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Developmental Biology

शुक्राणु झिल्ली के आकलन के लिए Fluorimetric तकनीक

Published: November 28, 2018 doi: 10.3791/58622
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Animal Sperm Research Center, Department of Animal Sciences, Robert H. Smith Faculty of Agriculture, Food and Environment, Hebrew University of Jerusalem, 2Department of Animal Sciences, Robert H. Smith Faculty of Agriculture, Food and Environment, Hebrew University of Jerusalem

Summary

यहां, हम वर्तमान के तरीके spermatozoan झिल्ली अखंडता, एक सेलुलर शुक्राणु निषेचन क्षमता के साथ जुड़े सुविधा का मूल्यांकन करने के लिए । हम शुक्राणु झिल्ली के fluorimetric आकलन के लिए तीन तकनीकों का वर्णन: एक साथ विशिष्ट फ्लोरोसेंट जांच के साथ धुंधला, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी, और उन्नत शुक्राणु-समर्पित प्रवाह cytometry. के तरीके के संयोजन के उदाहरण भी प्रस्तुत कर रहे हैं ।

Abstract

मानक spermiograms का वर्णन शुक्राणु की गुणवत्ता ज्यादातर शारीरिक और दृश्य मानकों पर आधारित हैं, जैसे बोल पड़ना मात्रा और एकाग्रता, गतिशीलता और प्रगतिशील गतिशीलता, और शुक्राणु आकृति विज्ञान और व्यवहार्यता । हालांकि, इन आकलनों में से कोई भी वीर्य की गुणवत्ता की भविष्यवाणी करने के लिए काफी अच्छा है । यह देखते हुए कि शुक्राणु व्यवहार्यता और निषेचन क्षमता के रखरखाव झिल्ली अखंडता और intracellular कार्यशीलता पर निर्भर करता है, इन मापदंडों का मूल्यांकन शुक्राणु निषेचन क्षमता का एक बेहतर भविष्यवाणी सक्षम हो सकता है । यहां, हम विशिष्ट फ्लोरोसेंट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी या प्रवाह cytometry विश्लेषण के साथ संयुक्त जांच का उपयोग शुक्राणु गुणवत्ता का मूल्यांकन करने के लिए तीन व्यवहार्य तरीकों का वर्णन । विश्लेषण प्लाज्मा झिल्ली अखंडता का उपयोग 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) और propidium आयोडाइड (PI), acrosomal झिल्ली अखंडता का उपयोग fluorescein isothiocyanate-संयुग्मित Pisum सटिवुम agglutinin (FITC-पीएसए) और mitochondrial झिल्ली अखंडता का उपयोग 5, 5 ', 6, 6 '-टेट्रा-क्लोरोफ्लूरोकार्बन-1, 1 ', 3, 3 '-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine आयोडाइड (जे. ए.-1). इन पद्धतियों के युग्म भी प्रस्तुत हैं. उदाहरण के लिए, annexin वी PI fluorochromes के साथ संयुक्त का उपयोग apoptosis का आकलन करने में सक्षम बनाता है और अपोप्तोटिक शुक्राणु (अपोप्तोटिक सूचकांक) के अनुपात की गणना. हम मानते है कि इन तरीकों, जो spermatozoon झिल्ली की जांच पर आधारित है शुक्राणु की गुणवत्ता के मूल्यांकन के लिए बहुत उपयोगी होते हैं ।

Introduction

अखंडता और शुक्राणु झिल्ली की कार्यक्षमता शुक्राणु व्यवहार्यता और निषेचन की क्षमता का संकेत कारकों में से कुछ हैं । प्लाज्मा झिल्ली intracellular और extracellular डिब्बों के बीच एक बाधा के रूप में कार्य करता है, जिससे सेलुलर आसमाटिक संतुलन को बनाए रखने1. किसी भी तनाव है कि प्लाज्मा झिल्ली अखंडता को नुकसान लाती homeostasis ख़राब हो सकता है, व्यवहार्यता और निषेचन की क्षमता को कम करने, और सेल मौत वृद्धि हुई है । उदाहरण के लिए, cryopreservation अपने प्लाज्मा झिल्ली को नुकसान के कारण शुक्राणु व्यवहार्यता को कम कर देता है, तापमान परिवर्तन और आसमाटिक तनाव2का एक परिणाम के रूप में । हम पहले से बताया कि इस तरह के कीटनाशक atrazine, इसके प्रमुख metabolite diaminochlorotriazine या mycotoxin aflatoxin B1 के रूप में foodborne संदूषणों की कम सांद्रता के लिए बैल शुक्राणु को उजागर, शुक्राणु व्यवहार्यता1,3 कम कर देता है . यह PI, जो एक क्षतिग्रस्त प्लाज्मा झिल्ली के साथ कोशिकाओं के डीएनए को बांध के साथ संयोजन में DAPI के साथ डबल-असहाय डीएनए लेबलिंग द्वारा निर्धारित किया गया था ।

Acrosome प्रतिक्रिया (एआर) बाहरी Acrosome झिल्ली का फ्यूजन और acrosomal एंजाइमों4,5की रिहाई में जिसके परिणामस्वरूप के लिए झूठ प्लाज्मा झिल्ली शामिल है । ये zona-pellucida पैठ के लिए आवश्यक घटनाओं और oocyte6के साथ शुक्राणु के आगे विलय कर रहे हैं । इसलिए, acrosomal झिल्ली अखंडता का मूल्यांकन वीर्य की गुणवत्ता और पुरुष प्रजननता7,8,9का मूल्यांकन करने के लिए एक उपयोगी पैरामीटर का गठन किया । कई फ्लोरोसेंट तकनीक acrosome अखंडता, FITC-ॄणा या FITC-8पीएसए,10के सत्यापन के लिए उपयुक्त हैं । हमारे पिछले अध्ययनों में, FITC के पैटर्न का उपयोग कर-1,3धुंधला, हम (i) बरकरार acrosome के लिए सही परिभाषा प्रदान की, (ii) क्षतिग्रस्त acrosome झिल्ली और (iii) acrosome प्रतिक्रिया व्यक्त की है । वर्तमान रिपोर्ट में, हम शुक्राणु-समर्पित प्रवाह cytometry का उपयोग करके acrosome स्थिति का मूल्यांकन करते हैं और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने वाले परिणामों की तुलना करते हैं.

mitochondria बहुआयामी organelles में शामिल हैं, अन्य बातों के अलावा, एटीपी संश्लेषण, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के उत्पादन, कैल्शियम संकेतन और apoptosis. शारीरिक रोग, पुरुष और महिला बांझपन सहित, बदल mitochondrial समारोह11के साथ जुड़े रहे हैं । शुक्राणु mitochondria midpiece में व्यवस्थित कर रहे है और शुक्राणु गतिशीलता12में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । यह अच्छी तरह से स्वीकार किया है कि उच्च mitochondrial झिल्ली क्षमता (ΔΨm) सामांय गतिशीलता और उच्च निषेचन क्षमता13के साथ जुड़ा हुआ है । इसके विपरीत, कम ΔΨm प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों और कम निषेचन दर14के एक उच्च स्तर के साथ जुड़ा हुआ है । फिर भी, विभिंन पर्यावरणीय यौगिकों, उदाहरण अंत: स्रावी अवरोधकों के लिए, सेलुलर तनाव पैदा कर सकते है और ΔΨm में एक क्षणिक वृद्धि के लिए नेतृत्व, hyperpolarization1,3, मुक्त कण के उत्पादन में वृद्धि और अंत में, apoptosis15. फ्लोरोसेंट जांच 5, 5 ', 6, 6 '-टेट्रा-क्लोरोफ्लूरोकार्बन-1, 1 ', 3, 3 '-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine आयोडाइड (जे. सी.-1) उदाहरण के लिए जांच करने में सक्षम बनाता है, शुक्राणु foodborne पर ΔΨm विषाक्त पदार्थों के प्रभाव1,3.

मानक spermiograms, शारीरिक और रूपात्मक मानकों के आधार पर, वीर्य की गुणवत्ता की भविष्यवाणी करने के लिए काफी अच्छा नहीं कर रहे हैं । अधिक सटीक तरीके शुक्राणु की गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक हैं । यहाँ, हम शुक्राणु झिल्ली के मूल्यांकन के आधार पर sperms गुणवत्ता का निर्धारण करने के लिए दो व्यवहार्य तरीके प्रदान करते हैं: एक साथ विशिष्ट फ्लोरोसेंट जांच और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ धुंधला हो जाना, हमारे अध्ययन में वर्णित1,3 और उन्नत शुक्राणु समर्पित प्रवाह cytometry, हाल ही में हमारी प्रयोगशाला में उपयोग किया है, और पहले से ही दूसरों के द्वारा इस्तेमाल किया जा रहा16,17,18.

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Protocol

सभी प्रयोगों के अनुसार पशु कल्याण के लिए १९९४ इजरायल दिशानिर्देश के साथ प्रदर्शन किया गया । गोजातीय शुक्राणु कृत्रिम गर्भाधान और प्रजनन के लिए वाणिज्यिक इजरायली कंपनी द्वारा आपूर्ति की गई थी । 11 बैल के बोल पड़ना इस अध्ययन में मूल्यांकन किया गया ।

1. शुक्राणु नमूना तैयारी

नोट: प्रक्रिया रोथ प्रयोगशाला के प्रोटोकॉल पर आधारित है1,3.

  1. कमरे के तापमान पर एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में बैल वीर्य की लगभग 1-6 मिलीलीटर प्राप्त करें ।
  2. वीर्य के प्रत्येक 1 मिलीलीटर करने के लिए, (३७ डिग्री सेल्सियस से कम) NKM बफर (११० मिमी NaCl, गरम की 6 मिलीलीटर जोड़ें 5 मिमी KCl, 20 मिमी MOPS [3-N-morphilino propanesulfonic एसिड; पीएच ७.४]) और ६०० x जी, 1 पर 8 मिनट के लिए केंद्रापसारक-2 बार जब तक supernatant स्पष्ट है ।
    नोट: यदि शुक्राणु एकाग्रता या प्रारंभिक मात्रा बहुत अधिक हैं, पहली धोने पर दो ट्यूबों में विभाजित ।
  3. तुरंत हटाने और स्पष्ट supernatant त्याग और गोली के ऊपर supernatant के लगभग 1 सेमी छोड़ दें ।
  4. ध्यान से एक 30 ° कोण पर ट्यूबों दुबला करने के लिए शुक्राणु के लिए सतह क्षेत्र में वृद्धि और 20 प्रतीक्षा-30 मिनट के लिए शुक्राणु को ३७ डिग्री सेल्सियस पर तैरने की अनुमति देते हैं ।
    नोट: Turbidity देखा जा सकता है ।
  5. एक micropipette सावधानी से, एक नया १.५ एमएल ट्यूब करने के लिए gram शुक्राणु युक्त supernatant के ऊपरी 1 मिलीलीटर निकालें ।
  6. शुक्राणु ३७ डिग्री सेल्सियस पर उपयोग तक रखें ।
  7. शुक्राणु एक Neubauer hemocytometer का उपयोग कर गिनती का अनुमान है ।
    नोट: इसके बजाय एक अलग से मतगणना कक्ष का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन मतगणना अलग है ।
    1. spermatozoon आंदोलन को रोकने के लिए, एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में 10 मिलीलीटर डबल आसुत जल (DDW) (1:100 कमजोर पड़ने) के साथ gram शुक्राणु के १०० µ l को पतला करें और धीरे से मिलाएं ।
    2. hemocytometer और coverslip के प्रत्येक पक्ष में नमूना के 10 µ एल लोड. चैंबर के अंदर बुलबुला गठन से बचने के रूप में यह एक गलत शुक्राणु गिनती में परिणाम हो सकता है सुनिश्चित करें ।
    3. एक 20X उद्देश्य के साथ एक यौगिक माइक्रोस्कोप के तहत निरीक्षण ।
      नोट: एक hemocytometer पर पूर्ण ग्रिड 9 बड़े चौकों, प्रत्येक 1 मिमी2शामिल हैं, और coverglass चैंबर की मंजिल से ऊपर ०.१ मिमी टिकी हुई है । इस प्रकार, केंद्रीय गिनती क्षेत्र पर मात्रा ०.१ मिमी3 या ०.१ µ एल है । hemocytometer के मध्य क्षेत्र में 25 मध्यम वर्ग होते हैं और प्रत्येक मीडियम स्क्वायर में 16 छोटे चौकोर एकल रेखाओं के होते हैं ।
    4. 4 मध्यम कोने वर्गों और मध्य वर्ग में पाए जाने वाले कक्षों की कुल संख्या की गणना करें । उच्च परिशुद्धता के लिए, दो कक्षों गिनती (Neubauer hemocytometer के दोनों पक्षों) और सेल एकाग्रता की गणना करने के लिए औसत का उपयोग करें.
    5. 5 द्वारा प्राप्त माध्य संख्या गुणा करके शुक्राणु गिनती की गणना (गिनती क्षेत्र के अनुसार कोशिकाओं की संख्या को प्राप्त करने के लिए) और १०,००० द्वारा (पतला नमूना के 1 मिलीलीटर प्रति कोशिकाओं की संख्या प्राप्त करने के लिए). फिर कमजोर पड़ने फैक्टर (1:100) द्वारा प्राप्त गिनती गुणा ।
      नोट: उदाहरण के लिए, दो मंडलों के केंद्रीय मतगणना क्षेत्र के भीतर 25 मध्यम वर्गो में से 5 में गिना शुक्राणुओं की औसत संख्या १५० है ([152 + 148]/ इस प्रकार, चैंबर प्रति शुक्राणुओं की मतलब संख्या (या प्रति ०.१ µ एल) १५० x 5 = ७५० है । १०,००० द्वारा ७५० गुणा पतला नमूना (७,५००,०००) के 1 मिलीलीटर प्रति कोशिकाओं की संख्या को प्राप्त करने के लिए और फिर १०० से गुणा (कमजोर पड़ने फैक्टर) मूल वीर्य का नमूना के एमएल प्रति ७५ एक्स 107 कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए ।

2. तकनीक #1: कई फ्लोरोसेंट जांच का उपयोग शुक्राणु झिल्ली का एक साथ मूल्यांकन

नोट: शुक्राणु झिल्ली (प्लाज्मा, acrosomal और mitochondrial) पहले Celeghini एट अल.10द्वारा वर्णित के रूप में मूल्यांकन किया गया, कुछ संशोधनों के साथ । Epifluorescent माइक्रोस्कोपी इस्तेमाल किया गया था, उत्तेजना के साथ एक डिजिटल कैमरा के साथ संयुक्त 450-490 एनएम और उत्सर्जन में 515-565 एनएम एक ट्रिपल फिल्टर का उपयोग कर ।

  1. स्टॉक समाधान तैयार करें ।
    1. तैयार ०.१ मिलीग्राम/एमएल DAPI 5 मिलीग्राम DAPI के ५० मिलीलीटर में फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) भंग करके । तैयार ५० µ एल aliquots और स्टोर पर-20 डिग्री सेल्सियस । उपयोग करने से पहले, 1:10 पर पंजाबियों के साथ शेयर समाधान पतला (काम समाधान; 10 µ g/एमएल) ।
    2. तैयार 1 मिलीग्राम/एमएल FITC-FITC के 1 मिलीग्राम भंग करके पीएसए शेयर समाधान-पंजाब के 1 मिलीलीटर में पीएसए । तैयार ५० µ एल aliquots और स्टोर पर-20 डिग्री सेल्सियस । उपयोग करने से पहले, 1:10 पर पंजाबियों के साथ शेयर समाधान पतला (काम समाधान; १०० µ g/एमएल) ।
    3. dimethyl sulfoxide (DMSO) के 1 मिलीलीटर में 1 मिलीग्राम/एमएल जे-1 के भंग करके शेयर समाधान तैयार । 10 µ l aliquots और स्टोर पर-20 ° c तैयार करें । उपयोग करने से पहले, 1:10 पर DMSO के साथ शेयर समाधान पतला (काम समाधान; ०.१ मिलीग्राम/एमएल) ।
    4. (२.५ मिलीग्राम/एमएल) देने ४०० µ एल में 10 मिलीग्राम pi के भंग करके pi स्टॉक समाधान तैयार करें । + 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर । 1:20 पर पंजाबियों के साथ शेयर 1 पतला (काम समाधान; ०.१२५ मिलीग्राम/एमएल) । एक शेयर समाधान के रूप में + 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
      चेतावनी: PI एक संभावित mutagen है और देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए । डाई का निपटारा सुरक्षित रूप से और लागू स्थानीय विनियमों के अनुसार किया जाना चाहिए ।
  2. स्थानांतरण १३३ µ l की gram शुक्राणु (step १.५) को एक नई १.५ एमएल ट्यूब (25 x 106 शुक्राणु/
    नोट: यदि नमूना एकाग्रता अधिक है, यह आवश्यक एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए NKM बफर में पतला; यदि नमूना एकाग्रता के ऊपर तैरने का नमूना कम है, 5 मिनट के लिए १,००० x g पर तैराकी के बाद प्राप्त supernatant केंद्रापसारक, supernatant के ०.५ मिलीलीटर निकालें और शुक्राणु फिर से गिनती ।
  3. DAPI के 17 µ एल जोड़ें (काम समाधान) और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए मशीन ।
  4. 5 मिनट के लिए १,००० x g पर केंद्रापसारक और supernatant त्यागें ।
  5. गोली करने के लिए, NKM बफर के १०० µ एल जोड़ें ।
  6. FITC के ५० µ एल जोड़ें – पीएसए, जे सी-1 और PI के 3 µ एल के 2 µ एल (काम समाधान) और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए मशीन ।
  7. 5 मिनट के लिए १,००० x g पर केंद्रापसारक और supernatant हटा दें ।
  8. गोली करने के लिए, NKM बफर के ४० µ एल जोड़ें और pipetting द्वारा resuspend ।
  9. एक गिलास स्लाइड करने के लिए नमूने के 10 µ एल हस्तांतरण, धब्बा और coverslip.
  10. एक ट्रिपल फिल्टर के साथ epifluorescence माइक्रोस्कोपी (उपयोग 40x उद्देश्य) के द्वारा तुरंत कल्पना, एक डिजिटल कैमरा के साथ सुसज्जित है और प्रत्येक फिल्टर के लिए अलग से एक छवि पर कब्जा ।
    नोट: visualized फ़िल्टर के क्रम के लिए कोई महत्व नहीं है ।
    1. ३५८ एनएम पर उत्तेजना के साथ DAPI चैनल के तहत कल्पना और उत्सर्जन ४६१ एनएम पर ।
    2. FITC चैनल के तहत हरे मोनोमर के लिए 450 पर उत्तेजना के साथ कल्पना-490 एनएम और उत्सर्जन 515-565 एनएम ।
    3. ४८८ एनएम और ५९० एनएम के उत्सर्जन पर उत्तेजना के साथ लाल समुच्चय के लिए PI चैनल के तहत कल्पना ।
    4. ५५९ एनएम पर उत्तेजना के साथ जे सी-1 लाल समुच्चय के तहत कल्पना, और 574 की सीमा में उत्सर्जन-627 एनएम; जे. पी.-1 ग्रीन मोनोमर ४८८ एनएम और 500 की रेंज में उत्सर्जन-535 एनएम पर उत्तेजना के साथ ।
  11. तीन छवियों JPG/JPEG प्रारूप में फ़िल्टर से प्राप्त विलय, कैमरा सॉफ्टवेयर के "मर्ज" विकल्प का उपयोग कर ।
  12. "पेंट" उपकरण के साथ मर्ज की गई छवि खोलें और गिने शुक्राणु को चिह्नित करने के लिए ब्रश विकल्प का उपयोग करें ।
  13. वर्गीकृत शुक्राणु प्रत्येक जांच से उत्सर्जित प्रतिदीप्ति के आधार पर:
    1. सामान्य रूप से मूल्यांकन में न्यूनतम २०० शुक्राणु प्रति स्लाइड — सभी कक्ष नीले (DAPI) दिखाई देते हैं.
    2. मृत कोशिकाओं की गिनती, जो बैंगनी (PI [लाल] + DAPI [नीला]) दिखाई देते हैं और मृत कोशिकाओं के प्रतिशत की गणना (मृत कोशिकाओं/कुल गिने कोशिकाओं एक्स १००) की व्यवहार्यता का मूल्यांकन करें ।
    3. acrosome स्थिति का मूल्यांकन फ्लोरोसेंट धुंधला (FITC-पीएसए) के पैटर्न का उपयोग कर । अलग पैटर्न के प्रतिशत की गणना (बरकरार, क्षतिग्रस्त या प्रतिक्रिया acrosome कोशिकाओं/कुल गिने कोशिकाओं x १००) ।
      नोट: क्षतिग्रस्त acrosomal झिल्ली एक पूरी तरह से सना हुआ, हरे acrosome टोपी के रूप में प्रकट होता है; प्रतिक्रिया acrosomal झिल्ली अवशिष्ट हरी इक्वेटोरियल या ऊपरी धुंधला से पता चलता है; बरकरार acrosomal झिल्ली युक्त कोशिकाओं acrosomal क्षेत्र के किसी भी हरे दाग प्रदर्शन नहीं होगा ।
    4. उच्च ΔΨm के साथ भेद शुक्राणु द्वारा ΔΨm का मूल्यांकन, जो एक लाल दाग midpiece प्रदर्शन, और कम शुक्राणु जो एक हरे दाग ΔΨm प्रदर्शन के साथ midpiece । लाल और हरे रंग की midpieces अलग गिनती और उनके अनुपात की गणना (लाल/

3. तकनीक #2: तैयार करने के लिए उपयोग किट और प्रवाह Cytometry के साथ शुक्राणु झिल्ली का आकलन

नोट: प्लाज्मा झिल्ली अखंडता का आकलन, mitochondrial झिल्ली क्षमता और acrosomal झिल्ली अखंडता के लिए तैयार उपयोग प्रवाह cytometry lyophilized fluorochromes युक्त एक अच्छी तरह से किट के साथ किया गया था । प्रक्रिया कुछ संशोधनों के साथ निर्माताओं के अनुसार किया गया था ।

  1. प्लाज्मा झिल्ली अखंडता मूल्यांकन
    1. व्यवहार्यता और एकाग्रता किट (PI और SYbr14) के पैकेज से कुओं की वांछित संख्या ले लो, उन्हें काम कर आधार करने के लिए स्थानांतरण और एक लचीला ढक्कन के साथ कवर (प्रकाश से बचाने के लिए).
    2. प्रति well cytometry के लिए बफ़र्ड समाधान के १९९ µ l जोड़ें ।
    3. ५७ x 106/mL पर सजातीय वीर्य की 1 µ एल जोड़ें (अच्छी तरह से प्रति ५७,००० कोशिकाओं) और pipetting द्वारा homogenize ।
    4. प्लेट को काले ढक्कन से ढक कर रख दीजिये ।
    5. ३७ ° c प्रकाश से सुरक्षित पर 10 मिनट के लिए मशीन ।
    6. ' व्यवहार्यता ' की स्थापना के साथ प्रवाह cytometer के माध्यम से नमूना भागो ।
  2. Mitochondrial झिल्ली संभावित
    1. mitochondrial गतिविधि किट के पैकेज से कुओं की वांछित संख्या ले लो (जे.-1), उंहें काम कर रहे आधार पर स्थानांतरण और एक लचीला ढक्कन के साथ कवर (प्रकाश से बचाने के लिए) ।
    2. अच्छी तरह से प्रति निरपेक्ष इथेनॉल के 10 µ एल जोड़ें और पिपेट के भीतर मौजूद पाउडर resuspend करने के लिए अच्छी तरह से ।
    3. पंजाब के १९० µ एल जोड़ें और pipetting द्वारा homogenize ।
    4. ५७ x 106/mL पर सजातीय वीर्य के ०.७५ µ एल जोड़ें (प्रति अच्छी तरह से ५०,००० कोशिकाओं) और pipetting द्वारा homogenize ।
    5. प्लेट को काले ढक्कन से ढक कर रख दीजिये ।
    6. ३७ ° c प्रकाश से सुरक्षित पर 30 मिनट के लिए मशीन ।
    7. नमूना ʽ mitochondrial गतिविधि ' सेटिंग के साथ cytometer प्रवाह के माध्यम से चलाएँ ।
  3. Acrosomal झिल्ली अखंडता
    नोट: FITC-पीएसए धुंधला (देखें तकनीक #1) 3 acrosome श्रेणियों के मूल्यांकन (बरकरार acrosome, प्रतिक्रिया acrosome और क्षतिग्रस्त acrosome) सक्षम बनाता है । प्रवाह cytometer और व्यवहार्यता और acrosome अखंडता किट (PI और FITC – ॄणा) का उपयोग करना, शुक्राणु इन 3 श्रेणियों में अलग कर रहे हैं ।
    1. व्यवहार्यता और acrosome अखंडता किट के पैकेज से कुओं की वांछित संख्या ले लो, उन्हें काम कर आधार करने के लिए स्थानांतरण और एक लचीला ढक्कन के साथ कवर (प्रकाश से बचाने के लिए).
    2. प्रति well cytometry के लिए बफ़र्ड समाधान के २०० µ l जोड़ें ।
    3. ५७ x 106/mL पर सजातीय वीर्य के ०.७ µ एल जोड़ें (प्रति अच्छी तरह से ४०,००० कोशिकाओं) और pipetting द्वारा homogenize ।
    4. प्लेट को काले ढक्कन से ढक कर रख दीजिये ।
    5. ३७ ° c प्रकाश से सुरक्षित पर ४५ मिनट के लिए मशीन ।
    6. नमूना प्रवाह के माध्यम से cytometer सेटिंग ʽ incyte ' के साथ चलाएँ ।
    7. प्रतिदीप्ति तीव्रता के अनुसार तीन मार्कर क्षेत्रों गेटिंग द्वारा परिणामी हिस्टोग्राम का विश्लेषण, बरकरार, दाग acrosome (R1), fluorescing (R2) के अवशिष्ट दाग भाग के साथ कम acrosome कोशिकाओं के साथ नगण्य, कम fluorescing कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व और बाधित acrosome (R3) के साथ अत्यधिक fluorescing कोशिकाओं ।
      नोट: तीन क्षेत्रों (R1, R2, R3) बनाने के क्रम में साधन उपयोगकर्ता गाइड में "अन्य मॉड्यूल का उपयोग कर अधिग्रहीत फ़ाइलों का विश्लेषण" अनुभाग का उपयोग करें ।

4. तकनीक #3: शुक्राणु की झिल्ली का आकलन फ्लोरोसेंट जांच और प्रवाह Cytometry का उपयोग

नोट: annexin वी PI fluorochromes के साथ संयुक्त का उपयोग apoptosis का आकलन करने में सक्षम बनाता है और अपोप्तोटिक शुक्राणु (अपोप्तोटिक सूचकांक) के अनुपात की गणना.

  1. 20x शेयर समाधान से 1x annexin v बाध्यकारी बफर तैयार (annexin V बाध्यकारी बफर 20x के ९.५ मिलीलीटर बाँझ आसुत जल के साथ शेयर समाधान के ५०० µ l पतला) ।
  2. खंड १.७ में वर्णित के रूप में एक Neubauer hemocytometer का उपयोग कर शुक्राणु गिनती का अनुमान लगाएं ।
  3. धो 10 1x annexin V बाध्यकारी बफर के 1 मिलीलीटर में6 शुक्राणु और 10 मिनट के लिए ३०० x g पर केंद्रापसारक ।
  4. supernatant को पूरी तरह से महाप्राण ।
  5. १०० µ में गोली resuspend 1x annexin V बाध्यकारी बफर के एल ।
  6. annexin वी संयुग्मित के 10 µ l को FITC में जोड़ें ।
  7. अच्छी तरह से मिश्रण और कमरे के तापमान पर अंधेरे में 15 मिनट के लिए गर्मी ।
  8. 106 कोशिकाओं के प्रति 1x annexin V बाध्यकारी बफर के 1 मिलीलीटर जोड़कर शुक्राणु धोने और 10 मिनट के लिए ३०० x g पर केंद्रापसारक ।
  9. supernatant को पूरी तरह से महाप्राण ।
  10. 106 कुल कोशिकाओं प्रति 1x annexin V बाध्यकारी बफर के ५०० µ एल में सेल गोली resuspend ।
  11. एक प्रवाह cytometer के साथ विश्लेषण करने के लिए तुरंत पहले 1 µ g/mL PI जोड़ें ।
  12. ʽ incyte ' पर सेट फ्लो cytometer के माध्यम से नमूना चलाएँ.

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Representative Results

चित्रा 1 शुक्राणु झिल्ली (प्लाज्मा, acrosomal और mitochondrial) PI, DAPI, FITC-पीएसए और जे सी-1 का उपयोग कर के एक साथ fluorimetric आकलन से पता चलता है । शुक्राणु झिल्ली का आकलन चार फ्लोरोसेंट जांच के साथ एक साथ धुंधला का उपयोग कर की अनुमति देता है, उदाहरण के लिए, प्रत्येक श्रेणी में शुक्राणु के अनुपात का मूल्यांकन-मृत बनाम रहते हैं ; उच्च बनाम कम ΔΨm; बरकरार बनाम क्षतिग्रस्त acrosome — एक साथ प्रत्येक spermatozoon के लिए ।

चित्रा 2 fluorimetric जांच का उपयोग शुक्राणु झिल्ली मूल्यांकन के परिणाम प्रस्तुत करता है । केवल वही वीर्य जो प्रयोग में सबसे कम ८०% gram शुक्राणु का उपयोग किया गया था । प्रति सांड के कम २०० कक्षों की जांच की गई । यह झिल्ली अखंडता के मामले में शुक्राणु नमूना गुणवत्ता में अंतर का मूल्यांकन करने के लिए संभव था । उदाहरण के लिए, बैल no .7 के बोल पड़ना मृत कोशिकाओं के एक अपेक्षाकृत कम प्रतिशत, एक छद्म के साथ शुक्राणु की कम अनुपात acrosome और उच्च mitochondrial झिल्ली क्षमता, के रूप में बैल नंबर 1 के बोल पड़ना की तुलना में था ।

3 चित्रा (चित्रा 3 सी 3) और mitochondrialगतिविधि (चित्रा3d3F) व्यवहार्यता के लिए मूल्यांकन प्रतिनिधि नमूने से पता चलता है । नमूनों की प्रतिदीप्ति तीव्रता समर्पित सॉफ्टवेयर के साथ एक समर्पित microcapillary शुक्राणु प्रवाह cytometer द्वारा मूल्यांकन किया गया । इस प्रवाह cytometer एक ठोस चरण नीले लेजर (४४८ एनएम) और दो photodiodes: फॉरवर्ड तितर बितर और साइड स्कैटर शामिल हैं । यह विशेष रूप से तीन photomultiplier ट्यूबों के साथ शुक्राणु उत्सर्जन गुणों के उपाय (ग्रीन: 525/30 एनएम, पीला: 583/26 एनएम; लाल: 655/50 एनएम) और ऑप्टिकल फिल्टर और16के बंटवारे को समायोजित करता है । यह विश्लेषण के अनुसार ५,००० शुक्राणु का मूल्यांकन सक्षम करता है ।

व्यवहार्यता मूल्यांकन किट (बरकरार प्लाज्मा झिल्ली) और मृत (क्षतिग्रस्त प्लाज्मा झिल्ली) शुक्राणु (आंकड़ा 3सी) व्यवहार्यता के लिए अंतर पारगम्यता के साथ एक जांच शामिल हैं । शुक्राणु ΔΨm एक किट है कि ध्रुवीकरण mitochondrial झिल्ली (नारंगी में दिखने प्रतिदीप्ति) और ध्रुवीकरण mitochondrial झिल्ली (हरे रंग में दिखने प्रतिदीप्ति) (चित्रा 3F) के बीच भेद का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया था ।

चित्रा 4 तैयार करने के लिए उपयोग किट के साथ प्रदर्शन किया acrosome अखंडता का मूल्यांकन प्रस्तुत करता है, प्रवाह cytometry के साथ पढ़ें (आंकड़े 4a-4c), gated शुक्राणु के परिणामी हिस्टोग्राम तीन मार्कर क्षेत्रों में विभाजित, बरकरार, दाग acrosome (R1) के साथ नगण्य कम-fluorescing कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व, acrosome (R2) के अवशिष्ट दाग भाग के साथ कम-fluorescing कोशिकाओं, और बाधित fluorescing (R3) के साथ अत्यधिक acrosome कोशिकाओं.

1 तालिका शुक्राणु झिल्ली के आकलन के लिए दो fluorimetric तकनीकों की तुलना प्रस्तुत करता है । तीन अलग बैल से एक ही शुक्राणु के नमूने व्यवहार्यता के लिए मूल्यांकन किया गया, mitochondrial झिल्ली क्षमता (ΔΨm) और acrosome अखंडता के साथ ही प्रवाह cytometry के रूप में एक साथ. यह तुलना बहुत महत्वपूर्ण है, के रूप में यह दो तकनीकों में से प्रत्येक का उपयोग कर मिलान परिणामों से पता चलता है । डेटा एक विश्लेषण और छात्र के टी परीक्षण द्वारा विश्लेषण किया गया । कोई सांख्यिकीय महत्वपूर्ण मतभेद मनाया गया ।

चित्रा 5 annexin वी (ए वी) और propidium आयोडाइड (PI) fluorochromes का उपयोग कर apoptosis के लिए मूल्यांकन एक प्रतिनिधि नमूना दिखाता है । इन दो जांच का उपयोग व्यवहार्य कोशिकाओं का संकेत चार पैटर्न के बीच भेद सक्षम बनाता है (ए वी-, pi-), जल्दी अपोप्तोटिक कोशिकाओं (ए वी +, pi-), अपोप्तोटिक कोशिकाओं (ए वी +, pi +) और गल कोशिकाओं (ए वी, pi +) ।

Figure 1
चित्रा 1: शुक्राणु के Epifluorescence photomicrography कई फ्लोरोसेंट जांच के साथ एक साथ सना हुआ । (A) चार जांच पीआई, DAPI, FITC-पीएसए और जे सी-1 के साथ एक साथ धुंधला) (बी) DAPI नाभिक और उच्च mitochondrial झिल्ली क्षमता (ΔΨm) के दाग के साथ रहते हैं, जे सी-1 जांच के साथ सना हुआ । (ग) क्षतिग्रस्त प्लाज्मा झिल्ली के साथ मृत spermatozoon PI जांच के साथ सना हुआ, क्षतिग्रस्त acrosome FITC-पीएसए जांच और कम ΔΨm के साथ दाग । (घ) जीवित, acrosome-प्रतिक्रिया spermatozoon अवशिष्ट इक्वेटोरियल दाग और कम ΔΨm के साथ. (ङ) जीवित, अवशिष्ट ऊपरी दाग और उच्च ΔΨm के साथ acrosome-प्रतिक्रियात्मक spermatozoon. स्केल बार्स = 10 µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: fluorimetric जांच का उपयोग बैल शुक्राणु झिल्ली का मूल्यांकन । (क) शुक्राणु व्यवहार्यता फ्लोरोसेंट जांच 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) और propidium आयोडाइड (PI) के साथ निर्धारित किया गया था । (ख) Acrosome स्थिति FITC-पीएसए धुंधला पैटर्न के अनुसार निर्धारित किया गया था । प्रस्तुत है शुक्राणु के अनुपात के साथ प्रतिक्रिया acrosome । (ग) Mitochondrial झिल्ली क्षमता (ΔΨm) जे-1 फ्लोरोसेंट जांच के साथ प्रयोग और लाल दाग (उच्च क्षमता) और हरे दाग (कम क्षमता) शुक्राणु का मतलब अनुपात के बीच अनुपात के रूप में प्रस्तुत का मूल्यांकन किया गया । डेटा कुल मूल्यांकित कक्षों से बाहर के कक्षों के प्रतिशत के रूप में प्रस्तुत किया जाता है । प्रति सांड से कम २०० शुक्राणु का विश्लेषण किया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: व्यवहार्यता (A-C) और mitochondrial गतिविधि (D-F) EasyCyte प्रवाह cytometer द्वारा मापी गई प्रतिनिधि नमूनों का प्रतिदीप्ति आकलन । हिस्टोग्राम शुक्राणु और मलबे का प्रतिनिधित्व (ए, डी), gated शुक्राणु (बी, ई), शुक्राणु का वितरण व्यवहार्य (हरा) और मृत (लाल) कोशिकाओं (सी), और शुक्राणु के वितरण के लिए ध्रुवीकरण (पीला) और ध्रुवीकरण ( green) mitochondrial झिल्ली (F). स्केल बार्स = 10 µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4: EasyCyte प्रवाह cytometer द्वारा मापी गई प्रतिनिधि नमूनों की acrosome अखंडता का प्रतिदीप्ति आकलन । (क) शुक्राणु और मलबे के हिस्टोग्राम । (ख, ग) तैयार करने के लिए उपयोग किट के साथ प्रदर्शन किया acrosome अखंडता के मूल्यांकन के साथ gated शुक्राणु के हिस्टोग्राम, अनुकूलित सेटिंग ' InCyte ' के साथ पढ़ा, gated शुक्राणु के परिणामी हिस्टोग्राम तीन मार्कर क्षेत्रों में विभाजित, नगण्य का प्रतिनिधित्व, बरकरार, दाग acrosome (R1), acrosome (R2) और बाधित fluorescing (R3) के साथ अत्यधिक acrosome कोशिकाओं के अवशिष्ट दाग भाग के साथ कम-fluorescing कोशिकाओं के साथ कम fluorescing कोशिकाओं । स्केल बार्स = 10 µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

कक्षों की औसत संख्या Vialbility Mitochondrial झिल्ली संभावित Acrosome अखंडता
व्यवहार्य मृत ध्रुवीकरण Polarized लाल/ बरकरार Acrosome प्रतिक्रिया व्यक्त Acrosome बाधित Acrosome
चौगुनी धुंधला २५३ ३२.७ ± १.५३% ६७.३ ± १.५३% ६५.७ ± २.२५% ३४.३ ± २.५२% ०.५ ± ०.०६ ३७.३ ± ७.२% ३८.० ± ५.७% २४.३ ± ३.०%
प्रवाह Cytomtery ५,००० ३२.३ ± २.०८% ६७.७ ± २.०८% ६५.० ± १.००% ३५.० ± १.००% ०.५ ± ०.०२ ३९.५ ± ५.७% ३९.५ ± ६.५% २१.० ± ८.०%

तालिका 1: शुक्राणु झिल्ली के आकलन के लिए दो fluorimetric तकनीकों की तुलना । एक ही शुक्राणु के नमूनों व्यवहार्यता के लिए मूल्यांकन किया गया, mitochondrial झिल्ली क्षमता और acrosome अखंडता एक साथ का उपयोग कर चौगुनी धुंधला और प्रवाह cytometry. डेटा की जांच की कोशिकाओं का मतलब अनुपात ± एसडी के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं, 3 के लिए गणना की प्रतिकृति ।

Figure 5
चित्रा 5: Annexin वी और PI प्रतिदीप्ति एक प्रतिनिधि नमूने के एक प्रवाह cytometer द्वारा मापा । हिस्टोग्राम (ए) ungateed और मलबे और (बी) gated शुक्राणु के वितरण जल्दी अपोप्तोटिक (ए वी +, pi-), अपोप्तोटिक (ए वी +, pi +), व्यवहार्य (ए वी, pi-) और गल (ए वी-, pi +) कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

शुक्राणु निषेचन की क्षमता कई कारकों पर निर्भर करता है इसकी गुणवत्ता को दर्शाती है । शुक्राणु की एक उच्च एकाग्रता और अत्यधिक उत्तरोत्तर gram शुक्राणु के एक उच्च अनुपात उच्च गुणवत्ता वाले वीर्य पर विचार किया जा सकता है । फिर भी, इस तरह के एक मूल्यांकन खाते में अंय सेलुलर और कार्यात्मक मापदंडों नहीं ले करता है । ' बेंच-टॉप ' microcapillary फ्लो cytometer का उपयोग आसानी से विभिंन शुक्राणु फ्लोरोसेंट जांच का उपयोग संरचनाओं का मूल्यांकन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, के रूप में पहले17 दूसरों के द्वारा दिखाए गए और यहां का प्रदर्शन (तकनीक #3) । उदाहरण के लिए, शुक्राणु acrosome अखंडता सफल प्राकृतिक निषेचन की घटना के लिए अत्यधिक महत्वपूर्ण है और इसलिए, acrosomal स्थिति का सटीक मूल्यांकन वारंट है । इस तरह के एक मूल्यांकन आसानी से acrosome स्थिति के वर्गीकरण के द्वारा किया जा सकता है फ्लोरोसेंट धुंधला (FITC-पीएसए, FITC-ॄणा, यानी, तकनीक #1 के पैटर्न का उपयोग कर, के रूप में पहले वर्णित)1,3। विशेष रूप से, यह अत्यधिक के लिए बरकरार acrosome के साथ शुक्राणु के अनुपात का निर्धारण महत्वपूर्ण है (यानी, एक दाग acrosome प्रदर्शित) क्षतिग्रस्त acrosome के साथ उन के सापेक्ष । बाद के संबंध में, क्षतिग्रस्त acrosome के साथ शुक्राणु प्रदर्शित कर सकते हैं (i) एक पूरी तरह से सना हुआ acrosomal टोपी, जो इंगित करता है कि झिल्ली क्षतिग्रस्त है, acrosome पुटिका में झिल्ली के माध्यम से प्रवाह करने के लिए डाई को सक्षम करने; (ii) acrosome-प्रतिक्रिया शुक्राणु है कि केवल अवशिष्ट acrosome सामग्री का प्रदर्शन, यह दर्शाता है कि एआर पहले से ही हुआ है (यानी, छद्म एआर) । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इस तरह के एक मूल्यांकन भी समर्पित प्रवाह cytometer के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है ।

तैयार करने के लिए उपयोग व्यवहार्यता और acrosome अखंडता किट दोनों शुक्राणु व्यवहार्यता (व्यवहार्य या मृत) और acrosomal अखंडता (बरकरार या बाधित) को परिभाषित करता है । यहां, हम समर्पित प्रवाह cytometer का उपयोग करने के लिए तीन aforementioned acrosomal स्थितियों को परिभाषित करने का सुझाव (यानी, बरकरार, क्षतिग्रस्त, प्रतिक्रिया व्यक्त की) । हम और अधिक सटीक मूल्यांकन, जो acrosome-प्रतिक्रिया शुक्राणु (यानी, कम प्रतिदीप्ति) की पहचान के लिए microcapillary प्रवाह cytometer मंच अनुकूलित जबकि उंहें बाधित acrosome (उच्च प्रतिदीप्ति) के साथ उन लोगों से छोड़कर, बजाय उंहें शामिल एक बरकरार acrosome होने के साथ उन । यह कार्यात्मक या फंक्शनल acrosome के साथ शुक्राणु का एक सटीक अनुपात देता है । acrosome के साथ शुक्राणु के रूप में अच्छी तरह से बाधित acrosomal झिल्ली को oocyte खाद की क्षमता खो दिया है । इसके अलावा, सटीक विश्लेषण acrosome परिवर्तन, यानी, क्षतिग्रस्त acrosome झिल्ली बनाम छद्म acrosome सक्रियण अंतर्निहित तंत्र पर प्रकाश डाला सकता है ।

हम तकनीक #1 और तकनीक #2 के साथ प्राप्त परिणामों की तुलना में, और उन दोनों के बीच महान संगतता पाया, विशेष रूप से व्यवहार्यता और ΔΨm के मूल्यांकन में (1 तालिका) । समर्पित प्रवाह cytometer का उपयोग करने का मुख्य लाभ में से एक शुक्राणु की छोटी संख्या है कि व्यवहार में प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और जांच द्वारा मूल्यांकन कर रहे हैं के सापेक्ष शुक्राणु मूल्यांकन की बड़ी संख्या है (हजारों बनाम सैकड़ों, क्रमशः ). इसके अलावा, बाद की प्रक्रिया समय लेने वाली और व्यक्तिपरक है, यहां तक कि जब एक अनुभवी पर्यवेक्षक द्वारा प्रदर्शन किया । के रूप में प्रवाह cytometry केवल कण से जुड़े प्रतिदीप्ति का पता लगाता है, वहां कोई जरूरत नहीं है समाधान है, जो एक समय लेने के लिए है17से असीम जांच धोने । दूसरी ओर, शुक्राणु झिल्ली के fluorimetric आकलन तकनीक में वर्णित #1 एकाधिक झिल्ली के एक साथ मूल्यांकन सक्षम बनाता है । हम के रूप में कई के रूप में चार फ्लोरोसेंट जांच एक साथ उपयोग करने में सक्षम थे1,3।

अंत में, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि समर्पित प्रवाह cytometer एक खुला परख मॉड्यूल के रूप में विकसित किया गया था, नमूना अधिग्रहण और डेटा विश्लेषण के लिए बुनियादी उपकरणों के सभी प्रदान । अधिग्रहण समारोह एक सेल नमूना से जानकारी के विभिंन प्रकार के संग्रह में सक्षम बनाता है और इसलिए अधिक सटीक मूल्यांकन के लिए अनुकूलन की अनुमति देता है, के रूप में acrosome स्थिति और अपोप्तोटिक सूचकांक के लिए यहां दिखाया गया है ।

अंत में, इस पत्र में वर्णित तरीके वीर्य गुणवत्ता के मूल्यांकन के लिए बहुत उपयोगी होते हैं । spermatozoon झिल्ली की जांच शुक्राणु निषेचन क्षमता का निर्धारण करने के लिए अत्यधिक महत्वपूर्ण है ।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि हितों का कोई टकराव नहीं हैं.

Acknowledgments

लेखक का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा "सायन" कृत्रिम गर्भाधान और प्रजनन के लिए इजरायल की कंपनी (Hafetz-Haim, इज़राइल) उनकी मदद और सहयोग के लिए, और साधन सेटअप और प्रशिक्षण के साथ सहायता के लिए सुश्री ली एनए (IMV टेक्नोलॉजीज, L'Aigle, फ्रांस) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NaCl Sigma S5886
KCl Sigma P5405
MOPS [3-N-morphilino propanesulfonic acid] Sigma M1254
PBS Sigma P5493
DMSO Sigma D2438
Ethanol absolute Sigma 64-17-5
Hemacytometer Neubauer Germany hemocytometer
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) Sigma D9542 fluorescent probe
PI (propidium iodide ) Sigma P4170 fluorescent probe
FITC-PSA (fluorescein isothiocyanate-conjugated Pisum sativum agglutinin ) Sigma L0770 fluorescent probe
JC-1 (5,5',6,6'-tetra-chloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodide) ENZOBiochem, New York, NY, USA ENZ52304 fluorescent probe
Annexin V conjugated to FITC MACS, Miltenyi Biotec 130-093-060 fluorescent probe
Annexin V binding buffer 20x stock solution MACS, Miltenyi Biotec 130-092-820 buffer
Nikon Eclipse, TE-2000-u Nikon, Tokyo, Japan inverted fluorescence microscope
Nis Elements Nikon, Tokyo, Japan software
Nikon DXM1200F Nikon, Tokyo, Japan digital camera
Guava EasyCyte Plus IMV Technologies, L'Aigle, France microcapillary sperm flow cytometer
CytoSoft Guava Technologies Inc., Hayward, CA, USA; distributed by IMV Technologies software
Buffered solution for cytometry IMV Technologies, L'Aigle, France 023862 buffer
Viability and concentration kit IMV Technologies, L'Aigle, France 024708 kit for viability assessment
Mitochondrial activity kit IMV Technologies, L'Aigle, France 024864 kit for mitochondrial activity assessment
Viability & acrosome integrity kit IMV Technologies, L'Aigle, France 025293 kit for acrosome integrity assessment
JMP-13 SAS Institute Inc., 2004, ary, NC, USA software
Bovine sperm "SION", Israeli company for artificial insemination and dreeding, Hafetz-Haim, Israel

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References

  1. Komsky-Elbaz, A., Roth, Z. Effect of the herbicide atrazine and its metabolite DACT on bovine sperm quality. Reprod Toxicol. 67, 15-25 (2016).
  2. Gürler, H., et al. Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm. Theriogenology. 86 (2), 562-571 (2016).
  3. Komsky-Elbaz, A., Saktsier, M., Roth, Z. Aflatoxin B1 impairs sperm quality and fertilization competence. Toxicology. 393, 42-50 (2018).
  4. Beltrán, C., et al. Role of Ion Channels in the Sperm Acrosome Reaction. Adv Anat Embryol Cell Biol. 220, 35-69 (2016).
  5. Breitbart, H. Signaling pathways in sperm capacitation and acrosome reaction. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 49 (3), 321-327 (2003).
  6. Almadaly, E., et al. Methodological factors affecting the results of staining frozen-thawed fertile and subfertile Japanese Black bull spermatozoa for acrosomal status. Anim Reprod Sci. 136 (1-2), 23-32 (2012).
  7. Jankovicová, J., Simon, M., Antalíková, J., Horovská, L. Acrosomal and viability status of bovine spermatozoa evaluated by two staining methods. Vet Hung. 56 (1), 133-138 (2008).
  8. Lybaert, P., Danguy, A., Leleux, F., Meuris, S., Lebrun, P. Improved methodology for the detection and quantification of the acrosome reaction in mouse spermatozoa. Histol Histopathol. 24 (8), 999-1007 (2009).
  9. Whitfield, C. H., Parkinson, T. J. Relationship between fertility of bovine semen and in vitro induction of acrosome reactions by heparin. Theriogenology. 38 (1), 11-20 (1992).
  10. Celeghini, E. C. C., de Arruda, R. P., de Andrade, A. F. C., Nascimento, J., Raphael, C. F. Practical Techniques for Bovine Sperm Simultaneous Fluorimetric Assessment of Plasma, Acrosomal and Mitochondrial Membranes. Reprod Domest Anim. 42 (5), 479-488 (2007).
  11. Ramalho-Santos, J., Varum, S., Amaral, S., Mota, P. C., Sousa, A. P., Amaral, A. Mitochondrial functionality in reproduction: from gonads and gametes to embryos and embryonic stem cells. Hum Reprod. 15 (5), 553-572 (2009).
  12. Eddy, E. M., O’Brien, A. The spermatozoon. , Raven Press. New York, USA. Knobil and Neill's Physiology of Reproduction; Volume 1 (1994).
  13. Gallon, F., Marchetti, C., Jouy, N., Marchetti, P. The functionality of mitochondria differentiates human spermatozoa with high and low fertilizing capability. Fertil Steril. 86 (5), 1526-1530 (2006).
  14. Espinoza, J. a, Paasch, U., Villegas, J. V. Mitochondrial membrane potential disruption pattern in human sperm. Hum Reprod. 24 (9), 2079-2085 (2009).
  15. Hüttemann, M., Lee, I., Pecinova, A., Pecina, P., Przyklenk, K., Doan, J. W. Regulation of oxidative phosphorylation, the mitochondrial membrane potential, and their role in human disease. J Bioenerg Biomembr. 40 (5), 445-456 (2008).
  16. Sellem, E., et al. Use of combinations of in vitro quality assessments to predict fertility of bovine semen. Theriogenology. 84 (9), 1447-1454 (2015).
  17. Odhiambo, J. F., Sutovsky, M., DeJarnette, J. M., Marshall, C., Sutovsky, P. Adaptation of ubiquitin-PNA based sperm quality assay for semen evaluation by a conventional flow cytometer and a dedicated platform for flow cytometric semen analysis. Theriogenology. 76 (6), 1168-1176 (2011).
  18. Barrier Battut, I., Kempfer, A., Becker, J., Lebailly, L., Camugli, S., Chevrier, L. Development of a new fertility prediction model for stallion semen, including flow cytometry. Theriogenology. 86 (4), 1111-1131 (2016).

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विकास जीवविज्ञान अंक १४१ शुक्राणु acrosome प्रतिक्रिया mitochondrial झिल्ली क्षमता प्लाज्मा झिल्ली फ्लोरोसेंट जांच प्रवाह cytometry वीर्य मूल्यांकन
शुक्राणु झिल्ली के आकलन के लिए Fluorimetric तकनीक
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Komsky-Elbaz, A., Roth, Z. Fluorimetric Techniques for the Assessment of Sperm Membranes. J. Vis. Exp. (141), e58622, doi:10.3791/58622 (2018).

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