Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Fluorimetrische technieken voor de beoordeling van sperma membranen

Published: November 28, 2018 doi: 10.3791/58622
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Animal Sperm Research Center, Department of Animal Sciences, Robert H. Smith Faculty of Agriculture, Food and Environment, Hebrew University of Jerusalem, 2Department of Animal Sciences, Robert H. Smith Faculty of Agriculture, Food and Environment, Hebrew University of Jerusalem

Summary

Hier presenteren we methodologieën voor evaluatie van spermatozoan membraan integriteit, een cellulaire functie sperma bevruchting bevoegdheid is gekoppeld. We beschrijven drie technieken voor de beoordeling van de fluorimetrische van sperma membranen: gelijktijdige kleuring met specifieke fluorescerende sondes, fluorescentie microscopie en geavanceerde sperma-dedicated stroom cytometry. Voorbeelden van het combineren van de methoden worden ook gepresenteerd.

Abstract

Standaard spermiograms beschrijving van de kwaliteit van het sperma zijn meestal gebaseerd op de fysiologische en visuele parameters, zoals het volume van ejaculaat en concentratie, beweeglijkheid en progressieve mobiliteit, en sperma morfologie en levensvatbaarheid. Echter, geen van deze evaluaties is goed genoeg om te voorspellen van de kwaliteit van sperma. Gezien het feit dat onderhoud van sperma levensvatbaarheid en bevruchting potentiële hangt af van membraan integriteit en intracellulaire functionaliteit, evaluatie van deze parameters in staat kan stellen een betere voorspelling van sperma bevruchting bevoegdheid. Hier beschrijven we drie haalbare methoden voor evaluatie van de kwaliteit van het sperma met behulp van specifieke fluorescerende sondes gecombineerd met fluorescentie microscopie en stroom cytometry analyses. Analyses beoordeeld plasmamembraan integriteit met behulp van 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) en propidium jodide (PI), acrosomal membraan integriteit met fluoresceïne isothiocyanaat-geconjugeerde Pisum sativum agglutinin (FITC-PSA) en mitochondriale membraan integriteit met behulp van 5, 5', 6, 6'-tetra-chloro-1, 1', 3, 3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine jodide (JC-1). Combinaties van deze methoden worden ook gepresenteerd. Bijvoorbeeld, gebruik van Annexine V gecombineerd met PI fluorochromes maakt beoordeling van apoptosis en de berekening van het aandeel van apoptotic sperma (apoptotic index). Wij zijn van mening dat deze methodieken, die gebaseerd zijn op het onderzoek van de zaadcel membranen, zeer nuttig voor de beoordeling van de kwaliteit van het sperma zijn.

Introduction

Integriteit en functionaliteit van sperma membranen zijn enkele van de factoren die sperma levensvatbaarheid en bevruchting potentiële aangeeft. Het plasma-membraan fungeert als een beveiligingsbarrière tussen intracellulaire en extracellulaire compartimenten, waardoor het behoud van de cellulaire osmotische evenwicht1. Elke stress die schade aan de integriteit van het plasmamembraan induceert kan afbreuk doen aan de homeostase, levensvatbaarheid en bevruchting capaciteitsvermindering en verhogen van celdood. Bijvoorbeeld, vermindert cryopreservatie sperma levensvatbaarheid verschuldigd aan schade aan haar plasmamembraan, als gevolg van temperatuurveranderingen en osmotische stress2. We eerder gemeld dat het sperma van de stier aan lage concentraties van foodborne contaminanten zoals het pesticide atrazine, haar belangrijkste metaboliet diaminochlorotriazine of de mycotoxine aflatoxine B1, bloot vermindert sperma levensvatbaarheid1,3 . Dit werd bepaald door het dubbelstrengig DNA met DAPI labeling in combinatie met PI, dat aan het DNA van cellen met een beschadigde plasma-membraan bindt.

Acrosoom reactie (AR) gaat de fusie van de buitenste Acrosoom membraan en de bovenliggende plasmamembraan resulterend in de release van acrosomal enzymen4,5. Dit zijn essentiële gebeurtenissen voor zona-zitten penetratie en verdere samenvoegen van de zaadcellen met de oöcyt6. Evaluatie van acrosomal membraan integriteit vormt daarom een nuttige parameter om de kwaliteit van het sperma en de mannelijke vruchtbaarheid7,8,9te evalueren. Verschillende TL technieken zijn geschikt voor de verificatie van de integriteit van het Acrosoom, FITC-PNA of FITC-PSA8,10. In onze eerdere studies, met behulp van de patronen van FITC-PSA kleuring1,3, wij nauwkeurige definities voor (i) intact Acrosoom, (ii) beschadigd Acrosoom membraan en (iii) reageerde Acrosoom. In het onderhavige verslag, we behulp van sperma-dedicated stroom cytometry van de status van de Acrosoom evalueren en vergelijken de resultaten met behulp van fluorescentie microscopie.

De mitochondriën zijn multifunctionele organellen betrokken in, onder andere dingen, ATP synthese, reactieve zuurstof soorten productie, calcium signalering en apoptosis. Fysiologische stoornissen, met inbegrip van mannelijke en vrouwelijke onvruchtbaarheid, zijn gekoppeld aan gewijzigde mitochondriale functie11. Sperma mitochondriën zijn gerangschikt in de midpiece en een cruciale rol in12beweeglijkheid van sperma. Het wordt goed geaccepteerd dat hoge Mitochondriale membraanpotentiaal (ΔΨm) geassocieerd met normale beweeglijkheid en hoge bevruchting capaciteit13 wordt. In tegenstelling, lage ΔΨm wordt geassocieerd met een verhoogd niveau van reactieve zuurstof soorten en bevruchting tarief14verminderd. Niettemin, verschillende ecologische verbindingen, bijvoorbeeld endocriene verstoorders, kunnen induceren van cellulaire spanning en leiden tot een tijdelijke toename van de ΔΨm, hyperpolarisatie1,3, verhoogde productie van vrije radicalen en uiteindelijk, Apoptosis15. De fluorescente sonde 5, 5', 6, 6'-tetra-chloro-1, 1', 3, 3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine jodide (JC-1) kan bijvoorbeeld onderzoek naar de effecten van foodborne toxines op sperma ΔΨm1,3.

Standaard spermiograms, op basis van fysiologische en morfologische parameters, zijn niet goed genoeg om te voorspellen sperma kwaliteit. Nauwkeuriger methoden zijn verplicht om de kwaliteit van het sperma. Hier bieden we twee haalbaar methoden voor het bepalen van de kwaliteit van het sperma op basis van evaluaties van sperma membranen: gelijktijdige vierpersoonskamers kleuring met specifieke fluorescerende sondes en fluorescentie microscopie, beschreven in onze studies1,3 en geavanceerde sperma-dedicated stroom cytometry, onlangs gebruikt in ons laboratorium, en al worden gebruikt door anderen16,17,18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle van de experimenten werden uitgevoerd volgens de Israëlische richtsnoeren van 1994 voor het welzijn van dieren. Boviene sperma werd geleverd door Israëlische handelsvennootschap voor kunstmatige inseminatie en fokken. Ejaculeert van 11 stieren werden in deze studie geëvalueerd.

1. sperma proeven voorbereiding

Opmerking: De procedure is gebaseerd op het Roth laboratory's protocol1,3.

  1. Verkrijgen van ongeveer 1 – 6 mL rundersperma in een tube van 15 mL bij kamertemperatuur.
  2. Aan elke 1 mL sperma, voeg 6 mL voorverwarmde (bij 37 ° C) NKM buffer (110 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM MOPS [3-N-morphilino-propanesulfonic zuur; pH 7.4]) en centrifugeer voor 8 min op 600 x g, 1 – 2 keer totdat het supernatans is duidelijk.
    Opmerking: Als sperma concentratie of het oorspronkelijke volume zeer hoog zijn, opgesplitst in twee buizen op de eerste wasbeurt.
  3. Onmiddellijk verwijderen en de duidelijke vloeistof wordt weggeworpen en laat ongeveer 1 cm van het supernatans dat boven de pellet.
  4. Zorgvuldig mager de buizen in een hoek van 30° te verhogen van de oppervlakte voor zaadcellen zwemmen omhoog en wacht 20 – 30 min zodat spermacellen zwemmen omhoog bij 37 ° C.
    Opmerking: Troebelheid kan worden gezien.
  5. Met behulp van een micropipet zorgvuldig, verwijder de bovenste 1 mL van het supernatans dat met de motile spermacellen tot een nieuwe 1,5 mL koker.
  6. Houd het sperma bij 37 ° C tot gebruik.
  7. Schatten van de zaadcellen tellen met behulp van een Neubauer-hemocytometer.
    Opmerking: In plaats daarvan een verschillende tellen kamer kan worden gebruikt, maar de telling is anders.
    1. Om te voorkomen dat een zaadcel beweging, Verdun 100 µL van de motile spermacellen met 10 mL dubbel gedestilleerd water (DDW) (1:100 verdunning) in een tube van 15 mL en meng voorzichtig.
    2. Laad 10 µL van het monster in elke zijde van de hemocytometer en dekglaasje aan. Zorg ervoor dat u voorkomen luchtbel vorming binnen de kamer zoals dit in een onjuiste sperma telling resulteren kan.
    3. Observeren onder een samengestelde microscoop met een 20 X doelstelling.
      Opmerking: De volledige grid op een hemocytometer bevat 9 grote pleinen, elke 1 mm2en het dekglaasje berust 0.1 mm boven de vloer van de kamer. Dus, het volume over het centrale tellen gebied is 0.1 mm3 of 0.1 µL. Het centrale gedeelte van de hemocytometer bevat de 25 middelgrote pleinen en elk medium vierkant heeft 16 kleinere vierkantjes met enkele lijnen.
    4. Tel het totale aantal cellen gevonden in 4 middelgrote hoek pleinen en het centrale plein. Voor hogere precisie, tellen twee kamers (beide zijden van de Neubauer-hemocytometer) en gebruiken om het gemiddelde te berekenen van de concentratie van de cel.
    5. Bereken het sperma door te vermenigvuldigen met het gemiddelde aantal verkregen door 5 (om het aantal cellen per gebied tellen) en 10.000 (om het aantal cellen per 1 mL verdunde monster). Vervolgens vermenigvuldigt u de verkregen telling met de verdunningsfactor (1:100).
      Opmerking: Bijvoorbeeld, een gemiddeld aantal zaadcellen geteld in 5 van de 25 middelgrote vierkantjes binnen het centrum tellen van twee kamers is 150 ([152 + 148] / 2). Zo is het gemiddelde aantal zaadcellen per kamer (of per 0.1 µL) 150 x 5 = 750. 750 door 10.000 voor het verkrijgen van het aantal cellen per 1 mL verdunde monster (7.500.000) en dan te vermenigvuldigen met 100 (verdunningsfactor) te verkrijgen van 75 x 107 cellen per mL van de originele sperma monster vermenigvuldigen.

2. techniek #1: Simultane evaluatie van sperma membranen met behulp van meerdere TL Probes

Opmerking: Sperma membranen (plasma, acrosomal en mitochondriale) zijn beoordeeld zoals eerder beschreven door Celeghini et al.10, met enkele wijzigingen. Epifluorescerende microscopie werd gebruikt, in combinatie met een digitale camera met excitatie bij 450-490 nm en emissie bij 515-565 nm met behulp van een triple filter.

  1. Bereiden van stamoplossingen.
    1. Bereiden 0,1 mg/mL stockoplossing DAPI door ontbinding van de DAPI 5 mg in 50 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Bereiden van 50 µL aliquots en opgeslagen bij-20 ° C. Vóór gebruik, Verdun de stockoplossing met PBS op 1:10 (werkoplossing, 10 µg/mL).
    2. Bereiden 1 mg/mL stockoplossing FITC-PSA door ontbinding van 1 mg van FITC-PSA in 1 mL PBS. Bereiden van 50 µL aliquots en opgeslagen bij-20 ° C. Vóór gebruik, Verdun de stockoplossing met PBS op 1:10 (werkoplossing, 100 µg/mL).
    3. 1 mg/mL JC-1 stamoplossing bereid door ontbinding van 1 mg van JC-1 in 1 mL dimethylsulfoxide (DMSO). 10 µL aliquots bereiden en opgeslagen bij-20 ° C. Vóór gebruik, Verdun de stockoplossing met DMSO op 1:10 (werkoplossing; 0,1 mg/mL).
    4. Bereid de PI-stockoplossing door ontbinding van 10 mg van PI in 400 µL van PBS (het geven van 2,5 mg/mL). Opslag bij + 4 ° C. Verdun voorraad 1 met PBS op 1:20 (werkoplossing; 0,125 mg/mL). Als een stamoplossing bij + 4 ° C worden opgeslagen.
      Let op: PI is een potentiële mutagene stof en moet met zorg worden behandeld. De kleurstof afvoeren veilig en in overeenstemming met toepasselijke lokale regelgeving.
  2. Breng 133 µL van de motile spermacellen (stap 1.5) tot een nieuwe 1,5 mL koker (25 x 106 sperma/mL).
    Opmerking: Als de concentratie van het monster hoger is, Verdun het in NKM buffer te bereiken van de vereiste concentratie; de concentratie van het monster van het zwemmen up monster lager is, Centrifugeer het verkregen supernatant na het zwemmen up bij 1.000 x g gedurende 5 min, verwijderen van 0,5 mL van het supernatans dat als het sperma telling weer.
  3. Voeg 17 µL van de DAPI (werkende oplossing) en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 ° C.
  4. Centrifugeer bij 1.000 x g gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant.
  5. Om de pellet, voeg 100 µL van NKM buffer.
  6. Voeg 50 µL van FITC-PSA, 2 µL van JC-1 en 3 µL van PI (werkt oplossingen) en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 ° C.
  7. Centrifugeer bij 1.000 x g gedurende 5 minuten en verwijder de bovendrijvende substantie.
  8. De pellet, voeg 40 µL van NKM buffer en resuspendeer door pipetteren.
  9. 10 µL van het monster overbrengen in een glasplaatje, uitstrijkjes en dekglaasje aan.
  10. Visualiseer onmiddellijk door epifluorescence microscopie (gebruik 40 x doelstelling) met een drievoudige filter, uitgerust met een digitale camera en een afbeelding voor elk filter afzonderlijk vastleggen.
    Opmerking: Er is geen betekenis volgorde van filters gevisualiseerd.
    1. Visualiseren onder DAPI kanaal met excitatie op 358 nm en emissie bij 461 nm.
    2. Visualiseer onder FITC kanaal voor groene monomeren met excitatie bij 450 – 490 nm en emissie bij 515-565 nm.
    3. Visualiseren onder PI kanaal voor rode aggregaten met excitatie op 488 nm en emissie bij 590 nm.
    4. Visualiseren onder JC-1 rode aggregaten met excitatie op 559 nm en emissie in de range van 574-627 nm; JC-1 groene monomeren met excitatie op 488 nm en emissie in het bereik van 500 – 535 nm.
  11. Het samenvoegen van de drie afbeeldingen van de filters in JPG/JPEG-indeling, met de optie 'samenvoegen' van de camerasoftware ontvangen.
  12. Open de samengevoegde afbeelding met "Verf" gereedschap en gebruik de optie penseel ter gelegenheid van de getelde spermacellen.
  13. Classificeren spermacellen op basis van de fluorescentie uitgestoten van elke sonde:
    1. In het algemeen evalueren ten minste 200 spermacellen per dia — alle cellen worden in blauw weergegeven (DAPI).
    2. Beoordelen van de levensvatbaarheid door dode cellen te tellen, die paars (PI [red] + [blue] DAPI) en bereken het percentage van de dode cellen (de dode cellen/totaal geteld cellen x 100) verschijnen.
    3. Evalueren Acrosoom status met behulp van de patronen van het fluorescerende vlekken (FITC-PSA). De percentages van de verschillende patronen (intact, beschadigde of gereageerde Acrosoom cellen/totaal geteld cellen x 100) te berekenen.
      Opmerking: Beschadigde acrosomal membraan wordt weergegeven als een volledig gekleurd, groene Acrosoom GLB; Uitgereageerd acrosomal membraan toont residuele groene equatoriale bovenste of onderste kleuring; cellen met intact acrosomal membraan zal niet vertonen groene verkleuring van de acrosomal regio.
    4. ΔΨm evalueren door onderscheid te maken van spermacellen met hoge ΔΨm, die vertonen een midpiece rood-gekleurd en spermacellen met lage ΔΨm die vertonen een groen-gekleurde midpiece. Tellen rood en groen midpieces afzonderlijk en berekenen van hun verhouding (rood/groen).

3. techniek #2: Beoordeling van sperma membranen met kant-en-klare Kits en Stroom Cytometry

Opmerking: Beoordeling van plasma membraan integriteit, mitochondriale membraan potentiële en acrosomal membraan integriteit werd uitgevoerd met kant-en-klare stroom cytometry kits met gelyofiliseerd fluorochromes in elk putje. De procedure werd uitgevoerd volgens de fabrikanten met enkele wijzigingen.

  1. Plasma membraan integriteit evaluatie
    1. Neem het gewenste aantal putten uit het pakket van levensvatbaarheid en concentratie kit (PI en SYbr14), overbrengen naar de werkende base en bedek met een flexibele deksel (beschermen tegen licht).
    2. Voeg 199 µL van gebufferde oplossing voor cytometry per putje.
    3. Voeg 1 µL van homogene sperma 57 x 106/mL (57.000 cellen per putje) en meng door pipetteren.
    4. De afdekplaat met de zwarte deksel.
    5. Incubeer gedurende 10 minuten bij 37 ° C beschermd tegen licht.
    6. Het monster doorlopen met de cytometer van de stroom met de instelling 'levensvatbaarheid'.
  2. Mitochondriale membraanpotentiaal
    1. Neem het gewenste aantal putten uit het pakket van mitochondriale activiteit kit (JC-1), overbrengen naar de werkende base en bedek met een flexibele deksel (beschermen tegen licht).
    2. Voeg 10 µL van absolute ethanol per putje en Pipetteer om resuspendeer de poeder aanwezig in de put.
    3. Voeg 190 µL van PBS per putje en meng door pipetteren.
    4. Voeg 0,75 µL van homogene sperma 57 x 106/mL (50.000 cellen per putje) en meng door pipetteren.
    5. De afdekplaat met de zwarte deksel.
    6. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C beschermd tegen licht.
    7. Het monster te doorlopen van de cytometer van de stroom met de instelling ʽmitochondrial activiteit '.
  3. Acrosomal membraan integriteit
    Opmerking: FITC-PSA kleuring (zie techniek #1) kan de evaluatie van de 3 Acrosoom categorieën (intact Acrosoom, gereageerde Acrosoom en beschadigde Acrosoom). Gebruik de stroom cytometer en levensvatbaarheid & Acrosoom integriteit kit (PI en FITC-PNA), zijn de spermacellen onderverdeeld in deze 3 categorieën.
    1. Neem het gewenste aantal putten uit het pakket van levensvatbaarheid & Acrosoom integriteit kit, overbrengen naar de werkende base en bedek met een flexibele deksel (beschermen tegen licht).
    2. Voeg 200 µL van gebufferde oplossing voor cytometry per putje.
    3. Voeg 0,7 µL van homogene sperma 57 x 106/mL (40.000 cellen per putje) en meng door pipetteren.
    4. De afdekplaat met de zwarte deksel.
    5. Incubeer gedurende 45 minuten bij 37 ° C beschermd tegen licht.
    6. Het monster te doorlopen van de cytometer van de stroom met de instelling ʽInCyte'.
    7. Analyseren van het resulterende histogram door drie gebieden van de markering volgens de intensiteit van de fluorescentie gating, vertegenwoordigen te verwaarlozen, lage-fluorescerende cellen met intact, onbevlekt Acrosoom (R1), laag-fluorescerende cellen met resterende deel van het Acrosoom (R2) gekleurd en sterk fluorescerende cellen met een verstoorde Acrosoom (R3).
      Opmerking: De sectie "analyseren van bestanden die zijn verworven met behulp van andere modules" in de gebruikershandleiding van het instrument gebruiken om het maken van de drie gewesten (R1, R2, R3).

4. techniek #3: Beoordeling van sperma membranen met behulp van fluorescerende sondes en Stroom Cytometry

Opmerking: Gebruik van Annexine V gecombineerd met PI fluorochromes maakt beoordeling van apoptosis en de berekening van het aandeel van apoptotic sperma (apoptotic index).

  1. 1 x Annexine V bindende buffer van 20 x stockoplossing (verdund 500 µL van Annexine V bindende buffer 20 x stockoplossing met 9.5 mL steriel gedistilleerd water) voor te bereiden.
  2. Schatten van de zaadcellen tellen met behulp van een hemocytometer Neubauer, zoals beschreven in paragraaf 1.7.
  3. Wassen 106 spermacellen in 1 mL 1 x Annexine V bindende buffer en centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 minuten.
  4. Het supernatant volledig gecombineerd.
  5. Resuspendeer de pellet in 100 µL van 1 x V bindende buffer Annexine.
  6. Voeg 10 µL van Annexine V geconjugeerd met FITC.
  7. Meng goed en incubeer gedurende 15 min. in het donker bij kamertemperatuur.
  8. Wassen spermacellen door toevoeging van 1 mL 1 x Annexine V bindende buffer per 106 cellen en centrifuge bij 300 x g gedurende 10 minuten.
  9. Het supernatant volledig gecombineerd.
  10. Resuspendeer de pellet cel in 500 µL van 1 x Annexine V bindende buffer per 106 totaal aantal cellen.
  11. Voeg 1 µg/mL PI onmiddellijk vóór de analyse met een stroom-cytometer.
  12. Het monster te doorlopen van de stroom cytometer ingesteld op ʽInCyte'.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figuur 1 toont gelijktijdige fluorimetrische beoordeling van sperma membranen (plasma, acrosomal en mitochondriale) met behulp van PI, DAPI, FITC-PSA en JC-1. Beoordeling van sperma membranen met behulp van gelijktijdige kleuring met vier TL sondes toelaat, bijvoorbeeld, evaluatie van het aandeel van zaadcellen in elke categorie — live vs. doden; hoge vs. lage ΔΨm; intact vs. beschadigd Acrosoom — gelijktijdig voor elke zaadcel.

Figuur 2 presenteert resultaten van sperma membraan evaluatie met fluorimetrische sondes. Alleen sperma die ten minste 80% motile spermacellen werden gebruikt in het experiment. Minstens 200 cellen werden onderzocht per stier. Het was mogelijk om te evalueren van de verschillen in kwaliteit van het sperma monster in termen van de membraan integriteit. Bijvoorbeeld, het ejaculaat van stier no. 7 had een relatief lage percentage van dode cellen, een geringe aantal zaadcellen met pseudo Acrosoom en hogere Mitochondriale membraanpotentiaal, ten opzichte van het ejaculaat van stier nr.1 gereageerd.

Figuur 3 toont representatieve steekproeven geëvalueerd voor levensvatbaarheid (figuur 3A-3 C) en de mitochondriale activiteit (figuur 3D-3F). Intensiteit van de fluorescentie van de monsters werden beoordeeld door een toegewijde microcapillary sperma doorstroming cytometer, met speciale software. Deze stroom cytometer bevat één solid-phase blauwe laser (448 nm) en twee fotodiodes: scatter en kant scatter toekomen. Het meet specifiek sperma emissie-eigenschappen met drie fotomultiplicator buizen (groene: 525/30 nm, geel: 583/26 nm; rood: 655/50 nm) en optische filters en splitters16herbergt. Hierdoor evaluatie van 5.000 spermacellen per analyse.

De levensvatbaarheid evaluatiekit bevat een sonde met differentiële permeabiliteit levensvatbare (intact plasmamembraan) te doden (beschadigde plasmamembraan) spermacellen (Figuur 3 c). Sperma ΔΨm werd beoordeeld met behulp van een kit die een onderscheid tussen maakt gepolariseerd mitochondriale membraan (fluorescentie verschijnen in oranje) en depolarized van de mitochondriale membraan (fluorescentie verschijnen in het groen) (figuur 3F).

Figuur 4 presenteert een evaluatie van Acrosoom integriteit uitgevoerd met de kant-en-klare kit, lezen met de stroom cytometry (cijfers 4A-4 C), de resulterende histogram van gated spermacellen te verdelen in drie gebieden van de markering, dat verwaarloosbaar laag-fluorescerende cellen weergeeft met intact, onbevlekt Acrosoom (R1), laag-fluorescerende cellen met het resterende deel van het Acrosoom (R2) gekleurd en sterk fluorescerende cellen met verstoorde Acrosoom (R3).

Tabel 1 geeft een vergelijking van de twee fluorimetrische technieken voor de beoordeling van sperma membranen. De dezelfde spermastaaltje uit drie verschillende stieren werden geëvalueerd voor de levensvatbaarheid, de Mitochondriale membraanpotentiaal (ΔΨm) en de Acrosoom integriteit met behulp van gelijktijdige vierpersoonskamers kleuring evenals stroom cytometry. Deze vergelijking is zeer belangrijk, omdat het toont de overeenkomende resultaten met behulp van elk van de twee technieken. Gegevens werden geanalyseerd door een analyse en van de Student t-test. Er werden geen statistisch significante verschillen waargenomen.

Figuur 5 toont een representatieve steekproef geëvalueerd voor apoptose met behulp van Annexine V (AV) en propidium jodide (PI) fluorochromes. Gebruik van deze twee sondes maakt onderscheid tussen vier patronen die aangeeft levensvatbare cellen (AV-, PI-), vroege apoptotic cellen (AV +, PI-), apoptotic cellen (AV +, PI +) en necrotische cellen (AV-, PI +).

Figure 1
Figuur 1: Epifluorescence photomicrography van spermatozoïden gekleurd gelijktijdig met verschillende TL sondes. (A) simultaan kleuring met vier sondes PI, DAPI, FITC-PSA en JC-1) (B) Live zaadcel met DAPI kleuring van nucleus en hoge Mitochondriale membraanpotentiaal (ΔΨm), gekleurd met JC-1 sonde. (C) dode zaadcel met beschadigde plasmamembraan gekleurd met PI sonde, beschadigd Acrosoom gekleurd met FITC-PSA sonde en lage ΔΨm. (D) Live, Acrosoom-reageerde zaadcel met residuele equatoriale kleuring en lage ΔΨm. (E) Live, Acrosoom-reageerde zaadcel met overblijvende bovenste kleuring en hoge ΔΨm. Schaal bars = 10 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: evaluatie van stier sperma membranen met fluorimetrische sondes. (A) sperma levensvatbaarheid met fluorescerende sondes 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) en propidium jodide (PI) werd vastgesteld. (B) Acrosoom status werd bepaald volgens FITC-PSA kleuring patronen. Het percentage spermacellen met gereageerde Acrosoom zijn gepresenteerd. (C) Mitochondriale membraanpotentiaal (ΔΨm) werd geëvalueerd met behulp met JC-1 tl sonde en gepresenteerd als de verhouding tussen de gemiddelde verhouding van rode gebeitste (hoog potentieel) en groene gebeitste (lage potentiële) sperma. Gegevens worden gepresenteerd als percentage van cellen uit totale beoordeeld op cellen. Minstens 200 spermacellen werden geanalyseerd per stier. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: levensvatbaarheid (A-C) en mitochondriale activiteit (D-F) beoordeling van de fluorescentie van representatieve monsters gemeten door EasyCyte stroom cytometer. Histogrammen vertegenwoordigen ungated spermacellen en puin (A, D), gated spermacellen (B, E), verdeling van spermatozoïden levensvatbare (groen) te doden (rood) cellen (C) en verdeling van spermatozoïden gepolariseerde (geel) en depolarized) groen) mitochondriale membraan (F). Schaal bars = 10 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: beoordeling van de fluorescentie van Acrosoom integriteit van representatieve monsters gemeten door EasyCyte stroom cytometer. (A) Histogram van ungated spermatozoïden en puin. (B, C) Histogrammen van gated spermacellen met evaluatie van Acrosoom integriteit uitgevoerd met kant-en-klare kit, lezen met aangepaste instelling 'InCyte', het verdelen van de resulterende histogram van gated spermacellen in drie gebieden van de marker, vertegenwoordigen te verwaarlozen, lage-fluorescerende cellen met intact, onbevlekt Acrosoom (R1), laag-fluorescerende cellen met het resterende deel van de Acrosoom (R2) en zeer fluorescerende cellen met een gekleurd verstoord Acrosoom (R3). Schaal bars = 10 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Gemiddelde geen van de cellen Vialbility Mitochondriale membraanpotentiaal Acrosoom integriteit
Levensvatbare Dood Depolarized Gepolariseerde Rood/groen verhouding Intact Acrosoom Uitgereageerd Acrosoom Verstoorde Acrosoom
Vierpersoonskamer kleuring 253 32.7 ± 1,53% 67.3 ± 1,53% 65.7 ± 2,25% 34.3 ± 2,52% 0,5 ± 0,06 37,3 ± 7,2% 38.0 ± 5,7% 24.3 ± 3,0%
Stroom Cytomtery 5.000 32.3 ± 2.08% 67.7 ± 2.08% 65,0 ± 1,00% 35.0 ± 1,00% 0,5 ± 0,02 39.5 ± 5,7% 39.5 ± 6,5% 21.0 ± 8,0%

Tabel 1: vergelijking van de twee fluorimetrische technieken voor de beoordeling van sperma membranen. De dezelfde spermastaaltje werden geëvalueerd voor de levensvatbaarheid, Mitochondriale membraanpotentiaal en Acrosoom integriteit met behulp van gelijktijdige vierpersoonskamers kleuring en stroom cytometry. Gegevens worden gepresenteerd zoals bedoel deel ± SD van de behandelde cellen, berekend voor 3 wordt gerepliceerd.

Figure 5
Figuur 5: Annexine V en PI fluorescentie van een representatief monster gemeten door een stroom cytometer. Histogrammen vertegenwoordigen (A) ungated spermatozoïden en puin en (B) distributie van de gated spermacellen te vroege apoptotic (AV +, PI-), apoptotic (AV +, PI +), levensvatbare (AV-PI) en necrotisch (AV-, PI +) cellen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Sperma bevruchting potentiële hangt af van meerdere factoren als gevolg van de kwaliteit. Een hoge concentratie van spermatozoïden en een groot aantal zeer geleidelijk motile spermacellen kunnen hoge kwaliteit sperma te worden overwogen. Echter een dergelijke evaluatie doet niet rekening houden met andere cellulaire en functionele parameters. Het gebruik van 'bench-top' microcapillary stroom cytometer kunnen gemakkelijk aan te passen aan de evaluatie van verschillende sperma structuren met behulp van fluorescerende sondes, eerder getoond door anderen17 en hierin wel gebleken (techniek #3). Sperma Acrosoom integriteit is bijvoorbeeld zeer belangrijk voor het voorkomen van succesvolle natuurlijke bevruchting en blijft daarom, met precieze evaluatie van de status van de acrosomal. Een dergelijke evaluatie kan gemakkelijk worden uitgevoerd door indeling Acrosoom toestand met behulp van de patronen van fluorescerende vlekken (FITC-PSA, FITC-PNA, dat wil zeggen, techniek #1, zoals eerder is beschreven)1,3. In het bijzonder, is het zeer belangrijk om te bepalen van het aandeel van zaadcellen met intact Acrosoom (dat wil zeggen, vertoont een onbevlekt Acrosoom) ten opzichte van mensen met beschadigde Acrosoom. Met betrekking tot het laatstgenoemde, sperma met beschadigde Acrosoom kan vertonen (i) een volledig gekleurd acrosomal cap, waarmee wordt aangegeven dat het membraan is beschadigd, waardoor de kleurstof stromen door het membraan naar de Acrosoom vesikel; (ii) Acrosoom hebben gereageerd sperma die alleen residuele Acrosoom inhoud, die aangeeft dat de AR zich al heeft voorgedaan (d.w.z., pseudo AR) vertonen. Opgemerkt moet worden dat een dergelijke evaluatie kan ook worden uitgevoerd met de speciale stroom cytometer.

De kant-en-klare levensvatbaarheid & Acrosoom integriteit kit definieert de levensvatbaarheid van beide sperma (levensvatbaar of dood) en acrosomal integriteit (intact of verstoord). Hier, wij stellen voor de drie bovengenoemde acrosomal statussen definiëren met behulp van de speciale stroom cytometer (d.w.z., intact, beschadigd, reageerde). We de microcapillary stroom cytometer platform voor nauwkeuriger evaluatie, waarmee de zaadcellen Acrosoom hebben gereageerd (dat wil zeggen, lage fluorescentie) aangepast terwijl ze uitsluiten voor mensen met een verstoorde Acrosoom (hoge fluorescentie), in plaats van met inbegrip van hen met degenen die een intact Acrosoom. Dit geeft een nauwkeurige aandeel van zaadcellen met functionele of deactiveren Acrosoom. Sperma met gereageerde Acrosoom evenals verstoord acrosomal membraan hebben verloren hun vermogen om te bevruchten de oöcyt. Daarnaast nauwkeurige analyse mogelijk licht werpen op de onderliggende Acrosoom wijziging, dat wil zeggen mechanisme, beschadigd Acrosoom membraan vs. pseudo Acrosoom activering.

We vergeleken de resultaten met techniek #1 en #2 van de techniek, en vonden grote compatibiliteit tussen hen, in het bijzonder bij de evaluatie van de haalbaarheid en de ΔΨm (tabel 1). Een van de belangrijkste voordelen van het gebruik van de de speciale stroom cytometer is het grote aantal geëvalueerde spermacellen ten opzichte van het kleine aantal spermacellen die in de praktijk worden geëvalueerd door fluorescentie microscopie en sondes (duizenden vs. honderden, respectievelijk ). Bovendien, de laatste procedure is tijdrovend en subjectief, zelfs wanneer uitgevoerd door een ervaren waarnemer. Als stroom cytometry alleen partikel-geassocieerde fluorescentie detecteert, behoeft niet te wassen van de niet-afhankelijke sonde van de oplossing, die een tijdrovende stap17 is. Aan de andere kant, kunt de fluorimetrische beoordeling van sperma membranen in techniek #1 beschreven gelijktijdige evaluatie van meerdere membranen. We konden maar liefst vier TL sondes samen1,3gebruikt.

Tot slot moet opgemerkt worden dat de specifieke stroom cytometer werd ontwikkeld als een open assay module, alle van de basisinstrumenten voorzien van acquisitie en data-analyse van monster. De overname-functie kunt verzamelen van verschillende soorten gegevens uit een cel monster en daarom toegestaan aanpassing voor nauwkeuriger evaluatie, zoals hier wordt weergegeven voor Acrosoom status en apoptotic index.

Kortom, zijn de methoden beschreven in dit document zeer nuttig voor de beoordeling van de kwaliteit van het sperma. Behandeling van de zaadcel membranen is zeer belangrijk voor het bepalen van sperma bevruchting bevoegdheid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat er geen belangenconflicten.

Acknowledgments

De auteurs bedank "SION" Israëlische bedrijf voor kunstmatige inseminatie en fokken (Hafetz-Haim, Israël) voor hun hulp en samenwerking, en mevrouw Li Na (IMV Technologies, L'Aigle, Frankrijk) voor hulp bij de installatie van het instrument en de opleiding.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NaCl Sigma S5886
KCl Sigma P5405
MOPS [3-N-morphilino propanesulfonic acid] Sigma M1254
PBS Sigma P5493
DMSO Sigma D2438
Ethanol absolute Sigma 64-17-5
Hemacytometer Neubauer Germany hemocytometer
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) Sigma D9542 fluorescent probe
PI (propidium iodide ) Sigma P4170 fluorescent probe
FITC-PSA (fluorescein isothiocyanate-conjugated Pisum sativum agglutinin ) Sigma L0770 fluorescent probe
JC-1 (5,5',6,6'-tetra-chloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodide) ENZOBiochem, New York, NY, USA ENZ52304 fluorescent probe
Annexin V conjugated to FITC MACS, Miltenyi Biotec 130-093-060 fluorescent probe
Annexin V binding buffer 20x stock solution MACS, Miltenyi Biotec 130-092-820 buffer
Nikon Eclipse, TE-2000-u Nikon, Tokyo, Japan inverted fluorescence microscope
Nis Elements Nikon, Tokyo, Japan software
Nikon DXM1200F Nikon, Tokyo, Japan digital camera
Guava EasyCyte Plus IMV Technologies, L'Aigle, France microcapillary sperm flow cytometer
CytoSoft Guava Technologies Inc., Hayward, CA, USA; distributed by IMV Technologies software
Buffered solution for cytometry IMV Technologies, L'Aigle, France 023862 buffer
Viability and concentration kit IMV Technologies, L'Aigle, France 024708 kit for viability assessment
Mitochondrial activity kit IMV Technologies, L'Aigle, France 024864 kit for mitochondrial activity assessment
Viability & acrosome integrity kit IMV Technologies, L'Aigle, France 025293 kit for acrosome integrity assessment
JMP-13 SAS Institute Inc., 2004, ary, NC, USA software
Bovine sperm "SION", Israeli company for artificial insemination and dreeding, Hafetz-Haim, Israel

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Komsky-Elbaz, A., Roth, Z. Effect of the herbicide atrazine and its metabolite DACT on bovine sperm quality. Reprod Toxicol. 67, 15-25 (2016).
  2. Gürler, H., et al. Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm. Theriogenology. 86 (2), 562-571 (2016).
  3. Komsky-Elbaz, A., Saktsier, M., Roth, Z. Aflatoxin B1 impairs sperm quality and fertilization competence. Toxicology. 393, 42-50 (2018).
  4. Beltrán, C., et al. Role of Ion Channels in the Sperm Acrosome Reaction. Adv Anat Embryol Cell Biol. 220, 35-69 (2016).
  5. Breitbart, H. Signaling pathways in sperm capacitation and acrosome reaction. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 49 (3), 321-327 (2003).
  6. Almadaly, E., et al. Methodological factors affecting the results of staining frozen-thawed fertile and subfertile Japanese Black bull spermatozoa for acrosomal status. Anim Reprod Sci. 136 (1-2), 23-32 (2012).
  7. Jankovicová, J., Simon, M., Antalíková, J., Horovská, L. Acrosomal and viability status of bovine spermatozoa evaluated by two staining methods. Vet Hung. 56 (1), 133-138 (2008).
  8. Lybaert, P., Danguy, A., Leleux, F., Meuris, S., Lebrun, P. Improved methodology for the detection and quantification of the acrosome reaction in mouse spermatozoa. Histol Histopathol. 24 (8), 999-1007 (2009).
  9. Whitfield, C. H., Parkinson, T. J. Relationship between fertility of bovine semen and in vitro induction of acrosome reactions by heparin. Theriogenology. 38 (1), 11-20 (1992).
  10. Celeghini, E. C. C., de Arruda, R. P., de Andrade, A. F. C., Nascimento, J., Raphael, C. F. Practical Techniques for Bovine Sperm Simultaneous Fluorimetric Assessment of Plasma, Acrosomal and Mitochondrial Membranes. Reprod Domest Anim. 42 (5), 479-488 (2007).
  11. Ramalho-Santos, J., Varum, S., Amaral, S., Mota, P. C., Sousa, A. P., Amaral, A. Mitochondrial functionality in reproduction: from gonads and gametes to embryos and embryonic stem cells. Hum Reprod. 15 (5), 553-572 (2009).
  12. Eddy, E. M., O’Brien, A. The spermatozoon. , Raven Press. New York, USA. Knobil and Neill's Physiology of Reproduction; Volume 1 (1994).
  13. Gallon, F., Marchetti, C., Jouy, N., Marchetti, P. The functionality of mitochondria differentiates human spermatozoa with high and low fertilizing capability. Fertil Steril. 86 (5), 1526-1530 (2006).
  14. Espinoza, J. a, Paasch, U., Villegas, J. V. Mitochondrial membrane potential disruption pattern in human sperm. Hum Reprod. 24 (9), 2079-2085 (2009).
  15. Hüttemann, M., Lee, I., Pecinova, A., Pecina, P., Przyklenk, K., Doan, J. W. Regulation of oxidative phosphorylation, the mitochondrial membrane potential, and their role in human disease. J Bioenerg Biomembr. 40 (5), 445-456 (2008).
  16. Sellem, E., et al. Use of combinations of in vitro quality assessments to predict fertility of bovine semen. Theriogenology. 84 (9), 1447-1454 (2015).
  17. Odhiambo, J. F., Sutovsky, M., DeJarnette, J. M., Marshall, C., Sutovsky, P. Adaptation of ubiquitin-PNA based sperm quality assay for semen evaluation by a conventional flow cytometer and a dedicated platform for flow cytometric semen analysis. Theriogenology. 76 (6), 1168-1176 (2011).
  18. Barrier Battut, I., Kempfer, A., Becker, J., Lebailly, L., Camugli, S., Chevrier, L. Development of a new fertility prediction model for stallion semen, including flow cytometry. Theriogenology. 86 (4), 1111-1131 (2016).

Tags

Ontwikkelingsbiologie kwestie 141 sperma Acrosoom reactie mitochondriaal membraanpotentiaal plasmamembraan fluorescente sonde stroom cytometry sperma-evaluatie
Fluorimetrische technieken voor de beoordeling van sperma membranen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Komsky-Elbaz, A., Roth, Z.… More

Komsky-Elbaz, A., Roth, Z. Fluorimetric Techniques for the Assessment of Sperm Membranes. J. Vis. Exp. (141), e58622, doi:10.3791/58622 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter