement est retournement.
  2. Pour étudier l’effet de la concentration locale sur le taux de renouvellement des protéines et la quantité, terrain FRAP fraction mi-temps et mobile contre l’intensité initiale accepteur.
  3. Pour étudier l’effet de la charge de la protéine sur le taux de renouvellement des protéines et la quantité, terrain FRAP fraction mi-temps et mobile contre frette index/efficacité.
    Remarque : Selon la protéine ou de la structure, il peut aussi être intéressant d’examiner les effets des paramètres physiques, notamment la taille de la structure ou l’excentricité, sur charge de protéines ou de chiffre d’affaires.

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Representative Results

FRETTE-FRAP est constitué de la combinaison de deux techniques fluorescents, vous inquiétez pas et PAF. Comme nous nous sommes concentrés sur les effets de la charge de la protéine, nous avons utilisé axée sur la frette tension capteurs34,46. Ces capteurs sont souvent basés sur une tension de détection module composé de deux protéines fluorescentes, tels que mTFP1 et VenusA206K, reliés par un éditeur de liens flagelliform (Figure 1 a). Lorsque le module est placé entre les domaines de tête et la queue d’une protéine, il est possible de mesurer la charge exercée sur les protéines. Lors de l’analyse des données de la frette, images prises dans le canal de l’accepteur sont utilisées pour évaluer les localisation capteur de tension et de concentration, que ce signal est indépendante de la frette (Figure 1 b). Après le calcul du rendement de la frette, charge de protéine peut être visualisée sur une échelle colorimétrique où une baisse d’efficacité FRET vers des couleurs plus froides indique une augmentation de la charge de la protéine, et efficacités FRET dans la gamme rouge indiquent la charge faible en protéines ( Figure 1 b). FRAP imagerie est réalisée en utilisant un laser pour blanchir le fluorophore accepteur dans une reprise de structure et moniteur subcellulaire unique au fil du temps (Figure 1). La courbe résultante de FRAP normalisée peut être analysée pour extraire les paramètres décrivant la dynamique des protéines, y compris le temps de récupération et fraction mobile (Figure 1). Parce que frette et PAF analyses ont été effectuées sur la même cellule, la protéine moyenne charge et le chiffre d’affaires dans une structure subcellulaire peuvent être tracées comme point unique. Plusieurs cellules d’imagerie donne plusieurs points et une tendance émergente peut indiquer si une protéine est déstabilisé (Figure 1E) ou stabilisés par charge moléculaire (Figure 1F).

Le capteur de tension de vinculine (VinTS) stablement exprimé en vinculine MEFs null localise très clairement aux FAs répartis dans toute la cellule, comme on le voit en regardant l’image de canal accepteur (Figure 2 a). L’image de canal accepteur est utilisée pour créer un masque de segmentation qui identifie chaque FA individuel avec un ID unique, visuellement désigné par des couleurs différentes (Figure 2 b). L’algorithme de segmentation est basée sur la méthode de « l’eau » et les étiquettes des FAs approximativement dans l’ordre de luminosité, comme précédemment décrit34,65. Les résultats de segmentation sont converties en un masque binaire qui est ensuite appliqué les résultats d’efficacité de frette (Figure 2), et le rendement moyen du FRET au sein de chaque FA unique est calculé (Figure 2D). Propriétés supplémentaires peuvent être calculées pour chaque FA de manière similaire, y compris l’accepteur de moyenne intensité, taille, excentricité et localisation dans la cellule. De cette façon, selon la FA est choisi pour PAF peut être associée à l’ID unique de la FA et les propriétés associées.

Analyse et imagerie FRAP est sensible à plusieurs facteurs qui peuvent être maîtrisés, y compris le laser et l’imagerie de paramètres, et certains facteurs qui ne peuvent être contrôlés, tels que de l’ensemble FA stabilité26,27,28, 29. Par exemple, une exposition excessive à la lumière pendant le Time-lapse imagerie peut conduire à des enjeux majeurs dans l’interprétation des données de PAF. Bien que l’analyse du contrôle AF qui n’étaient pas blanchi peut être utilisé pour normaliser pour photoblanchiment mineur au fil du temps, avec trop d’exposition de l’échantillon à la lumière, la courbe FRAP montre une reprise initiale suivie d’un plongeon en intensité normalisée qui ne peut pas être correctement en forme avec une fonction exponentielle. Si cet effet est observé régulièrement dans les données, il est nécessaire de ré-optimiser les paramètres d’imagerie afin de diminuer les temps d’exposition, augmenter le pas de temps entre les images d’imagerie ou diminuer la longueur de la Time-lapse pour réduire l’exposition de l’échantillon à la lumière.

Un autre exemple de données FRAP est ininterprétable, quand la FA qui a été photobleached translocation rapidement au cours de la récupération,28. Un cas représentatif de la translocation excessive est illustré à la Figure 3. L’image initiale, où la ROIs sont choisie, ne donne pas une indication de la stabilité (Figure 3 a) de la FA. Suivi la FA blanchie au fil du temps, il éloigne rapidement de la position initiale et le suivi automatisé ne parvient pas à suivre immédiatement en raison de la faible signal fluorescent après photoblanchiment (Figure 3 a). La courbe résultante de FRAP montre une phase initiale d’une légère reprise avec un saut quand la fluorescence est récupéré assez pour le logiciel détecter la FA et de déplacer le ROI (Figure 3 b). Cette courbe ne peut pas être adaptée avec succès par une fonction exponentielle. La translocation rapide de la FA suggère également que la structure de la FA est instable. Ainsi, l’instables FAs ne devraient pas figurer dans la même analyse FRAP-frette que FAs stables, en raison de problèmes techniques et biologiques.

Avec des données satisfaisantes frette et PAF, la prochaine étape termine l’analyse de la frette-PAF en évaluant simultanément dynamique et charge de protéine. Figure 4 a montre les cartes de l’efficacité de frette de trois vinculine null MEFs VinTS exprimant de manière stable. Le FAs en blanc ont été choisi pour l’analyse de la FRAP, et les intensités de l’accepteur apparaissent au fil du temps. Ces trois SAF ont vinculine sous différentes quantités de charger et d’afficher un profil de récupération vinculine différents. La quantification de ces propriétés en calculant le temps de récupération et de comploter contre le rendement moyen du FRET dans chaque FA montre la tendance globale de la vinculine est stabilisée par l’augmentation de la charge (Figure 4 b). Cependant, la fraction mobile complotée contre efficacité frette ne montre aucune tendance, suggérant que cette fraction mobile n’est pas réglementée par charge moléculaire (Figure 4). Présentant une mutation ponctuelle dans le VinTS à acides aminés 50 (A50I) a été démontré pour empêcher la vinculine liaison à un partenaire de liaison majeur au sein de la FAs, talin,66. L’altération de cette interaction protéine-protéine affecte vinculine dynamique de force-sensibles. Vinculine null MEFs exprimant de manière stable VinTS A50I ont différentes cellules et morphologies FA, différent vinculine chargement des profils et différents vinculine dynamique (Figure 4). Quantification de la moitié des temps de récupération et de l’efficacité de la frette et le tracé montrent que lorsque l’interaction vinculine-talin est perturbée, vinculine au FAs est déstabilisé par l’augmentation de la charge (Figure 4E) tandis que la fraction mobile ne montre aucune tendance (Figure 4F ).

Figure 1
Figure 1 : principes de la technique de la frette-FRAP. (A) schéma du module capteur tension axée sur la frette (TSMod) inséré dans une protéine d’intérêt et l’effet de la tension du signal de FRET. (B) afin de quantifier le FRET utilisant l’émission sensibilisée, les images sont prises au signal de donneur de capture (non illustré), signal accepteur et signal FRET. Avec les corrections appropriées, l’image FRET peut être attribué à une échelle colorimétrique de visualiser combien de tension est appliquée à la sonde. FRAP (C) est réalisée en utilisant le signal de l’accepteur, qui est directement proportionnel à la concentration. L’analyse d’imagerie FRAP (D) produit des courbes d’intensité de fluorescence au fil du temps qui peut être adapté à l’aide de modèles mathématiques pour déterminer la dynamique des protéines. (E, F) Lorsqu’on combine la frette et PAF, force et chiffre d’affaires en un seul FA peuvent être mesurés. FAs multiples dans plusieurs cellules de mesure donne une relation entre la charge de protéine et de renouvellement des protéines. Dans cette analyse, une relation dans laquelle corrélats de charge accrue dont le chiffre d’affaires accru est dénommée un État force-déstabilisé (E). Dans cette analyse, une relation dans laquelle charge accrue est en corrélation avec diminution de chiffre d’affaires est dénommée un état stabilisé force (F). Ce chiffre a été modifié par Rothenberg et al. 37. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : identification de la FA et l’analyse de la frette. (A) un vinculine null MEF exprimant la VinTS visualisées dans le canal de l’accepteur, où l’intensité indique une concentration locale de vinculine. Echelle = 30 µm. B SAF est segmentés selon le canal de l’accepteur pour créer un masque de FA ID lorsque chaque FA a été attribuée à un ID unique, représenté ici sous différentes couleurs, approximativement dans l’ordre de luminosité. (C) le masque de FA ID est converti en un masque binaire et appliqué à l’image d’efficacité Frette pour montrer les valeurs de rendement de FRET seulement au SAF. (D) l’efficacité FRET au sein de chaque FA est moyenne pour obtenir une valeur unique pour chaque immobilisation, qui est associée à l’ID de FA dans la table de données de sortie. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : exemple d’AF translocating. (A) un vinculine null MEF exprimant le capteur mutant VinTS A50I est visualisé dans le canal de l’accepteur, avec la table des couleurs inversée pour plus de clarté. Echelle = 30 µm. La FA cernée de noir a été choisie pour la décoloration. Zoom-in images montrent la progression de FA au fil du temps avec le contour rouge indiquant où le logiciel identifié la FA. Echelle = 2 µm. (B) la courbe FRAP normalisée de données (a). Il y a un bond de 5 % environ qui suit intensité point 3 résultant de la FA translocation rapidement avant récupération suffisante pour que le logiciel détecte la modification de l’emplacement de la FA. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : représentant frette-FRAP résulte. (A) vinculine null MEFs exprimant la VinTS affiché comme moyens images d’efficacité de frette de la cellule entière (barre d’échelle = 30 µm) avec zoom-in inversé les images de canal accepteur montrant la progression de récupération FRAP (barre d’échelle = 2 µm). (B) PAF mi-temps de récupération complotée contre efficacité Frette pour 32 cellules, avec les points représentant les cellules au point A mis en évidence en rouge. (C) PAF mobile fraction complotée contre efficacité FRET pour les mêmes cellules au point B. (D) vinculine null MEFs exprimant le capteur mutant VinTS A50I affiché sous la forme moyennes images d’efficacité de frette de la cellule entière (barre d’échelle = 30 µm) avec zoom-in inversé les images de canal accepteur montrant la progression de récupération FRAP (barre d’échelle = 2 µm). (E) mi-temps FRAP de récupération comploté contre efficacité Frette pour 21 cellules, avec les points représentant les cellules en (ré) apparaissent en rouge. (F) FRAP mobile fraction complotée contre efficacité FRET pour les mêmes cellules en (E). Données ont été initialement publiées dans Rothenberg et al. 37 et sont visualisées ici dans un nouveau format. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

La méthode FRAP-frette permet une mesure directe de la dynamique des protéines sensibles à la force une propriété qui a été difficile de sonder directement à l’intérieur de cellules vivantes. La sensibilité de la dynamique des protéines à charge moléculaire est essentielle aux fonctions de la protéine comme un transmetteur de force ou un transducteur. Chargement est nécessaire pour la transmission des deux interne et forces appliqué extérieurement, appelé mechanotransmission et pour la conversion de ces forces en signaux détectables biochimiquement, appelé mécanotransduction. Toutefois, les changements de charge peuvent affecter la durée qu'une protéine reste liée, donc le moins de temps une protéine passe de charge, le moins de chance la force doit être transmis à d’autres protéines ou transduites en un signal détectable biochimiquement et senti. La méthode FRAP-frette comble le fossé entre le niveau moléculaire et cellulaire en permettant des mesures échelle moléculaire de dynamique de force-sensibles pour être accessible dans un contexte cellulaire. Il permet en outre, ces mesures prises tout en perturbant l’environnement intracellulaire ou extracellulaire biochimiquement ou mécaniquement. Cette technique devrait s’applique à n’importe quel capteur de tension axée sur la frette, permettant à l’enquête de l’état mécanique de protéine dans une variété de structures subcellulaires et contextes extracellulaires.

Les étapes critiques en veillant à ce que les mesures souhaitées de frette-FRAP sont obtenues impliquent optimisant les paramètres d’imagerie et de l’analyse de données et interprétation. Optimisation des paramètres d’imagerie, comme décrit dans le protocole, est nécessaire pour limiter le photovieillissement à l’échantillon, tout en permettant pour les structures désirées et la dynamique à distinguer et à force de signal suffisant pour le calcul du FRET. Instituant ces paramètres d’imagerie pour une lignée cellulaire particulière et de la protéine d’intérêt dès le début facilitera la comparaison directe entre les différents groupes expérimentaux. Il est à noter que des modifications au système, tels que la mutation de la protéine d’intérêt ou d’introduire des inhibiteurs, peuvent conduire à des changements dans la localisation des protéines (ainsi modifier l’intensité du signal) et de la dynamique. Les paramètres optimisés devraient permettre des mesures précises et claires dans toutes les conditions expérimentales. Par conséquent, il est recommandé de choisir les paramètres qui sont à l’extrémité d’être utile, par exemple, n’étant pas en mesure de distinguer à peine signal bruit.

Alors que l’imagerie dans le présent protocole a été décrit à un microscope à épifluorescence et joint module laser FRAP, frette-FRAP est applicable à d’autres systèmes d’imagerie. Par exemple, cette technique peut être adaptée aux microscopes confocaux à balayage linéaire, mais aussi des microscopes confocale tourne-disque avec un module de photoblanchiment ci-joint. Imagerie des paramètres doit être optimisé de manière analogue pour atteindre signal-bruit adéquat sans causer de photovieillissement ou photoblanchiment excessif. En particulier en ce qui concerne l’imagerie frette, détecteurs d’efficacité quantique élevée sont tenus d’obtenir un signal suffisant pour le calcul de frette réussie sans provoquer de dommages de fluorophore. Il y a un certain nombre de publications décrivant l’imagerie frette ou FRAP distinct à l’aide d’un microscope confocal67,68,,69, qui peut être utilisé pour guider l’optimisation pour l’imagerie de la frette-PAF.

Suite à l’expérience, analyse des données devrait être traitée avec soin et réalisé de manière reproductible, préférablement automatisée. En raison de l’incapacité de plus de 2-3 régions subcellulaires dans une seule cellule d’eau de Javel avant blanchiment trop du pool disponible de protéine, le débit de cette technique est relativement limité. Ainsi, des ensembles de données sont souvent combinées sur plusieurs jours de l’imagerie, nécessitant un traitement cohérent des données. FRETTE et FRAP offrent des défis avec analyse des données. Indice de frette et mesures d’efficacité frette permettent une quantification de la charge de la protéine. Index de la frette est une mesure relative qui est fortement tributaire de réglages du microscope, tandis que les mesures d’efficacité FRET sont absolues et indépendant du microscope paramètres55,70. Nous avons montré récemment qu’une méthode déjà élaborée à l’aide de l’imagerie « trois-cube » peut être utilisée pour déterminer l’efficacité des mesures d’émission sensibilisée qui sont typiquement quantifié avec frette Index lors de l’utilisation des capteurs de tension axée sur la frette56 frette . Les mesures de l’efficacité de la frette sont nécessaires si les mesures de l’expérience des forces absolue par les capteurs de tension doivent être calculés34. Les cellules exprimant des capteurs de tension axée sur la frette, cellules particulièrement stables à des numéros de passage élevé, peuvent se recombiner ou dégrader les capteurs, menant à inutilisable frette données50. Ceci est facilement identifiable quand les ratios de donneur-accepteur à calculer lors du calcul de FRET efficacité37,56 mais peuvent être plus difficiles à détecter en utilisant des index de la frette. Lorsque vous démarrez avec un capteur de tension axée sur la frette, il peut être utile obtenir un jeu de données volumineux (> 50 cellules) des seules les données pour les constructions d’intérêt pour identifier les économies de gamme attendue de la frette frette. En outre, FRAP données peuvent être difficiles d’extraire de structures qui sont très mobiles, tels qu’AF qui est rapidement glisser ou de démontage. En sélectionnant une sous-population de structures ou en optimisant les conditions de placage de cellule pour atténuer cet effet peut aider à minimiser ce problème.

Dans le concept, la frette-FRAP peut être appliqué à n’importe quel capteur à base frette dans n’importe quelle région subcellulaire, avec une bonne optimisation. Dans la pratique, il peut être difficile de saisir force-sensible à la dynamique des protéines qui ne sont pas sous la charge mécanique importante ou possédant des demi-temps de récupération sur l’échelle de temps très court de quelques secondes à l’échelle de temps long de plusieurs dizaines de minutes. Les résultats des études de molécules simples peuvent pointer vers les protéines qui peuvent montrer sensibles à la force dynamique au sein de cellules vivantes. Jusqu’ici, cela inclut plusieurs FA et AJ protéines13,14,15,16 ainsi que certains éléments du cytosquelette71,,72,73. Fortuitement, capteurs à base de FRET ont été conçus pour un grand nombre de ces protéines46. Ces résultats peuvent guider le choix d’une protéine d’intérêt ; Cependant, il ne faut pas s’attendre que frette-FRAP données reflète exactement les résultats de ces études de molécules simples. En fait, régulation biochimique, interactions avec d’autres protéines et la structure du cytosquelette locale peut obscurcir ou les altérer, les effets des forces sur les interactions protéine-protéine. La capacité d’observer ces complexités est une force unique de l’approche de la frette-FRAP.

Une combinaison de manipulations à la cellule et la protéine d’intérêt peuvent servir à élucider les facteurs importants dans la dynamique des protéines de régulation. Par exemple, il peut être utile de disposer d’un capteur qui est force-insensible, soit par le biais de la suppression ou la mutation d’une force de liaison domaine35,74 où il ne devrait y avoir aucune dépendance à l’égard de la dynamique de chiffre d’affaires de protéine la force rapportée par le capteur. En outre, les mutations d’autres sites de liaison critique ou sites de phosphorylation de la protéine peuvent fournir une image plus complète de la façon dont la protéine d’intérêt est réglementée. Apporter des modifications globales à la cellule ou de l’environnement par le biais des inhibiteurs du cytosquelette ou en modifiant les propriétés du substrat (matrice extracellulaire ex. ou raideur), respectivement, peuvent aider à déterminer comment la dynamique de la force-sensibles de la protéine répondre à perturbations mécaniques. Combinant l’information sur la charge protéique et sensibles à la force dynamique avec d’autres propriétés biophysiques de la protéine peut aider à établir l’état mécanique de la protéine d’intérêt. Cela peut inclure la localisation et les interactions entre protéines locales au sein d’une structure subcellulaire75,76. En outre, la protéine pourrait résider dans les États de conformation différente, même au sein de la même structure subcellulaire, selon contexte76,,77. Charge de protéine, dynamique, localisation et conformation peuvent tous être touchées simultanément par les forces générées en interne et externe appliqué37,76,78,79, dicter un rôle de la protéine dans la transmission de force et de la mécanotransduction. La polyvalence de la méthode FRAP-frette et sa compatibilité éventuelle avec une variété de protéines et de manipulations devrait permettre l’élucidation de l’interaction entre la mécanique en vrac, la dynamique des protéines et mécanosensibles de signalisation.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par une bourse de la National Science Foundation carrière (NSF-CMMI-14-54257) ainsi que les subventions accordées par l’American Heart Association (16GRNT30930019) et le National Institutes of Health (R01GM121739-01) décerné à m. Brenton Hoffman et un ressortissant Science Foundation recherche bourse d’études supérieures accordé à Katheryn Rothenberg. Le contenu est la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles de la NSF ou NIH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin-EDTA Thermo Fisher 25300062
16% Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 30525-89-4
60x Objective NA1.35 Olympus UPLSAPO 60XO
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) Gibco 15240-062
Automated Stage Prior Scientific H117EIX3
Custom Dichroic Mirror Chroma Technology Corp T450/514rpc
Custom mTFP1 Emission Filter Chroma Technology Corp ET485/20m
Custom mTFP1 Excitation Filter Chroma Technology Corp ET450/30x
Custom Venus Excitation Filter Chroma Technology Corp ET514/10x
DMEM-gfp Live Cell Visualization Medium Sapphire MC102
Dulbecco's Modified Eagle's Medium  Sigma Aldrich D5796 with L-glutamine and sodium bicarbonate
Fetal Bovine Serum HyClone SH30396.03
Fibronectin, Human Corning 47743-654
FRAPPA Calibration Slide Andor provided along with FRAPPA unit
FRAPPA System with 515 nm Laser Andor
Glass-bottomed Fluoro Dishes World Precision Instruments FD35
HEK293-T Cells ATCC CRL-3216
Hexadimethrine Bromide, Polybrene Sigma Aldrich H9268-5G
High-glucose Dulbecco's Modified Eagle's Medium Sigma Aldrich D6429
Inverted Fluorescent Microscope Olympus IX83
JMP Pro Software SAS
Lambda 10-3 Motorized Filter Wheels Sutter Instruments LB10-NW
LambdaLS Arc Lamp with 300W Ozone-Free Xenon Bulb Sutter Instruments LS/OF30
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-027
MATLAB Software Mathworks
MEM Non-Essential Amino Acids Thermo Fisher 11140050
MetaMorph for Olympus Olympus
Micro-Humidification System Bioptechs 130708
MoFlo Astrios EQ Cell Sorter Beckman Coulter B25982
Objective Heater Medium Bioptechs 150819-13
OptiMEM Thermo Fisher 31985070
Phosphate Buffered Saline Sigma Aldrich D8537
pMD2.G Envelope Plasmid Addgene 12259
pRRL Vector gift from Dr. Kam Leong (Columbia University)
psPax2 Packaging Plasmid Addgene 12260
sCMOS ORCA-Flash4.0 V2 Camera Hamamatsu Photonics C11440-22CU
Sorvall Legend XT/XF Centrifuge Thermo Fisher 75004505
Stable Z Stage Warmer Bioptechs 403-1926
Venus Emission Filter Semrock FF01-571/72

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Rothenberg, K. E., Puranam, I., Hoffman, B. D. Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques. J. Vis. Exp. (141), e58619, doi:10.3791/58619 (2018).

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