Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Измерение силы чувствительных белка динамики в живых клетках, используя комбинацию люминесцентные методы

Published: November 2, 2018 doi: 10.3791/58619
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, Duke University

Summary

Здесь мы представляем протокол для одновременного использования Фёрстер резонанса энергии на основе передачи напряжения датчиков для измерения нагрузки и флуоресценции восстановления белка после Фотообесцвечивание для измерения динамики белков, позволяя измерения силы чувствительных динамика белков в живых клеток.

Abstract

Клетки воспринимают и отвечают к физические сигналы в их среде путем преобразования механических раздражителей в биохимически обнаружить сигналы в процессе, называемом mechanotransduction. Важным шагом в mechanotransduction является передача сил между внешней и внутренней среды. Для передачи силы, должны быть устойчивый, непрерывный физической связи, созданные серии белок белковых взаимодействий. Данный белок белковых взаимодействия механические нагрузки могут иметь либо не влияет на взаимодействие, приводят к быстрее диссоциации взаимодействия, или даже стабилизировать взаимодействия. Понимание как молекулярные нагрузки диктует, что оборот белка в живых клетках могут предоставить ценную информацию о состоянии механических белка, в свою очередь разъяснению ее роли в mechanotransduction. Существующие методы для измерения силы чувствительных белка динамики отсутствуют прямые измерения нагрузки протеина или полагаться на измерениях, выполненных вне сотовой связи. Здесь мы описываем протокол для передачи флуоресценции рекуперации энергии резонанса Фёрстер после Фотообесцвечивание (Лада-FRAP) технику, которая позволяет измерение динамики белков чувствительных к силе в живых клеток. Этот метод является потенциально применимы к любой датчик на основе ладу напряженности, содействие изучению динамики белков чувствительных к силе в различных внутриклеточных структур и различных типов клеток.

Introduction

Внеклеточная среда является богатым источником биохимические и физические сигналы, которые определяют поведение клеток. В частности физической природы микроокружения может посредничать основных клеточных функций, включая рост клеток, миграции и дифференциации1,2,3,4. Dysregulation механики микроокружения является важнейшим компонентом многих заболеваний, которые еще не имеют надлежащего лечения, таких как рак5, атеросклероз6и фиброз7. Полное понимание как клетки конвертировать физические раздражители в биохимически обнаружить сигналы, процесс называется mechanotransduction, требует выяснения молекулярных механизмов посредничества передачи силы, как в и из клеток и в рамках нескольких внутриклеточных структур.

Внутри внутриклеточных структур белки постоянно переворачивая; Привязка и отмена привязки, основанные на прочность их взаимодействия с обязательными партнерами8. Для силы успешно передаваться через физическое расстояние должен быть непрерывная цепь белок белковых взаимодействий, означает, что оборот белка должно быть достаточно медленно, чтобы сохранить и передавать силы для его привязки партнер9. В то время как белок белковых взаимодействий, как правило, состоят из нескольких non ковалентные связи между доменами белка, взаимодействие часто задумана как связанного состояния, которое может переход на свободные государства под различные условия10, 11. для данного протеин взаимодействия, вполне возможно, что силы может иметь не влияет на срок службы взаимодействия, известный как «идеальный Бонда», сократить срок службы взаимодействия, известный как «скольжения Бонда» или увеличить время существования взаимодействия , известный как «поймать Бонда»10. Таким образом существует сложная взаимосвязь между белка нагрузки и динамики белков, который мы называем силу учитывающих динамику.

К пониманию эффект нагрузки на динамику Бонд, ряд весьма информативным эксперименты были проведены на уровне одной молекулы. Использование изолированных белков, или фрагментов белков и методы манипуляции, такие как Магнитные пинцеты, Оптический пинцет и атомно-силовой микроскопии, эти исследования продемонстрировали силу чувствительных белок белковых взаимодействий для нескольких соответствующих 11,белки12. Обе интегринов13 и cadherins14, которые являются трансмембранные белки важны для формирования клеток матрица и ячеек взаимодействий, соответственно, показали изменения в динамике за загрузки. В ячейке vinculin набирается для обоих Талина15 и α-катенина16 в зависимости от силы и может сформировать улов Бонд с актина17, указывающее решающую роль для vinculin фокуса спаек (ФАС) и adherens развязок (Айс ) под нагрузкой. Сингл молекулярных исследований позволяют для изоляции определенных белок белковых взаимодействий и дать однозначные результаты, но они не учитывают сложность клеточной среды.

Достопримечательность эксперименты показали, что несколько внутриклеточных структур, в том числе ФАС и AJs, являются mechanosensitive и активизации Ассамблеи в ответ на внутренне создаваемом или внешне применяется нагрузок18,19, 20,21,22. Кроме того несколько теоретических моделей предполагают, что mechanosensitive Ассамблея может управляться силой чувствительных белка динамика23,24,25. Для изучения динамики этих сил чувствительных в живых клеток, были приняты несколько косвенные подходы. FRAP и родственные методы обеспечивают сравнительно простой методологии для измерения динамики белка в клетках26,27,,2829. Однако измерения нагрузки белка был более ограниченным. Обычным подходом является сравнение динамики белков в клетках с и без воздействия ингибитор цитоскелета, используется для снижения общей ячейки сократимости8,30,31. Концептуально это сравнение между высокой нагрузкой и низкой нагрузки государством. Однако существует не количественная оценка нагрузки через белка в любом государстве, и может быть непреднамеренным биохимические эффекты ингибитора, такие потери ключевых привязки сайтов вдоль F-актина накаливания. Другой подход, характерные для ФАС, был для измерения общей силы нагрузки на подложке с помощью тяги силовой микроскопии приблизительное молекулярной нагрузки и изучить взаимосвязь с динамикой одного белка в Англии32ф. Хотя этот подход и позволяет для количественной оценки общей силы, он не предоставляет молекулярно конкретную информацию. ФАС состоят из более чем 200 различных белков, многие из которых может нести нагрузку33. Таким образом измерение общей силы вывод FA потенциально скрывает возможность нескольких путей передачи силы и надежно не обеспечивают измерение нагрузки на определенных белков.

В отличие от предыдущих подходов в mechanobiology, появление на основе ладу напряжение датчиков позволяет прямое измерение нагрузок, испытываемых специфических белков внутри живых клеток34,35,36. Здесь мы представляем протокол, который сочетает в себе на основе ладу напряжение датчиков на основе FRAP измерения динамики белков. Мы называем эту технику FRAP ладу. Этот подход позволяет одновременное измерение белка нагрузки и динамики белков, таким образом позволяя оценки динамики белков чувствительных к силе в живых клеток (рис. 1). Уже FRAP ладу техника применялась к изучению силы чувствительных динамики механических компоновщика белка vinculin37. Напряжение датчиков были разработаны для многочисленных белков, которые актуальны в различных внутриклеточных структур. Например датчики разработаны для vinculin34 и Талине38,39 в ФАС, cadherins и catenins в AJs40,,41,42, nesprin в ядерный комплекс линк 43, α-актинина44 и filamin36 цитоскелета и MUC-1 в Гликокаликс45, среди прочих46. Аналогично FRAP это широко используемый метод был использован на mechanosensitive белков внутри фокуса спайки8,31, adherens развязок47, актина кора26и ядро48. Продвигаясь вперед, FRAP ладу техника должна быть широко применимо к любому этих существующих датчиков или недавно разработали датчики, позволяя для измерения силы учитывающих динамику в разнообразных условиях и внутриклеточных структур. С этой целью мы предоставляем подробную, обобщенные протокол для реализации метода FRAP ладу применимые в этих различных систем. Надеюсь это даст возможность широкого ряда экспериментов, выяснения роли различных белков mechanosensitive в регулировании передачи силы и в посредничестве поведение клеток.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. создать образцы для изображений

  1. Стабильно Экспресс напряжение датчика конструкции в нужной ячейки типа.
    1. Клонировать конструкция датчика напряжения в pRRL вектор или других вирусных выражение плазмиды.
      Примечание: Несколько различных молекулярного клонирования инструменты доступны для достижения этот шаг, включая использование энзимов ограничения, расширение, и Ассамблея Гибсон35. PRRL вектор используется в Ленти вирусный трансдукция и позволяет существенную степень производства белка с помощью промоутер человека цитомегаловирусом (CMV). Различные векторы могут быть необходимы для конкретного контекста. К примеру промоутер ЦМВ замолчать в некоторых типов клеток49. Кроме того только на основе ладу датчики, содержащие флуоресцентный белок что отсутствие сильных последовательности гомологии, например mTFP1 и A206K Венеры, может использоваться для создания стабильных клеточных линий. Датчики, содержащие голубой флуоресцентный белок и желтый флуоресцентный белок, вероятно, будет предметом гомологичная рекомбинация50.
    2. Генерировать человека в клетках человеческого эмбриона почек (ГЭС) 293T с помощью psPax2 и pMD2.G плазмиды упаковки с использованием стандартных вирусов производства методы51.
      Предупреждение: Человека должны обрабатываться только должным образом подготовленного персонала в среде лаборатории биобезопасности уровня 2.
      Примечание: Это сочетание клетки и упаковки плазмид подходит для использования с pRRL. Другие системы могут потребоваться с других векторов.
    3. Передают нужные ячейки с вирусом, используя стандартные трансдукции протоколы52 и использовать проточной цитометрии для сортировки клеток53 выбор однородное население, выражая каждой конструкции приблизительно эндогенными уровнями37. После выбора ячейки эксперименты могут проводиться непосредственно, или клетки может быть криогенно заморожен для последующего использования. Не следует превышать 2 циклов замораживания оттаивания для стабильной ячейки строки.
      Примечание: Использование клеточных линий дефицит белка, чтобы быть изучены (например, vinculin- / - MEFs для использования с датчиком натяжения vinculin) будет увеличить сигнал/шум соотношение в ладу экспериментов, а также ограничить гиперэкспрессия артефакты. Такие линии эмбриональных фибробластов (MEF) стабильная мыши могут быть использованы для приблизительно 15 проходы до значительные потери выражения или деградация датчиков является очевидной. Если вирусная основаны методы не желательны, множество коммерческих реактивов может использоваться согласно производителя протокол для временно transfect различные типы клеток с датчиками напряженности в соответствующих плазмида, например pcDNA3.1. Оптимальное выражение будет 24-48 ч после transfection.
  2. Подготовьте субстратов для заполнения ячейки.
    1. Приобрести 4, 35 мм прозрачным дном блюда.
    2. Работая в капюшоне культуры клеток, в канонический трубки 15 мл, сделайте 4 мл 10 мкг/мл фибронектин фосфат амортизированное (PBS) физраствора с использованием стерильных PBS в капюшоне культуры клеток. Аккуратно Инвертируйте трубки раз перемешать и пусть решение сидеть в течение 5 мин в капюшоне культуры клеток.
      Примечание: Концентрация или тип ECM белка может иметь корректироваться для других типов клеток. Условий, предусмотренных для MEFs.
    3. Пипетка 1 мл раствора фибронектин на каждое блюдо с прозрачным дном.
    4. Оставьте раствор фибронектин на блюда за 1 ч при комнатной температуре или на ночь при 4 ° C.
    5. Аспирационная фибронектин решения, раз ополосните PBS и добавьте 1 mL PBS.
  3. Семя клетки на подготовленных субстраты.
    1. Начните с клетками интерес на процент слияния для subcultivation культуры блюдо 6 см.
      Примечание: Различных типов клеток потребует отдельных клеток культуры условий и subcultivation протоколы. Этот раздел содержит рекомендации для MEFs. Как правило выращиваются MEFs до 85% слияния до subcultivation.
    2. Работая в рамках Худ культуры клеток, промойте клетки один раз с 3 мл ФСБ. Добавить 1 мл 0,05% трипсина-ЭДТА и инкубировать в течение 5 минут при 37 ° C.
    3. Добавить 3 мл полной СМИ на 6 см блюдо, собирать клетки и место в 15 мл Конические трубки.
      Примечание: Состав для полной СМИ будет зависеть от используемого типа ячейки. Для MEFs, полный СМИ часто определяется как высокие глюкоза Дульбекко изменения среднего орла с 10% плода бычьим сывороточным, 1% антибиотикам действие-противогрибковое (содержащая амфотерицин B, пенициллина и стрептомицина) и 1% раствор несущественные аминокислот (NEAA).
    4. Вращать клетки вниз на 1000 x g за 5 мин.
    5. Аспирационная СМИ и Ресуспензируйте Пелле клеток в 1 мл полной СМИ.
    6. Удаление PBS из стекла с покрытием фибронектин блюда. Подсчитать количество ячеек и семян 30 000 ячеек на каждое блюдо фибронектин покрытием стекла с соответствующей полной СМИ для окончательного объема 1,5 мл.
      Примечание: Эта плотность клеток подходит для MEFs и приведет к популяции клеток, которые не трогательно, но не чрезвычайно редкий. Точное мобильный номер может потребоваться быть скорректированы для других типов клетки или другие тепловизионные камеры.
    7. Позволяют клеткам распространилась за 4 ч после посева. На 2 ч распространения аспирационная роста средств массовой информации и раз ополосните изображений СМИ, оставляя 1,5 мл изображений СМИ.
      Примечание: Это распространяя время подходит для MEFs но возможно потребуется изменить для других ячеек. Однако инкубационный период более чем 6-8 ч приведет к значительным отложением ECM белка от сыворотки в полной СМИ. Imaging СМИ должны содержать же дополнения как полный СМИ, но должно быть оптически ясно и не содержат соединения, которые флуоресцировать в визуализации каналы, такие как flavins или утолить флуоресцирование, например фенола красного. Обычно полезно изображений СМИ является DMEM-gfp Live визуализации ячейки СМИ с 10% FBS и 1% раствор NEAA. Если фон аутофлюоресценция является неприемлемо высоким, то можно уменьшить количество сыворотки. Если средства массовой информации изменения невозможно после первоначального покрытия, клетки могут непосредственно высокомобильна в imaging СМИ, дополнена ингибитор трипсина.

2. Настройте микроскоп для изображений

  1. Поверните на микроскопе.
    1. Дуговая лампа сначала включите.
      Примечание: Дуговая лампа будет релиз электромагнитного импульса, который может повредить другое оборудование, которое уже находится на.
    2. Включите фильтр колесо контроллер, автоматизированный этап контроллер, Микроскоп компьютерный интерфейс и камеры.
    3. Включите лазер FRAP и лазерные позиции контроллеры.
      Предупреждение: Мощных лазеров может повредить глаза если непосредственно рассматривать. Рекомендуется настроить систему микроскоп для блокирования лазерного возбуждения от направляется на куски глаз, которым может быть достигнуто путем перемещения зеркало в FRAP луча во время отбеливания отражать лазерный сторону образца и предотвращения передачи для окуляра.
    4. Включите компьютер и программное обеспечение управления Открытый Микроскоп.
    5. Разрешить 15 мин для дуговая лампа и FRAP лазера, чтобы согреться.
  2. Калибровку лазера FRAP.
    1. Откройте окно конфигурации лазера. Установки Подсветки (во время импульса) соответствующие значения освещенности FRAP лазерного облучения образца. Установите Параметр освещенность (во время обработки изображений) для настройки освещения для изображений только акцепторной Флюорофор.
    2. Выберите цель для калибровки под Настройки системы координат. Снимите флажок Вручную нажмите калибровочных точек и проверьте Отображение изображения во время калибровки.
    3. Установите время задержки до 10000 МКС и количество импульсов до 100.
    4. Место калибровки слайд из бромид ethidium, опечатаны между стеклянное скольжение и coverslip, в стадии адаптер с coverslip стороной вниз.
      Предупреждение: Бромид Ethidium является мутагенным и должны быть обработаны с помощью перчатки. Если слайд скомпрометирован, распоряжаться согласно учреждение руководящих принципов.
    5. Используйте параметры освещения акцептора сосредоточиться на поверхности слайда, идентифицировать как фокальной плоскости с ярким сигнала. Небольшие дефекты в покрытие будет видимым для помощи в упор.
    6. Переместите его в область с единой флуоресценции по всей плоскости изображения.
    7. Нажмите на создать параметр. Программное обеспечение будет инициализировать процесс калибровки, автоматически отбеливания и обнаружения положение отбеленной точки.
    8. Обеспечение успешной калибровки путем оценки окончательное изображение, которое будет сетки 3 x 3 отбеленной точек, которые должны быть равномерно распределены и в фокусе. Сохраните изображение калибровки для будущей справки.
    9. Удалить слайд калибровки и безопасно хранить. Калибровка должна выполняться перед началом каждого эксперимента, но не должны выполняться между выборками.

3. Выберите параметры для изображений ладу

  1. Исправление, один из создаваемых образцов клеток, выражая датчик напряженности с параформальдегида 4% за 10 мин параформальдегида решение должно быть метанола свободный, часто упоминается как EM-класс, чтобы избежать денатурации флуоресцентных белков. Место в PBS после фиксации.
    Предупреждение: Параформальдегида решения являются токсичными. Этот шаг должен выполняться в зонта и решение следует утилизировать согласно институциональной политики.
    Примечание: Эта оптимизация не зависит от динамики белков, и фиксированной выборки позволяет максимальное время обработки изображений не беспокоясь о здоровье клеток.
  2. Промойте образца три раза с PBS и оставить в PBS.
    Примечание: Использование наиболее коммерчески доступных монтажа СМИ будут влиять на Флюорофор свойства, делая образца неподобающе для визуализации54ладу. В идеале будет немедленно отражаться клетки, но может остаться на ночь при 4 ° C. Больше ждать раз приведет к ухудшению образца.
  3. Поместите образец в держатель Этап микроскопа для воображения.
  4. Откройте инструмент многомерного приобретения (MDA). Создание последовательных изображений трех каналов: акцептор только возбуждения и выбросов (акцептор канал), доноров возбуждения и акцептор выбросов (ладу канал) и доноров только возбуждения и выбросов (доноров канал).
    Примечание: Существует целый ряд способов изображения ладу образцов. 3 канальный или «три куб» метод визуализации в паре с средствами калибровки системы для измерения эффективности ладу рекомендуется для основанных на ладу напряжение датчиков55,56. Этот подход является быстрый, простой, неразрушающего контроля, требует только стандартный флуоресценции изображения микроскопа и позволяет сравнение экспериментов в разные дни и визуализации установок.
  5. Проверка образца с помощью Выдержка 500 мс и фильтр нейтральной плотности (ND) 10%. Найдите ячейку, выражая напряжение датчика с четкой локализации к структуре интерес.
  6. Выберите время экспозиции 500 мс или нужной длины для каждого изображения канала и ND-фильтр 100% и получить последовательность изображений ладу.
  7. Оценка средней интенсивности датчика внутриклеточных структур интерес в каждом канале, изображений. Низкий сигнал может привести к неточные результаты из-за неправильного коррекции оценок, нелинейным детекторы, или значительный вклад фона сигналов. Приблизительное основного положения состоит в цель для интенсивности выше 10% динамического диапазона камеры (т.е., для 16-разрядной камеры, интенсивность должна быть выше 6000).
    Примечание: Идентичные оптические параметры (время экспозиции, фильтры, цели и других переменных, таких как камеры прибыли или биннинга) должны использоваться для всех ладу экспериментов, которые будут сравниваться. Изменение любого из этих параметров приведет к изменения в количестве ладу, которая является либо созданных и/или обнаружен в микроскопии set-up. Измерения эффективности ладу являются независимыми от эти настройки, но не калибровочные коэффициенты, используемые для определения эффективности ладу. В теории различные наборы калибровочных факторов могут использоваться для создания ладу эффективности из различных оптических параметров, но это не рекомендуется. Отбеливание или Фототоксичность может отличаться между различными параметрами, создавая ложные результаты.
  8. Приобрести второй последовательности изображений ладу же поле зрения. Оценить Фотообесцвечивание между кадрами путем сравнения средней интенсивности датчика в каждом канале, визуализации. Фотообесцвечивание должны быть сведены к минимуму, желательно меньше, чем 1-5% потери сигнала.
  9. Чтобы максимизировать интенсивность при сведении к минимуму Фотообесцвечивание параметры визуализации. Для грубой корректировок измените ND-фильтр, используется во время приобретения. Для тонкой корректировки измените время экспозиции в шагах 250 мс.
  10. Повторите шаги 3.5 – 3.8, до тех пор, пока достаточное сигнала могут быть получены при сведении к минимуму Фотообесцвечивание.
    Примечание: Как правило, параметры для датчика напряжения vinculin в vinculin- / - MEFs являются 1500 мс, 1500 мс и 1000 мс для доноров, ладу и акцептор каналов соответственно. Оптимальные значения будут зависеть от типа системы освещения, цель, наборы фильтров и датчик выражение уровня.

4. Выберите параметры для FRAP изображений

  1. Оптимизируйте настройки лазер для обеспечения полного отбеливания региона интерес (ROI) без отбеливания окрестности или вызывая фотоповреждения.
    1. Исправьте один из создаваемых образцов клеток, выражая напряжение датчика с параформальдегида 4% за 10 мин.
      Примечание: Эта оптимизация не зависит от динамики белков, и фиксированной выборки позволяет максимальное время обработки изображений не беспокоясь о здоровье клеток. Это также позволит предотвратить восстановление отбеливание мобильных белков, позволяя для изоляции эффект отбеливания, избегая каких-либо эффектов от быстрого, Диффузия опосредованной флуоресценции восстановления, происходящих между случаев обесцвечивания и принимая первый пост отбеливатель изображение.
      Предупреждение: Параформальдегида решения являются токсичными. Этот шаг должен выполняться в зонта и решение следует утилизировать согласно институциональной политики.
    2. Промойте образца 3 раза с PBS и оставить в PBS.
      Примечание: Использование наиболее коммерчески доступных монтажа СМИ будут влиять на свойства Флюорофор, делая образца неподобающе для визуализации54FRAP. В идеале будет немедленно отражаться клетки, но может остаться на ночь при 4 ° C. Больше ждать раз приведет к ухудшению образца.
    3. Поместите образец в держатель Этап микроскопа для воображения.
    4. Откройте окно конфигурации лазера. Начните с установки лазерной продолжительность 1000 МКС и 10 импульсов, означает, что каждое пятно в сканирования через ROI будет получать 10.000 мкСм полной мощности лазера
      Примечание: 500 МВт, 515 нм лазер используется для отбеливания. Это был выбран, чтобы выборочно отбеливателем Венера A206K, акцептора в vinculin напряжение датчика, с максимальной эффективностью. Если используются датчики на основе ладу напряженности с другими флуоресцентных белков, другой тип лазера может потребоваться быть использованы.
    5. Найдите ячейку, выражая напряжение датчика с четкой локализации к структуре интерес и приобрести изображение.
    6. Нарисуйте прямоугольный ROI изложением отбеливателя и ROI расположение магазина. Импульсный лазер. Защелкните другое изображение образца.
      Примечание: Размер коробки должно быть примерно размер всей Англии. Следует позаботиться что размер коробки не сильно варьироваться через эксперименты. Отбеленная области должны тщательно контролироваться в белках, динамика которого страдают от диффузии. Это потенциальную обеспокоенность в трансмембранные белки, такие как cadherins47, или белков, которые медленно диффузного27,57.
    7. Проверьте качество Фотообесцвечивание, установив, что весь ROI отбеливают таким образом, что интенсивность находится вблизи фоновых уровней. Кроме того убедитесь, что существует не отбеливания вне ROI.
    8. Настройте параметры лазера, необходимы для достижения значительное количество отбеливания в ROI, не вызывая значительных отбеливания вне ROI. Для грубой корректировок поднять и снизить время жить в шагах 100 МКС и точную регулировку, поднимать и опускать количество импульсов в шаги 5 импульсов.
    9. Повторите шаги 4.1.5 – 4.1.8 до достижения минимальные параметры, на которые ROI полностью отбеленной без мимо Фотообесцвечивание.
      Примечание: Достижение существенного начальное значение отбеливания не вызывая Фототоксичность является ключевым аспектом FRAP анализа. Используйте параметры лазера, которые приводят к полной отбеливатель в фиксированных выборок. В целом минимальное количество фотонов должны использоваться для достижения желаемого уровня отбеливания. Кроме того отбеливание протокол должны храниться относительно постоянной во время экспериментов, как изменения могут повлиять на измерение динамики белков58.
  2. Оптимизируйте покадровой параметры полностью захватить динамику протеина интереса при сведении к минимуму Фотообесцвечивание.
    1. Подготовьте set-up микроскопии изображений живых клеток, желательно с подогревом стадии и цели, а также CO2 элемента управления. Позволяет сбалансировать за 20 мин.
      Примечание: Для поддержания здоровья образа клеток, температуры и рН должна поддерживаться в визуализации судна. Разнообразные подогревом этапов и объективных нагреватели может легко поддерживать клетки температуре 37 ° C. Контроль pH для многих типов носителей может быть достигнуто с использованием перистальтического насоса на перевал увлажняется 5% CO2 над образца в 15 мл/мин в качестве альтернативы, если CO2 управления недоступен, живой изображений СМИ, содержащие HEPES должны использоваться для предотвращение изменений больших рН.
    2. Разместите один из создаваемых образцов клеток, выражая напряжение датчика в держатель Этап микроскопа для изображений. Позволяет сбалансировать за 10 мин.
    3. Используя средство MDA, настроить промежуток времени приобрести 3-5 изображений предварительно отбеливателя, Блич ROI и продолжать принимать 10-60 изображений.
      Примечание: Для vinculin в ФАС, изображения каждые 5 s для 5 мин после отбеливатель достаточно для наблюдения за динамикой без введения чрезмерное отбеливание31. В литературе47,48,,5960можно найти полезные отправные точки для визуализации стоимость и продолжительность для многих других белков.
    4. Используйте акцептора визуализации параметров, которые сводят к минимуму воздействие образца света, при сохранении достаточной соотношение сигнал шум, чтобы изображение структуры интереса. Хорошей отправной точкой является половина ND фильтр и выдержка времени, необходимого для визуализации акцептор в ладу.
    5. Найдите ячейку, выражая напряжение датчика с четкой локализации к структуре интерес и snap изображение.
    6. Рисование прямоугольных ROI для выделения где отбеливателя и ROI расположение магазина. Инициируйте промежуток времени.
    7. Просмотрите результирующий набор изображений для потенциальных проблем.
      1. Если есть существенные прыжков, (больше чем 10% от первоначальных интенсивности) в флуоресценции восстановления между кадрами, сократить время шаг, между кадрами.
      2. Если существует значительная потеря глобального флуоресценции со временем (больше чем 5-10% от первоначальных интенсивности), уменьшить количество изображений, снятых после отбеливатель и/или изменить настройки изображений для уменьшения воздействия образца к свету.
      3. Если флуоресценции восстановления не перестала расти к концу покадровой, увеличьте протяженность промежуток времени.
    8. Соответствующим образом скорректировать покадровой параметры и повторите шаги 4.2.5 – 4.2.7 до восстановления флуоресценции адекватно захвачен без глобальных фото повреждения образца.

5. приобрести FRAP ладу данных

  1. Подготовьте set-up микроскопии изображений живых клеток, желательно с подогревом стадии и цели, а также CO2 элемента управления. Позволяет сбалансировать за 20 мин.
    1. Для обеспечения здоровья образа клеток, поддержания температуры при 37 ° C в тепловизионной камере. Использование Перистальтический насос пройти увлажняется 5% CO2 над образца в 15 мл/мин для поддержания рН.
    2. Кроме того если CO2 управления недоступна, используйте живой изображений СМИ, содержащие HEPES для предотвращения от изменения больших рН.
  2. Открыть инструмент MDA и установить с ладу визуализации параметров, включая наборы различных фильтров.
  3. Сохраните этот MDA в экспериментальной папку с именем MDA_FRET_Date.
  4. Настроить другой MDA с FRAP, визуализации параметров, включая наборы различных фильтров, покадровой настройки и журнал импульсный лазер после приобретения предварительно отбеливатель.
  5. Сохраните этот MDA в экспериментальной папку с именем MDA_FRAP_Date. Закройте окно MDA.
  6. В панели инструментов в верхней части экрана, выберите Журнал | Начать запись.
  7. Открыть окна MDA, загрузить состояние MDA_FRET_Date и нажмите кнопку получить. Затем загрузить состояние MDA_FRAP_Date и нажмите кнопку получить.
  8. В конце приобретения, на панели инструментов в верхней части экрана, выберите Журнал | Остановить запись.
  9. Сохранить этот журнал экспериментальной папку с именем FRETFRAP_Date и добавьте его на панель инструментов для легкого доступа. Закройте окно MDA.
  10. Разместите один из создаваемых образцов клеток, выражая напряжение датчика в Микроскоп держатель для изображений. Позволяет сбалансировать за 10 мин.
  11. Перемещения образца с помощью захвата изображений под приобретать | Приобрести с минимальным воздействием времени и ND фильтр для выявления клеток интерес.
  12. Установите вспышку, перейдя в устройства | Фокус. Вручную фокус на образце до достижения правильного изображения плоскости.
  13. Щелкните Задать непрерывное внимание, ждать для настройки системы и нажмите кнопку Начать непрерывный упором.
    Примечание: Это не является обязательным, но значительно улучшает качество кривых восстановления FRAP, потому что она предотвращает образца дрейфующих вне фокуса.
  14. Найдите ячейку, выражая напряжение датчика с четкой локализации к структуре интерес и snap изображение.
  15. Рисование прямоугольных ROI для выделения где отбеливателем. ROI расположение магазина.
  16. Инициализируйте журнал FRETFRAP_Date , который начнется приобретение ладу изображения после инициализации FRAP промежуток времени.
  17. Повторите шаги 5.14-5.16 приобрел 10-15 наборов изображений.
    Примечание: Измерение не может повторяться в той же ячейке. После того, как происходит Фотообесцвечивание, ладу данные ненадежны.

6. анализ данных, FRAP ладу

  1. Анализ изображения ладу, с помощью программного обеспечения по выбору.
    Примечание: Существует несколько способов изображения и quantitate ладу61, включая ratiometric ладу62 и ладу индекс34,35. Однако настоятельно рекомендуется использовать оценки ЛАДА эффективности55,63 для интерпретации данных, FRAP ладу. Смотрите обсуждение для дальнейшего изучения этой темы. Для сенсибилизированных выбросов и расчет эффективности ладу заказного программного обеспечения доступен из лаборатории Хоффман на https://gitlab.oit.duke.edu/HoffmanLab-Public.
  2. Определить соответствующие параметры для каждой субцеллюлярные структуры, которая была суровая. Это должно включать средний ладу индекс/эффективности и средний первоначальный акцептора интенсивности (пропорционально концентрации), но могут также включать физические параметры, такие как размер Руа.
  3. Анализ изображения FRAP, с помощью программного обеспечения по выбору.
    Примечание: Существует несколько способов, чтобы quantitate FRAP26,27,,2829. Основные экспериментальные проблемы включают бухгалтерского учета для отбеливания во время после отбеливатель, изображений, изменения в интенсивности фон и транслокации высокодинамичные внутриклеточных структур, таких как фокуса спайки. Отбеливание, исправления и изменения в фоновой подсветки может быть достигнуто путем анализа Неотбеленная и не люминесцентные областей изображения. Высокодинамичный внутриклеточных структур, особенно показаны чрезмерного роста или разборки динамика несовместимы с стандартным FRAP анализы и не должны быть проанализированы. Кроме того существует целый ряд способов нормализовать данные. Предоставленные руководящие принципы предназначены для простой анализ.
  4. Исправьте данные восстановления для отбеливания эффекты и затем нормализовать предварительно отбелить интенсивности. Количественно половина время восстановления и мобильных дроби согласно следующим уравнением28,34:
    MF - (MF - Ro) e-kt
    где MF мобильных дроби, Ro является первоначального восстановления, и k — это скорость восстановления. Половина время восстановления определяется:
    1/2 τ = ln/2К.
    Примечание: Существует целый ряд публично имеющиеся программные пакеты для завершения этих анализов64 , а также целый ряд плагинов ImageJ. Пользовательское программное обеспечение доступно из лаборатории Хоффман на https://gitlab.oit.duke.edu/HoffmanLab-Public. Дополнительные анализы должны использоваться для ситуаций, когда распространение влияет на динамику протеина интереса, несколько шкал времени проявляются в восстановление, или используются нестандартные отбеливания геометрии.

7. интерпретации данных, FRAP ладу

  1. Собирать соответствующую информацию для каждого ROI, в том числе: лад индекс/эффективности, акцептора интенсивности, FRAP тайм, FRAP мобильных дроби.
    Примечание: Индекс лад или эффективность используется для определения средней нагрузки через белка в ROI. Акцептор интенсивности мер местными концентрация белка. Половина время восстановления является показателем динамики белков. Меньше половины времени указывает более быстрого оборота. FRAP мобильных фракция измеряет количество белка в ROI, который активно переворачивая. Крупных мобильных фракция указывает, что больший процент белка в ROI переворачивая.
  2. Зонда эффект местных концентрации белка текучести и суммы, участок FRAP тайм и мобильных фракция против первоначального акцептора интенсивности.
  3. Зонда эффект белка нагрузки на белок текучести и суммы, участок FRAP тайм и мобильных фракция против ладу индекс/эффективности.
    Примечание: В зависимости от белка или структуры, она может также быть интересно изучить последствия физических параметров, таких как размер структуры или эксцентриситет, белок нагрузки или оборота.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ЛАД-FRAP состоит из комбинации двух люминесцентные методы, Лада и FRAP. Как мы сосредоточены на эффекты белка нагрузки, мы использовали на основе ладу напряжение датчиков34,46. Эти датчики часто основаны на напряжение зондирования модуль, состоящий из двух флуоресцентных белков, таких как mTFP1 и VenusA206K, соединены flagelliform компоновщик (рис. 1A). Когда модуль помещается между головой и хвостом домены белка, это можно измерить нагрузке, передаваемой через белка. При анализе данных ладу, снимки, сделанные в акцепторной канала используются для оценки локализации датчик напряжения и концентрации, как этот сигнал является независимым от ладу (рис. 1B). После расчета эффективности ладу белок нагрузки могут быть визуализированы колориметрические масштабе, где уменьшение эффективности ладу кулер цветами свидетельствует увеличение нагрузки белка, и эффективность лад в красном диапазоне указывают низкопротеиновое нагрузки ( Рисунок 1B). FRAP изображений осуществляется с помощью лазера для отбеливания акцепторной Флюорофор в единый субцеллюлярные монитора и структуры восстановления с течением времени (рис. 1 c). Результирующая кривая нормализованных FRAP могут быть проанализированы для извлечения параметров, описывающих динамику белков, включая половина время восстановления и мобильных дроби (рис. 1 d). Потому что ладу и FRAP анализы на той же ячейке, средняя белка нагрузка и оборот в структуре субцеллюлярные может отображаться как один момент. Визуализации несколько ячеек дает несколько точек и зарождающуюся тенденцию можно указать, является ли белок дестабилизировали (Рисунок 1E) или стабилизированный молекулярной нагрузки (Рисунок 1F).

Датчик напряжения vinculin (VinTS), стабильно выражена в vinculin null MEFs очень четко локализуется в ФАС распространилась по всей клетке, как видно, глядя на изображение канала акцептора (рисунок 2A). Акцептор канал изображение используется для создания маски сегментации, который идентифицирует каждого индивидуального FA с уникальным идентификатором, визуально, назначенные различными цветами (рис. 2B). Алгоритм сегментации основан на методе «вода» и этикетки ФАС примерно в порядок яркость, как описано в34,65. Сегментации результаты преобразуются в двоичный маска, которая затем применяется к результатам эффективности ладу (рис. 2 c), и рассчитывается средняя эффективность лад в пределах каждой уникальной FA (Рисунок 2D). Дополнительные свойства могут рассчитываться для каждой ОС в Аналогичным образом, включая интенсивность средняя акцептор, размер, эксцентриситет и расположение в пределах ячейки. Таким образом, какой ОС выбирается для FRAP может соответствовать уникальный идентификатор Англии и связанные с ними свойства.

FRAP изображений и анализ чувствителен к несколько факторов, которые могут быть под контролем, включая лазерные и визуализации параметров, и некоторые факторы, которые не могут контролироваться, как общая Англии стабильности26,27,28, 29. Например слишком много воздействием света во время промежуток времени изображений может привести к основным вопросам интерпретации данных FRAP. Хотя анализ управления ФАС, которые не отбелили могут быть использованы для нормализации для незначительных Фотообесцвечивание со временем, с слишком много воздействием образца свет, результирующая кривая FRAP показывает первоначального восстановления, последующим купанием в нормализованной интенсивности, не может быть точно соответствуют экспоненциальной функции. Если этот эффект постоянно наблюдается в данных, необходимо повторно оптимизировать параметры визуализации либо уменьшить время экспозиции, увеличить время шаг между кадрами изображения, или уменьшить длину промежуток времени для снижения воздействия образца к свету.

Еще один пример данных FRAP нечитаемое, когда Англии, что было photobleached translocates быстро во время восстановления28. Показательным примером чрезмерной транслокации показан на рисунке 3. Исходное изображение, где выбираются трансформирования, не дают указание Англии стабильности (рис. 3A). Мониторинг отбеленной FA с течением времени, она быстро движется от первоначальной позиции и автоматизированного отслеживания не может следовать непосредственно за из-за низкой флуоресцентного сигнала, после Фотообесцвечивание (рис. 3A). Результирующая кривая FRAP показывает, что первоначальный этап небольшое восстановление с прыжок когда флюоресценция быть восстановлены достаточно для программного обеспечения для обнаружения фа и переместить ROI (рис. 3B). Эта кривая не может поместиться успешно экспоненциальной функцией. Быстрое транслокации FA также предполагает, что структура Англии является нестабильным. Таким образом нестабильная ФАС не должны включаться в тот же FRAP ладу анализ как стабильная ФАС, из-за технических и биологических проблем.

С удовлетворительных данных ладу и FRAP следующий шаг завершает анализ ладу-FRAP одновременно оценки нагрузки протеина и динамику. На рисунке 4A показывает ладу эффективности карты три vinculin null MEFs стабильно выражения VinTS. ФАС, изложенные в белой были выбраны для анализа FRAP, и интенсивности акцептора показываются со временем. Эти три ФАС у vinculin под различное количество загрузки и отображения различных vinculin восстановления профиля. Количественная оценка этих свойств путем расчета половина время восстановления и заговоре против средняя эффективность лад в каждом FA демонстрирует общую тенденцию vinculin, стабилизируемых путем увеличения нагрузки (рис. 4B). Однако мобильные дроби, заговор против ладу эффективность показывает не тенденция, предполагая, что мобильные фракция не регулируется молекулярной нагрузки (рис. 4 c). Представляя Точечная мутация в VinTS на аминокислоты 50 (A50I) было показано, чтобы предотвратить vinculin привязки для привязки основных партнера в ФАС, Талин66. Изменения этого взаимодействия протеин протеина влияет на vinculin силы учитывающих динамику. Vinculin значение null MEFs стабильно выражая VinTS A50I имеют разные ячейки и FA морфологии, различные vinculin загрузки профилей и различные vinculin динамика (рис. 4 d). Количественной оценки раза восстановления и эффективность ладу и заговоре показывает, что когда нарушается взаимодействие vinculin Талин, vinculin в ФАС дестабилизированы повышенной нагрузки (Рисунок 4E) в то время как мобильные фракция не тенденция (Рисунок 4F ).

Figure 1
Рисунок 1: принципы Лада-FRAP техники. (A) схема на основе ладу напряжение датчик модуля (TSMod) вставляется в протеин интереса и эффект напряженности на ладу сигнала. (B) для количественного определения ладу с использованием сенсибилизированных выбросов, изображения взяты захвата сигнала доноров (не показан), акцептора сигнала и сигнала ладу. С соответствующие исправления ладу изображение может быть назначен колориметрические масштаба для визуализации, сколько напряженности применяется к датчику. (C) FRAP проводится с использованием акцептора сигнала, которая прямо пропорциональна концентрации. (D) FRAP визуализации анализа производит кривые интенсивности флуоресценции со временем, который может быть установлен с помощью математических моделей для определения динамики белков. (E, F) Когда объединяются ладу и FRAP, силы и оборот в одной ОС могут быть измерены. Измерения нескольких ФАС в несколько ячеек дает отношения между нагрузкой белка и протеина оборот. В этом анализе отношения в которых повышенная нагрузка коррелирует с увеличение товарооборота именуется как силы дестабилизировали государства (E). В этом анализе отношения, в которых повышенная нагрузка коррелирует с снижение оборота называется силой стабилизированный государства (F). Эта цифра была изменена от Ротенберг и др. 37. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: FA идентификации и анализа ладу. (A vinculin null MEF, выражая визуализирована в акцепторной канале, где интенсивность указывает местных концентрация vinculin VinTS. Шкалы бар = 30 мкм. (B) ФАС сегментированы основе акцептора канал для создания маски FA ID, где каждый Обладатель назначается уникальный идентификатор, здесь показано как разные цвета, примерно в порядок яркость. (C Англии ID маска преобразуется в двоичный маску и применяется к изображению эффективности ладу Показать значения эффективности ладу только в ФАС. (D лад эффективности в рамках каждой FA среднем получить одно значение для каждой ОС, который связан с идентификатором Англии в таблице данных вывода. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: пример translocating ОС. (A vinculin null MEF, выражая VinTS A50I, мутант датчик визуализируется в акцепторной канале, с таблицей цветов Перевернутый для ясности. Шкалы бар = 30 мкм. Англии, изложенные в черном был выбран для отбеливания. Детализированного изображения показывают FA прогрессии со временем с красным контуром, указывающее, где программное обеспечение определены FA. Шкалы бар = 2 мкм. (B) результирующая кривая нормализованных FRAP от данных в (A). Есть примерно 5% скачок в интенсивности следующие точки 3 результате translocating быстро FA до достаточного восстановления программного обеспечения для обнаружения изменения в расположении FA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: представитель ладу-FRAP результаты. (A) Vinculin null MEFs выражая VinTS, отображается как средняя эффективность изображения ладу всей ячейки (шкалы бар = 30 мкм) с увеличенной в Перевернутый акцептора канал изображения показаны FRAP восстановления прогрессии (шкала бар = 2 мкм). (B) FRAP половина время восстановления заговор против ладу эффективности для 32 ячеек, с точки, представляющие клетки в (A) выделены красным цветом. (C) FRAP мобильных фракция заговор против ладу эффективности для тех же ячейках (b). (D) Vinculin null MEFs выражая VinTS A50I мутант датчика отображается как средняя эффективность изображения ладу всей ячейки (шкалы бар = 30 мкм) с увеличенной в Перевернутый акцептора канал изображения показаны FRAP восстановления прогрессии (шкала бар = 2 мкм). (E) FRAP половина время восстановления, заговор против ладу эффективности для 21 клетки, с точки, представляющие клетки в (D) выделены красным цветом. (F) FRAP мобильных дроби, заговор против ладу эффективность же ячеек (E). Данные были первоначально опубликованы в Ротенберг и др. 37 и являются здесь визуализирована в новом формате. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ЛАД-FRAP метод позволяет для прямого измерения динамики белков чувствительных к силе, свойство, которое было трудно непосредственно зонд внутри живых клеток. Чувствительность динамики белков в молекулярных нагрузки имеет решающее значение для функции белка как силы передатчик или датчика. Загрузка не требуется для передачи как внутренне созданные и внешне применяется силы, называется mechanotransmission, а для преобразования этих сил в биохимически обнаружить сигналы, называется mechanotransduction. Однако изменения нагрузки может повлиять на продолжительность, что белок остается связанной, таким образом, чем меньше время белок тратит нагрузка, тем меньше шансов, что силы должен быть передан другие белки или преобразованы в биохимически обнаружить сигнал и почувствовал. ЛАД-FRAP метод ликвидирует разрыв между молекулярном и клеточном уровне, позволяя молекулярно шкала измерения силы чувствительных динамики для доступа в более широком контексте сотовой. Кроме того она позволяет для этих измерений быть приняты во время нарушается внутриклеточных или внеклеточных среды механически или биохимически. Эта техника должны быть применимы к любой датчик напряженности на основе ладу, позволяя для расследования белка механические государства в различных внутриклеточных структур и внеклеточной контекстах.

Важнейшие шаги в обеспечении, которые получаются нужный лад-FRAP измерения включают оптимизации параметров визуализации и выполнения анализа и интерпретации данных. Оптимизацию параметров, изображений, как описано в рамках протокола, необходимо ограничить фотоповреждения образца, позволяя при этом для желаемой структуры и динамики следует отличать и для достаточного сигнала для расчета ладу. Создание этих изображений параметров для конкретной клеточной линии и протеин интереса на раннем этапе будет способствовать прямое сравнение между различными экспериментальных групп. Стоит отметить, что изменения в системе, таких как мутирует протеина интереса или введения ингибиторов, может привести к изменениям в локализации протеина (тем самым изменяя интенсивность сигнала) и динамике. Оптимизированные параметры должны позволить четких, точных измерений во всех экспериментальных условиях. Поэтому рекомендуется выбрать параметры, которые не в крайней конце быть полезным, например, в состоянии различать едва сигнала от шума.

В то время как изображения в этот протокол был описан для эпифлуоресцентного микроскопа и прилагаемый FRAP лазерный модуль, Лада-FRAP применимы для других систем тепловидения. Например этот метод может быть адаптирована к линии сканирование конфокальные микроскопы, а также спиннинг диск конфокальные микроскопы с модулем вложенное Фотообесцвечивание. Параметры обработки изображений должны быть оптимизированы в аналогичных моды для достижения адекватного сигнал шум не вызывая фотоповреждения или чрезмерного Фотообесцвечивание. Особенно касается ладу изображений, высокой квантовой эффективности детекторы необходимы для получения достаточного сигнала для успешного ладу расчета не вызывая повреждение Флюорофор. Существует ряд публикаций, описывающие отдельные лад или FRAP изображений, используя Конфокальный микроскоп67,68,69, который может использоваться для руководства оптимизация для Лада-FRAP изображений.

После эксперимента анализ данных следует рассматривать осторожно и воспроизводимость, предпочтительно автоматизированной, образом. Из-за неспособности отбеливателем внутриклеточных регионов более чем 2-3 в одиночной камере до отбеливания слишком много из доступного пула белка, пропускная способность этой техники является относительно ограниченной. Таким образом через несколько дней изображений, требует последовательной обработки данных часто объединяются наборы данных. ЛАДУ и FRAP предлагают проблемы с анализом данных. Индекс ладу и измерения эффективности ладу позволяют для количественного определения белка нагрузки. ЛАДУ индекс является относительной мерой, которая сильно зависит от параметров микроскопа, в то время как Лада измерения эффективности являются абсолютными и независимыми от Микроскоп параметры55,70. Недавно мы показали, что ранее разработанного метода, с помощью изображений «три куб» может использоваться для определения эффективности МУЧИТЬСЯ от измерения сенсибилизированных выбросов, которые обычно количественно с ЛАДАМИ индекса при использовании основанных на ладу напряжение датчиков56 . Если измерения абсолютной силы опыт напряжение датчики должны быть вычисляемых34требуются измерения эффективности ладу. Клетки, выражая датчики на основе ладу напряженности, особенно стабильная клетки на высокий проход чисел, могут перекомбинировать или ухудшить датчики, ведущих к непригодным ладу данных50. Это легко определить, когда расчет соотношения донорно акцепторной во время расчета ладу эффективности37,56 , но может быть труднее обнаружить с помощью индекса ладу. Когда начиная с датчиком на основе ладу напряженности, это может быть полезно для получения большой набор данных (> 50 клеток) только ладу данных для конструкций, представляющих интерес для определения эффективности ожидаемый диапазон ладу. Кроме того FRAP данные могут быть трудно извлечь из структур, которые являются очень подвижны, таких как FAs, которые быстро скольжения или разборки. При выборе субпопуляции структур или оптимизации условий покрытие ячейки для уменьшения этого эффекта может помочь свести к минимуму эту проблему.

В концепции FRAP лад может применяться любой датчик на основе ладу в любом регионе субклеточном, с правильной оптимизации. На практике это может быть трудно захватить силы учитывающих динамику белков, которые не под значительные механические нагрузки или имеют раза восстановления на очень короткие сроки несколько секунд или на длинные сроки десятки минут. Результаты исследований сингл молекула может указывать на белки, которые могут продемонстрировать силу учитывающих динамику в живых клеток. До настоящего времени это включает в себя много FA и AJ белки13,14,,1516 , а также некоторые цитоскелетных элементов71,72,73. Случайно основанные на ладу датчики разработаны для многих из этих белков46. Эти результаты могут определять выбор протеин интереса; Однако не следует ожидать, что ладу-FRAP данных точно будет отражать результаты этих исследований одной молекулы. В самом деле биохимические регулирования, взаимодействия с другими белками и местные цитоскелета структура может скрывать и не изменять, влияние сил на белок белковых взаимодействий. Способность наблюдать эти сложности является уникальная прочность FRAP ладу подхода.

Сочетание манипуляций в ячейку и протеина интереса может использоваться для выяснения важных факторов в регулировании динамики белков. Например это может быть полезно иметь датчик, который силы-без учета, либо путем удаления или мутация35,силы привязки в домен74 , как не должно быть никакой зависимости от динамики оборота белка силы, сообщает датчик. Кроме того мутации других критических привязки сайтов или сайтов фосфорилирования протеина может обеспечить более полную картину как регулируется протеина интереса. Внесение глобальных изменений в ячейку или окружающей среде через цитоскелета ингибиторы или изменяя свойства субстрата (ex. внеклеточная матрица или скованность), соответственно, может помочь определить, как силы учитывающих динамику белка реагировать механические возмущения. Объединяя информацию о белка нагрузки и силы учитывающих динамику с другими биофизические свойства белка может помочь создать механического состояния протеина интереса. Это может включать локализации и местные белок белковых взаимодействий в рамках субцеллюлярные структуры75,76. Кроме того белок может проживать в государствах различные конформации, даже в пределах одной субцеллюлярные структуры, в зависимости от контекста76,77. Белка нагрузки, динамика, локализации и конформации могут все быть одновременно затронуты создается внутренне и внешне применяется силами37,,7678,79, диктуя роль белка в силу передачи и mechanotransduction. Универсальность метода FRAP ладу и ее потенциальные совместимости с различными белков и манипуляции должны позволить разяснения взаимодействия механики сыпучих, динамики белков и mechanosensitive сигнализации.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана национальной науки фонд CAREER Award (NSF-CMMI-14-54257) а также гранты от Американской ассоциации сердца (16GRNT30930019) и национальных институтов здравоохранения (R01GM121739-01) присуждена д-р Хоффман Брентон и национального Наука фонд исследовательских стипендий присуждена Кэтрин Ротенберг. Содержание является исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения NSF или низ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin-EDTA Thermo Fisher 25300062
16% Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 30525-89-4
60x Objective NA1.35 Olympus UPLSAPO 60XO
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) Gibco 15240-062
Automated Stage Prior Scientific H117EIX3
Custom Dichroic Mirror Chroma Technology Corp T450/514rpc
Custom mTFP1 Emission Filter Chroma Technology Corp ET485/20m
Custom mTFP1 Excitation Filter Chroma Technology Corp ET450/30x
Custom Venus Excitation Filter Chroma Technology Corp ET514/10x
DMEM-gfp Live Cell Visualization Medium Sapphire MC102
Dulbecco's Modified Eagle's Medium  Sigma Aldrich D5796 with L-glutamine and sodium bicarbonate
Fetal Bovine Serum HyClone SH30396.03
Fibronectin, Human Corning 47743-654
FRAPPA Calibration Slide Andor provided along with FRAPPA unit
FRAPPA System with 515 nm Laser Andor
Glass-bottomed Fluoro Dishes World Precision Instruments FD35
HEK293-T Cells ATCC CRL-3216
Hexadimethrine Bromide, Polybrene Sigma Aldrich H9268-5G
High-glucose Dulbecco's Modified Eagle's Medium Sigma Aldrich D6429
Inverted Fluorescent Microscope Olympus IX83
JMP Pro Software SAS
Lambda 10-3 Motorized Filter Wheels Sutter Instruments LB10-NW
LambdaLS Arc Lamp with 300W Ozone-Free Xenon Bulb Sutter Instruments LS/OF30
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-027
MATLAB Software Mathworks
MEM Non-Essential Amino Acids Thermo Fisher 11140050
MetaMorph for Olympus Olympus
Micro-Humidification System Bioptechs 130708
MoFlo Astrios EQ Cell Sorter Beckman Coulter B25982
Objective Heater Medium Bioptechs 150819-13
OptiMEM Thermo Fisher 31985070
Phosphate Buffered Saline Sigma Aldrich D8537
pMD2.G Envelope Plasmid Addgene 12259
pRRL Vector gift from Dr. Kam Leong (Columbia University)
psPax2 Packaging Plasmid Addgene 12260
sCMOS ORCA-Flash4.0 V2 Camera Hamamatsu Photonics C11440-22CU
Sorvall Legend XT/XF Centrifuge Thermo Fisher 75004505
Stable Z Stage Warmer Bioptechs 403-1926
Venus Emission Filter Semrock FF01-571/72

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DuFort, C. C., Paszek, M. J., Weaver, V. M. Balancing forces: architectural control of mechanotransduction. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (5), 308-319 (2011).
  2. Mammoto, T., Ingber, D. E. Mechanical control of tissue and organ development. Development. 137 (9), 1407-1420 (2010).
  3. Sun, Y., Chen, C. S., Fu, J. Forcing stem cells to behave: a biophysical perspective of the cellular microenvironment. Annual Review of Biophysics. 41, 519-542 (2012).
  4. Wozniak, M. A., Chen, C. S. Mechanotransduction in development: a growing role for contractility. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (1), 34-43 (2009).
  5. Broders-Bondon, F., Nguyen Ho-Bouldoires, T. H., Fernandez-Sanchez, M. E., Farge, E. Mechanotransduction in tumor progression: The dark side of the force. The Journal of cell biology. 217 (5), 1571-1587 (2018).
  6. Simmons, R. D., Kumar, S., Jo, H. The role of endothelial mechanosensitive genes in atherosclerosis and omics approaches. Archives of Biochemistry and Biophysics. 591, 111-131 (2016).
  7. Wells, R. G. Tissue mechanics and fibrosis. Biochimica et Biophysica Acta. 1832 (7), 884-890 (2013).
  8. Lele, T. P., et al. Mechanical forces alter zyxin unbinding kinetics within focal adhesions of living cells. Journal of Cellular Physiology. 207 (1), 187-194 (2006).
  9. Hoffman, B. D., Grashoff, C., Schwartz, M. A. Dynamic molecular processes mediate cellular mechanotransduction. Nature. 475 (7356), 316-323 (2011).
  10. Dembo, M., Torney, D. C., Saxman, K., Hammer, D. The reaction-limited kinetics of membrane-to-surface adhesion and detachment. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 234 (1274), 55-83 (1988).
  11. LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Hoffman, B. D. Molecular-Scale Tools for Studying Mechanotransduction. Annual Review of Biomedical Engineering. 17, 287-316 (2015).
  12. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
  13. Kong, F., Garcia, A. J., Mould, A. P., Humphries, M. J., Zhu, C. Demonstration of catch bonds between an integrin and its ligand. The Journal of Cell Biology. 185 (7), 1275-1284 (2009).
  14. Rakshit, S., Zhang, Y., Manibog, K., Shafraz, O., Sivasankar, S. Ideal catch, and slip bonds in cadherin adhesion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (46), 18815-18820 (2012).
  15. del Rio, A., et al. Stretching Single Talin Rod Molecules Activates Vinculin Binding. Science. 323 (5914), 638-641 (2009).
  16. Seddiki, R., et al. Force-dependent binding of vinculin to alpha-catenin regulates cell-cell contact stability and collective cell behavior. Molecular Biology of the Cell. 29 (4), 380-388 (2018).
  17. Huang, D. L., Bax, N. A., Buckley, C. D., Weis, W. I., Dunn, A. R. Vinculin forms a directionally asymmetric catch bond with F-actin. Science. 357 (6352), 703-706 (2017).
  18. Chrzanowska-Wodnicka, M., Burridge, K. Rho-stimulated contractility drives the formation of stress fibers and focal adhesions. The Journal of Cell Biology. 133 (6), 1403-1415 (1996).
  19. Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin-cytoskeleton linkages. Cell. 88 (1), 39-48 (1997).
  20. Liu, Z., et al. Mechanical tugging force regulates the size of cell-cell junctions. Proceedings of the National Academy of Science. 107 (22), 9944-9949 (2010).
  21. Riveline, D., et al. Focal contacts as mechanosensors: externally applied local mechanical force induces growth of focal contacts by an mDia1-dependent and ROCK-independent mechanism. The Journal of Cell Biology. 153 (6), 1175-1186 (2001).
  22. Brevier, J., Vallade, M., Riveline, D. Force-extension relationship of cell-cell contacts. Physical Review Letters. 98 (26), 268101 (2007).
  23. Bershadsky, A., Kozlov, M., Geiger, B. Adhesion-mediated mechanosensitivity: a time to experiment, and a time to theorize. Current opinion in cell biology. 18 (5), 472-481 (2006).
  24. Chan, C. E., Odde, D. J. Traction dynamics of filopodia on compliant substrates. Science. 322 (5908), 1687-1691 (2008).
  25. Wu, Z., Plotnikov, S. V., Moalim, A. Y., Waterman, C. M., Liu, J. Two distinct actin networks mediate traction oscillations to confer focal adhesion mechanosensing. Biophysical Journal. 112 (4), 780-794 (2017).
  26. Fritzsche, M., Charras, G. Dissecting protein reaction dynamics in living cells by fluorescence recovery after photobleaching. Nature Protocols. 10 (5), 660-680 (2015).
  27. McNally, J. G. Quantitative FRAP in analysis of molecular binding dynamics in vivo. Methods of Cell Biology. 85, 329-351 (2008).
  28. Wehrle-Haller, B. Analysis of integrin dynamics by fluorescence recovery after photobleaching. Methods in Molecular Biology. 370, 173-202 (2007).
  29. Carisey, A., Stroud, M., Tsang, R., Ballestrem, C. Fluorescence recovery after photobleaching. Methods of Molecular Biology. 769, 387-402 (2011).
  30. Carisey, A., et al. Vinculin regulates the recruitment and release of core focal adhesion proteins in a force-dependent manner. Current Biology. 23 (4), 271-281 (2013).
  31. Wolfenson, H., Bershadsky, A., Henis, Y. I., Geiger, B. Actomyosin-generated tension controls the molecular kinetics of focal adhesions. Journal of Cell Science. 124, 1425-1432 (2011).
  32. Dumbauld, D. W., et al. How vinculin regulates force transmission. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (24), 9788-9793 (2013).
  33. Zaidel-Bar, R., Itzkovitz, S., Ma'ayan, A., Iyengar, R., Geiger, B. Functional atlas of the integrin adhesome. Nature Cell Biology. 9 (8), 858-867 (2007).
  34. Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
  35. LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Berginski, M. E., Urs, A. N., Hoffman, B. D. Construction, imaging, and analysis of FRET-based tension sensors in living cells. Biophysical Methods in Cell Biology. 125, 161-186 (2015).
  36. Meng, F., Suchyna, T. M., Sachs, F. A fluorescence energy transfer-based mechanical stress sensor for specific proteins in situ. The FEBS Journal. 275 (12), 3072-3087 (2008).
  37. Rothenberg, K. E., Scott, D. W., Christoforou, N., Hoffman, B. D. Vinculin Force-Sensitive Dynamics at Focal Adhesions Enable Effective Directed Cell Migration. Biophysical journal. 114 (7), 1680-1694 (2018).
  38. Austen, K., et al. Extracellular rigidity sensing by talin isoform-specific mechanical linkages. Nature Cell Biology. 17 (12), 1597-1606 (2015).
  39. Kumar, A., et al. Talin tension sensor reveals novel features of focal adhesion force transmission and mechanosensitivity. The Journal of Cell Biology. 213 (3), 371-383 (2016).
  40. Acharya, B. R., et al. Mammalian Diaphanous 1 Mediates a Pathway for E-cadherin to Stabilize Epithelial Barriers through Junctional Contractility. Cell Reports. 18 (12), 2854-2867 (2017).
  41. Borghi, N., et al. E-cadherin is under constitutive actomyosin-generated tension that is increased at cell-cell contacts upon externally applied stretch. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (31), 12568-12573 (2012).
  42. Conway, D. E., Williams, M. R., Eskin, S. G., McIntire, L. V. Endothelial cell responses to atheroprone flow are driven by two separate flow components: low time-average shear stress and fluid flow reversal. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298 (2), H367-H374 (2010).
  43. Arsenovic, P. T., et al. Nesprin-2G, a Component of the Nuclear LINC Complex, Is Subject to Myosin-Dependent Tension. Biophysical Journal. 110 (1), 34-43 (2016).
  44. Ye, N., et al. Direct observation of alpha-actinin tension and recruitment at focal adhesions during contact growth. Experimental Cell Research. 327 (1), 57-67 (2014).
  45. Paszek, M. J., et al. The cancer glycocalyx mechanically primes integrin-mediated growth and survival. Nature. 511 (7509), 319-325 (2014).
  46. Gayrard, C., Borghi, N. FRET-based Molecular Tension Microscopy. Methods. 94, 33-42 (2016).
  47. de Beco, S., Gueudry, C., Amblard, F., Coscoy, S. Endocytosis is required for E-cadherin redistribution at mature adherens junctions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (17), 7010-7015 (2009).
  48. Östlund, C., et al. Dynamics and molecular interactions of linker of nucleoskeleton and cytoskeleton (LINC) complex proteins. Journal of Cell Science. 122 (22), 4099-4108 (2009).
  49. Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. The interactions of retroviruses and their hosts. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor (NY). (1997).
  50. Komatsubara, A. T., Matsuda, M., Aoki, K. Quantitative analysis of recombination between YFP and CFP genes of FRET biosensors introduced by lentiviral or retroviral gene transfer). Scientific Reports. 5, 13283 (2015).
  51. Nasri, M., Karimi, A., Farsani, M. A. Production purification and titration of a lentivirus-based vector for gene delivery purposes. Cytotechnology. 66 (6), 1031-1038 (2014).
  52. Addgene, Generating Stable Cell Lines with Lentivirus. , Available from: https://www.addgene.org/protocols/generating-stable-cell-lines (2016).
  53. Roederer, M. Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats. Cytometry: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 45 (3), 194-205 (2001).
  54. Malkani, N., Schmid, J. A. Some secrets of fluorescent proteins: distinct bleaching in various mounting fluids and photoactivation of cyan fluorescent proteins at YFP-excitation. PLoS One. 6 (4), e18586 (2011).
  55. Chen, H., Puhl, H. L. 3rd, Koushik, S. V., Vogel, S. S., Ikeda, S. R. Measurement of FRET efficiency and ratio of donor to acceptor concentration in living cells. Biophysical journal. 91 (5), L39-L41 (2006).
  56. Rothenberg, K. E., Neibart, S. S., LaCroix, A. S., Hoffman, B. D. Controlling Cell Geometry Affects the Spatial Distribution of Load Across Vinculin. Cellular and Molecular Bioengineering. 8 (3), 364-382 (2015).
  57. Carnell, M., Macmillan, A., Whan, R. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP): acquisition, analysis, and applications. Methods of Molecular Biology. 1232, 255-271 (2015).
  58. Trembecka, D. O., Kuzak, M., Dobrucki, J. W. Conditions for using FRAP as a quantitative technique--influence of the bleaching protocol. Cytometry A. 77 (4), 366-370 (2010).
  59. Lavelin, I., et al. Differential effect of actomyosin relaxation on the dynamic properties of focal adhesion proteins. PLoS One. 8 (9), e73549 (2013).
  60. Foote, H. P., Sumigray, K. D., Lechler, T. FRAP analysis reveals stabilization of adhesion structures in the epidermis compared to cultured keratinocytes. PLoS One. 8 (8), e71491 (2013).
  61. Zal, T., Gascoigne, N. R. Photobleaching-corrected FRET efficiency imaging of live cells. Biophysical Journal. 86 (6), 3923-3939 (2004).
  62. Hodgson, L., Shen, F., Hahn, K. Biosensors for characterizing the dynamics of rho family GTPases in living cells. Current Protocols in Cell Biology. 46 (1), (2010).
  63. Day, R. N. Measuring protein interactions using Förster resonance energy transfer and fluorescence lifetime imaging microscopy. Methods. 66 (2), 200-207 (2014).
  64. Rapsomaniki, M. A., et al. easyFRAP: an interactive, easy-to-use tool for qualitative and quantitative analysis of FRAP data. Bioinformatics. 28 (13), 1800-1801 (2012).
  65. Zamir, E., et al. Molecular diversity of cell-matrix adhesions. Journal of cell science. 112 (11), 1655-1669 (1999).
  66. Bakolitsa, C., et al. Structural basis for vinculin activation at sites of cell adhesion. Nature. 430 (6999), 583-586 (2004).
  67. De Los Santos, C., Chang, C. W., Mycek, M. A., Cardullo, R. FRAP, FLIM, and FRET: Detection and analysis of cellular dynamics on a molecular scale using fluorescence microscopy. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 587-604 (2015).
  68. Periasamy, A., Wallrabe, H., Chen, Y., Barroso, M. Chapter 22: Quantitation of protein-protein interactions: confocal FRET microscopy. Methods in Cell Biology. 89, 569-598 (2008).
  69. Stehbens, S., Pemble, H., Murrow, L., Wittmann, T. Imaging intracellular protein dynamics by spinning disk confocal microscopy. Methods in Enzymology. , 293-313 (2012).
  70. Zeug, A., Woehler, A., Neher, E., Ponimaskin, E. G. Quantitative intensity-based FRET approaches--a comparative snapshot. Biophysical Journal. 103 (9), 1821-1827 (2012).
  71. Ehrlicher, A. J., Nakamura, F., Hartwig, J. H., Weitz, D. A., Stossel, T. P. Mechanical strain in actin networks regulates FilGAP and integrin binding to filamin A. Nature. 478 (7368), 260-263 (2011).
  72. Guo, B., Guilford, W. H. Mechanics of actomyosin bonds in different nucleotide states are tuned to muscle contraction. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (26), 9844-9849 (2006).
  73. Lee, C. Y., et al. Actin depolymerization under force is governed by lysine 113:glutamic acid 195-mediated catch-slip bonds. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (13), 5022-5027 (2013).
  74. Cost, A. L., Ringer, P., Chrostek-Grashoff, A., Grashoff, C. How to Measure Molecular Forces in Cells: A Guide to Evaluating Genetically-Encoded FRET-Based Tension Sensors. Cellular and Molecular Bioengineering. 8 (1), 96-105 (2015).
  75. Bertocchi, C., et al. Nanoscale architecture of cadherin-based cell adhesions. Nature Cell Biology. 19 (1), 28-37 (2017).
  76. Case, L. B., et al. Molecular mechanism of vinculin activation and nanoscale spatial organization in focal adhesions. Nature Cell Biology. 17 (7), 880-892 (2015).
  77. Chen, H., Cohen, D. M., Choudhury, D. M., Kioka, N., Craig, S. W. Spatial distribution and functional significance of activated vinculin in living cells. The Journal of Cell Biology. 169 (3), 459-470 (2005).
  78. Kim, T. J., et al. Dynamic visualization of alpha-catenin reveals rapid, reversible conformation switching between tension states. Current Biology. 25 (2), 218-224 (2015).
  79. Yao, M., et al. Mechanical activation of vinculin binding to talin locks talin in an unfolded conformation. Scientific reports. 4, 4610 (2014).

Tags

Биоинженерия выпуск 141 Mechanobiology mechanotransduction биофизики основанные на ладу напряжение датчиков FRAP динамика белков чувствительных к силе
Измерение силы чувствительных белка динамики в живых клетках, используя комбинацию люминесцентные методы
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rothenberg, K. E., Puranam, I.,… More

Rothenberg, K. E., Puranam, I., Hoffman, B. D. Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques. J. Vis. Exp. (141), e58619, doi:10.3791/58619 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter