Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Måling av Force-Sensitive Protein dynamikk i levende celler ved hjelp av en kombinasjon av fluorescerende teknikker

Published: November 2, 2018 doi: 10.3791/58619
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, Duke University

Summary

Her presenterer vi en protokoll for samtidig bruk av han selvmord resonans energi overføring-basert spenning sensorer for å måle protein belastning og fluorescens gjenoppretting etter photobleaching å måle protein dynamics slik at måling av kraft-sensitive protein dynamikken i levende celler.

Abstract

Celler forstand og svare på fysiske signaler i miljøet ved å konvertere mekanisk stimuli til biokjemisk-detectable signaler i en prosess som kalles mechanotransduction. Et avgjørende skritt i mechanotransduction er overføring av styrker mellom de eksterne og interne miljøene. Å sende styrker, må det være en vedvarende, ubrutt fysiske koblingen laget av en rekke protein-protein interaksjoner. For en gitt protein-protein interaksjon, mekanisk belastning kan enten har ingen innvirkning på samspill, føre til raskere tilknytningene til samhandlingen, eller aften stabilisere samhandlingen. Forstå hvordan molekylær Last dikterer protein omsetning i levende celler kan gi verdifull informasjon om mekaniske staten en protein, igjen Klargjørende sin rolle i mechanotransduction. Eksisterende teknikker for måling av kraft-sensitive protein dynamics enten mangler direkte målinger av protein belastning eller stole på målinger utført enhetskontroll mobilnettet. Her beskriver vi en protokoll for han selvmord resonans energi overføring-fluorescens utvinning etter photobleaching (bånd-FRAP) teknikk, som gjør at måling av kraft-sensitive protein dynamikken i levende celler. Denne teknikken er potensielt gjelder enhver bånd-baserte spenning sensor, tilrettelegge studiet av kraft-sensitive protein dynamikken i rekke subcellular strukturer og ulike celletyper.

Introduction

Ekstracellulære miljøet er en rik kilde til både biokjemiske og fysiske signaler som styrer celle atferd. Spesielt kan fysisk natur av microenvironment formidle viktige cellulære funksjoner, inkludert cellevekst, migrasjon og differensiering1,2,3,4. Feilregulering om mekanikken i microenvironment er en kritisk komponent for mange sykdommer som ennå ikke har tilstrekkelig behandlinger, for eksempel kreft5, aterosklerose6og fibrose7. En fullstendig forståelse av hvordan celler konvertere fysiske stimuli til biokjemisk-detectable signaler, en prosess kalt mechanotransduction, krever utviklingen av molekylære mekanismer formidling styrke overføring, både inn og ut av cellene og innen flere subcellular strukturer.

I subcellular strukturer blir proteiner stadig over; bindende og frigiving basert på styrken av deres interaksjon med bindende partnere8. For styrker å være overføres over en fysisk avstand, må det være en ubrutt klareringskjede protein-protein interaksjoner, betyr at et protein omsetning må være treg nok til å opprettholde og overføre makt til sin bindende partner9. Mens protein-protein interaksjoner består vanligvis av flere ikke-kovalente bindinger mellom protein domenene, er samspillet ofte definert som en bundet tilstand som kan gå til en ubundet tilstand under ulike forhold10, 11. en gitt protein-protein interaksjon, er det mulig at makt kan har ingen effekt på levetiden til samhandling, kjent som en "ideell bånd", redusere levetiden til samhandling, kjent som en "slip bånd", eller øke levetiden til samhandlingen , kjent som en "catch bånd"10. Således, det er en intrikat sammenheng mellom protein belastning og protein dynamikk, som vi kaller kraft-sensitive dynamikk.

Mot å forstå effekten av belastningen på bond dynamics, har en rekke svært informativ eksperimenter utført på enkelt-molekylet nivå. Bruker isolert proteiner eller fragmenter av proteiner og manipulasjon teknikker som magnetiske pinsett, optisk pinsett og atomic force mikroskopi, har disse studiene vist kraft-sensitive protein-protein interaksjoner i flere relevante proteiner11,12. Begge integrins13 og cadherins14, som transmembrane proteiner viktig for å danne celle-matrise og celle-celle interaksjoner, henholdsvis, har vist endringer i dynamics grunn for å laste. Inne i cellen, vinculin er rekruttert til begge talin15 og α-catenin16 i en makt-avhengige måte og kan danne en fange bånd med utgangen17, som indikerer en avgjørende rolle for vinculin både fokal adhesjon (FAs) og adherens veikryss (AJs ) under belastning. Single-molekylet studier tillater isolering av bestemt protein-protein interaksjoner og entydig resultater, men de ikke gjøre rede for kompleksiteten i mobilnettet miljø.

Landemerke eksperimenter har vist at flere subcellular strukturer, inkludert FAs og AJs, er mechanosensitive, og viser forbedret montering svar på internt generert eller eksternt brukte laster18,19, 20,21,22. I tillegg har flere teoretiske modeller antydet at mechanosensitive montering kan være drevet av kraft-sensitive protein dynamics23,24,25. For å undersøke disse kraft-sensitive dynamikk i levende celler, er noen indirekte tilnærminger tatt. FRAP og relaterte teknikker gi en relativt enkel metodikk for måling av protein dynamikk i celler26,27,28,29. Måling av protein belastning har imidlertid vært mer begrenset. En typisk bruksmåte er å sammenligne protein dynamikk i celler med og uten eksponering en cellen cytoskjelett hemmer brukes til å redusere totale celle contractility8,30,31. Konseptuelt, er dette en sammenligning mellom høy belastning og lav belastning tilstand. Men det er ingen kvantifisering av lasten over protein i enten tilstand, og det kan være utilsiktet biokjemiske effekter av hemmer, slike tap av viktige bindende områder langs en F-utgangen filament. En annen tilnærming, gjelder for FAs, har vært å måle sum force anstrengelse på underlaget av FA bruker trekkraft force mikroskopi omtrentlig molekylær belastning og undersøke forholdet dynamikken i et enkelt protein i FA32. Mens denne tilnærmingen lar for kvantifisering av total makt, gir det ikke molecularly spesifikk informasjon. FAs består av over 200 ulike proteiner, hvorav mange kan bære belastningen33. Dermed måle det sum force produksjonen av en FA potensielt tilslører muligheten av flere kraft overføring og gir ikke pålitelig et mål av belastningen på et bestemt protein.

I motsetning til tidligere tilnærmingene i mechanobiology, bruk av bånd-baserte spenning sensorer kan direkte måling av laster oppleves av spesifikke proteiner i levende celler34,35,36. Her presenterer vi en protokoll som kombinerer bånd-baserte spenning sensorer med FRAP-baserte mål av protein dynamikk. Vi kaller denne teknikken bånd-FRAP. Denne tilnærmingen kan samtidig måling av protein belastning og protein dynamikk, slik at vurdering av kraft-sensitive protein dynamikken i levende celler (figur 1). Allerede, er bånd-FRAP teknikken brukt til studiet av kraft-sensitive dynamikk av mekanisk koblingsfunksjonalitet protein vinculin37. Spenning sensorer har blitt utviklet for mange proteiner som er relevante i en rekke subcellular strukturer. For eksempel har sensorer blitt utviklet for vinculin34 og talin38,39 FAs, cadherins og catenins i AJs40,41,42, nesprin i kjernefysiske LINC komplekse 43, α-actinin44 og filamin36 i cytoskeleton og MUC-1 i glycocalyx45, blant annet46. Tilsvarende er FRAP en vanlig teknikk er brukt på mechanosensitive proteiner i fokal adhesjon8,31, adherens veikryss47, begrepsordbok cortex26og kjernen48. Fremover, bånd-FRAP teknikken skal være bredt aktuelt til noen av disse eksisterende sensorer eller nylig utviklet sensorer, slik at målinger av kraft-sensitive dynamikk i en rekke subcellular strukturer og sammenhenger. Mot dette formål gir vi en detaljert, generalisert protokoll for implementering av bånd-FRAP teknikk i disse forskjellige systemer. Forhåpentligvis aktiverer dette en rekke eksperimenter Klargjørende rollene av mechanosensitive regulerer kraft overføring og formidling celle atferd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Generer prøver for Imaging

  1. Stabilt uttrykke spenningen sensor konstruere i ønsket celle type.
    1. Klone spenning sensor konstruere inn pRRL vektor- eller andre viral uttrykk plasmider.
      Merk: Flere ulike molekylær kloning verktøy er tilgjengelig for å oppnå dette trinnet inkludert bruk av begrensning enzymer, overlapper utvidelsen, og Gibson montering35. PRRL-vektor brukes i lenti viral signaltransduksjon og gjør en betydelig grad av protein produksjon gjennom bruk av menneskelige cytomegalovirus (CMV) arrangøren. Forskjellige vektorer kan være nødvendig for en bestemt sammenheng. For eksempel, er CMV arrangøren forstummet i noen cellen typer49. I tillegg kan bare bånd-baserte sensorer med fluorescerende protein at mangel sterk sekvens homologi, som mTFP1 og Venus A206K, brukes til å opprette stabil linjer. Sensorer som inneholder cyan fluorescerende protein og gule fluorescerende protein vil trolig være underlagt homologe rekombinasjon50.
    2. Generere lentivirus i menneskelige embryonale nyre (HEK) 293T celler ved hjelp av psPax2 og pMD2.G emballasje plasmider bruker standard virus produksjon metoder51.
      FORSIKTIG: Lentivirus bør kun håndteres riktig utdannet personell i et laboratoriemiljø for biosikkerhet nivå 2.
      Merk: Denne kombinasjonen av celler og emballasje plasmider er egnet for bruk med pRRL. Andre systemer kan være nødvendig med andre vektorer.
    3. Transduce ønsket celler med virus benytter standard signaltransduksjon protokoller52 og bruke flowcytometri til å sortere celler53 velge en homogen befolkning uttrykke hver konstruere på ca endogene37. Eksperimenter kan gjennomføres umiddelbart etter merkede celleområdet, eller celler cryogenically kan fryses for senere bruk. Ikke overstige 2 fryse-Tin sykluser for en gitt stabil celle linje.
      Merk: Bruk av cellelinjer mangelfull i protein skal studerte (f.eksvinculin- / - MEFs for bruk med vinculin spenning sensor) vil øke signal til støy forhold bånd eksperimenter samt begrense over uttrykk gjenstander. Slike stabil mus embryonale fibroblast (MEF) linjer kan brukes ca 15 ganger før betydelig tap av uttrykk eller nedbrytning av sensorer er tydelig. Hvis viral metoder ikke er ønskelig, kan en mengde kommersielle reagenser brukes i henhold til produsentens protokollen til transiently transfect en rekke celletyper med spenning sensorer i et passende plasmider, som pcDNA3.1. Optimal uttrykket vil være 24-48 h etter hva.
  2. Forberede underlag celle seeding.
    1. Erverve 4, 35 mm glassbunn retter.
    2. Arbeider i celle kultur hette, i en 15 mL kanoniske tube, foreta 4 mL 10 µg/mL fibronectin fosfat-bufret (PBS) saltvann bruke sterilt PBS i celle kultur panseret. Forsiktig Inverter røret en gang å blande og la løsningen sitte i 5 min i celle kultur panseret.
      Merk: Den konsentrasjon eller type ECM protein må justeres for andre celletyper. Vilkår er egnet for MEFs.
    3. Pipetter 1 mL av fibronectin løsning på hver glassbunn rett.
    4. La fibronectin løsningen på rettene 1t ved romtemperatur eller over natten på 4 ° C.
    5. Sug opp den fibronectin løsningen, skyll når med PBS og legge 1 mL av PBS.
  3. Ætt cellene på forberedt underlag.
    1. Start med cellene rundt ved samløpet passer for subcultivation i 6 cm kultur parabol.
      Merk: Forskjellige celletyper krever forskjellige celle kultur forhold og subcultivation protokoller. Denne delen inneholder veiledninger egnet for MEFs. Vanligvis er MEFs økt til 85% samløpet før subcultivation.
    2. Arbeider i celle kultur hette, skyll cellene gang med 3 mL PBS. Legge 1 mL av 0,05% Trypsin-EDTA og Inkuber i 5 min på 37 ° C.
    3. Legge 3 mL komplett til 6 cm parabolen, samle cellene, og plasser i en 15 mL konisk rør.
      Merk: Komposisjon for komplett vil avhenge av hvilken celle som brukes. MEFs, komplett er ofte definert som høy glukose Dulbecco endret Eagle Medium med 10% fosterets bovin serum, 1% antibiotika-Antimycotic (inneholder amfotericin B, Penicillin og Streptomycin), og en 1% ikke-essensielle aminosyren (NEAA) løsning.
    4. Nedspinning cellene 1000 x g i 5 min.
    5. Sug opp media og resuspend celle pellet i 1 mL av komplett.
    6. Fjern PBS fra fibronectin-belagt glass retter. Telle celler og frø 30.000 celler på hver fibronectin-belagt glass rett med riktig komplett media for et siste volum på 1,5 mL.
      Merk: Denne cellen tetthet passer for MEFs, og vil føre til en populasjon av celler som ikke er rørende, men ikke svært sparsom. Hvor nøyaktig cellen må justeres for andre celletyper eller andre tenkelig kammer.
    7. At cellene å spre 4 h etter seeding. Sug opp vekst media 2t spre, og skyll når med imaging media, forlater 1,5 mL Imaging media.
      Merk: Spre nå passer for MEFs, men må kanskje endres for andre celler. Imidlertid vil inkubasjon perioder av lengre enn 6-8 h føre til betydelig avleiring av ECM protein fra serum i komplett media. Imaging media skal inneholde de samme tilleggene som komplett men bør være optisk klart og ikke inneholder noen forbindelser som fluoresce i tenkelig kanaler, for eksempel flavins, eller slukke fluorescens, som fenol røde. Generelt nyttig tenkelig media er DMEM-gfp Live celle visualisering media med 10% FBS og 1% NEAA løsning. Hvis bakgrunnen autofluorescence er svært høy, så reduseres hvor mye serum. Hvis en media endring ikke er mulig etter den første plating, kan cellene være direkte resuspended i imaging media supplert med en trypsin inhibitor.

2. Sett opp mikroskop for Imaging

  1. Slå på mikroskopet.
    1. Slå på arc lampe første.
      Merk: En bue lampe vil frigi en elektromagnetisk puls, som kan skade annet utstyr som er allerede på.
    2. Slå på filteret hjulet kontrolleren, automatisert scenen kontrolleren, mikroskop-datamaskin-grensesnitt og kameraet.
    3. Slå på FRAP laser og laser posisjon-kontrollere.
      FORSIKTIG: Kraftige lasere kan skade øynene hvis direkte sett. Det anbefales å konfigurere mikroskop systemet for å blokkere laser eksitasjon fra dirigeres til øye stykker, som kan oppnås ved å flytte et speil til FRAP strålen banen under bleking reflektere laser mot prøven og hindre overføring til i okularet.
    4. Slå av datamaskinen og åpne mikroskop programvare.
    5. Tillate 15 min for arc lampe og FRAP laser til å varme opp.
  2. Kalibrere FRAP laser.
    1. Åpne vinduet laser konfigurasjon. Sett Belysning innstillingen (under puls) til de aktuelle FRAP belysning innstillingene for laser eksponering til prøven. Sett Innstillingen for belysning (under imaging) belysning innstillingene passer for imaging bare acceptor fluorophore.
    2. Velg målet å kalibrere under Koordinatsystem innstilling. Fjern Manuelt Klikk kalibrering poeng og sjekk bilder under kalibrering.
    3. Angi holdetiden 10.000 µs og antall pulser til 100.
    4. Plass kalibrering lysbildet, laget av ethidium bromide forseglet mellom et glass lysbilde og en dekkglassvæske, inn i scenen adapteren med den dekkglassvæske siden ned.
      FORSIKTIG: Ethidium bromide er en mutagen og bør håndteres med hansker. Hvis lysbildet er kompromittert, kast i henhold til institusjonens retningslinjer.
    5. Bruke acceptor belysning for å fokusere på overflaten av lysbildet identifiserbar fokalplanet med det sterkeste signalet. Liten feil i belegget vises som hjelp til å fokusere.
    6. Flytt lysbildet til et område med uniform fluorescens over tenkelig flyet.
    7. Klikk på Opprett innstilling. Programvaren vil initialisere kalibreringsprosessen, bleking og oppdage plasseringen av bleket poenget automatisk.
    8. Sikre vellykket kalibrering ved å vurdere det endelige bildet, som vil være et rutenett av 3 x 3 bleket punkter som bør være jevnt fordelt og fokus. Lagre kalibreringen bildet for fremtidig referanse.
    9. Fjerne kalibrering lysbildet og trygt oppbevare. Kalibreringen bør utføres før du starter hvert eksperiment, men trenger ikke utføres mellom eksempler.

3. Velg parameterne for bånd Imaging

  1. Fastsette en generert prøvene av celler uttrykke spenningen sensoren med 4% paraformaldehyde for 10 min. Paraformaldehyde løsning bør være metanol gratis, ofte referert til som EM-klasse, å hindre denaturing av fluorescerende proteiner. Plasser i PBS etter fiksering.
    FORSIKTIG: Paraformaldehyde er giftige. Dette trinnet skal utføres i avtrekksvifte og løsningen bør avhendes i henhold til institusjonelle politikk.
    Merk: Denne optimaliseringen avhengig ikke av protein dynamics, og et fast utvalg tillater maksimal tenkelig tid uten bekymringsfull om cell helse.
  2. Skyll prøven tre ganger med PBS og la på PBS.
    Merk: Bruk av mest kommersielt tilgjengelig montering media vil påvirke fluorophore egenskaper, gjør prøven uegnet for BÅNDS tenkelig54. Ideelt sett cellene blir vist umiddelbart, men kan stå over natten på 4 ° C. Lengre ventetider fører til forringelse av prøven.
  3. Plass prøven i mikroskopet scenen holderen for bildebehandling.
  4. Åpne verktøyet Multi-Dimensional oppkjøp (MDA). Etablere en sekvensiell avbilding av tre kanaler: acceptor bare eksitasjon og utslipp (acceptor kanal), donor eksitasjon og acceptor utslipp (bånd kanal), og donor bare eksitasjon utslipp (donor kanal).
    Merk: Det er mange måter å bilde bånd samples. Tre-kanals eller "tre-kube" metoden for bildebehandling sammen med hjelp av kalibrere systemet å måle bånd effektiviteten anbefales for bånd-baserte spenning sensorer55,56. Denne tilnærmingen er rask, enkel, ikke-destruktive, krever bare en standard fluorescens imaging mikroskop og gjør sammenligning av eksperimenter på ulike dager og tenkelig oppsett.
  5. Skanne prøven ved hjelp av en eksponeringstid på 500 ms og en nøytral tetthet (ND) filter på 10%. Finne en celle uttrykke spenningen sensoren med klart lokaliseringen å en struktur av interesse.
  6. Velg en eksponeringstid på 500 ms eller ønsket lengde for hver tenkelig kanal og en ND filter på 100% og kjøpe en bånd bildesekvens.
  7. Beregne gjennomsnittlig intensiteten av sensoren på subcellular strukturer av interesse i hver tenkelig kanal. Svake signaler kan føre til unøyaktige resultater feil rettelsen estimater, ikke-lineære funksjonene i detektorer eller betydelig bidrag av bakgrunnen signaler. En omtrentlig retningslinje er å satse intensiteter over 10% av det dynamiske utvalget av kameraet (dvs., et 16-biters kamera, intensiteter bør være over 6000).
    Merk: Identisk optisk innstillinger (eksponeringstider, filtre, mål og andre variabler som kameraet gevinst eller binning) må brukes for alle bånd eksperimenter som blir sammenlignet. Endre disse innstillingene vil føre til en endring i hvor bånd som er enten generert og/eller oppdaget i mikroskopi oppsettet. BÅND effektivitet mål er uavhengig av disse innstillingen, men kalibrering faktorene brukes til å bestemme bånd effektivitet er ikke. I teorien, ulike sett med kalibrering faktorer kan brukes til å generere bånd effektivitet fra forskjellige optisk innstillinger, men dette anbefales ikke. Bleking eller Phototoksisitet kan være forskjellig mellom de ulike innstillingene, opprette falske resultater.
  8. Få en andre bånd bildesekvens i samme synsfelt. Beregne photobleaching mellom rammer ved å sammenligne gjennomsnittlig intensiteten av sensoren i hver tenkelig kanal. Photobleaching bør holdes til et minimum, fortrinnsvis mindre enn 1-5% tap av signal.
  9. Justere tenkelig parametere for å maksimere intensiteten samtidig som photobleaching. For grov justeringer, endre ND brukes under oppkjøpet. Endre eksponeringstid i trinn på 250 ms for finere justeringer.
  10. Gjenta trinn 3.5-3.8 til tilstrekkelig signal kan hentes samtidig minimere photobleaching.
    Merk: Vanligvis innstillingene for vinculin spenning sensoren i vinculin- / - MEFs er 1500 ms 1500 ms og 1000 ms for giver, bånd og acceptor kanaler henholdsvis. Optimale verdiene varierer med type belysning systemet, mål, filteret sett og sensor uttrykk nivå.

4. Velg parametere for FRAP Imaging

  1. Optimalisere laser innstillingene for å sikre fullstendig bleking av regionen rundt (ROI) uten bleking området eller forårsaker photodamage.
    1. Rette en generert prøvene av celler uttrykke spenningen sensoren med 4% paraformaldehyde i 10 min.
      Merk: Denne optimaliseringen avhengig ikke av protein dynamics, og et fast utvalg tillater maksimal tenkelig tid uten bekymringsfull om cell helse. Dette vil også forhindre utvinning av bleking av mobile proteiner, slik at for isolering av effekten av bleking, unngå noen effekter fra rask, diffusjon-mediert fluorescens recovery oppstår mellom forekomsten av bleking og tar den første post blekemiddel bildet.
      FORSIKTIG: Paraformaldehyde er giftige. Dette trinnet skal utføres i avtrekksvifte og løsningen bør avhendes i henhold til institusjonelle politikk.
    2. Skyll prøven 3 ganger med PBS og la på PBS.
      Merk: Bruk av mest kommersielt tilgjengelig montering media påvirker fluorophore egenskaper, gjør prøven uegnet for FRAP imaging54. Ideelt sett cellene blir vist umiddelbart, men kan stå over natten på 4 ° C. Lengre ventetider fører til forringelse av prøven.
    3. Plass prøven i mikroskopet scenen holderen for bildebehandling.
    4. Åpne vinduet laser konfigurasjon. Start med å sette en laser bor 1000 µs og 10 pulser, betyr at hver spot i scan over Avkastningen vil få 10.000 µs full kraft laser
      Merk: En 500 mW 515 nm laser ble brukt for bleking. Dette ble valgt å selektivt bleke Venus A206K, acceptor i vinculin spenning sensor, med maksimal effektivitet. Hvis bånd-baserte spenning sensorene med andre fluorescerende proteiner brukes, må en annen type laser brukes.
    5. Finne en celle uttrykke spenningen sensoren med klart lokaliseringen å en struktur rundt og få et bilde.
    6. Tegne en rektangulær avkastning beskriver området for å bleke og lagre ROI plasseringen. Puls laser. Feste et annet bilde av utvalget.
      Merk: Størrelsen bør være omtrent på størrelse med hele FA. Forsiktighet bør utvises at ruten størrelse ikke varierer drastisk over eksperimenter. Bleket området må nøye overvåket i proteiner som dynamics påvirkes av spredningen. Dette er en mulig bekymring i transmembrane proteiner, som cadherins47, eller proteiner som diffus sakte27,57.
    7. Sjekk kvaliteten på photobleaching ved å kontrollere at hele Avkastningen er bleket slik at intensiteten i bakgrunnen nivåer. Kontroller også at det er ingen bleking utenfor Avkastningen.
    8. Justere laser for å oppnå en betydelig mengde bleking i Avkastningen uten å indusere betydelig bleking utenfor Avkastningen. For grov justeringer, heve og senke holdetiden i trinn av 100 µs og finjusteringer, heve og senke antall pulser i trinn 5 pulser.
    9. Gjenta trinn 4.1.5-4.1.8 fram minimumsinnstillingene som Avkastningen er fullt bleket uten off-målet photobleaching.
      Merk: Å oppnå en betydelig innledende bleking verdi uten å indusere Phototoksisitet er et viktig aspekt av FRAP analyse. Bruke laser innstillingene som resulterer i en komplett blekemiddel i fast prøvene. Generelt, skal minimal antall fotoner brukes til å oppnå det ønskede bleking. Også bør bleking protokollen holdes relativt konsekvent under eksperimenter, så endringer kan påvirke målinger av protein dynamics58.
  2. Optimalisere time-lapse parametere for å fange fullstendig dynamikken i protein rundt samtidig som photobleaching.
    1. Forberede mikroskopi opplegget levende celle bildebehandling, fortrinnsvis med et oppvarmet Stadium og mål samt CO2 kontroll. La equilibrate for 20 min.
      Merk: For å opprettholde helsen til fotografert cellene, temperatur og pH må opprettholdes i tenkelig fartøyet. En rekke oppvarmet stadier og objektive varmeovner kan lett vedlikeholde cellen temperaturen på 37 ° C. Kontroll av pH for mange medietyper kan oppnås ved bruk av en peristaltiske pumpe pass fuktet 5% CO2 over prøven på 15 mL/min. Alternativt, hvis CO2 kontrollen er utilgjengelig, live imaging mediet som inneholder HEPES skal brukes til å forhindre store pH endringer.
    2. Plass en generert prøvene av celler uttrykke spenningen sensoren i mikroskopet scenen holderen for bildebehandling. La equilibrate i 10 min.
    3. Bruke verktøyet MDA, sette opp en time-lapse å kjøpe 3-5 bilder pre bleke, bleke Avkastningen og fortsette å 10-60 bilder.
      Merk: For vinculin på FAs, imaging hver 5 s 5 min etter blekemiddel er tilstrekkelig til å observere dynamikken uten å innføre overdreven bleking31. Nyttig utgangspunkt for bildebehandling rate og varighet for mange andre proteiner kan bli funnet i litteraturen47,48,59,60.
    4. Bruk acceptor imaging som minimerer eksponering for eksempel lys, samtidig opprettholde en tilstrekkelig signal-til-støy-forhold, å image strukturen av interesse. Et godt utgangspunkt er halvparten av det ND filter og eksponering tid nødvendig for avbilding av acceptor under bånd.
    5. Finn en celle uttrykke spenningen sensoren med klart lokaliseringen å en struktur av interesse og knipse et bilde.
    6. Tegne en rektangulær avkastning for å markere hvor bleke og lagre ROI plasseringen. Starte den time-lapse.
    7. Undersøke resultatpostsettet bilder for potensielle problemer.
      1. Hvis det er betydelig hopp (større enn 10% av første intensitet) i fluorescens utvinning mellom rammer, redusere tid-trinn mellom rammer.
      2. Hvis det er en betydelig global tap av fluorescens over tid (større enn 5-10% av første intensitet), redusere antall bilder tatt etter blekemiddel og/eller endre imaging for å redusere eksponering for eksempel lys.
      3. Hvis fluorescens utvinning ikke har platå på slutten av den time-lapse, øke den totale lengden på den time-lapse.
    8. Justere parameterne time-lapse tilsvarende og gjenta 4.2.5-4.2.7 til fluorescens utvinning er tilstrekkelig fanget uten globale Foto-skade til prøven.

5. få bånd-FRAP data

  1. Forberede mikroskopi opplegget levende celle bildebehandling, fortrinnsvis med et oppvarmet Stadium og mål samt CO2 kontroll. La equilibrate for 20 min.
    1. For å sikre helsen til fotografert cellene, opprettholde temperaturen på 37 ° C i tenkelig kammeret. Bruk en peristaltiske pumpe skjedde fuktet 5% CO2 over prøven på 15 mL/min å opprettholde pH.
    2. Alternativt hvis CO2 control er tilgjengelig, bruke live bildebehandling mediet som inneholder HEPES hindre store pH endringer.
  2. Åpne verktøyet MDA og satt opp med BÅNDS tenkelig parametere, inkludert annet filter settene.
  3. Lagre denne MDA eksperimentelle mappen med navnet på MDA_FRET_Date.
  4. Angi en annen MDA med FRAP imaging parametere, inkludert annet filter settene, time-lapse innstillingene og journalen til puls laser etter pre blekemiddel oppkjøpet.
  5. Lagre denne MDA eksperimentelle mappen med navnet på MDA_FRAP_Date. Lukk vinduet MDA.
  6. På verktøylinjen øverst i skjermbildet Velg Journal | Starter opptaket.
  7. Åpne vinduet MDA, laste MDA_FRET_Date staten og trykke Hent. Deretter laste MDA_FRAP_Date staten og trykke Hent.
  8. På slutten av oppkjøpet, på verktøylinjen øverst i skjermbildet Velg Journal | Stopp registrering.
  9. Lagre denne journalen til eksperimentelle mappen med navnet på FRETFRAP_Date og legge den til en verktøylinje for enkel tilgang. Lukk vinduet MDA.
  10. Plass en generert prøvene av celler uttrykke spenningen sensoren i mikroskopet holderen for bildebehandling. La equilibrate i 10 min.
  11. Navigere prøven bruker bildeopptak under anskaffe | Erverve med minimal eksponering tid og ND filter for å finne cellene rundt.
  12. Angi kontinuerlig autofokus ved å navigere til enheter | Fokus. Manuelt fokus på prøven fram riktig tenkelig flyet.
  13. Klikk Angi kontinuerlig fokus, venter for systemet å justere, og klikk Start kontinuerlig fokus.
    Merk: Dette er ikke nødvendig, men vesentlig forbedrer kvaliteten på FRAP utvinning kurver fordi den hindrer at prøven drivende ut-av-fokus.
  14. Finn en celle uttrykke spenningen sensoren med klart lokaliseringen å en struktur av interesse og knipse et bilde.
  15. Tegne en rektangulær avkastning for å markere hvor å bleke. Lagre ROI plasseringen.
  16. Initialisere FRETFRAP_Date journalen, som vil starte oppkjøpet av bånd bilder etterfulgt av initialiseringen av FRAP time-lapse.
  17. Gjenta trinn 5.14-5,16 til 10-15 image sett er ervervet.
    Merk: Måling kan ikke gjentas i samme celle. Når photobleaching skjer, er bånd data upålitelig.

6. analysere bånd-FRAP data

  1. Analysere bånd bilder ved hjelp av programvaren til valg.
    Merk: Det finnes flere måter å image og quantitate bånd61, inkludert ratiometric bånd62 og bånd indeks34,35. Men anbefales det å bruke anslag over bånd effektivitet55,63 for tolkningen av bånd-FRAP data. Se diskusjonen for videre utforskning av dette emnet. Oppmerksomme utslipp og beregning av bånd effektivitet er tilpasset programvare tilgjengelig fra Hoffman Lab på https://gitlab.oit.duke.edu/HoffmanLab-Public.
  2. Kvantifisere relevante parametere for hver subcellular struktur som ble bleket. Dette bør inkludere gjennomsnittlig bånd indeks/effektivitet og gjennomsnitt første acceptor intensitet (proporsjonal med konsentrasjon), men kan også omfatte fysiske parametere som Avkastningen størrelse.
  3. Analysere FRAP bilder ved hjelp av programvaren til valg.
    Merk: Det er flere måter å quantitate FRAP26,27,28,29. Sentrale eksperimentelle bekymringer inkluderer regnskap for bleking under etter blekemiddel imaging, endringer i bakgrunnen intensitet og translokasjon av svært dynamisk subcellular strukturer, for eksempel fokal adhesjon. Bleking rettelser og variasjoner i bakgrunnen belysning kan oppnås gjennom analysen av ikke-bleket og ikke-fluorescerende områder av bilder. Svært dynamisk subcellular strukturer, spesielt de som viser overdreven vekst eller demontering dynamics er uforenlig med standard FRAP analyser og bør ikke bli analysert. I tillegg finnes det en rekke måter å normalisere data. Følger retningslinjene er for enkleste analyse.
  4. Korriger Gjenopprettingsdataene for bleking effekter og deretter normalisere å pre bleke intensiteter. Kvantifisere Halvtid utvinning og mobile brøken i henhold til følgende formel28,34:
    MF - (MF - Ro) e-kt
    der MF er den mobile brøken, Ro er første utvinning, og k er utvinningsgrad. Den halv tid på utvinning bestemmes av:
    Τ1/2 = ln 2/k.
    Merk: Det er en rekke offentlig tilgjengelig programvare for å fullføre disse analyser64 samt en rekke ImageJ plugins. Tilpasset programvare er tilgjengelig fra Hoffman Lab på https://gitlab.oit.duke.edu/HoffmanLab-Public. Flere analyser bør brukes i situasjoner der spredningen påvirker dynamikken i protein av interesse, flere tidsskalaer er i utvinningen, eller ikke-standard bleking geometrier brukes.

7. tolke bånd-FRAP data

  1. Kompilere relevant informasjon for hver avkastning inkludert: bånd indeks/effektivitet, acceptor intensitet, FRAP pause, FRAP mobile brøkdel.
    Merk: Bånd indeks eller effektivitet brukes til å bestemme gjennomsnittlig mengde over protein i Avkastningen. Acceptor intensitet måler lokale konsentrasjonen av protein. Halv tid recovery er et mål av protein dynamikk. En mindre halv tid angir rask omsetning. FRAP mobile brøkdel måler mengden protein i Avkastningen som er aktivt snu. En større mobile brøkdel angir at en større andel av protein i Avkastningen er snu.
  2. For å undersøke effekten av lokale konsentrasjon på protein omløpshastighet og beløpet, tegne FRAP pause og mobile brøkdel mot første acceptor intensitet.
  3. For å undersøke effekten av protein belastning på protein omløpshastighet og beløp, tegne FRAP pause og mobile brøkdel mot bånd indeks/effektivitet.
    Merk: Avhengig av protein eller struktur, det kan også være interessant å se effekten av fysisk parametere, for eksempel strukturstørrelse eller eksentrisitet, protein belastning eller omsetning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

BÅND-FRAP består av en kombinasjon av to fluorescerende teknikker, bekymre og FRAP. Som vi fokusert på effekten av protein belastning, brukte vi bånd-baserte spenning sensorer34,46. Disse sensorene er ofte basert på en spenning sensing modul som består av to fluorescerende proteiner, som mTFP1 og VenusA206K, sammen med et flagelliform linker (figur 1A). Når modulen er plassert mellom hodet og baklykter domenene av et protein, er det mulig å måle belastningen utøvde over protein. Når du analyserer bånd data, bilder tatt i acceptor kanalen brukes til å vurdere spenning sensor lokalisering og konsentrasjon, som signalet er uavhengig av bånd (figur 1B). Etter beregning av bånd effektivitet, kan protein belastning visualiseres i kolorimetrisk skala der en nedgang i bånd effektivitet mot kjøligere farger indikerer en økning i protein belastning, og bånd effektivitet i det røde området angi lav protein belastning ( Figur 1B). FRAP avbildning utføres ved hjelp av en laser til å bleke acceptor fluorophore i en enkelt subcellular struktur og overvåke frisk over tid (figur 1 c). Resulterende normalisert FRAP kurven kan analyseres for å pakke ut parametere beskrive protein dynamikken, inkludert den halve tiden i utvinning og mobile brøkdel (figur 1 d). Fordi bånd og FRAP analyser ble utført i samme celle, gjennomsnittlig protein belastning og omsetning i en subcellular struktur kan tegnes som et enkelt tilgangspunkt. Imaging cellene gir flere punkter og en ny trend kan angi om et protein er ustabil (figur 1E) eller stabiliseres av molekylære belastning (figur 1F).

Vinculin spenning sensoren (VinTS) stabilt uttrykt i vinculin null MEFs regionaliserer veldig klart å FAs spredt over hele cellen, sett av ser på acceptor kanal bildet (figur 2A). Acceptor kanal bildet brukes til å opprette en segmentering maske som identifiserer hver enkelt aktiva med en unik ID, visuelt utpekt av forskjellige farger (figur 2B). Segmentering algoritmen er basert på metoden "vann" og etiketter FAs ca for lysstyrke, som beskrevet tidligere34,65. Segmentering resultatene blir konvertert til en binær maske som brukes deretter bånd effektivitet resultatene (figur 2C) og gjennomsnittlig bånd effektiviteten i hver unike FA beregnes (figur 2D). Tilleggsegenskaper kan beregnes for hvert aktiva på en lignende måte, inkludert gjennomsnittlig acceptor intensitet, størrelse, eksentrisitet og plassering i cellen. På denne måten samsvarer som FA er valgt for FRAP med den unike FA-IDen og de tilknyttede egenskapene.

FRAP bildebehandling og analyse er følsom for flere faktorer som kan kontrolleres, inkludert laser og tenkelig parametere, og noen faktorer som ikke kan kontrolleres, som samlet FA stabilitet26,27,28, 29. For eksempel kan for mye eksponering for lys under tidsinnstilt bildebehandling føre til store problemer i tolke FRAP data. Selv om analysen av kontroll FAs som ikke ble bleket kan brukes til å normalisere for mindre photobleaching over tid, med mye eksponering for eksempel lys, resulterende FRAP kurven viser en innledende utvinning etterfulgt av en dukkert i normalisert intensitet som kan ikke være nøyaktig passe med en eksponentiell funksjon. Hvis denne effekten er konsekvent observert i dataene, er det nødvendig å optimalisere parameterne tenkelig å redusere eksponeringstid, øke tid-trinn mellom bildebehandling, eller redusere lengden på time-lapse å redusere eksponeringen av prøven lys.

Et annet eksempel FRAP data som er uninterpretable, er når de var photobleached translocates raskt under gjenoppretting28. En representant ved overdreven translokasjon vises i Figur 3. Det første bildet, gir hvor ROIs er valgt, ikke en indikasjon på FA stabilitet (figur 3A). Overvåking bleket FA over tid, flyttes raskt fra utgangsposisjon og automatisert sporing er ikke umiddelbart følge på grunn av lav fluorescerende signalet etter photobleaching (figur 3A). Resulterende FRAP kurven viser en innledende fase av slakt utvinning med et hopp når fluorescensen er kommet til hektene nok programvare oppdage FA og flytte Avkastningen (figur 3B). Denne kurven kan ikke kunne passe av en eksponentiell funksjon. Rask translokasjon av de foreslår også at FA struktur er ustabil. Dermed skal ustabil FAs ikke inkluderes i samme bånd-FRAP analyse som stabil FAs, på grunn av både tekniske og biologiske problemer.

Med tilfredsstillende bånd og FRAP, er neste trinn fullført bånd-FRAP analyse av samtidig vurdere protein belastning og dynamikk. Figur 4A viser bånd effektivitet kart av tre vinculin null MEFs stabilt uttrykke VinTS. FAs skissert i hvitt ble valgt for FRAP analyse, og acceptor intensiteten vises over tid. Disse tre FAs har vinculin under ulike mengder belaste og utfoldelse en annerledes vinculin utvinning profil. Kvantifisere disse egenskapene ved å beregne den halve tiden av utvinning og konspirert mot gjennomsnittlig bånd effektiviteten i hvert aktiva viser den generelle trenden av vinculin blir stabilisert av økte belastningen (figur 4B). Mobile brøken plottet mot bånd effektivitet viser imidlertid ingen trend, antyder at mobil brøkdel ikke er regulert av molekylære belastning (figur 4C). Vi presenterer en punkt mutasjon i VinTS på aminosyre 50 (A50I) har vist å hindre vinculin binding til store bindende partner i FAs, talin66. Endring av Samvirkingen protein-protein påvirker vinculin force-sensitive dynamikk. Vinculin null MEFs stabilt uttrykke VinTS A50I har forskjellige celler og FA morphologies, ulike vinculin lasting profiler og forskjellige vinculin dynamics (Figur 4 d). Kvantifisere halv-tider utvinning og bånd effektivitet og plotte viser at når vinculin-talin interaksjon er forstyrret, vinculin på FAs er ustabil av økte belastningen (figur 4E) mens mobile brøkdel viser ingen trend (figur 4F ).

Figure 1
Figur 1: prinsipper for bånd-FRAP teknikk. (A) skjematisk av bånd-baserte spenning sensor modul (TSMod) inn et protein av interesse og effekten av spenning på bånd signalet. (B) for å kvantifisere bånd med sensibilisert utslipp, tas til fange donor signal (vises ikke), acceptor signal og bånd signal. Med riktig rettelser, kan bånd bildet tilordnes en kolorimetrisk skala å visualisere hvor mye spenning brukes til sensoren. (C) FRAP er utført med acceptor signalet, som er direkte proporsjonal med konsentrasjonen. (D) FRAP tenkelig analyse produserer kurver av fluorescens over tid som kan passe bruker matematiske modeller for å bestemme protein dynamics. (E, F) Når det kombineres bånd og FRAP, kan kraft og omsetning i et enkelt aktiva måles. Måle flere FAs i flere celler gir en sammenheng mellom protein Last- og protein omsetning. I denne analysen var en relasjon i som økte belastningen korrelerer med økt omsetning er referert til som en kraft-ustabil tilstand (E). I denne analysen kalles en relasjon der økte belastningen korrelerer med redusere omsetning en kraft-stabilisert tilstand (F). Dette tallet har blitt endret fra Rothenberg et al. 37. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: FA identifikasjon og bånd analyse. (A) en vinculin null MEF uttrykke VinTS visualisert i acceptor kanalen, hvor intensiteten angir lokale konsentrasjonen av vinculin. Skala bar = 30 µm. (B) FAs er segmentert basert på acceptor kanalen å opprette en FA ID maske hvor hver FA tilordnes en unik ID, her vist som forskjellige farger, ca for lysstyrken. (C) FA ID maske konverteres til en binær maske og brukes på bånd effektivitet bildet vise bånd effektivitet verdiene bare på FAs. (D) bånd effektivitet innenfor hver FA er gjennomsnittet for å få en enkeltverdi for hvert aktiva, som er forbundet med FA-ID i utdatatabellen data. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: eksempel på en translocating FA. (A) en vinculin null MEF uttrykke VinTS A50I mutant sensoren er visualisert i acceptor kanalen, med fargetabellen invertert klarhet. Skala bar = 30 µm. FA skissert i svart ble valgt for bleking. Zoomet inn bildene viser FA progresjon over tid med rød kontur som angir hvor programvaren identifisert FA. Skala bar = 2 µm. (B) den resulterende normalisert FRAP kurven fra data i (A). Det er en ca 5% hoppe i intensitet følgende punkt 3 som følge av FA translocating raskt før tilstrekkelig restitusjonstid programvare oppdage endringen i aktivalokasjonen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: representant bånd-FRAP resultater. (A) Vinculin null MEFs uttrykke VinTS vises som gjennomsnittlig bånd effektivitet bilder av hele cellen (skala bar = 30 µm) med zoomet inn invertert acceptor kanal bilder viser FRAP utvinning progresjon (skala bar = 2 µm). (B) FRAP halv tid på utvinning plottet mot bånd effektivitet for 32 celler, med punktene som representerer celler i (A) uthevet i rødt. (C) FRAP mobile brøkdel plottet mot bånd effektivitet for de samme cellene i (B). (D) Vinculin null MEFs uttrykke VinTS A50I mutant sensoren som gjennomsnittlig bånd effektivitet bilder av hele cellen (skala bar = 30 µm) med zoomet inn invertert acceptor kanal bilder viser FRAP utvinning progresjon (skala bar = 2 µm). (E) FRAP halv tid på utvinning plottet mot bånd effektivitet for 21 celler, med punktene som representerer celler i (D) uthevet i rødt. (F) FRAP mobile brøkdel plottet mot bånd effektivitet for de samme cellene i (E). Dataene ble opprinnelig publisert i Rothenberg et al. 37 og er visualisert her i et nytt format. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

BÅND-FRAP metoden tillater direkte måling av kraft-sensitive protein dynamikk, en egenskap som har vært vanskelig å direkte undersøke i levende celler. Følsomheten til protein dynamics molekylær lastes er kritisk til protein's fungerer som en kraft senderen eller transduktor. Lasting kreves for overføring av både internt generert og eksternt brukte styrker, kalt mechanotransmission, og for konvertering av disse styrkene til biokjemisk-detectable signaler, kalt mechanotransduction. Imidlertid endringer i belastning kan påvirke varigheten et protein forblir bundet, dermed jo mindre tid en protein tilbringer peiling belastning, jo mindre sjanse har overført til andre proteiner eller transduced i en biokjemisk detectable signal og kjente. Metoden bånd-FRAP bro mellom molekylære og mobilnettet nivå ved at molekylær skala målinger av kraft-sensitive dynamikk for tilgang i en bredere mobilnettet kontekst. Videre tillater for disse målingene tas mens perturbing intracellulær eller ekstracellulær miljøet biokjemisk eller mekanisk. Denne teknikken skal gjelder for enhver bånd-baserte spenning sensor, slik at etterforskningen av protein mekanisk tilstand i en rekke subcellular strukturer og ekstracellulære sammenhenger.

Avgjørende skritt i å sikre ønsket bånd-FRAP målene er oppnådd innebære optimalisere tenkelig parametrene og dataanalyse og tolkning. Optimalisere tenkelig parametrene, som beskrevet i protokollen, er nødvendig å begrense photodamage til prøven, samtidig som ønsket strukturer og dynamics skilles og tilstrekkelig signalstyrke for beregning av bånd. Etablere disse tenkelig parametere for en bestemt celle linje og protein rundt tidlig vil lette direkte sammenligning mellom ulike eksperimentelle grupper. Det er verdt å merke seg at endringer i systemet, for eksempel mutere protein av interesse eller innføre hemmere, kan føre til endringer i protein lokalisering (og dermed endre signalet intensitet) og dynamikk. Optimalisert parameterne bør aktivere klare, nøyaktige målinger over alle eksperimentelle forhold. Derfor er det anbefalt å velge parameterne som ikke er på ekstreme slutten av å være nyttig, for eksempel å kunne knapt skille signal fra støy.

Mens bildebehandling i denne protokollen var på en epifluorescence mikroskop og tilknyttede FRAP laser modul, gjelder bånd-FRAP andre imaging-systemer. For eksempel, kan denne teknikken tilpasses linje-skanning AC confocal mikroskop som spinner disken AC confocal mikroskop med en tilknyttet photobleaching modul. Imaging innstillinger skal være optimalisert på en tilsvarende måte å oppnå tilstrekkelig signal-til-støy uten å forårsake photodamage eller overdreven photobleaching. Spesielt om BÅNDS tenkelig er høy quantum effektivitet detektorer pålagt å skaffe tilstrekkelig signalet for vellykket bånd beregning uten å indusere fluorophore skade. Det finnes en rekke publikasjoner som beskriver separate bånd eller FRAP bildebehandling ved hjelp av en AC confocal mikroskop67,68,69, som kan brukes til å veilede optimalisering for bånd-FRAP bildebehandling.

Etter eksperimentet dataanalyse bør være behandlet nøye og utført i en reproduserbare, fortrinnsvis automatiserte måte. På grunn av manglende evne til å bleke mer enn 2-3 subcellular områder i én celle før bleking for mye av det anvendelig vannpytt av protein, gjennomstrømningen av denne teknikken er relativt begrenset. Dermed er datasett ofte kombinert over flere dager i bildebehandling, krever konsekvent behandling av data. Både bånd og FRAP tilbyr utfordringer med dataanalyse. BÅND indeks og bånd effektivitet målinger gir en kvantifisering av protein belastning. BÅND-indeks er et relativt mål som er svært avhengig av mikroskopet innstillinger, mens bånd effektivitet mål er absolutt og uavhengig av mikroskopet innstillinger55,70. Vi har nylig vist at tidligere utviklet metode med "tre-kube" imaging kan brukes til å bestemme bånd effektivitet fra målinger av sensibilisert utslipp som vanligvis er kvantifisert med bånd indeks ved bånd-baserte spenning sensorer56 . Målinger av bånd effektivitet kreves hvis målinger av absolutt styrker opplevelsen av spenning sensorer skal være beregnet34. Celler uttrykke bånd-baserte spenning sensorer, kan spesielt stabil cellene på høy passasje tall, recombine eller svekke sensorene, fører til ubrukelig bånd data50. Dette er lett identifiseres når beregning giver-til-acceptor forholdstall under beregning av bånd effektivitet37,56 men kan være vanskeligere å oppdage bruker bånd indeks. Når du starter med en bånd-baserte spenning sensor, kan det være nyttig å få et stort datasett (> 50 celler) av bare bånd data for konstruksjoner av interesse å identifisere forventede utvalg av bånd effektiviteten. I tillegg kan FRAP data være vanskelig å trekke fra strukturer som er svært mobile, som FAs raskt skyve eller demontere. Velge en subpopulasjon av strukturer eller optimalisere celle plating forhold å redusere denne effekten kan hjelpe for å minimere problemet.

I konseptet, kan bånd-FRAP brukes på enhver bånd-baserte sensoren i alle subcellular regionen, med riktig optimalisering. I praksis, kan det være vanskelig å fange kraft-sensitive dynamikk av proteiner som ikke er under betydelig mekanisk belastning eller som har halv-ganger av utvinning på svært kort tidsskalaen av noen sekunder eller minutter lang tidsskalaen. Resultater fra single-molekylet studier kan peke på proteiner som kan demonstrere makt-sensitive dynamikk i levende celler. Hittil, inkluderer dette mange FA og AJ proteiner13,14,15,16 samt noen cellen cytoskjelett elementer71,72,73. Tilfeldig, er bånd-baserte sensorer designet for mange av disse proteinene46. Disse resultatene kan rettlede valget av et protein steder. Imidlertid bør det ikke forventes at bånd-FRAP data vil nøyaktig gjenspeile resultatene fra disse single-molekylet studier. Biokjemiske regulering, interaksjoner med andre proteiner og lokale cellen cytoskjelett strukturen kan faktisk skjule eller endre effekten av styrker på protein-protein interaksjoner. Muligheten til å observere disse kompleksiteten er en unik styrken av bånd-FRAP tilnærming.

En kombinasjon av manipulasjoner til cellen og protein rundt kan brukes til å belyse de viktige faktorene i å regulere protein dynamics. For eksempel kan det være nyttig å ha en sensor som er kraft-ufølsomme, enten gjennom sletting eller mutasjon av kraft-bindende domene35,74 som det skal ingen avhengighet av protein omsetning dynamikken på kraft rapportert av sensoren. I tillegg kan mutasjoner av andre kritiske bindende eller fosforylering områder i protein gi et mer komplett bilde av hvordan protein rundt reguleres. Globale endringer gjøres i cellen eller miljøet gjennom cellen cytoskjelett hemmere eller ved å endre egenskapene substrat (ex. ekstracellulær matrix eller stivhet), henholdsvis, kan hjelpe bestemme hvordan kraft-sensitive dynamikk av proteinet reagerer mekanisk forstyrrelser. Kombinere informasjon om protein belastning og kraft-sensitive dynamikk andre Biofysiske egenskaper av proteinet kan bidra til å etablere den mekaniske delstaten protein rundt. Dette kan inkludere lokalisering og lokale protein-protein interaksjoner i subcellular struktur75,76. I tillegg kan protein ligge i forskjellige konformasjon stater, selv innenfor samme subcellular struktur, avhengig av konteksten76,77. Protein belastning, dynamikk, lokalisering og conformation kan alle bli samtidig påvirket av internt generert og eksternt brukes37,76,78,79, dikterer et protein's rolle i kraft overføring og mechanotransduction. Allsidigheten til bånd-FRAP metoden og potensielle kompatibilitet med en rekke proteiner og manipulasjoner bør aktivere utviklingen av samspillet mellom bulk mekanikk, protein dynamics og mechanosensitive signalering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av en National Science Foundation CAREER-pris (NSF-CMMI-14-54257) og tilskudd fra American Heart Association (16GRNT30930019) og National Institutes of Health (R01GM121739-01) tildelt Dr. Brenton Hoffman og en nasjonal Science Foundation Graduate forskningsstipend tildelt Katheryn Rothenberg. Innholdet er ansvar forfattere og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synet av NSF eller NIH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin-EDTA Thermo Fisher 25300062
16% Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 30525-89-4
60x Objective NA1.35 Olympus UPLSAPO 60XO
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) Gibco 15240-062
Automated Stage Prior Scientific H117EIX3
Custom Dichroic Mirror Chroma Technology Corp T450/514rpc
Custom mTFP1 Emission Filter Chroma Technology Corp ET485/20m
Custom mTFP1 Excitation Filter Chroma Technology Corp ET450/30x
Custom Venus Excitation Filter Chroma Technology Corp ET514/10x
DMEM-gfp Live Cell Visualization Medium Sapphire MC102
Dulbecco's Modified Eagle's Medium  Sigma Aldrich D5796 with L-glutamine and sodium bicarbonate
Fetal Bovine Serum HyClone SH30396.03
Fibronectin, Human Corning 47743-654
FRAPPA Calibration Slide Andor provided along with FRAPPA unit
FRAPPA System with 515 nm Laser Andor
Glass-bottomed Fluoro Dishes World Precision Instruments FD35
HEK293-T Cells ATCC CRL-3216
Hexadimethrine Bromide, Polybrene Sigma Aldrich H9268-5G
High-glucose Dulbecco's Modified Eagle's Medium Sigma Aldrich D6429
Inverted Fluorescent Microscope Olympus IX83
JMP Pro Software SAS
Lambda 10-3 Motorized Filter Wheels Sutter Instruments LB10-NW
LambdaLS Arc Lamp with 300W Ozone-Free Xenon Bulb Sutter Instruments LS/OF30
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-027
MATLAB Software Mathworks
MEM Non-Essential Amino Acids Thermo Fisher 11140050
MetaMorph for Olympus Olympus
Micro-Humidification System Bioptechs 130708
MoFlo Astrios EQ Cell Sorter Beckman Coulter B25982
Objective Heater Medium Bioptechs 150819-13
OptiMEM Thermo Fisher 31985070
Phosphate Buffered Saline Sigma Aldrich D8537
pMD2.G Envelope Plasmid Addgene 12259
pRRL Vector gift from Dr. Kam Leong (Columbia University)
psPax2 Packaging Plasmid Addgene 12260
sCMOS ORCA-Flash4.0 V2 Camera Hamamatsu Photonics C11440-22CU
Sorvall Legend XT/XF Centrifuge Thermo Fisher 75004505
Stable Z Stage Warmer Bioptechs 403-1926
Venus Emission Filter Semrock FF01-571/72

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DuFort, C. C., Paszek, M. J., Weaver, V. M. Balancing forces: architectural control of mechanotransduction. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (5), 308-319 (2011).
  2. Mammoto, T., Ingber, D. E. Mechanical control of tissue and organ development. Development. 137 (9), 1407-1420 (2010).
  3. Sun, Y., Chen, C. S., Fu, J. Forcing stem cells to behave: a biophysical perspective of the cellular microenvironment. Annual Review of Biophysics. 41, 519-542 (2012).
  4. Wozniak, M. A., Chen, C. S. Mechanotransduction in development: a growing role for contractility. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (1), 34-43 (2009).
  5. Broders-Bondon, F., Nguyen Ho-Bouldoires, T. H., Fernandez-Sanchez, M. E., Farge, E. Mechanotransduction in tumor progression: The dark side of the force. The Journal of cell biology. 217 (5), 1571-1587 (2018).
  6. Simmons, R. D., Kumar, S., Jo, H. The role of endothelial mechanosensitive genes in atherosclerosis and omics approaches. Archives of Biochemistry and Biophysics. 591, 111-131 (2016).
  7. Wells, R. G. Tissue mechanics and fibrosis. Biochimica et Biophysica Acta. 1832 (7), 884-890 (2013).
  8. Lele, T. P., et al. Mechanical forces alter zyxin unbinding kinetics within focal adhesions of living cells. Journal of Cellular Physiology. 207 (1), 187-194 (2006).
  9. Hoffman, B. D., Grashoff, C., Schwartz, M. A. Dynamic molecular processes mediate cellular mechanotransduction. Nature. 475 (7356), 316-323 (2011).
  10. Dembo, M., Torney, D. C., Saxman, K., Hammer, D. The reaction-limited kinetics of membrane-to-surface adhesion and detachment. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 234 (1274), 55-83 (1988).
  11. LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Hoffman, B. D. Molecular-Scale Tools for Studying Mechanotransduction. Annual Review of Biomedical Engineering. 17, 287-316 (2015).
  12. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
  13. Kong, F., Garcia, A. J., Mould, A. P., Humphries, M. J., Zhu, C. Demonstration of catch bonds between an integrin and its ligand. The Journal of Cell Biology. 185 (7), 1275-1284 (2009).
  14. Rakshit, S., Zhang, Y., Manibog, K., Shafraz, O., Sivasankar, S. Ideal catch, and slip bonds in cadherin adhesion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (46), 18815-18820 (2012).
  15. del Rio, A., et al. Stretching Single Talin Rod Molecules Activates Vinculin Binding. Science. 323 (5914), 638-641 (2009).
  16. Seddiki, R., et al. Force-dependent binding of vinculin to alpha-catenin regulates cell-cell contact stability and collective cell behavior. Molecular Biology of the Cell. 29 (4), 380-388 (2018).
  17. Huang, D. L., Bax, N. A., Buckley, C. D., Weis, W. I., Dunn, A. R. Vinculin forms a directionally asymmetric catch bond with F-actin. Science. 357 (6352), 703-706 (2017).
  18. Chrzanowska-Wodnicka, M., Burridge, K. Rho-stimulated contractility drives the formation of stress fibers and focal adhesions. The Journal of Cell Biology. 133 (6), 1403-1415 (1996).
  19. Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin-cytoskeleton linkages. Cell. 88 (1), 39-48 (1997).
  20. Liu, Z., et al. Mechanical tugging force regulates the size of cell-cell junctions. Proceedings of the National Academy of Science. 107 (22), 9944-9949 (2010).
  21. Riveline, D., et al. Focal contacts as mechanosensors: externally applied local mechanical force induces growth of focal contacts by an mDia1-dependent and ROCK-independent mechanism. The Journal of Cell Biology. 153 (6), 1175-1186 (2001).
  22. Brevier, J., Vallade, M., Riveline, D. Force-extension relationship of cell-cell contacts. Physical Review Letters. 98 (26), 268101 (2007).
  23. Bershadsky, A., Kozlov, M., Geiger, B. Adhesion-mediated mechanosensitivity: a time to experiment, and a time to theorize. Current opinion in cell biology. 18 (5), 472-481 (2006).
  24. Chan, C. E., Odde, D. J. Traction dynamics of filopodia on compliant substrates. Science. 322 (5908), 1687-1691 (2008).
  25. Wu, Z., Plotnikov, S. V., Moalim, A. Y., Waterman, C. M., Liu, J. Two distinct actin networks mediate traction oscillations to confer focal adhesion mechanosensing. Biophysical Journal. 112 (4), 780-794 (2017).
  26. Fritzsche, M., Charras, G. Dissecting protein reaction dynamics in living cells by fluorescence recovery after photobleaching. Nature Protocols. 10 (5), 660-680 (2015).
  27. McNally, J. G. Quantitative FRAP in analysis of molecular binding dynamics in vivo. Methods of Cell Biology. 85, 329-351 (2008).
  28. Wehrle-Haller, B. Analysis of integrin dynamics by fluorescence recovery after photobleaching. Methods in Molecular Biology. 370, 173-202 (2007).
  29. Carisey, A., Stroud, M., Tsang, R., Ballestrem, C. Fluorescence recovery after photobleaching. Methods of Molecular Biology. 769, 387-402 (2011).
  30. Carisey, A., et al. Vinculin regulates the recruitment and release of core focal adhesion proteins in a force-dependent manner. Current Biology. 23 (4), 271-281 (2013).
  31. Wolfenson, H., Bershadsky, A., Henis, Y. I., Geiger, B. Actomyosin-generated tension controls the molecular kinetics of focal adhesions. Journal of Cell Science. 124, 1425-1432 (2011).
  32. Dumbauld, D. W., et al. How vinculin regulates force transmission. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (24), 9788-9793 (2013).
  33. Zaidel-Bar, R., Itzkovitz, S., Ma'ayan, A., Iyengar, R., Geiger, B. Functional atlas of the integrin adhesome. Nature Cell Biology. 9 (8), 858-867 (2007).
  34. Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
  35. LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Berginski, M. E., Urs, A. N., Hoffman, B. D. Construction, imaging, and analysis of FRET-based tension sensors in living cells. Biophysical Methods in Cell Biology. 125, 161-186 (2015).
  36. Meng, F., Suchyna, T. M., Sachs, F. A fluorescence energy transfer-based mechanical stress sensor for specific proteins in situ. The FEBS Journal. 275 (12), 3072-3087 (2008).
  37. Rothenberg, K. E., Scott, D. W., Christoforou, N., Hoffman, B. D. Vinculin Force-Sensitive Dynamics at Focal Adhesions Enable Effective Directed Cell Migration. Biophysical journal. 114 (7), 1680-1694 (2018).
  38. Austen, K., et al. Extracellular rigidity sensing by talin isoform-specific mechanical linkages. Nature Cell Biology. 17 (12), 1597-1606 (2015).
  39. Kumar, A., et al. Talin tension sensor reveals novel features of focal adhesion force transmission and mechanosensitivity. The Journal of Cell Biology. 213 (3), 371-383 (2016).
  40. Acharya, B. R., et al. Mammalian Diaphanous 1 Mediates a Pathway for E-cadherin to Stabilize Epithelial Barriers through Junctional Contractility. Cell Reports. 18 (12), 2854-2867 (2017).
  41. Borghi, N., et al. E-cadherin is under constitutive actomyosin-generated tension that is increased at cell-cell contacts upon externally applied stretch. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (31), 12568-12573 (2012).
  42. Conway, D. E., Williams, M. R., Eskin, S. G., McIntire, L. V. Endothelial cell responses to atheroprone flow are driven by two separate flow components: low time-average shear stress and fluid flow reversal. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298 (2), H367-H374 (2010).
  43. Arsenovic, P. T., et al. Nesprin-2G, a Component of the Nuclear LINC Complex, Is Subject to Myosin-Dependent Tension. Biophysical Journal. 110 (1), 34-43 (2016).
  44. Ye, N., et al. Direct observation of alpha-actinin tension and recruitment at focal adhesions during contact growth. Experimental Cell Research. 327 (1), 57-67 (2014).
  45. Paszek, M. J., et al. The cancer glycocalyx mechanically primes integrin-mediated growth and survival. Nature. 511 (7509), 319-325 (2014).
  46. Gayrard, C., Borghi, N. FRET-based Molecular Tension Microscopy. Methods. 94, 33-42 (2016).
  47. de Beco, S., Gueudry, C., Amblard, F., Coscoy, S. Endocytosis is required for E-cadherin redistribution at mature adherens junctions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (17), 7010-7015 (2009).
  48. Östlund, C., et al. Dynamics and molecular interactions of linker of nucleoskeleton and cytoskeleton (LINC) complex proteins. Journal of Cell Science. 122 (22), 4099-4108 (2009).
  49. Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. The interactions of retroviruses and their hosts. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor (NY). (1997).
  50. Komatsubara, A. T., Matsuda, M., Aoki, K. Quantitative analysis of recombination between YFP and CFP genes of FRET biosensors introduced by lentiviral or retroviral gene transfer). Scientific Reports. 5, 13283 (2015).
  51. Nasri, M., Karimi, A., Farsani, M. A. Production purification and titration of a lentivirus-based vector for gene delivery purposes. Cytotechnology. 66 (6), 1031-1038 (2014).
  52. Addgene, Generating Stable Cell Lines with Lentivirus. , Available from: https://www.addgene.org/protocols/generating-stable-cell-lines (2016).
  53. Roederer, M. Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats. Cytometry: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 45 (3), 194-205 (2001).
  54. Malkani, N., Schmid, J. A. Some secrets of fluorescent proteins: distinct bleaching in various mounting fluids and photoactivation of cyan fluorescent proteins at YFP-excitation. PLoS One. 6 (4), e18586 (2011).
  55. Chen, H., Puhl, H. L. 3rd, Koushik, S. V., Vogel, S. S., Ikeda, S. R. Measurement of FRET efficiency and ratio of donor to acceptor concentration in living cells. Biophysical journal. 91 (5), L39-L41 (2006).
  56. Rothenberg, K. E., Neibart, S. S., LaCroix, A. S., Hoffman, B. D. Controlling Cell Geometry Affects the Spatial Distribution of Load Across Vinculin. Cellular and Molecular Bioengineering. 8 (3), 364-382 (2015).
  57. Carnell, M., Macmillan, A., Whan, R. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP): acquisition, analysis, and applications. Methods of Molecular Biology. 1232, 255-271 (2015).
  58. Trembecka, D. O., Kuzak, M., Dobrucki, J. W. Conditions for using FRAP as a quantitative technique--influence of the bleaching protocol. Cytometry A. 77 (4), 366-370 (2010).
  59. Lavelin, I., et al. Differential effect of actomyosin relaxation on the dynamic properties of focal adhesion proteins. PLoS One. 8 (9), e73549 (2013).
  60. Foote, H. P., Sumigray, K. D., Lechler, T. FRAP analysis reveals stabilization of adhesion structures in the epidermis compared to cultured keratinocytes. PLoS One. 8 (8), e71491 (2013).
  61. Zal, T., Gascoigne, N. R. Photobleaching-corrected FRET efficiency imaging of live cells. Biophysical Journal. 86 (6), 3923-3939 (2004).
  62. Hodgson, L., Shen, F., Hahn, K. Biosensors for characterizing the dynamics of rho family GTPases in living cells. Current Protocols in Cell Biology. 46 (1), (2010).
  63. Day, R. N. Measuring protein interactions using Förster resonance energy transfer and fluorescence lifetime imaging microscopy. Methods. 66 (2), 200-207 (2014).
  64. Rapsomaniki, M. A., et al. easyFRAP: an interactive, easy-to-use tool for qualitative and quantitative analysis of FRAP data. Bioinformatics. 28 (13), 1800-1801 (2012).
  65. Zamir, E., et al. Molecular diversity of cell-matrix adhesions. Journal of cell science. 112 (11), 1655-1669 (1999).
  66. Bakolitsa, C., et al. Structural basis for vinculin activation at sites of cell adhesion. Nature. 430 (6999), 583-586 (2004).
  67. De Los Santos, C., Chang, C. W., Mycek, M. A., Cardullo, R. FRAP, FLIM, and FRET: Detection and analysis of cellular dynamics on a molecular scale using fluorescence microscopy. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 587-604 (2015).
  68. Periasamy, A., Wallrabe, H., Chen, Y., Barroso, M. Chapter 22: Quantitation of protein-protein interactions: confocal FRET microscopy. Methods in Cell Biology. 89, 569-598 (2008).
  69. Stehbens, S., Pemble, H., Murrow, L., Wittmann, T. Imaging intracellular protein dynamics by spinning disk confocal microscopy. Methods in Enzymology. , 293-313 (2012).
  70. Zeug, A., Woehler, A., Neher, E., Ponimaskin, E. G. Quantitative intensity-based FRET approaches--a comparative snapshot. Biophysical Journal. 103 (9), 1821-1827 (2012).
  71. Ehrlicher, A. J., Nakamura, F., Hartwig, J. H., Weitz, D. A., Stossel, T. P. Mechanical strain in actin networks regulates FilGAP and integrin binding to filamin A. Nature. 478 (7368), 260-263 (2011).
  72. Guo, B., Guilford, W. H. Mechanics of actomyosin bonds in different nucleotide states are tuned to muscle contraction. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (26), 9844-9849 (2006).
  73. Lee, C. Y., et al. Actin depolymerization under force is governed by lysine 113:glutamic acid 195-mediated catch-slip bonds. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (13), 5022-5027 (2013).
  74. Cost, A. L., Ringer, P., Chrostek-Grashoff, A., Grashoff, C. How to Measure Molecular Forces in Cells: A Guide to Evaluating Genetically-Encoded FRET-Based Tension Sensors. Cellular and Molecular Bioengineering. 8 (1), 96-105 (2015).
  75. Bertocchi, C., et al. Nanoscale architecture of cadherin-based cell adhesions. Nature Cell Biology. 19 (1), 28-37 (2017).
  76. Case, L. B., et al. Molecular mechanism of vinculin activation and nanoscale spatial organization in focal adhesions. Nature Cell Biology. 17 (7), 880-892 (2015).
  77. Chen, H., Cohen, D. M., Choudhury, D. M., Kioka, N., Craig, S. W. Spatial distribution and functional significance of activated vinculin in living cells. The Journal of Cell Biology. 169 (3), 459-470 (2005).
  78. Kim, T. J., et al. Dynamic visualization of alpha-catenin reveals rapid, reversible conformation switching between tension states. Current Biology. 25 (2), 218-224 (2015).
  79. Yao, M., et al. Mechanical activation of vinculin binding to talin locks talin in an unfolded conformation. Scientific reports. 4, 4610 (2014).

Tags

Bioteknologi problemet 141 Mechanobiology mechanotransduction biofysikk bånd-baserte spenning sensorer FRAP kraft-sensitive protein dynamics
Måling av Force-Sensitive Protein dynamikk i levende celler ved hjelp av en kombinasjon av fluorescerende teknikker
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rothenberg, K. E., Puranam, I.,… More

Rothenberg, K. E., Puranam, I., Hoffman, B. D. Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques. J. Vis. Exp. (141), e58619, doi:10.3791/58619 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter