Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Bioengineering

Mätning av kraft-känsliga Protein Dynamics i levande celler med hjälp av en kombination av fluorescerande tekniker

doi: 10.3791/58619 Published: November 2, 2018

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för samtidig användning av Förster resonans energi överföring-baserade spänning sensorer för att mäta protein belastning och fluorescens återhämtning efter fotoblekning att mäta protein dynamics möjliggör mätning av kraft-känslig protein dynamiken inom levande celler.

Abstract

Celler känna och reagera på fysiska ledtrådar i deras miljö genom att omvandla mekanisk stimuli till biokemiskt-detectable signaler i en process som kallas mechanotransduction. Ett avgörande steg i mechanotransduction är överföringen av krafter mellan de yttre och inre miljöerna. Att överföra krafter, det måste finnas en ihållande, obruten fysisk koppling som skapas av en serie av protein-protein interaktioner. För ett visst protein-protein interaktioner, mekanisk belastning kan antingen har ingen effekt på samverkan, leda till snabbare disassociation av interaktionen, eller ens stabilisera interaktionen. Förstå hur molekylära belastning dikterar protein omsättningen i levande celler kan ge värdefull information om det mekaniska tillståndet av ett protein, som i sin tur belysa dess roll i mechanotransduction. Befintliga tekniker för att mäta kraft-känsliga protein dynamics antingen saknar direkta mätningar av protein belastning eller förlita sig på de mätningar som utförs utanför det cellulära sammanhanget. Här beskriver vi ett protokoll för Förster resonans energi överföring-fluorescens återhämtning efter fotoblekning (bandet-FRAP) teknik, som möjliggör mätning av kraft-känsliga protein dynamiken inom levande celler. Denna teknik är potentiellt tillämpliga på någon bandet-baserade spänning sensor, att underlätta studiet av kraft-känsliga protein dynamics i mängd subcellulära strukturer och i olika celltyper.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Den extracellulära miljön är en rik källa till både biokemiska och fysiska ledtrådar som dikterar cell beteende. Särskilt kan den fysiska naturen i närmiljön medla viktiga cellulära funktioner, inklusive celltillväxt, migration och differentiering1,2,3,4. Dysreglering av mekaniken i närmiljön är en kritisk komponent för många sjukdomar som ännu inte har tillräcklig behandlingar, såsom cancer5, åderförkalkning6och fibros7. En fullständig förståelse av hur celler omvandlar fysiska stimuli till biokemiskt-detectable signaler, en process som kallas mechanotransduction, kräver förtydligandet av de molekylära mekanismer som medla kraft överföring, både in och ut ur cellerna och inom flera subcellulära strukturer.

Inuti subcellulära strukturer vänder proteiner ständigt över; bindande och uppdelningen baserat på styrkan i deras interaktioner med bindande partner8. För krafter överförs framgångsrikt över fysiska avstånd, måste det finnas en obruten kedja av protein-protein interaktioner, vilket innebär att en proteinets omsättning måste vara långsam nog att bevara och överföra kraft till dess bindande partner9. Medan protein-protein interaktioner består vanligen av flera icke-kovalenta bindningar mellan protein domäner, konceptualiseras samspelet ofta som en bunden stat som kan övergå till en obunden stat under olika villkor10, 11. för ett visst protein-protein interaktioner, är det möjligt att kraft kan har ingen effekt på livslängden av interaktionen, känd som en ”perfekt bond”, minska livslängden på interaktionen, känd som en ”slip bond”, eller öka livslängden på samspelet , känd som en ”catch bond”10. Således finns det ett intrikat förhållande mellan protein belastning och protein dynamik, som vi kallar kraft-känsliga dynamics.

För att förstå effekten av belastning på bond dynamics, har ett antal mycket informativ experiment utförts på nivån singel-molekyl. Med isolerade proteiner eller fragment av proteiner och manipulation tekniker såsom magnetiska pincetter, optisk pincett och atomic force microscopy, har dessa studier visat kraft-känsliga protein-protein interaktioner för flera relevanta proteiner11,12. Båda integriner13 och cadherins14, som är transmembrana proteiner viktiga för att bilda cell-matrix och cell-cell interaktioner, respektive, har visat förändringar i dynamics på grund för att ladda. I cellen, vinculin rekryteras till båda talin15 och α-catenin16 i en kraft-beroende sätt och kan bilda fångst med aktin17, indikerar en avgörande roll för vinculin på både fokal sammanväxningar (FAs) och adherens föreningspunkter (AJs ) under belastning. Singel-molekyl studier tillåta för isolering av specifika protein-protein interaktioner och ge entydiga resultat, men de hänsyn inte till komplexiteten i den cellulära miljön.

Landmärke experiment visat att flera subcellulära strukturer, inklusive FAs och AJs, är mechanosensitive, och uppvisar förbättrad församlingen svar på internt genererad eller externt appliceras laster18,19, 20,21,22. Flera teoretiska modeller har dessutom föreslagit att mechanosensitive församlingen kunde drivas av kraft-känsliga protein dynamics23,24,25. För att undersöka dessa kraft-känsliga dynamiken inom levande celler, har några indirekta metoder vidtagits. FRAP och relaterade tekniker ger en relativt enkel metod för att mäta protein dynamics i celler26,27,28,29. Mätning av protein belastning har dock varit mer begränsad. En typisk metod är att jämföra protein dynamics i celler med och utan exponering för en cytoskeletal-hämmare används för att minska totala cell kontraktilitet8,30,31. Begreppsmässigt är detta en jämförelse mellan en hög belastning och låg belastning. Dock finns det ingen kvantifiering av belastningen över proteinet i antingen tillstånd, och det kan finnas oavsiktliga biokemiska effekter av hämmaren, sådan förlusten av viktiga bindande platser längs en F-aktin filament. Ett annat tillvägagångssätt, specifika för FAs, har varit att mäta total kraft ansträngning på substraten av FA använder dragkraft force microscopy ungefärliga molekylär belastning och undersöka förhållandet med dynamiken i ett enda protein inom FA32. Medan detta tillvägagångssätt möjliggör kvantifiering av totala kraften, ger den inte molekylärt specifik information. FAs består av över 200 olika proteiner, av vilka många kan bära lasten33. Således mäta total kraft utdata från en FA potentiellt skymmer möjligheten att flera kraft överföring vägar och på ett tillförlitligt sätt ger inte ett mått på belastningen på ett specifikt protein.

Till skillnad från tidigare metoder i Mekanobiologi, tillkomsten av bandet-baserade spänning sensorer kan direkt mätning av laster upplevs av specifika proteiner inuti levande celler34,35,36. Här presenterar vi ett protokoll som kombinerar bandet-baserade spänning sensorer med FRAP-baserade mått av protein dynamics. Vi hänvisar till denna teknik som bandet-FRAP. Detta tillvägagångssätt möjliggör samtidig mätning av protein belastning och protein dynamik, vilket möjliggör bedömning av kraft-känsliga protein dynamiken i levande celler (figur 1). BANDET-FRAP tekniken har redan tillämpats till studien av kraft-känsliga dynamiken i de mekaniska linker protein vinculin37. Spänning sensorer har utvecklats för många proteiner som är relevanta i en mängd olika subcellulära strukturer. Till exempel har sensorer utvecklats för vinculin34 och talin38,39 i FAs, cadherins och catenins i AJs40,41,42, nesprin i den nukleära LINC komplexa 43, α-actinin44 och filamin36 i cytoskelettet och MUC-1 i de glykokalyx45, bland annat46. Likaså är FRAP en vanligt förekommande teknik har använts på mechanosensitive proteiner inom focal sammanväxningar8,31, adherens föreningspunkter47, aktin cortex26och nucleus48. Framåt, bandet-FRAP tekniken bör vara allmänt tillämpliga på någon av dessa befintliga sensorer eller nyligen utvecklat sensorer, vilket möjliggör mätningar av kraft-känsliga dynamik i en mängd olika subcellulära strukturer och sammanhang. Detta slutet tillhandahåller vi en detaljerad, generaliserad protokoll för att genomföra bandet-FRAP tekniken tillämpas i dessa olika system. Förhoppningsvis kan en mängd olika experiment klarlägga roller olika mechanosensitive proteiner reglerar kraft överföring och medla cell beteende.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. generera prover för Imaging

  1. Stabilt express spänningar sensorn construct i önskad celltyp.
    1. Klona spänningar sensorn konstruktion i pRRL vektor- eller andra virala uttryck plasmid.
      Obs: Flera olika molekylär kloning verktyg finns att åstadkomma detta steg inklusive användning av restriktionsenzym, överlappar förlängning, och Gibson församlingen35. PRRL vektorn används i lenti viral transduktion och möjliggör en betydande grad av proteinproduktion med hjälp av promotorn human cytomegalovirus (CMV). Olika vektorer kan behövas för ett visst sammanhang. Exempelvis är CMV arrangören tystade i vissa cell typer49. Dessutom bara bandet-baserade sensorer innehållande fluorescerande protein kan att starka sekvenshomologi för brist, såsom mTFP1 och Venus A206K, användas att skapa stabila cellinjer. Sensorer som innehåller cyan fluorescerande protein och gula fluorescerande protein kommer sannolikt omfattas av homolog rekombination50.
    2. Generera lentivirus i mänskliga embryonala njure (HEK) 293T celler med psPax2 och pMD2.G förpackning plasmider använder standard virus produktion metoder51.
      FÖRSIKTIGHET: Lentivirus ska endast hanteras av utbildad personal i laboratoriemiljö biosäkerhet nivå 2.
      Obs: Denna kombination av celler och förpackning plasmider är lämpliga för användning med pRRL. Andra system kan krävas med andra vektorer.
    3. Transduce önskad celler med virus använder standard transduktion protokoll52 och använda flödescytometri att sortera celler53 att välja en homogen befolkning att uttrycka varje konstruktion på ungefärligt endogena nivåerna37. Experiment kan utföras omedelbart efter cellmarkeringen, eller celler cryogenically kan frysas för senare användning. Överskrid inte 2 frysning-tining cykler för en given stabil cellinje.
      Obs: Användningen av cellinjer brist på proteinet vara studerade (t.ex., vinculin- / - MEFs för användning med vinculin spänningar sensorn) kommer att öka signal-brus-förhållande i bandet experiment samt begränsa över uttrycket artefakter. Sådana stabila mus embryonala fibroblast (MEF) linjer kan användas för cirka 15 passager innan betydande förlust av uttryck eller nedbrytning av sensorer är uppenbart. Om virala metoder inte är önskad, kan en uppsjö av kommersiella reagenser användas enligt tillverkarens protokollet till normalnivå transfect en mängd celltyper med spänning sensorer i en lämplig plasmid, såsom pcDNA3.1. Optimal uttryck blir 24-48 h efter transfection.
  2. Förbereda substrat för cell sådd.
    1. Förvärva 4, 35 mm glasbotten rätter.
    2. Arbetar i en cell kultur huva, i en 15 mL kanoniska tube, göra 4 mL 10 µg/mL Fibronektin i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) lösning med steril fosfatbuffrad Koksaltlösning i cell kultur huven. Vänd försiktigt röret en gång för att blanda och låt lösningen sitta i 5 min i cell kultur huven.
      Obs: Den koncentration eller typ av ECM protein kan behöva justeras för andra celltyper. Villkoren är lämpliga för MEFs.
    3. Pipettera 1 mL Fibronektin lösning på varje glas botten maträtt.
    4. Lämna den Fibronektin lösningen på rätter för 1 h i rumstemperatur eller över natten vid 4 ° C.
    5. Aspirera Fibronektin lösningen, skölj en gång med PBS och tillsätt 1 mL PBS.
  3. Utsäde cellerna på beredda substrat.
    1. Börja med celler av intresse vid sammanflödet procent lämplig för inkubationens en 6 cm kultur maträtt.
      Obs: Olika celltyper krävs distinkta cell odlingsbetingelser och inkubationens protokoll. Detta avsnitt innehåller riktlinjer passar MEFs. MEFs odlas normalt 85% sammanflödet innan inkubationens.
    2. Arbetar inom en cell kultur huva, skölj cellerna en gång med 3 mL PBS. Tillsätt 1 mL 0,05% Trypsin-EDTA och inkubera i 5 minuter vid 37 ° C.
    3. Tillsätt 3 mL komplett media till 6 cm skålen, samla cellerna och placera i en 15 mL koniska rör.
      Obs: Sammansättning för komplett media beror på den celltyp som används. MEFs, komplett media definieras ofta som hög glukos Dulbeccos modifierade Eagle Medium med 10% fetalt bovint serum, 1% antibiotika-Antimycotic (som innehåller amfotericin B, Penicillin och Streptomycin), och en 1% icke-essentiell aminosyra (NEAA) lösning.
    4. Snurra cellerna ner vid 1000 x g i 5 min.
    5. Aspirera media och återsuspendera cellpelleten i 1 mL av komplett media.
    6. Ta bort PBS från Fibronektin-belagda glas rätter. Räkna cellerna och utsäde 30.000 celler på varje Fibronektin-belagda glas skålen med lämpliga komplett media för en slutlig volym av 1,5 mL.
      Obs: Denna cell densiteten är anslår för MEFs och kommer att leda till en population av celler som inte är gripande, men inte mycket gles. Den exakta mobilnummer kan behöva justeras för andra celltyper eller andra imaging kammare.
    7. Tillåta att cellerna sprids för 4 h efter sådd. 2 h för spridning, aspirera tillväxt medier och skölj en gång med imaging media, lämnar 1,5 mL imaging media.
      Obs: Denna fördelande tid som är lämplig för MEFs men kan behöva ändras för andra celler. Dock kommer att längre än 6-8 h inkubation perioder leda till betydande nedfall av ECM protein från serum i komplett media. Imaging media bör innehålla samma tillägg som komplett media men bör vara optiskt klar och inte innehålla några föreningar som fluorescerar i imaging kanaler, såsom flaviner, eller släcka fluorescens, såsom fenolrött. En allmänt användbara imaging media är DMEM-gfp Live Cell visualisering media kompletteras med 10% FBS och 1% NEAA lösning. Om bakgrunden autofluorescens är oacceptabelt hög, kan då mängden serum minskas. Om en media förändring inte är möjlig efter den inledande pläteringen, kan cellerna vara direkt resuspended i imaging media kompletteras med en trypsin-inhibitor.

2. Ställ in mikroskopet för avbildning

  1. Slå på mikroskopet.
    1. Slå på lampan arc först.
      Obs: En Båglampa kommer att släppa en elektromagnetisk puls, som kan skada annan utrustning som redan är på.
    2. Slå på den filter ratten registeransvarige, automatiserade scenen controller, Mikroskop-dator gränssnitt och kameran.
    3. Slå på FRAP laser och laser position styrenheter.
      FÖRSIKTIGHET: Motorstarka lasrar kan vara skadligt för ögonen om direkt tittade på. Det rekommenderas att konfigurera Mikroskop system för att blockera laser excitation dirigeras till ögat bitar, som kan åstadkommas genom att flytta en spegel till FRAP beam sökvägen under blekning för att reflektera lasern mot provet och förhindra överföring till okularet.
    4. Slå på datorn och öppna Mikroskop styrprogram.
    5. Låt 15 min för Båglampa och FRAP laser för att värma upp.
  2. Kalibrera FRAP lasern.
    1. Öppna fönstret laser konfiguration. Ställa in Belysningen (under puls) till lämpliga FRAP belysning inställningar för laser exponering för provet. Ange Inställning av belysningens (under imaging) till belysning inställningarna för imaging endast acceptor fluorophore.
    2. Välj målet att kalibrera under Koordinatsystem inställning. Avmarkera Manuellt Klicka kalibreringspunkter och kontrollera Visa bilder under kalibreringen.
    3. Ställa in fördröjningstiden till 10.000 µs och antalet pulser till 100.
    4. Placera bilden kalibrering av etidiumbromid som förseglas mellan en glasskiva och ett täckglas, i scenen adaptern med täckglas sida ner.
      FÖRSIKTIGHET: Etidiumbromid är ett mutagen och bör hanteras med handskar. Om bilden äventyras, kassera enligt institutionens riktlinjer.
    5. Använda acceptor belysning inställningarna för att fokusera på ytan av bilden, identifierbara som fokalplanet med den ljusaste signalen. Små defekter i beläggningen kommer att vara synlig för stöd i fokus.
    6. Flytta bilden till ett område med enhetlig fluorescens över bildplanen.
    7. Klicka på Skapa inställning. Programvaran kommer att initiera kalibreringsprocessen, blekning och upptäcka placeringen av blekt poängen automatiskt.
    8. Säkerställa framgångsrika kalibrering av bedömningen av den slutliga bilden, som kommer att vara ett 3 x 3 rutnät av blekt punkter som bör fördelas jämnt och i fokus. Spara kalibrering bilden för framtida referens.
    9. Ta bort kalibrering bilden och säkert lagra. Kalibrering ska utföras innan du börjar varje experiment men behöver inte utföras mellan prover.

3. Välj parametrar för bandet Imaging

  1. Fixa en av de genererade proverna av de celler som uttrycker spänningar sensorn med 4% PARAFORMALDEHYD för 10 min. PARAFORMALDEHYD lösning bör vara metanol gratis, ofta kallad EM-klass, att förhindra denaturering av fluorescerande proteiner. Placera i PBS efter fixering.
    FÖRSIKTIGHET: PARAFORMALDEHYD lösningar är giftiga. Detta steg bör utföras i dragskåp och lösningen ska bortskaffas enligt institutionella principer.
    Obs: Denna optimering beror inte på protein dynamics, och fasta prov möjliggör maximal tänkbar tid utan att oroa om cell hälsa.
  2. Skölj provet tre gånger med PBS och lämna i PBS.
    Obs: Användning av mest kommersiellt tillgängliga montering media kommer att påverka fluorophore egenskaper, vilket gör provet olämpliga för bandet imaging54. Helst cellerna kommer avbildas omedelbart, men kan vara kvar över natten vid 4 ° C. Längre väntetider kommer att leda till försämring av provet.
  3. Placera provet i Mikroskop scenen hållaren för avbildning.
  4. Öppna verktyget Multi-Dimensional förvärv (MDA). Upprätta en sekventiell avbildning av tre kanaler: acceptor enda excitation och utsläpp (acceptor kanal), donator excitation och acceptor utsläpp (bandet kanal), och givaren bara excitation och utsläpp (givare kanal).
    Obs: Det finns en mängd sätt att bilden bandet prover. Metoden tre-kanal eller ”tre-cube” Imaging parat med sätt att kalibrera systemet att mäta bandet effektivitet rekommenderas för bandet-baserade spänning sensorer55,56. Denna metod är snabb, enkel, icke-förstörande, kräver endast en standard fluorescens imaging mikroskopet och möjliggör jämförelse av experiment över olika dagar och imaging uppställningar.
  5. Skanna provet med en exponeringstid på 500 ms och ett filter med neutral densitet (ND) på 10%. Hitta en cell som uttrycker spänningar sensorn med tydlig lokalisering till en struktur av intresse.
  6. Välj en exponeringstid på 500 ms eller önskad längd för varje tänkbar kanal och ett ND-filter på 100% och förvärva en FRET bildsekvens.
  7. Uppskatta den genomsnittliga intensiteten av sensorn på intresset för varje tänkbar kanal subcellulära strukturer. Låga signaler kan leda till felaktiga resultat på grund av felaktig korrigering uppskattningar, icke-linjära i detektorer eller betydande bidrag av bakgrunden signaler. En ungefärlig riktlinje är att sikta på stödnivåer över 10% av det dynamiska omfånget av kameran (dvs., för en 16-bitars kamera, stödnivåer bör vara över 6 000).
    Obs: Identiska optiska inställningar (exponering gånger, filter, mål och andra variabler såsom kamera vinst eller binning) måste användas för alla bandet experiment som ska jämföras. Ändra dessa inställningar kommer att leda till en förändring i beloppet som bandet som är antingen genereras eller upptäckts i mikroskopi set-up. FRET effektivitet mätningar är oberoende av dessa inställning, men de kalibrering-faktorer som används för att bestämma bandet effektivitet är inte. I teorin, olika uppsättningar av kalibrering faktorer kan användas för att generera bandet effektivitetsvinster från olika optiska inställningar, men detta rekommenderas inte. Blekning eller fototoxicitet kan vara olika mellan olika inställningar, att skapa falska resultat.
  8. Skaffa en andra GRÄMA bildsekvens av samma synfält. Uppskatta fotoblekning mellan bildrutor genom att jämföra genomsnittliga intensiteten av sensorn i varje tänkbar kanal. Fotoblekning bör hållas till ett minimum, helst mindre än 1-5% förlust av signal.
  9. Justera parametrarna imaging för att maximera intensiteten samtidigt minimera fotoblekning. För grova justeringar, ändra ND-filter som används vid förvärvet. För finare justeringar, ändra exponeringstiden i steg om 250 ms.
  10. Upprepa steg 3,5 – 3,8 tills tillräcklig signal kan erhållas samtidigt minimera fotoblekning.
    Obs: Normalt inställningarna för vinculin spänningar sensorn i vinculin- / - MEFs är 1 500 ms, 1 500 ms och 1000 ms för givare, bandet och acceptor kanaler respektive. De optimala värdena varierar med typ av belysning system, mål, filteruppsättningar och sensorn uttryck nivå.

4. Välj parametrar för FRAP Imaging

  1. Optimera laser inställningarna för att säkerställa fullständig blekning av regionen av intresse (ROI) utan blekning omgivningarna eller orsakar photodamage.
    1. Fixa en av de genererade proverna av de celler som uttrycker spänningar sensorn med 4% PARAFORMALDEHYD i 10 min.
      Obs: Denna optimering beror inte på protein dynamics, och fasta prov möjliggör maximal tänkbar tid utan att oroa om cell hälsa. Detta förhindrar också återvinning av blekning av mobila proteiner, vilket möjliggör isolering av effekten av blekning, undvika eventuella effekter från snabba, diffusion-medierad fluorescens återhämtning inträffar mellan förekomsten av blekning och tar den första efter blekmedel bilden.
      FÖRSIKTIGHET: PARAFORMALDEHYD lösningar är giftiga. Detta steg bör utföras i dragskåp och lösningen ska bortskaffas enligt institutionella principer.
    2. Skölj provet 3 gånger med PBS och lämna i PBS.
      Obs: Användning av mest kommersiellt tillgängliga montering media påverkar fluorophore egenskaper, vilket gör provet olämpliga för FRAP imaging54. Helst cellerna kommer avbildas omedelbart, men kan vara kvar över natten vid 4 ° C. Längre väntetider kommer att leda till försämring av provet.
    3. Placera provet i Mikroskop scenen hållaren för avbildning.
    4. Öppna fönstret laser konfiguration. Börja med att sätta en laser dröjtiden 1000 µs och 10 pulser, vilket innebär att varje plats i scan över ROI får 10.000 µs av full effekt laser
      Obs: En 500 mW, 515 nm laser användes för blekning. Detta valdes att selektivt bleka Venus A206K, acceptorn i vinculin spänningar sensorn, med maximal effektivitet. Om bandet-baserade spänning sensorer med andra fluorescerande proteiner används, kanske en annan typ av laser användas.
    5. Hitta en cell som uttrycker spänningar sensorn med tydlig lokalisering till en struktur av intresse och skaffa sig en bild.
    6. Rita en rektangulär ROI beskriver området för att bleka och lagra den ROI-platsen. Pulse laser. Knäppa en annan bild av provet.
      Obs: Rutan storlek bör vara ungefär lika stor som hela FA. Försiktighet bör iakttas att rutan storlek inte varierar drastiskt över experiment. Det blekt området måste noga övervakas i proteiner vars dynamics påverkas genom diffusion. Detta är en potentiell oro i transmembrana proteiner, såsom cadherins47, eller proteiner som diffus långsamt27,57.
    7. Kontrollera kvaliteten på fotoblekning genom att kontrollera att hela ROI är blekt så att intensiteten är nära bakgrundsnivåerna. Kontrollera dessutom att det finns ingen blekning utanför ROI.
    8. Justera laser inställningar som behövs för att uppnå en betydande mängd blekning inom ROI utan att betydande blekning utanför ROI. För grova justeringar, höja och sänka uppehållstiden i steg på 100 µs och för finjusteringar, höja och sänka antalet pulser i steg om 5 pulser.
    9. Upprepa steg 4.1.5 – 4.1.8 tills de når lägsta inställningarna som ROI bleks helt utan off-target fotoblekning.
      Obs: Att uppnå en betydande inledande blekning värde utan att fototoxicitet är en viktig aspekt av FRAP analys. Använd laser inställningarna som resulterar i ett komplett blekmedel i fasta prover. Det minimala antalet fotoner bör i allmänhet användas för att uppnå önskad blekning nivå. Även bör protokollet blekning hållas relativt konsekvent under experiment, då förändringar kan påverka mätningarna av protein dynamics58.
  2. Optimera time-lapse parametrar för att fullständigt fånga dynamiken i proteinet av intresse samtidigt minimera fotoblekning.
    1. Förbereda mikroskopi set-up för levande cell imaging, helst med en uppvärmd scenen och mål samt CO2 kontroll. Låt jämvikta i 20 min.
      Obs: För att bibehålla hälsan hos de avbildade cellerna, temperatur och pH måste upprätthållas i imaging fartyget. En mängd uppvärmd stadier och objektiva värmare kan lätt hålla cell temperaturen vid 37 ° C. Kontroll av pH för många typer av media kan åstadkommas genom användning av en Peristaltisk pump till pass tilluften 5% CO2 över provet vid 15 mL/min. Alternativt, om CO2 -kontrollen är inte tillgänglig, live imaging media som innehåller HEPES bör användas för att förhindra stora pH-förändringar.
    2. Placera en av de genererade proverna av de celler som uttrycker spänningar sensorn i Mikroskop scenen hållaren för avbildning. Låt jämvikta i 10 min.
    3. Med verktyget MDA, ställa in en time-lapse att förvärva 3-5 bilder före bleach bleach ROI och fortsätta att ta 10-60 bilder.
      Obs: För vinculin på FAs, imaging varje 5 s för 5 min efter blekmedel är tillräckligt att konstatera dynamik utan att införa överdrivna blekning31. Användbara utgångspunkter för imaging och varaktighet för många andra proteiner kan hittas i litteratur47,48,59,60.
    4. Använd acceptor imaging inställningar som minimerar provet exponering för ljus, samtidigt som en tillräcklig signal-brus-förhållande, för att bilden strukturen av intresse. En bra utgångspunkt är hälften av den ND filter och exponering tid som krävs för avbildning av acceptorn under bandet.
    5. Hitta en cell som uttrycker spänningar sensorn med tydlig lokalisering till en struktur av intresse och knäppa en bild.
    6. Rita en rektangulär ROI för att markera var man bleker och lagra den ROI-platsen. Inleda den time-lapse.
    7. Undersöka den resulterande uppsättningen bilder för potentiella problem.
      1. Om det finns betydande hopp (större än 10% av inledande intensitet) i fluorescens återhämtning mellan ramar, minska den tid-steget mellan ramar.
      2. Om det finns en betydande global förlust av fluorescens över tid (mer än 5-10% av inledande intensitet), minska antalet bilder tagna efter blekmedel eller ändra imaging inställningarna för att minska exponeringen av provet till ljus.
      3. Om fluorescens återhämtning inte har nått sitt tak i slutet av den time-lapse, öka den totala längden av de time-lapse.
    8. Justera parametrarna time-lapse och upprepa steg 4.2.5 – 4.2.7 tills fluorescens återhämtningen är tillräcklig fångas utan globala foto-skador på provet.

5. uppkopplingstyp bandet-FRAP

  1. Förbereda mikroskopi set-up för levande cell imaging, helst med en uppvärmd scenen och mål samt CO2 kontroll. Låt jämvikta i 20 min.
    1. För att säkerställa hälsan hos de avbildade cellerna, hålla temperaturen vid 37 ° C i imaging kammaren. Använd en Peristaltisk pump att passera tilluften 5% CO2 över provet vid 15 mL/min till upprätthålla pH.
    2. Alternativt om CO2 -kontrollen inte är tillgänglig, använda levande imaging media som innehåller HEPES att förhindra att stora pH-förändringar.
  2. Öppna verktyget MDA och ställa upp med bandet imaging parametrar, inklusive de olika filteruppsättningar.
  3. Spara detta MDA i experimentell mapp med namnet på MDA_FRET_Date.
  4. Ställa in en annan MDA med FRAP imaging parametrar, inklusive de olika filteruppsättningar, time-lapse inställningarna och journalen till pulsval laser efter före blekmedel förvärv.
  5. Spara detta MDA i experimentell mapp med namnet på MDA_FRAP_Date. Stäng fönstret MDA.
  6. I verktygsfältet överst på skärmen, Välj tidning | Starta inspelning.
  7. Öppna fönstret MDA, Lägg MDA_FRET_Date staten och tryck förvärva. Sedan ladda den MDA_FRAP_Date staten och tryck förvärva.
  8. I slutet av förvärvet i verktygsfältet överst på skärmen, Välj tidning | Stoppa inspelning.
  9. Spara denna tidning i experimentell mapp med namnet på FRETFRAP_Date och lägga till ett verktygsfält för enkel åtkomst. Stäng fönstret MDA.
  10. Placera en av de genererade proverna av de celler som uttrycker spänningar sensorn i mikroskopet hållaren för avbildning. Låt jämvikta i 10 min.
  11. Navigera i urvalet använder bild förvärv under förvärva | Förvärva med minimal exponering tid och ND filter för att identifiera cellerna av intresse.
  12. Ställa in kontinuerlig autofokus genom att navigera till enheter | Fokus. Manuellt fokus på prov tills de når den rätta bildplanen.
  13. Klicka på Ställ in kontinuerlig fokus, vänta för systemet att justera och klicka på Starta kontinuerlig fokusering.
    Obs: Detta är inte obligatoriskt, men avsevärt förbättrar kvaliteten på FRAP återhämtning kurvor eftersom det förhindrar provet drifting out-of-fokus.
  14. Hitta en cell som uttrycker spänningar sensorn med tydlig lokalisering till en struktur av intresse och knäppa en bild.
  15. Rita en rektangulär ROI för att markera var att bleka. Lagra den ROI-platsen.
  16. Initiera FRETFRAP_Date journalen som börjar förvärvet av bandet bilder följt av initieringen av FRAP time-lapse.
  17. Upprepa steg 5.14-5.16 tills 10-15 bild uppsättningar förvärvas.
    Obs: Mätning kan inte upprepas i samma cell. När fotoblekning sker, är FRET data opålitliga.

6. analysera bandet-FRAP data

  1. Analysera bandet bilder med hjälp av programvaran val.
    Obs: Det finns flera sätt att bild och kvantifiera bandet61, inklusive proportionerlig bandet62 och bandet index34,35. Emellertid, det rekommenderas starkt att använda uppskattningarna av bandet effektivitet55,63 för tolkningen av bandet-FRAP data. Se diskussionen för vidare utforskning av det här avsnittet. För sensibiliserade utsläpp och beräkning bandet effektivitet är anpassad programvara tillgänglig från den Hoffman Lab vid https://gitlab.oit.duke.edu/HoffmanLab-Public.
  2. Kvantifiera relevanta parametrar för varje subcellulär struktur som var blekt. Detta bör inkludera genomsnittliga bandet index/effektivitet och genomsnittliga initiala acceptor intensitet (proportionell mot koncentrationen) men kan också omfatta fysiska parametrar såsom ROI storlek.
  3. Analysera FRAP bilderna med hjälp av programvaran val.
    Obs: Det finns flera sätt att kvantifiera FRAP26,27,28,29. Experimentell huvudfrågorna inkluderar redovisning för blekning under efter blekmedel imaging, förändringar i bakgrunden intensitet och flyttning av högdynamiska subcellulära strukturer, såsom fokal sammanväxningar. Blekning korrigeringar och variationer i bakgrundsbelysning kan åstadkommas genom analys av icke-blekt och icke-fluorescerande regioner av bilderna. Högdynamiska subcellulära strukturer, särskilt de som visar överdriven tillväxt eller demontering dynamics är inkompatibla med standard FRAP-analyser och bör inte analyseras. Dessutom finns det en mängd sätt att normalisera data. Angivna riktlinjerna är för enklaste analys.
  4. Korrekt återvinning data för blekning effekter och sedan normalisera att pre blekmedel stödnivåer. Kvantifiera halvtid för återvinning och den mobila fraktionen enligt följande ekvation28,34:
    MF - (MF - Ro) e-kt
    där MF är den mobila fraktionen, Ro är den inledande återhämtningen, och k är återvinningsgraden. Halvtid för återhämtning bestäms av:
    Τ1/2 = ln 2/k.
    Obs: Det finns en mängd allmänt tillgängliga programvarupaket för att slutföra dessa analyser64 samt en mängd ImageJ plugins. Anpassad programvara är tillgänglig från den Hoffman Lab vid https://gitlab.oit.duke.edu/HoffmanLab-Public. Fler analyser bör användas i situationer där diffusionen påverkar dynamiken i proteinet av intresse, flera tidsskalor är uppenbara i återvinning, eller icke-standardiserade blekning geometrier används.

7. tolka bandet-FRAP data

  1. Sammanställa relevant information för varje ROI inklusive: FRET index/effektivitet, intensitet acceptanten, FRAP halvtid, FRAP mobila bråkdel.
    Obs: FRET index eller effektivitet används för att bestämma genomsnittliga belastning över proteinet inom ROI. Acceptor intensitet mäter den lokala koncentrationen av protein. Halva tiden för återhämtning är ett mått på protein dynamics. En mindre halvtid visar mer snabb omsättning. FRAP mobila bråkdel mäter mängden protein inom ROI som aktivt vänder över. En större mobil bråkdel indikerar att en större andel av proteinet inom ROI vända.
  2. För att undersöka effekten av lokal koncentration på protein omsättningshastighet och belopp, rita FRAP halvtid och mobila bråkdel mot inledande acceptor intensitet.
  3. För att undersöka effekten av protein belastning på protein omsättningshastighet och belopp, rita FRAP halvtid och mobila bråkdel mot bandet index/effektivitet.
    Obs: Beroende på protein eller struktur, det kan också vara intressant att undersöka effekterna av fysiska parametrar, såsom strukturstorlek eller excentricitet, protein belastning eller omsättning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

BANDET-FRAP utgörs av kombinationen av två fluorescerande tekniker, FRET och FRAP. Som vi fokuserat på effekterna av protein belastning, använde vi bandet-baserade spänning sensorer34,46. Dessa sensorer är ofta baserade på en spänning avkänning modul bestående av två fluorescerande proteiner, såsom mTFP1 och VenusA206K, ansluten med en flagelliform länkare (figur 1A). När modulen är placerad mellan huvud och stjärt domänerna av ett protein, är det möjligt att mäta den belastning som hela proteinet. När man analyserar bandet data, bilder tagna i kanalen acceptor används för att bedöma spänningar sensorn lokalisering och koncentration, som denna signal är oberoende av bandet (figur 1B). Efter beräkning av bandet effektivitet, kan protein belastning visualiseras på en kolorimetrisk skala där en minskning av bandet effektivitet mot kallare färger indikerar en ökning av protein belastning, och bandet effektivitetsvinster i det röda området anger låg protein belastning ( Figur 1B). FRAP imaging utförs med hjälp av en laser för att bleka acceptor fluorophore i en enda subcellulär struktur och övervaka återhämtning över tiden (figur 1 c). Den resulterande normaliserade FRAP kurvan kan analyseras för att extrahera parametrar som beskriver protein dynamiken, inklusive halvtid av återhämtning och mobila bråkdel (figur 1 d). Eftersom bandet och FRAP-analyser utfördes på samma cell, genomsnittliga protein belastning och omsättning en subcellulär struktur kan ritas som en enda kontaktpunkt. Imaging flera celler ger flera punkter och en framväxande trend kan ange om ett protein är destabiliserat (figur 1E) eller stabiliseras av molekylär belastning (figur 1F).

Vinculin spänningar sensorn (VinTS) stabilt uttryckt i vinculin null MEFs mycket tydligt lokaliserar till FAs sprida i hela cellen, som kan ses genom att titta på acceptor kanal bilden (figur 2A). Acceptor kanal bilden används för att skapa en segmentering mask som identifierar varje enskild FA med ett unikt ID, visuellt utsetts av olika färger (figur 2B). Segmentering algoritmen bygger på metoden ”vatten” och etiketter jordbruksrådgivningen ungefärligt i beställa av ljusstyrka, som tidigare beskrivits34,65. Segmentering resultatet konverteras till ett binärt mask som tillämpas sedan på bandet effektivitet resultaten (figur 2 c), och den genomsnittliga bandet effektiviteten inom varje unik FA beräknas (figur 2D). Ytterligare egenskaper kan beräknas för varje FA på ett liknande sätt, inklusive genomsnittliga acceptor intensitet, storlek, excentricitet och läge inom cellen. Detta sätt, kan beroende på vilket som FA väljs för FRAP matchas med det unika ID som FA och associerade egenskaper.

FRAP bildbehandling och analys är känslig för flera faktorer som kan kontrolleras, inklusive laser och imaging parametrar, och några faktorer som inte kan kontrolleras, till exempel övergripande FA stabilitet26,27,28, 29. Till exempel kan för mycket exponering för ljus under time-lapse bildtagning leda till stora problem vid tolkningen av FRAP data. Även om analysen av kontroll FA som inte var blekt kan användas att normalisera för mindre fotoblekning över tid, med för mycket exponering av provet för ljus, den resulterande FRAP kurvan visar en inledande återhämtning följt av ett dopp i normaliserade intensitet som kan inte vara korrekt passform med en exponentiell funktion. Om denna effekt observeras konsekvent i data, är det nödvändigt att optimera parametrarna imaging antingen minska exponeringstiden, tid-steget mellan imaging ramar, minska eller öka längden på den time-lapse att minska exponeringen av provet för ljus.

Ett annat exempel på FRAP data som är det, är när FA som var photobleached translocates snabbt under återhämtning28. Ett representativt fall av överdriven translokation visas i figur 3. Den första bilden, ger där ROIs väljs, inte en indikation på FA stabilitet (figur 3A). Övervakning blekt FA över tid, det rör sig snabbt bort från utgångsläget och automatisk spårning är oförmögen att följa omedelbart på grund av den låga fluorescerande signalen efter fotoblekning (figur 3A). Den resulterande FRAP kurvan visar en inledande fas av viss återhämtning med ett hopp när fluorescensen är återhämtat sig tillräckligt för programvaran för att upptäcka FA och flytta ROI (figur 3B). Denna kurva kan inte vara framgångsrikt passa av en exponentiell funktion. På snabb flyttning av FA föreslår också att FA struktur är instabil. Instabil FAs bör således inte ingå i samma bandet-FRAP analys som stabil FAs, på grund av både tekniska och biologiska frågor.

Med tillfredsställande bandet och FRAP data, är nästa steg att fylla bandet-FRAP analysen genom att samtidigt bedöma protein belastning och dynamics. Figur 4A visar bandet effektivitet kartor över tre vinculin null MEFs stabilt uttrycker VinTS. Jordbruksrådgivningen beskrivs i vitt valdes för FRAP analys, och stödnivåerna som acceptor visas över tiden. Dessa tre FAs har vinculin under olika mängder Ladda och visa en annan vinculin återhämtning profil. Kvantifiera dessa egenskaper genom att beräkna halvtid av återhämtning och konspirera mot den genomsnittliga band effektiviteten i varje FA visar den övergripande trenden av vinculin att stabiliseras genom ökad belastning (figur 4B). Den mobila fraktionen plottas mot bandet effektivitet visar dock ingen trend, vilket tyder på att mobila fraktionen inte regleras av molekylär belastning (figur 4 c). Att införa en punktmutation i VinTS på aminosyran 50 (A50I) har visat sig förhindra vinculin bindning till en större bindande partner inom FAs, talin66. Ändring av detta protein-protein interaktioner påverkar vinculin kraft-känsliga dynamics. Vinculin null MEFs stabilt uttrycker VinTS A50I har annan cell och FA morfologier, olika vinculin lastning profiler och olika vinculin dynamics (figur 4 d). Kvantifiera halv-tider av återhämtning och bandet effektivitetsvinster och plottning visar att när vinculin-talin samspelet störs, vinculin på FAs är destabiliseras av ökad belastning (figur 4E) medan mobila bråkdel visar ingen tendens (figur 4F ).

Figure 1
Figur 1: principer av bandet-FRAP teknik. (A) Schematisk bild av bandet-baserade spänning sensormodulen (TSMod) infogas i ett protein av intresse och effekten av spänning på signalen bandet. (B) för att kvantifiera bandet använder sensibiliserade utsläpp, tas bilderna till fånga givarens signal (visas inte), acceptor signal och bandet signal. Med lämpliga korrigeringar, kan FRET bilden tilldelas en kolorimetrisk skala att visualisera hur mycket spänningar tillämpas på sensorn. (C) FRAP utförs med signalen acceptor, vilken är direkt proportionell mot koncentrationen. (D) FRAP bildanalys producerar kurvor av fluorescensintensiteten över tiden som kan passa använder matematiska modeller för att bestämma protein dynamics. (E, F) När bandet och FRAP kombineras, kan kraft och omsättning i en enda FA mätas. Mäta flera FAs i flera celler ger en relation mellan protein belastning och protein omsättningen. I denna analys är en relation i vilken ökad belastning korrelerar med ökad omsättning avses som en kraft-destabiliserat stat (E). I den här analysen benämns en relation där ökad belastning korrelerar med minska omsättningen som en kraft-stabiliserad stat (F). Denna siffra har ändrats från Rothenberg et al. 37. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: FA identifiering och bandet analys. (A) en vinculin null MEF uttrycker den VinTS visualiseras i acceptor kanalen, där intensiteten anger lokal koncentration av vinculin. Skalstapeln = 30 µm. (B) FAs segmenteras utifrån acceptor kanalen för att skapa en FA ID mask där varje FA tilldelas ett unikt ID, här visas som olika färger, ungefärligt i beställa av ljusstyrka. (C) FA ID mask är konverterade till en binär mask och appliceras på bandet effektivitet bilden att Visa bandet effektivitet värdena endast på FAs. (D) bandet effektivitet inom varje FA är i genomsnitt för att få ett enda värde för varje FA, som är associerad med FA-ID i tabellen Utgående data. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: exempel på en translocating FA. (A) en vinculin null MEF uttrycker VinTS A50I mutant sensorn visualiseras i acceptor kanalen, med färgtabellen inverterad för tydlighet. Skalstapeln = 30 µm. FA beskrivs i svart valdes för blekning. Inzoomade bilder visar FA utvecklingen över tid med röd kontur som anger där programvaran identifieras FA. Skalstapeln = 2 µm. (B) den resulterande normaliserade FRAP kurvan från data i (A). Det finns en cirka 5% hoppa i intensitet efter punkt 3 följd de FA translocating snabbt innan tillräcklig återhämtning för programvaran att upptäcka förändringen i anl. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: representant bandet-FRAP resultat. (A) Vinculin null MEFs uttrycker den VinTS visas som genomsnittliga bandet effektivitet bilder av hela cellen (skalstapeln = 30 µm) med inzoomade inverterad acceptor kanal bilder visar FRAP återhämtning progression (skalstapeln = 2 µm). (B) FRAP halvtid av återhämtning plottas mot bandet effektivitet för 32 celler, med punkter som representerar celler i (A) i rött. (C) FRAP mobila bråkdel plottas mot bandet effektivitet av samma celler i (B). (D) Vinculin null MEFs uttrycker VinTS A50I mutant sensorn visas som genomsnittliga bandet effektivitet bilder av hela cellen (skalstapeln = 30 µm) med inzoomade inverterad acceptor kanal bilder visar FRAP återhämtning progression (skalstapeln = 2 µm). (E) FRAP halvtid av återhämtning plottas mot bandet effektivitet för 21 celler, med punkter som representerar celler i (D) i rött. (F) FRAP mobila bråkdel plottas mot bandet effektivitet av samma celler i (E). Publicerades ursprungligen i Rothenberg et al. 37 och är visualiseras här i ett nytt format. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

BANDET-FRAP metoden möjliggör direkt mätning av kraft-känsliga protein dynamics, en egenskap som har varit svårt att direkt söka inuti levande celler. Känsligheten av protein dynamics och molekylär belastning är kritiska till proteinets funktion som en kraft sändare eller givaren. Lastning krävs för överföring av både internt genererade och externt-tillämpad styrkor, kallas mechanotransmission, och för omvandlingen av dessa styrkor till biokemiskt-detectable signaler, som kallas mechanotransduction. Men förändringarna i belastningen kan påverka varaktigheten ett protein förblir bundna, således desto mindre tid tillbringar ett protein bärande belastning, desto mindre chans kraften har överförts till andra proteiner eller sensorik till ett biokemiskt-detectable signal och kände. Metoden bandet-FRAP överbryggar klyftan mellan molekylär och cellulär nivå genom att låta molekylär skala mätningar av kraft-känsliga dynamics kan nås inom en bredare cellulära sammanhang. Det möjliggör dessutom dessa mätningar tas samtidigt störande intracellulär eller extracellulär miljön antingen biokemiskt eller mekaniskt. Denna teknik bör tillämpas någon bandet-baserade spänning sensor, vilket möjliggör undersökning av protein mekaniska stat i en mängd subcellulära strukturer och extracellulära sammanhang.

Kritiska steg för att säkerställa som önskade bandet-FRAP mätningarna erhålls involvera optimera parametrarna imaging och utföra dataanalys och tolkning. Optimera imaging parametrarna, som beskrivs i protokollet, är nödvändigt att begränsa photodamage till provet, samtidigt som önskad strukturer och dynamics särskiljas och tillräcklig signalstyrka för beräkning av bandet. Att fastställa dessa imaging parametrar för en viss cell linje och protein av intresse tidigt kommer att underlätta direkt jämförelse mellan olika experimentella grupper. Det är värt att notera att ändringar i systemet, såsom muterar proteinet av intresse eller införa-hämmare, kan leda till förändringar i protein lokalisering (därmed förändra signalintensitet) och dynamik. De optimerade parametrarna bör aktivera tydliga, korrekta mätningar över alla experimentella förhållanden. Därför är det rekommenderat att välja de parametrar som extrema slutet av att vara användbara, exempelvis inte att kunna knappt skilja signaler från brus.

Medan imaging i detta protokoll beskrevs för ett epifluorescensmikroskop och bifogade FRAP lasermodul, är bandet-FRAP tillämplig på andra bildgivande system. Till exempel kan denna teknik anpassas till line-scanning confocal Mikroskop samt spinning-disk confocal Mikroskop med en bifogad fotoblekning modul. Imaging inställningar bör optimeras på ett liknande sätt att uppnå tillräcklig signal-brus utan att orsaka photodamage eller överdriven fotoblekning. Särskilt när det gäller bandet imaging krävs hög quantum effektivitet detektorer att erhålla tillräcklig signal för framgångsrika bandet beräkning utan att förmå fluorophore skador. Det finns ett antal publikationer som beskriver separat bandet eller FRAP bildåtergivning med en confocal Mikroskop67,68,69, som kan användas för att vägleda optimering för bandet-FRAP imaging.

Efter experimentet, dataanalys bör behandlas omsorgsfullt och utförs på ett sätt som reproducerbara, helst automatiserad. På grund av oförmågan att bleka mer än 2-3 subcellulär regioner i en enda cell innan blekning för mycket av den tillgängliga poolen av protein, genomströmning av denna teknik är relativt begränsad. Således, datauppsättningar kombineras ofta över flera dagar av imaging, som kräver konsekvent behandling av data. Både bandet och FRAP erbjuder utmaningar med dataanalys. FRET index och bandet effektivitet mätningar ger en kvantifiering av protein belastning. FRET index är ett relativt mått som är starkt beroende av mikroskopet inställningar, medan bandet effektivitet mätningar är absolut och oberoende av mikroskopet inställningar55,70. Vi har nyligen visat att en tidigare utvecklade metod med ”tre-cube” imaging kan användas för att bestämma bandet effektivitet från mätningar av sensibiliserade utsläpp som normalt kvantifieras med bandet Index när du använder bandet-baserade spänning sensorer56 . Mätningar av bandet effektivitet krävs om mätningar av den absoluta styrkor erfarenheten av spänning sensorer ska vara beräknat34. De celler som uttrycker bandet-baserade spänning sensorer, kan speciellt stabil celler vid hög passage-nummer, rekombinera eller försämra sensorerna, leder till oanvändbara bandet data50. Detta är lätt att identifiera när beräkning av givare-till-acceptor nyckeltal vid beräkning av GRÄMA effektivitet37,56 men kan vara svårare att upptäcka med hjälp av bandet index. När du startar med en FRET-baserade spänningar sensorn, kan det vara bra att få en stor datauppsättning (> 50 celler) av bara bandet data för konstruktioner av intresse att identifiera de förvänta utbud av bandet effektivitetsvinsterna. Dessutom kan FRAP data vara svårt att extrahera från strukturer som är mycket rörliga, såsom FAs som snabbt glider eller demontering. Att välja en subpopulation av strukturer eller optimera cell plätering villkor att mildra denna effekt kan hjälpa till att minimera problemet.

I konceptet, kan bandet-FRAP tillämpas på någon bandet-baserade sensor i någon subcellulär region, med ordentlig optimering. I praktiken kan det vara svårt att fånga kraft-känsliga dynamics av proteiner som inte är under betydande mekanisk belastning eller som har halv-gånger av återhämtning på mycket korta tidsskalan i några sekunder eller på lång tidsskala i tiotals minuter. Resultat från studier på singel-molekyl kan peka på de proteiner som kan påvisa force känsliga dynamiken inom levande celler. Hittills har inkluderar detta många FA och AJ proteiner13,14,15,16 samt några cytoskeletal element71,72,73. Slump, har bandet-baserade sensorer utformats för många av dessa proteiner46. Dessa resultat kan vägleda valet av ett protein av intresse. dock bör det inte förväntas att bandet-FRAP data exakt kommer att spegla resultaten från studierna singel-molekyl. Biokemiska förordning, interaktioner med andra proteiner och lokala cytoskeletal struktur kan faktiskt dölja eller förändra, effekterna av krafter på protein-protein interaktioner. Förmåga att iaktta dessa komplexitet är en unik styrka av metoden med bandet-FRAP.

En kombination av manipulationer till cellen och proteinet av intresse kan användas för att belysa de viktigaste faktorerna för reglerar protein dynamics. Exempelvis kan det vara bra att ha en sensor som är kraft-okänsliga, antingen genom radering eller mutation av en kraft-bindande domänen35,74 eftersom det bör finnas inga beroendet av protein omsättningen dynamiken på den kraft som rapporterats av sensorn. Mutationerna av andra kritiska bindningsställen eller fosforylering platser i proteinet kan dessutom ge en mer fullständig bild av hur proteinet av intresse regleras. Att göra globala ändringar i cellen eller miljön genom cytoskeletal hämmare eller genom att ändra egenskaperna substrat (ex. extracellulär matrix eller stelhet), respektive, kan avgöra hur kraft-känsliga dynamiken av proteinet reagera på Mekaniska störningar. Att kombinera informationen på protein last och kraft-känsliga dynamics med andra biofysiska egenskaper av protein kan bidra till att fastställa den mekaniska delstaten proteinet av intresse. Detta kan omfatta lokalisering och lokala protein-protein interaktioner inom en subcellulär struktur75,76. Dessutom proteinet kunde uppehålla sig i olika konformation stater, även inom samma subcellulär struktur, beroende på sammanhanget76,77. Protein belastning, dynamics, lokalisering och konformation kan alla påverkas samtidigt av internt genererade och externt-tillämpad styrkor37,76,78,79, dikterar en proteinets roll i kraft överförings- och mechanotransduction. Mångsidigheten i bandet-FRAP metoden och dess potentiella kompatibilitet med en mängd olika proteiner och manipulationer bör aktivera förtydligandet av samspelet mellan bulk mekanik, protein dynamics och mechanosensitive signalering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöds av en National Science Foundation karriär Award (NSF-CMMI-14-54257) samt bidrag från American Heart Association (16GRNT30930019) och National Institutes of Health (R01GM121739-01) tilldelas Dr Brenton Hoffman och en nationell Science Foundation Graduate Research Fellowship tilldelas Katheryn Rothenberg. Innehållet ansvarar enbart för författarna och representerar inte nödvändigtvis officiella ståndpunkter av NSF eller NIH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin-EDTA Thermo Fisher 25300062
16% Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 30525-89-4
60x Objective NA1.35 Olympus UPLSAPO 60XO
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) Gibco 15240-062
Automated Stage Prior Scientific H117EIX3
Custom Dichroic Mirror Chroma Technology Corp T450/514rpc
Custom mTFP1 Emission Filter Chroma Technology Corp ET485/20m
Custom mTFP1 Excitation Filter Chroma Technology Corp ET450/30x
Custom Venus Excitation Filter Chroma Technology Corp ET514/10x
DMEM-gfp Live Cell Visualization Medium Sapphire MC102
Dulbecco's Modified Eagle's Medium  Sigma Aldrich D5796 with L-glutamine and sodium bicarbonate
Fetal Bovine Serum HyClone SH30396.03
Fibronectin, Human Corning 47743-654
FRAPPA Calibration Slide Andor provided along with FRAPPA unit
FRAPPA System with 515 nm Laser Andor
Glass-bottomed Fluoro Dishes World Precision Instruments FD35
HEK293-T Cells ATCC CRL-3216
Hexadimethrine Bromide, Polybrene Sigma Aldrich H9268-5G
High-glucose Dulbecco's Modified Eagle's Medium Sigma Aldrich D6429
Inverted Fluorescent Microscope Olympus IX83
JMP Pro Software SAS
Lambda 10-3 Motorized Filter Wheels Sutter Instruments LB10-NW
LambdaLS Arc Lamp with 300W Ozone-Free Xenon Bulb Sutter Instruments LS/OF30
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-027
MATLAB Software Mathworks
MEM Non-Essential Amino Acids Thermo Fisher 11140050
MetaMorph for Olympus Olympus
Micro-Humidification System Bioptechs 130708
MoFlo Astrios EQ Cell Sorter Beckman Coulter B25982
Objective Heater Medium Bioptechs 150819-13
OptiMEM Thermo Fisher 31985070
Phosphate Buffered Saline Sigma Aldrich D8537
pMD2.G Envelope Plasmid Addgene 12259
pRRL Vector gift from Dr. Kam Leong (Columbia University)
psPax2 Packaging Plasmid Addgene 12260
sCMOS ORCA-Flash4.0 V2 Camera Hamamatsu Photonics C11440-22CU
Sorvall Legend XT/XF Centrifuge Thermo Fisher 75004505
Stable Z Stage Warmer Bioptechs 403-1926
Venus Emission Filter Semrock FF01-571/72

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DuFort, C. C., Paszek, M. J., Weaver, V. M. Balancing forces: architectural control of mechanotransduction. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12, (5), 308-319 (2011).
  2. Mammoto, T., Ingber, D. E. Mechanical control of tissue and organ development. Development. 137, (9), 1407-1420 (2010).
  3. Sun, Y., Chen, C. S., Fu, J. Forcing stem cells to behave: a biophysical perspective of the cellular microenvironment. Annual Review of Biophysics. 41, 519-542 (2012).
  4. Wozniak, M. A., Chen, C. S. Mechanotransduction in development: a growing role for contractility. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, (1), 34-43 (2009).
  5. Broders-Bondon, F., Nguyen Ho-Bouldoires, T. H., Fernandez-Sanchez, M. E., Farge, E. Mechanotransduction in tumor progression: The dark side of the force. The Journal of cell biology. 217, (5), 1571-1587 (2018).
  6. Simmons, R. D., Kumar, S., Jo, H. The role of endothelial mechanosensitive genes in atherosclerosis and omics approaches. Archives of Biochemistry and Biophysics. 591, 111-131 (2016).
  7. Wells, R. G. Tissue mechanics and fibrosis. Biochimica et Biophysica Acta. 1832, (7), 884-890 (2013).
  8. Lele, T. P., et al. Mechanical forces alter zyxin unbinding kinetics within focal adhesions of living cells. Journal of Cellular Physiology. 207, (1), 187-194 (2006).
  9. Hoffman, B. D., Grashoff, C., Schwartz, M. A. Dynamic molecular processes mediate cellular mechanotransduction. Nature. 475, (7356), 316-323 (2011).
  10. Dembo, M., Torney, D. C., Saxman, K., Hammer, D. The reaction-limited kinetics of membrane-to-surface adhesion and detachment. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 234, (1274), 55-83 (1988).
  11. LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Hoffman, B. D. Molecular-Scale Tools for Studying Mechanotransduction. Annual Review of Biomedical Engineering. 17, 287-316 (2015).
  12. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5, (6), 491-505 (2008).
  13. Kong, F., Garcia, A. J., Mould, A. P., Humphries, M. J., Zhu, C. Demonstration of catch bonds between an integrin and its ligand. The Journal of Cell Biology. 185, (7), 1275-1284 (2009).
  14. Rakshit, S., Zhang, Y., Manibog, K., Shafraz, O., Sivasankar, S. Ideal catch, and slip bonds in cadherin adhesion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, (46), 18815-18820 (2012).
  15. del Rio, A., et al. Stretching Single Talin Rod Molecules Activates Vinculin Binding. Science. 323, (5914), 638-641 (2009).
  16. Seddiki, R., et al. Force-dependent binding of vinculin to alpha-catenin regulates cell-cell contact stability and collective cell behavior. Molecular Biology of the Cell. 29, (4), 380-388 (2018).
  17. Huang, D. L., Bax, N. A., Buckley, C. D., Weis, W. I., Dunn, A. R. Vinculin forms a directionally asymmetric catch bond with F-actin. Science. 357, (6352), 703-706 (2017).
  18. Chrzanowska-Wodnicka, M., Burridge, K. Rho-stimulated contractility drives the formation of stress fibers and focal adhesions. The Journal of Cell Biology. 133, (6), 1403-1415 (1996).
  19. Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin-cytoskeleton linkages. Cell. 88, (1), 39-48 (1997).
  20. Liu, Z., et al. Mechanical tugging force regulates the size of cell-cell junctions. Proceedings of the National Academy of Science. 107, (22), 9944-9949 (2010).
  21. Riveline, D., et al. Focal contacts as mechanosensors: externally applied local mechanical force induces growth of focal contacts by an mDia1-dependent and ROCK-independent mechanism. The Journal of Cell Biology. 153, (6), 1175-1186 (2001).
  22. Brevier, J., Vallade, M., Riveline, D. Force-extension relationship of cell-cell contacts. Physical Review Letters. 98, (26), 268101 (2007).
  23. Bershadsky, A., Kozlov, M., Geiger, B. Adhesion-mediated mechanosensitivity: a time to experiment, and a time to theorize. Current opinion in cell biology. 18, (5), 472-481 (2006).
  24. Chan, C. E., Odde, D. J. Traction dynamics of filopodia on compliant substrates. Science. 322, (5908), 1687-1691 (2008).
  25. Wu, Z., Plotnikov, S. V., Moalim, A. Y., Waterman, C. M., Liu, J. Two distinct actin networks mediate traction oscillations to confer focal adhesion mechanosensing. Biophysical Journal. 112, (4), 780-794 (2017).
  26. Fritzsche, M., Charras, G. Dissecting protein reaction dynamics in living cells by fluorescence recovery after photobleaching. Nature Protocols. 10, (5), 660-680 (2015).
  27. McNally, J. G. Quantitative FRAP in analysis of molecular binding dynamics in vivo. Methods of Cell Biology. 85, 329-351 (2008).
  28. Wehrle-Haller, B. Analysis of integrin dynamics by fluorescence recovery after photobleaching. Methods in Molecular Biology. 370, 173-202 (2007).
  29. Carisey, A., Stroud, M., Tsang, R., Ballestrem, C. Fluorescence recovery after photobleaching. Methods of Molecular Biology. 769, 387-402 (2011).
  30. Carisey, A., et al. Vinculin regulates the recruitment and release of core focal adhesion proteins in a force-dependent manner. Current Biology. 23, (4), 271-281 (2013).
  31. Wolfenson, H., Bershadsky, A., Henis, Y. I., Geiger, B. Actomyosin-generated tension controls the molecular kinetics of focal adhesions. Journal of Cell Science. 124, 1425-1432 (2011).
  32. Dumbauld, D. W., et al. How vinculin regulates force transmission. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, (24), 9788-9793 (2013).
  33. Zaidel-Bar, R., Itzkovitz, S., Ma'ayan, A., Iyengar, R., Geiger, B. Functional atlas of the integrin adhesome. Nature Cell Biology. 9, (8), 858-867 (2007).
  34. Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466, (7303), 263-266 (2010).
  35. LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Berginski, M. E., Urs, A. N., Hoffman, B. D. Construction, imaging, and analysis of FRET-based tension sensors in living cells. Biophysical Methods in Cell Biology. 125, 161-186 (2015).
  36. Meng, F., Suchyna, T. M., Sachs, F. A fluorescence energy transfer-based mechanical stress sensor for specific proteins in situ. The FEBS Journal. 275, (12), 3072-3087 (2008).
  37. Rothenberg, K. E., Scott, D. W., Christoforou, N., Hoffman, B. D. Vinculin Force-Sensitive Dynamics at Focal Adhesions Enable Effective Directed Cell Migration. Biophysical journal. 114, (7), 1680-1694 (2018).
  38. Austen, K., et al. Extracellular rigidity sensing by talin isoform-specific mechanical linkages. Nature Cell Biology. 17, (12), 1597-1606 (2015).
  39. Kumar, A., et al. Talin tension sensor reveals novel features of focal adhesion force transmission and mechanosensitivity. The Journal of Cell Biology. 213, (3), 371-383 (2016).
  40. Acharya, B. R., et al. Mammalian Diaphanous 1 Mediates a Pathway for E-cadherin to Stabilize Epithelial Barriers through Junctional Contractility. Cell Reports. 18, (12), 2854-2867 (2017).
  41. Borghi, N., et al. E-cadherin is under constitutive actomyosin-generated tension that is increased at cell-cell contacts upon externally applied stretch. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, (31), 12568-12573 (2012).
  42. Conway, D. E., Williams, M. R., Eskin, S. G., McIntire, L. V. Endothelial cell responses to atheroprone flow are driven by two separate flow components: low time-average shear stress and fluid flow reversal. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298, (2), H367-H374 (2010).
  43. Arsenovic, P. T., et al. Nesprin-2G, a Component of the Nuclear LINC Complex, Is Subject to Myosin-Dependent Tension. Biophysical Journal. 110, (1), 34-43 (2016).
  44. Ye, N., et al. Direct observation of alpha-actinin tension and recruitment at focal adhesions during contact growth. Experimental Cell Research. 327, (1), 57-67 (2014).
  45. Paszek, M. J., et al. The cancer glycocalyx mechanically primes integrin-mediated growth and survival. Nature. 511, (7509), 319-325 (2014).
  46. Gayrard, C., Borghi, N. FRET-based Molecular Tension Microscopy. Methods. 94, 33-42 (2016).
  47. de Beco, S., Gueudry, C., Amblard, F., Coscoy, S. Endocytosis is required for E-cadherin redistribution at mature adherens junctions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, (17), 7010-7015 (2009).
  48. Östlund, C., et al. Dynamics and molecular interactions of linker of nucleoskeleton and cytoskeleton (LINC) complex proteins. Journal of Cell Science. 122, (22), 4099-4108 (2009).
  49. Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. The interactions of retroviruses and their hosts. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor (NY). (1997).
  50. Komatsubara, A. T., Matsuda, M., Aoki, K. Quantitative analysis of recombination between YFP and CFP genes of FRET biosensors introduced by lentiviral or retroviral gene transfer). Scientific Reports. 5, 13283 (2015).
  51. Nasri, M., Karimi, A., Farsani, M. A. Production purification and titration of a lentivirus-based vector for gene delivery purposes. Cytotechnology. 66, (6), 1031-1038 (2014).
  52. Addgene, Generating Stable Cell Lines with Lentivirus. Available from: https://www.addgene.org/protocols/generating-stable-cell-lines (2016).
  53. Roederer, M. Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats. Cytometry: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 45, (3), 194-205 (2001).
  54. Malkani, N., Schmid, J. A. Some secrets of fluorescent proteins: distinct bleaching in various mounting fluids and photoactivation of cyan fluorescent proteins at YFP-excitation. PLoS One. 6, (4), e18586 (2011).
  55. Chen, H., Puhl, H. L. 3rd, Koushik, S. V., Vogel, S. S., Ikeda, S. R. Measurement of FRET efficiency and ratio of donor to acceptor concentration in living cells. Biophysical journal. 91, (5), L39-L41 (2006).
  56. Rothenberg, K. E., Neibart, S. S., LaCroix, A. S., Hoffman, B. D. Controlling Cell Geometry Affects the Spatial Distribution of Load Across Vinculin. Cellular and Molecular Bioengineering. 8, (3), 364-382 (2015).
  57. Carnell, M., Macmillan, A., Whan, R. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP): acquisition, analysis, and applications. Methods of Molecular Biology. 1232, 255-271 (2015).
  58. Trembecka, D. O., Kuzak, M., Dobrucki, J. W. Conditions for using FRAP as a quantitative technique--influence of the bleaching protocol. Cytometry A. 77, (4), 366-370 (2010).
  59. Lavelin, I., et al. Differential effect of actomyosin relaxation on the dynamic properties of focal adhesion proteins. PLoS One. 8, (9), e73549 (2013).
  60. Foote, H. P., Sumigray, K. D., Lechler, T. FRAP analysis reveals stabilization of adhesion structures in the epidermis compared to cultured keratinocytes. PLoS One. 8, (8), e71491 (2013).
  61. Zal, T., Gascoigne, N. R. Photobleaching-corrected FRET efficiency imaging of live cells. Biophysical Journal. 86, (6), 3923-3939 (2004).
  62. Hodgson, L., Shen, F., Hahn, K. Biosensors for characterizing the dynamics of rho family GTPases in living cells. Current Protocols in Cell Biology. 46, (1), (2010).
  63. Day, R. N. Measuring protein interactions using Förster resonance energy transfer and fluorescence lifetime imaging microscopy. Methods. 66, (2), 200-207 (2014).
  64. Rapsomaniki, M. A., et al. easyFRAP: an interactive, easy-to-use tool for qualitative and quantitative analysis of FRAP data. Bioinformatics. 28, (13), 1800-1801 (2012).
  65. Zamir, E., et al. Molecular diversity of cell-matrix adhesions. Journal of cell science. 112, (11), 1655-1669 (1999).
  66. Bakolitsa, C., et al. Structural basis for vinculin activation at sites of cell adhesion. Nature. 430, (6999), 583-586 (2004).
  67. De Los Santos, C., Chang, C. W., Mycek, M. A., Cardullo, R. FRAP, FLIM, and FRET: Detection and analysis of cellular dynamics on a molecular scale using fluorescence microscopy. Molecular Reproduction and Development. 82, (7-8), 587-604 (2015).
  68. Periasamy, A., Wallrabe, H., Chen, Y., Barroso, M. Chapter 22: Quantitation of protein-protein interactions: confocal FRET microscopy. Methods in Cell Biology. 89, 569-598 (2008).
  69. Stehbens, S., Pemble, H., Murrow, L., Wittmann, T. Imaging intracellular protein dynamics by spinning disk confocal microscopy. Methods in Enzymology. 293-313 (2012).
  70. Zeug, A., Woehler, A., Neher, E., Ponimaskin, E. G. Quantitative intensity-based FRET approaches--a comparative snapshot. Biophysical Journal. 103, (9), 1821-1827 (2012).
  71. Ehrlicher, A. J., Nakamura, F., Hartwig, J. H., Weitz, D. A., Stossel, T. P. Mechanical strain in actin networks regulates FilGAP and integrin binding to filamin A. Nature. 478, (7368), 260-263 (2011).
  72. Guo, B., Guilford, W. H. Mechanics of actomyosin bonds in different nucleotide states are tuned to muscle contraction. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103, (26), 9844-9849 (2006).
  73. Lee, C. Y., et al. Actin depolymerization under force is governed by lysine 113:glutamic acid 195-mediated catch-slip bonds. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, (13), 5022-5027 (2013).
  74. Cost, A. L., Ringer, P., Chrostek-Grashoff, A., Grashoff, C. How to Measure Molecular Forces in Cells: A Guide to Evaluating Genetically-Encoded FRET-Based Tension Sensors. Cellular and Molecular Bioengineering. 8, (1), 96-105 (2015).
  75. Bertocchi, C., et al. Nanoscale architecture of cadherin-based cell adhesions. Nature Cell Biology. 19, (1), 28-37 (2017).
  76. Case, L. B., et al. Molecular mechanism of vinculin activation and nanoscale spatial organization in focal adhesions. Nature Cell Biology. 17, (7), 880-892 (2015).
  77. Chen, H., Cohen, D. M., Choudhury, D. M., Kioka, N., Craig, S. W. Spatial distribution and functional significance of activated vinculin in living cells. The Journal of Cell Biology. 169, (3), 459-470 (2005).
  78. Kim, T. J., et al. Dynamic visualization of alpha-catenin reveals rapid, reversible conformation switching between tension states. Current Biology. 25, (2), 218-224 (2015).
  79. Yao, M., et al. Mechanical activation of vinculin binding to talin locks talin in an unfolded conformation. Scientific reports. 4, 4610 (2014).
Mätning av kraft-känsliga Protein Dynamics i levande celler med hjälp av en kombination av fluorescerande tekniker
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rothenberg, K. E., Puranam, I., Hoffman, B. D. Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques. J. Vis. Exp. (141), e58619, doi:10.3791/58619 (2018).More

Rothenberg, K. E., Puranam, I., Hoffman, B. D. Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques. J. Vis. Exp. (141), e58619, doi:10.3791/58619 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter