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Bioengineering

एक 3 डी गतिशील संस्कृति प्रणाली के साथ एक Multilayered Mesenchymal स्टेम सेल शीट का निर्माण

Published: October 20, 2018 doi: 10.3791/58624
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 3, 1,2, 1,2, 1,2, 4, 1,2
1Key Laboratory for Regenerative Medicine, Ministry of Education, Jinan University, 2Department of Developmental and Regenerative Biology, Jinan University, 3Nansha College Preparatory Academy, 4Department of Cardiology, First Affiliated Hospital of Jinan University
* These authors contributed equally

Summary

यह लेख अनुकूल स्टेम सेल संपत्ति के साथ multilayered स्टेम सेल शीट के निर्माण के लिए एक कुशल और व्यवहार्य विधि प्रदान करता है ।

Abstract

स्टेम सेल थेरेपी घायल अंग और ऊतकों को पुनः उत्पन्न करने में एक होनहार भविष्य से पता चलता है, और सेल शीट तकनीक लक्ष्य क्षेत्र के भीतर कम सेल प्रतिधारण और गरीब अस्तित्व में सुधार करने के लिए विकसित किया गया है । हालांकि, इन विट्रो निर्माण प्रक्रिया के दौरान, स्टेम सेल की गतिविधियों को बनाए रखने और सेल शीट के भीतर सेल राशि को बढ़ाने के लिए एक समाधान तत्काल जरूरत है । यहां, इस प्रोटोकॉल अनुकूल स्टेम सेल के साथ एक multilayered सेल शीट के निर्माण के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है और इष्टतम अंतर । सेलुलर सुअर का पेरीकार्डियम (डीपीपी) सेल शीट पाड़ के रूप में एक2 (पीएलए2) decellularization विधि phospholipase द्वारा तैयार किया जाता है, और चूहा अस्थि मज्जा mesenchymal स्टेम सेल (BMSCs) अलग कर रहे है और बीज के रूप में कोशिकाओं का विस्तार । अस्थाई multilayered कक्ष पत्रक संरचना RAD16-I पेप्टाइड hydrogel का उपयोग करके निर्मित है । अंत में, सेल शीट एक गतिशील छिड़काव प्रणाली के साथ संस्कृति के लिए तीन आयामी (3 डी) संरचना को स्थिर है, और सेल शीट एक ४८ के बाद प्राप्त किया जा सकता है इन विट्रो मेंघंटे संस्कृति । यह प्रोटोकॉल एक multilayered स्टेम सेल शीट के निर्माण के लिए एक कुशल और व्यवहार्य विधि प्रदान करता है, और सेल शीट भविष्य में एक अनुकूल स्टेम सेल थेरेपी उत्पाद के रूप में विकसित किया जा सकता है ।

Introduction

स्टेम सेल थेरेपी कई रोगों के लिए एक प्रभावी उपचार के रूप में सूचित किया गया है; हालांकि, कम सेल प्रतिधारण और लक्ष्य क्षेत्र के भीतर गरीब अस्तित्व पारंपरिक स्टेम सेल इंजेक्शन के बाद महत्वपूर्ण मुद्दों रह । इस समस्या को हल करने के लिए टिशू इंजीनियरिंग के वैज्ञानिकों ने सेल शीट तकनीक विकसित की । बरकरार extracellular मैट्रिक्स के साथ एक monolayered सेल शीट सबसे पहले तापमान प्रतिक्रिया संस्कृति डिश1का उपयोग करके तैयार किया गया था, और उसके अनुवर्ती अध्ययन स्टेम सेल प्रतिधारण और infarcted के भीतर अस्तित्व के महत्वपूर्ण सुधार की सूचना क्षेत्रफल2,3. तरीकों के अलावा, multilayered सेल शीट का निर्माण सेल अस्तित्व में सुधार और सेल शीट उपचारात्मक प्रभाव3,4के लिए एक प्रभावी रणनीति के रूप में सूचित किया गया है । तब से, वैज्ञानिकों सेल राशि, स्टेम सेल संपत्ति, और सेल शीट के यांत्रिक संपत्ति को बढ़ाने के लिए अलग सेल शीट निर्माण विधियों के विकास पर काम किया है । अब तक, सेल शीट के कुछ प्रकार का निर्माण किया गया है और रोधगलन के उपचार में अध्ययन5, उपास्थि चोट6, और त्वचा घाव7.

प्रत्यारोपण से पहले स्टेम सेल की गतिविधि घायल ऊतक पुनर्जनन पर एक उभरते प्रभाव दिखाई दिया, और अलग सेल शीट निर्माण रणनीतियों स्टेम कोशिकाओं पर अलग प्रभाव है । एक तरफ, धाराप्रवाह सेल शीट्स केवल उच्च घनत्व स्टेम कोशिकाओं के शामिल है, और प्राकृतिक extracellular मैट्रिक्स monolayered सेल शीट्स8 stacking द्वारा या चुंबकीय ऊतक इंजीनियरिंग तकनीक9का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है । दूसरी ओर, शोधकर्ताओं ने अलग मचान विकसित करने के लिए पर्याप्त यांत्रिक शक्ति प्रदान करने के लिए और समर्थन सेल विकास10,11,12, जो एक कम स्टेम कोशिका बोने की सघनता के लिए पोषण सुनिश्चित करने की अनुमति आपूर्ति. हालांकि, इन तरीकों के बावजूद, multilayered सेल शीट संरचना के भीतर कम कुशल पोषण आपूर्ति में इन विट्रो निर्माण के दौरान एक प्रमुख चिंता बनी हुई है । इसलिए, एक कुशल और व्यवहार्य सेल शीट निर्माण प्रणाली तत्काल आवश्यक है ।

यह प्रोटोकॉल multilayeredmesenchymal स्टेम सेल (MSC) कक्ष पत्रक तैयार करने के लिए चरणों का वर्णन करता है । इस निर्माण प्रणाली में, सेल शीट यांत्रिक शक्ति एक डीपीपी द्वारा प्रदान की जाती है । इस पाड़ के आधार पर, 3d सेल संरचना जल्दी RAD16-मैं पेप्टाइड hydrogel के साथ निर्माण किया जा सकता है, और एक गतिशील छिड़काव प्रणाली multilayered सेल शीट संस्कृति के लिए प्रयोग किया जाता है, क्रम में 3 डी सेल शीट संरचना को स्थिर करने और पर्याप्त पोषण प्रदान कोशिकाओं के लिए आपूर्ति । इस प्रणाली का उपयोग करना, एक multilayered BMSC शीट सफलतापूर्वक तैयार किया गया था और चूहे रोधगलन पर एक इष्टतम उपचारात्मक प्रभाव का प्रदर्शन13मॉडल ।

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Protocol

सभी स्टेम सेल और पशु प्रयोग प्रक्रियाओं की देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग के लिए राष्ट्रीय गाइड के नैतिक दिशा निर्देशों के अनुसार आयोजित किया गया और जिनान विश्वविद्यालय पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित (गुआंगज़ौ, चीन) ।

1. पीएलए के साथ डीपीपी पाड़ा की तैयारी2 Decellularization विधि14

नोट: पीएलए2 decellularization विधि की योजनाबद्धता के लिए चित्र 1a देखें ।

  1. २०० U/एमएल पीएलए2 समाधान के १०० मिलीलीटर तैयार करें । जोड़ें सोडियम deoxycholate के ०.५ जी और पीएलए2 के 2 मिलीलीटर कार्बोनेट बफर समाधान के १९८ मिलीलीटर में । यह समाधान इसकी तैयारी के बाद 24 ज के भीतर किया जाना चाहिए ।
  2. कसाईखाना से ताजा सुअर का पेरीकार्डियम (FPP) प्राप्त करें और 1 ज के भीतर प्रयोगशाला में वापस लौटें ।
    नोट: FPP परिवहन के दौरान 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जाना चाहिए । कदम १.२-१.१० एक थर्मोस्टेट नियंत्रित पानी के स्नान में लगातार मिलाने के साथ आयोजित किया जाना चाहिए ।
  3. अच्छी तरह से २०० मिलीलीटर फॉस्फेट बफर समाधान (पंजाबियों) के साथ FPP धो 10 ° Cfor 10 मिनट में एक ५०० मिलीलीटर यूरिन में 1% पेनिसिलिन-streptomycin युक्त. इस चरण 2x दोहराएं ।
  4. FPP को दो परतों में विभक्त करें और वसा ऊतक को संदंश और कैंची से निकाल दें ।
    नोट: वसा ऊतक को हटाने के दौरान हर 20 मिनट में पंजाब के ५० मिलीलीटर जोड़कर गीला FPP रखें ।
  5. 10 x 10 सेमी2 टुकड़ों में कैंची के साथ FPP आकार । FPP २०० मिलीलीटर कार्बोनेट बफर समाधान (सीबीएस) से युक्त 1% पेनिसिलिन-streptomycin में एक ५०० मिलीलीटर चोंच में 10 ° c 10 मिनट के लिए, इस चरण 2x दोहराएँ ।
  6. FPP को शुद्ध पानी में स्थानांतरित करें और इसे 10 डिग्री सेल्सियस पर 12 घंटे के लिए भिगो दें ।
  7. 6 एच के लिए ३७ ° c पर २०० यू/एमएल पीएलए2 और ०.५% (डब्ल्यू/वी) सोडियम deoxycholate समाधान युक्त सीबीएस के ५० मिलीलीटर में 10 x 10 सेमी2 नमूने लेना ।
  8. 10 मिनट के लिए 10 ° c पर 1% पेनिसिलिन-streptomycin युक्त सीबीएस के साथ नमूनों को धो लें 2x इस चरण दोहराएं ।
  9. २०० यू/एमएल पीएलए2 और ०.५% (डब्ल्यू/वी) सोडियम deoxycholate समाधान में ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए 2 एच के ५० मिलीलीटर में प्रत्येक नमूने लेना ।
  10. 2 एच के लिए 10 डिग्री सेल्सियस पर 1% पेनिसिलिन-streptomycin युक्त सीबीएस के साथ नमूनों को धो लें 10x के लिए इस कदम को कम । फ्लैट प्लेटों पर नमूनों प्लेस और उन्हें ५५ डिग्री सेल्सियस पर एक निरंतर तापमान ओवन में लगातार वजन के लिए सूखी ।
    नोट: नमूने को पूरी तरह से सूख जाने की जरूरत है । डीपीपी नमूना हर 10 मिनट तौलना और दोहराने कि 3x या जब तक वजन अब नहीं बदलता है ।
  11. एक trephine के साथ एक १०.५ मिमी व्यास सर्कल में प्रत्येक डीपीपी नमूना आकार । एक बाँझ सील बैग में प्रत्येक डीपीपी पैक.
  12. डीपीपी नमूने गामा विकिरण (25 kGy) द्वारा निष्फल । उपयोग से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर डीपीपी नमूने संग्रहीत ।
    नोट: सभी नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस पर छह महीने तक के लिए संग्रहित किया जा सकता है ।

2. सेल शीट निर्माण के लिए तैयारियां

  1. 30 मिनट के लिए १२१ डिग्री सेल्सियस पर सभी उपकरणों और ऊतक वाहक घटकों आटोक्लेव, सहित १.५ मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूबों, संदंश, दांतेदार संदंश, कैंची, काले कुर्सियां (ऊतक वाहक घटक), और सफेद तनाव के छल्ले (ऊतक वाहक घटक) ।
  2. रोगाणु मुक्त 10% सुक्रोज समाधान के 20 मिलीलीटर तैयार । सुक्रोज का वजन 2 ग्राम और ultrapure पानी के 18 मिलीलीटर में सुक्रोज भंग । आटोक्लेव 10% सुक्रोज समाधान 30 मिनट के लिए १२१ डिग्री सेल्सियस पर या एक ०.२२ µm फिल्टर के साथ समाधान फिल्टर ।
  3. आटोक्लेव एक गैस विनिमय उपकरण, एक ५०० मिलीलीटर कांच की बोतल, एक छिड़काव संस्कृति कंटेनर, और संयोजी ट्यूबों सहित 30 मिनट के लिए १२१ ° c पर गतिशील छिड़काव प्रणाली उपकरणों को शामिल करें ।
  4. autoclaved उपकरणों और ऊतक वाहक घटकों को तैयार करें । एक संस्कृति डिश में ऊतक वाहक के काले आधार हिस्सा रखो ।
  5. एक सूखे डीपीपी पाड़ उठाओ और काले आधार के केंद्र में डाल दिया । डीपीपी पाड़ पर एक सफेद तनाव की अंगूठी रखो और यह ऊतक वाहक में ठीक ।
    नोट: यह सुनिश्चित करें कि पाड़ पूरी तरह से ऊतक वाहक में तय हो गया है और काले आधार और सफेद तनाव की अंगूठी के बीच कोई अंतर नहीं है । यदि नहीं, तो ऊतक वाहक अलग और पाड़ फिर से ठीक ।
  6. निर्जलीकरण के लिए डीपीपी पाड़ पर संस्कृति माध्यम के १०० µ एल जोड़ें ।
    नोट: यदि पाड़ ऊतक वाहक में अच्छी तरह से ठीक नहीं है, संस्कृति माध्यम संस्कृति डिश घुसपैठ होगी ।
  7. एक ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन में पाड़ रखो और यह 15 मिनट के लिए भिगोने के लिए अनुमति देते हैं ।

3. सेल शीट निर्माण के लिए कक्षों की तैयारी

नोट: इस प्रोटोकॉल सेल एक १०० mm डिश का उपयोग कर संस्कृति के लिए है । multilayered सेल संरचना के निर्माण की एक योजनाबद्ध के लिए चित्र 1b देखें ।

  1. अलग BMSCs13.
    नोट: इस विधि एक multilayered एमएससी सेल शीट के निर्माण के लिए बनाया गया है । इस प्रोटोकॉल में रैट BMSCs का इस्तेमाल किया जाता है । BMSCs पूरे अस्थि मज्जा अनुयाई विधि का उपयोग कर अलग कर रहे हैं, और BMSCs पर्याप्त सेल राशि प्राप्त करने के लिए इन विट्रो में विस्तारित कर रहे हैं ।
    1. संदंश, दांतेदार संदंश, और कैंची सहित 30 मिनट के लिए १२१ डिग्री सेल्सियस पर उपकरणों आटोक्लेव । एक 2 मिलीलीटर इंजेक्शन सिरिंज और BMSC संस्कृति माध्यम तैयार करें (Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम [DMEM], 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 1% glutamine, और 1% पेनिसिलिन-streptomycin).
    2. Euthanize ने तीन सप्ताह पूर्व नर Sprague-Dawley (SD) चूहों को सर्वाइकल बांस से विस्थापन किया । 5 मिनट के लिए एक चोंच में ७५% शराब समाधान के १०० मिलीलीटर में पशु सोख ।
    3. जानवर को यूरिन से बाहर निकालकर उसे ऑपरेशन टेबल पर रखने की आशंका रहती है । Incise से जानवर की पीठ पर त्वचा को कैंची और संदंश से काट लें । जांघ femurs को बेनकाब करने के लिए त्वचा और मांसपेशियों के ऊतकों को अलग ।
    4. जांघ femurs को अलग और एक ५० मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब में पंजाब के 30 मिलीलीटर में डाल दिया । दो जांघ femurs एक ट्यूब में रखें । भंवर केंद्रापसारक ट्यूब ऊतक धोने के लिए अच्छी तरह से । इस चरण 2x दोहराएं ।
    5. femurs के दोनों सिरों को कैंची से काट लें और मज्जा गुहा को बेनकाब करें ।
    6. महाप्राण एक इंजेक्शन सिरिंज के साथ BMSC संस्कृति माध्यम के 2 मिलीलीटर । मज्जा गुहा में सुई डालें और संस्कृति माध्यम के साथ अस्थि मज्जा बाहर फ्लश । १ १०० mm संस्कृति डिश में हर दो जांघ femurs बाहर फ्लश ।
    7. प्रत्येक १०० mm संस्कृति डिश के लिए, संस्कृति डिश में संस्कृति माध्यम के 2 मिलीलीटर जोड़ें । ७२ एच के लिए ३७ ° c मशीन और स्थैतिक संस्कृति में संस्कृति पकवान रखो ।
    8. बाहर मशीन से संस्कृति पकवान ले लो । ताजा संस्कृति माध्यम के 6 मिलीलीटर के साथ supernatant बदलें ।
    9. एक खुर्दबीन के नीचे प्राथमिक BMSCs का निरीक्षण । इस के बाद, BMSCs पारित हर 5-7 डी ।
  2. कोशिकाओं को मशीन से बाहर ले जाओ । एक खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं का निरीक्षण और सेल शीट निर्माण के लिए उपयुक्त कोशिकाओं का चयन करें । जब BMSCs ८०%-९०% संगम तक पहुँचने, कोशिकाओं को वरीयता प्राप्त कोशिकाओं के रूप में चुना जा सकता है ।
  3. संस्कृति माध्यम को कल्चरल डिश से निकालें । धीरे गर्म पंजाबियों के 2 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो लें । संस्कृति पकवान से सभी पंजाबियों निकालें और सुनिश्चित करें कि कोई तरल बना हुआ है । 3 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर पकवान और गर्मी के लिए ०.२५% trypsin (या एक अंय dissociating समाधान) के 2 मिलीलीटर जोड़ें ।
  4. संस्कृति माध्यम के 2 मिलीलीटर जोड़कर trypsin प्रभाव बंद करो, और धीरे पकवान से कोशिकाओं को धो लें । एक नया 15 एमएल केंद्रापसारक ट्यूब में सेल निलंबन स्थानांतरण । Centrifugate 5 मिनट के लिए २२५ x g पर कोशिकाओं ।
  5. supernatant निकालें । 10% (w/v) सुक्रोज समाधान के 3 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं resuspend ।
    नोट: 10% (w/v) सुक्रोज समाधान के लिए निंन चरणों में एक समान कक्ष-hydrogel मिश्रण प्राप्त करने के लिए कक्षों को धोने के लिए उपयोग किया जाता है ।
  6. सेल सस्पेंशन के महाप्राण 10 µ l को hemocytometer के साथ सेल नंबर की गणना करें । अगले चरण के लिए आवश्यक वॉल्यूम परिकलित करें । एक कक्ष पत्रक के लिए, ३,०००,००० BMSCs का उपयोग किया जाता है ।
  7. ३,०००,००० कोशिकाओं को निकालने और एक नया 15 एमएल केंद्रापसारक ट्यूब में उन्हें हस्तांतरण । 5 मिनट के लिए २२५ x g पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक ।
  8. supernatant निकालें । कोशिकाओं को 10% (w/v) सुक्रोज समाधान के 1 मिलीलीटर के साथ resuspend । एक १.५ मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब में सेल निलंबन स्थानांतरण ।
    नोट: एक १.५ एमएल केंद्रापसारक ट्यूब का उपयोग सेल-hydrogel मिश्रण तैयार करने के लिए फायदेमंद है ।
  9. 5 मिनट के लिए २६० xg पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक । पूरी तरह से supernatant को हटाने और सेल तलछट प्राप्त करते हैं ।

4. BMSCs और RAD16-I पेप्टाइड Hydrogel मिश्रण की तैयारी

नोट: multilayered सेल संरचना के निर्माण की एक योजनाबद्ध के लिए चित्र 1b देखें ।

  1. जोड़ें 20 µ एल के 10% (डब्ल्यू/v) सुक्रोज समाधान के लिए १.५ मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब । धीरे BMSCs resuspend और एक वर्दी निलंबन प्राप्त करते हैं ।
    नोट: resuspension के दौरान किसी भी बुलबुले उत्पन्न नहीं करते ।
  2. निलंबन के शीर्ष पर RAD16-I पेप्टाइड hydrogel के 20 µ l को जोड़ें । धीरे RAD16-मैं पेप्टाइड और पिपेट टिप के साथ सेल निलंबन हलचल । जब कोशिका निलंबन और hydrogel एक साथ मिश्रित कर रहे हैं, धीरे मिश्रण पिपेट बार के एक जोड़े ।
  3. ऊतक वाहक से डीपीपी पाड़ बाहर ले और धीरे एक पिपेट टिप के साथ संस्कृति माध्यम महाप्राण ।
    नोट: सुनिश्चित करें कि डीपीपी पाड़ सेल-hydrogel मिश्रण जोड़ने से पहले पूरी तरह से rehydratेड है ।
  4. मिश्रण को महाप्राण और समान रूप से डीपीपी पाड़ में डालें ।
    नोट: मिश्रण की कुल मात्रा के बारे में ४०-५० µ एल होगा । यह केंद्र से एक समय में मिश्रण 10 µ एल पाड़ के बाहर करने के लिए जोड़ने के लिए सिफारिश की है ।
  5. ऊतक वाहक के नीचे करने के लिए संस्कृति मध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़ें । 5 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन में सेल शीट रखो ।
  6. बाहर मशीन से सेल शीट ले लो । धीरे संस्कृति डिश में संस्कृति माध्यम के 4 मिलीलीटर जोड़ने और सेल शीट विसर्जित कर दिया । स्थिर संस्कृति के 2 ज के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन में सेल शीट रखो ।

5. इन विट्रो संस्कृति एक 3d Multilayered सेल शीट एक गतिशील संस्कृति प्रणाली का उपयोग कर

नोट: 3 डी गतिशील प्रणाली के एक योजनाबद्ध के लिए चित्रा 1C देखें ।

  1. एक सिकुड़नेवाला पंप, गैस विनिमय उपकरण, एक ५०० मिलीलीटर कांच की बोतल, एक छिड़काव संस्कृति कंटेनर, और संयोजी ट्यूबों सहित गतिशील छिड़काव प्रणाली, तैयार करते हैं । चित्र 2में दिखाए गए के रूप में गतिशील छिड़काव प्रणाली को इकट्ठा ।
  2. संस्कृति माध्यम की २०० मिलीलीटर बाँझ कांच की बोतल में जोड़ें । कक्ष पत्रक culture संग्राहक के कक्ष में सम्मिलित करें ।
    नोट: कक्ष पत्रक की ऊपरी सतह की दिशा पर ध्यान देना.
  3. टिशू कंटेनर में कल्चरल मीडियम के 3 एमएल डालें और कंटेनर को बंद कर दीजिये । मशीन में गतिशील छिड़काव प्रणाली रखो और पंप शुरू करते हैं । सिकुड़नेवाला पंप की प्रवाह दर को 8 मिलीलीटर पर सेट करें/४८ ज के लिए गतिशील छिड़काव प्रणाली में कक्ष पत्रक ।

6. Multilayered एमएससी सेल शीट प्राप्त करना

  1. आटोक्लेव १.५ मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूबों, संदंश, और दांतेदार संदंश सहित 30 मिनट, के लिए १२१ डिग्री सेल्सियस पर उपकरणों और ऊतक वाहक घटक है ।
  2. कंटेनर के लिए संस्कृति माध्यम की आपूर्ति को रोकने के लिए कांच की बोतल से इनपुट डक्ट बाहर खींचो ।
    नोट: संस्कृति संग्राहक खाली है, जब सिकुड़नेवाला पंप रोकें ।
  3. संस्कृति कंटेनर से बाहर ले सेल शीट और एक संस्कृति पकवान में डाल दिया ।
  4. एक संदंश का उपयोग करने के लिए ऊतक वाहक स्थिर और एक और दांतेदार संदंश का उपयोग करने के लिए काले आधार से सफेद तनाव की अंगूठी अलग । अंतत:, multilayered BMSCs कक्ष पत्रक प्राप्त करें ।
  5. कम संरक्षण के लिए, प्रत्येक कोशिका शीट संदंश के साथ एक १.५ मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब को हस्तांतरित किया जा सकता है । डीपीपी पाड़ केंद्रापसारक ट्यूब के भीतरी दीवार से जुड़ा होना चाहिए, और सेल शीट के रूप में ज्यादा के रूप में संभव के रूप में प्रसार ट्यूब में फैल जाना चाहिए ।
  6. धीरे केंद्रापसारक ट्यूब में संस्कृति मध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़ने के लिए सेल शीट विसर्जित कर दिया । केंद्रापसारक ट्यूब की टोपी बंद करो और 4 डिग्री सेल्सियस पर सेल शीट की दुकान ।
    नोट: सेल शीट का प्रत्यारोपण किया जाना चाहिए या जितनी जल्दी हो सके विश्लेषण । यह 4 एच के भीतर कक्ष शीट का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है ।

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Representative Results

multilayered स्टेम सेल शीट निर्माण की योजनाबद्ध चित्र 1में दिखाया गया है । पीएलए द्वारा सेल शीट पाड़ तैयार करना2 decellularization विधि पहला कदम है । पाड़ के आधार पर, एक अस्थाई 3d सेल संरचना RAD16-1 पेप्टाइड hydrogel के साथ स्टेम कोशिकाओं को मिलाकर निर्माण किया है । आदेश में अनुकूल स्टेम सेल के साथ एक multilayered सेल शीट को प्राप्त करने के लिए यांत्रिक और इष्टतम मैकेनिकल शक्ति, सेल शीट एक गतिशील छिड़काव प्रणाली में संस्कृति है । गतिशील पोषण आपूर्ति के तहत, स्टेम कोशिकाओं को पैदा करना और multilayered सेल शीट के भीतर सेल संपर्कों को स्थापित करने की अनुमति दी जाती है, और अंतिम स्थिर multilayered सेल शीट उत्पाद ~ 24-७२ घंटे की खेती के बाद प्राप्त किया जा सकता है ।

इस मामले में, सेल शीट पाड़ डीपीपी पीएलए2 decellularization विधि द्वारा तैयार किया जाता है । सूखे डीपीपी की उपस्थिति फ्लैट, चिकनी, और अल्पपारदर्शी (चित्रा 3ए) है । 2पीएलए के विशिष्ट लाइसे प्रभाव के कारण, विषम कोशिकाओं को पूरी तरह से हटा दिया जा सकता है, जबकि डीपीपी पाड़ के भीतर प्राकृतिक कोलेजन के ultrastructure अच्छी तरह से संरक्षित है (चित्र 3 बी), और यह बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है यांत्रिक शक्ति और पाड़ की अनुकूलता । इसके अतिरिक्त, पाड़ों एक वृद्धि कारक नियंत्रण रिलीज प्रणाली के रूप में संशोधित किया जा सकता स्टेम सेल विकास का समर्थन करने और vivo पुनर्जनन13 में सुधार होगा ।

जब स्टेम सेल तक पहुंच ~ ८०%-९०% संगम, कोशिकाओं संस्कृति पकवान से अलग कर रहे है और एक 10% सुक्रोज समाधान के साथ धोया । केंद्रापसारक के बाद, कोशिकाओं RAD16-मैं पेप्टाइड hydrogel के साथ मिश्रित कर रहे है और rehydratेड डीपीपी पाड़ को जोड़ा । एक अस्थाई multilayered संरचना एक दो घंटे के स्थैतिक संस्कृति के बाद गठन किया है । अंत में, multilayered BMSC शीट उत्पाद (चित्रा 4) गतिशील छिड़काव प्रणाली में एक ४८ घंटे की संस्कृति के बाद अधिग्रहण कर लिया है । डीपीपी पाड़ के समर्थन के साथ, सेल शीट आसानी से संदंश के साथ हेरफेर किया जा सकता है, और यह अस्थाई रूप से संस्कृति के माध्यम में १.५ मिलीलीटर ट्यूब में 4 ° c पर परीक्षा या प्रत्यारोपण से पहले 4 घंटे के लिए संरक्षित किया जा सकता है (चित्रा 4) । इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला परिणाम दिखाता है के रूप में, BMSCs स्टेम सेल मार्करों CD90 और CD29 के लिए अत्यधिक सकारात्मक हैं । कक्ष पत्रक निर्माण के बाद, multilayered कक्ष पत्रक के भीतर BMSCs CD29 और CD90 (चित्र 5) के उच्च स्तर दिखाएँ ।

Figure 1
चित्रा 1 : multilayered स्टेम सेल शीट के निर्माण के फ़्लोचार्ट । (A) पीएलए2 विसेलुलर पद्धति का उपयोग करके, FPP के भीतर विषम कोशिकाओं को नष्ट कर रहे हैं, जबकि प्राकृतिक extracellular मैट्रिक्स डीपीपी पाड़ में अच्छी तरह से संरक्षित हैं । (ख) डीपीपी पाड़ पर आधारित, अस्थाई multilayered कोशिका संरचना स्टेम कोशिकाओं और स्व-कोडांतरण पेप्टाइड hydrogel मिश्रण द्वारा निर्माण किया है । (ग) का पालन करने के लिए, सेल शीट एक 3 डी गतिशील प्रणाली में संस्कृति है, और स्टेम कोशिकाओं को पैदा करना और गतिशील पोषण की आपूर्ति के तहत सेल संपर्कों की स्थापना की उंमीद कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : ऊतक वाहक और गतिशील छिड़काव प्रणाली । (क) इस पैनल 13 मिमी व्यास ऊतक वाहक से पता चलता है । (ख) इस पैनल के गतिशील छिड़काव प्रणाली के विधानसभा दिखाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : रूप और डीपीपी की ultrastructure । (क) इस पैनल के १०.५ मिमी व्यास डीपीपी पाड़ों की उपस्थिति से पता चलता है । (ख) इस पैनल डीपीपी पाड़ के स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (SEM) परिणाम की एक प्रतिनिधि छवि से पता चलता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : multilayered BMSC शीट का प्रकटन । (क) इस पैनल ऊतक वाहक के भीतर multilayered BMSC शीट की उपस्थिति से पता चलता है । (ख) बरकरार multilayered BMSC शीट संदंश द्वारा रखी गई है. (सी - डी) multilayered सेल शीट का उपयोग करने से पहले १.५ मिलीलीटर ट्यूब में अस्थाई रूप से संरक्षित किया जा सकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5 : इम्यूनोफ्लोरेसेंस BMSC मार्करों अभिव्यक्ति के धुंधला परिणाम । (क) यह पैनल सेल शीट निर्माण से पहले BMSCs के इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला परिणाम दिखाता है । (ख) यह पैनल multilayered BMSC शीट अनुभाग के इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला परिणाम दिखाता है । CD90 (हरी) और CD29 (लाल) BMSCs और सेल शीट में सकारात्मक व्यक्त किया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

वर्तमान प्रोटोकॉल एक multilayered एमएससी शीट के निर्माण के लिए एक कुशल विधि की रिपोर्ट । यह सेल शीट इष्टतम यांत्रिक शक्ति, उच्च कोशिका बोने घनत्व, और अनुकूल स्टेम सेल की गतिविधि प्रदर्शित । एक उदाहरण के रूप में BMSCs का उपयोग करना, 3d सेल संरचना जल्दी RAD16-मैं पेप्टाइड hydrogel के साथ निर्माण किया है । गतिशील छिड़काव प्रणाली में प्रसंस्कृत होने के बाद, multilayered BMSC शीट सफलतापूर्वक प्राप्त की है और BMSCs स्टेम सेल मार्कर के एक उच्च अभिव्यक्ति बनाए रखने के ।

अस्थाई multilayered सेल संरचना का निर्माण प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण कदम है । RAD16-मैं एक वाणिज्यिक hydrogel पेप्टाइड है, और यह 1% एमिनो एसिड और ९९% पानी के होते हैं । कई अध्ययनों से बताया कि इस पेप्टाइड hydrogel प्राकृतिक ECM पर्यावरण की नकल कर सकते हैं और स्टेम सेल प्रसार और जीवन रक्षा के लिए फायदेमंद है15,16,17. वर्तमान प्रोटोकोल में ३,०००,००० एमएससी सस्पेंशन (10% सुक्रोज सॉल्यूशन के 20 µ l में) को RAD16-I पेप्टाइड hydrogel के 20 µ l के साथ मिलाया गया था । सेल सस्पेंशन और पेप्टाइड hydrogel की मात्रा अनुपात 1:1 था । इस पेप्टाइड hydrogel पर्यावरण पीएच मूल्य के प्रति संवेदनशील है, और पेप्टाइड अणुओं स्वचालित रूप से 3 डी नेटवर्क के रूप में जब पीएच मूल्य एसिड से तटस्थ करने के लिए बदल जाएगा । क्योंकि कोशिका सतह चार्ज कणों में होता है, सेल मिश्रण एक कम समय में तरल से hydrogel में बदल गया है, जो भी कोशिकाओं के मिश्रण को प्रभावित किया है । एक अनुकूल कोशिका hydrogel सेल निलंबन और पेप्टाइड hydrogel का एक भी मिश्रण होना चाहिए और सेल मिश्रण को समान रूप से पाड़ पर जोड़ा जा करने के लिए सक्षम बनाता है । शोधकर्ताओं ने अपने वास्तविक जरूरत के हिसाब से सीड सेल नंबर, सुक्रोज सॉल्यूशन वॉल्यूम, और पेप्टाइड hydrogel वॉल्यूम में फेरबदल करके मिक्सचर कंडीशन को ऑप्टिमाइज़ कर सकते हैं । यह सूचना है कि 10% सुक्रोज समाधान के साथ कोशिकाओं को धोने और समान रूप से सेल मिश्रण hydrogel मिश्रण प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण कदम हैं, और एक असमान मिश्रण महान कोशिका हानि और एक अस्थिर अस्थाई multilayered संरचना पैदा कर सकता है सार्थक है ।

डीपीपी पाड़ पर सेल-hydrogel मिश्रण जोड़ने के बाद, multilayered सेल शीट संरचना की यांत्रिक शक्ति कमजोर है क्योंकि पेप्टाइड hydrogel नेटवर्क दीर्घकालिक multilayered सेल संरचना बनाए रखने के लिए पर्याप्त मजबूत नहीं है, और सेल कक्ष पत्रक की स्थिरता बढ़ाने के लिए कनेक्शंस और ECM स्रावों की आवश्यकता होती है. इसके अलावा, संस्कृति माध्यम के गतिशील घुसपैठ स्टेम सेल पैदा करना और multilayered सेल संरचना के भीतर सेल संपर्क स्थापित करने की सुविधा कर सकते हैं, जबकि एक अपर्याप्त पोषण आपूर्ति कोशिका apoptosis कारण और सेल घनत्व को कम करेगा कक्ष पत्रक13में से । इसलिए, गतिशील छिड़काव सिस्टम multilayered कक्ष पत्रक संरचना स्थिर करने के लिए महत्वपूर्ण है । इसके अलावा, संस्कृति माध्यम की उचित प्रवाह दर विशिष्ट स्टेम सेल प्रकार और कोशिका बोने की सघनता के अनुसार समायोजित किया जाना चाहिए । इसके अलावा, डीपीपी पाड़ और multilayered सेल संरचना के बीच कमजोर यांत्रिक कनेक्शन वर्तमान निर्माण विधि की सीमा है, जो multilayered सेल परतों और पाड़ के विभाजन के कारण हो सकता है रहता है । इसलिए, आगे के अध्ययन के लिए 3 डी hydrogel पाड़ और डीपीपी पाड़ के यांत्रिक असंगति बढ़ाने के लिए आवश्यक हैं ।

अब तक, टिशू इंजीनियरिंग वैज्ञानिकों इन विट्रो मेंकुशल पोषण आपूर्ति प्रणाली स्थापित करने पर ध्यान केंद्रित कर रहा है, जैसे coculturing endothelial कोशिकाओं18 और एक छिद्रित पाड़19का उपयोग कर । हालांकि, 3d संरचना के भीतर पोषण पारगम्यता पारंपरिक स्थिर 3 डी संस्कृति प्रणाली में कम है, और स्टेम सेल व्यवहार्यता काफी प्रभावित हो जाएगा । इस मामले में, गतिशील छिड़काव प्रणाली का उपयोग करने स्टेम सेल व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए पर्याप्त पोषण आपूर्ति प्रदान कर सकते हैं । इस प्रोटोकॉल, एक multilayered BMSC शीट का उपयोग कार्डियक फंक्शन और एक चूहे रोधगलन मॉडल13में angiogenesis में सुधार हुआ । एक उच्च सेल लोड और अनुकूल स्टेम सेल संपत्ति के साथ एक स्टेम सेल शीट उत्पाद के निर्माण ऊतक पुनर्जनन के लिए महत्वपूर्ण है । इस कुशल निर्माण विधि का उपयोग करना, multilayered स्टेम सेल शीट के विभिंन प्रकार के बीज स्टेम कोशिका प्रकार, जैसे उपकला स्टेम सेल शीट, तंत्रिका स्टेम सेल शीट, या कार्डियक स्टेम सेल शीट के रूप में फेरबदल द्वारा निर्माण किया जा सकता है । इसके अलावा अंवेषण और multilayered स्टेम सेल शीट के विकल्प के लिए और अधिक ऊतक पुनर्जनन के लिए आवेदन का विस्तार करने की उंमीद कर रहे हैं ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस कार्य को राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन ऑफ चाइना (अनुदान संख्या ३१७७१०६४) द्वारा समर्थित किया गया; गुआंग्डोंग प्रांत की विज्ञान और प्रौद्योगिकी योजना परियोजना (अनुदान संख्याएं 2013B010404030, 2014A010105029, और 2016A020214012); गुआंगज़ौ के विज्ञान और प्रौद्योगिकी योजना परियोजना (अनुदान संख्या २०१६०७०१००६३); और स्नातक नवाचार और उद्यमिता प्रशिक्षण कार्यक्रम (अनुदान संख्या २०१६१०५५९०२८); चीन के युवा वैज्ञानिकों के लिए राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (ग्रांट नंबर ३१८००८१९) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phospholipase A2 Sigma-Aldrich P6534
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D6750-100G
Phosphate buffer Gibco BRL 89033
Penicillin streptomycin / amphotericin  Gibco BRL 15640055
Buffer bicarbonate Sigma-Aldrich C3041
Table concentrator Changzhou Aohua Instrument Co. KT20183
Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM) Corning Cellgro 10-014-CVR
South American fetal bovine serum  Gibco BRL 10270-106/P30-3302
L-Glutamine Corning Cellgro 25-005-CI
0.25% Trypsin/2.21 mM EDTA Corning Cellgro 25-053-CI
Biosafety cabinet Esco,Singapore AC2-2S1
Constant temperature incubator  Esco,Singapore CLS-170B-8
Centrifuge tube  Corning 430790
EP tube Axygen 31617934
Centrifugal machine TOMOS 1-16R 
Sucrose Sigma-Aldrich S9378-500G
Pura Matrix  BD 354250
Dynamic perfusion culture system Minucells and Minutissue D-93077
Peristaltic pump Ismatec IPC N8
Pump tubing Ismatec Nr.1306
MINUSHEET 1300  Regensburg tissue carrier components 
MINUSHEET Regensburg dynamic perfusion system 
MINUSHEET 0006 Regensburg gas exchange equipment 
MINUSHEET 0002 Regensburg 500 mL glass bottle 
MINUSHEET 1301 perfusion culture container 

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References

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इंजीनियरिंग अंक १४० इंजीनियरिंग ऊतक इंजीनियरिंग सेल शीट स्टेम सेल की गतिविधि 3 डी सेल संस्कृति ऊतक पुनर्जनन
एक 3 डी गतिशील संस्कृति प्रणाली के साथ एक Multilayered Mesenchymal स्टेम सेल शीट का निर्माण
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Wang, Y., Lu, C., He, C., Chen, B.,… More

Wang, Y., Lu, C., He, C., Chen, B., Zheng, Y., Zheng, J., Zhang, J., Wu, Z. Construction of a Multilayered Mesenchymal Stem Cell Sheet with a 3D Dynamic Culture System. J. Vis. Exp. (140), e58624, doi:10.3791/58624 (2018).

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