Summary
Denne teknik beskriver realtid indspilning af iltforbrug og ekstracellulære forsuring priser i eksplanterede mus retinale væv ved hjælp af en ekstracellulære flux analyzer.
Abstract
Høj skarphed vision er en stærkt energikrævende proces, og nethinden har udviklet flere unikke tilpasninger for at netop opfylde sådanne krav samtidig bevare gennemsigtigheden af den visuelle akse. Perturbationer til denne hårfine balance forårsage blændende sygdomme såsom diabetisk retinopati. Forståelse af energi metabolisme ændringer i nethinden under sygdom er derfor afgørende, at udviklingen af rationel terapier for forskellige årsager til vison tab. De nylige fremkomsten af kommercielt tilgængelige ekstracellulære flux analysatorer har foretaget undersøgelse af retinale energimetabolisme mere tilgængelige. Denne protokol beskriver brugen af sådan en analysator til måling af bidrag til retinal energiforsyning gennem sine to princippet arme - oxidativ fosforylering og glykolyse - af kvantificere ændringer i ilt forbrug satser (OCR) og ekstracellulære forsuring satser (ECAR) som proxies for disse veje. Denne teknik er let udføres i eksplanterede retinale væv, at lette vurderingen af svar til flere farmakologiske stoffer i et enkelt eksperiment. Metaboliske signaturer i nethinder fra dyr mangler stang fotoreceptor signalering er i forhold til wild-type kontrolelementer ved hjælp af denne metode. En stor begrænsning i denne teknik er manglen evne til at skelne mellem lys-tilpasset og dark-adapted energi udnyttelse, en vigtig fysiologisk overvejelse i retinal væv.
Introduction
Nethinden er blandt de mest energi-krævende væv i centralnervesystemet1. Ligesom de fleste væv genererer det adenosin trifosfat (ATP) via glykolysen i cytosol eller via oxidativ fosforylering i mitokondrierne. Energiske fordelen ved oxidativ fosforylering over glykolyse til at producere ATP fra et molekyle af glukose er klar: 36 molekyler af ATP genereret fra den tidligere vs 2 molekyler ATP genereret fra sidstnævnte. I overensstemmelse hermed, retinal neuroner afhænge primært af mitokondrie respiration for energiforsyning og dette afspejles af deres høj tæthed af mitokondrier2. Endnu, nethinden også stærkt afhængig glycolytic maskiner selv når ilt er rigelige. Denne proces af aerobe glykolyse blev oprindeligt beskrevet i kræftceller ved Otto Warburg3, der engang bemærkede, at nethinden var det kun post mitotiske væv i stand til at denne form for stofskifte4. Siden de indledende bemærkninger, er blevet beskrevet mange post mitotiske væv for at engagere sig i forskellige grader af glykolyse ud over oxidativ fosforylering til at opfylde deres ATP krav.
Phototransduction, visual pigment genbrug, biosyntese af fotoreceptor ydre segmenter og synaptic aktivitet er alle energi krævende processer i fotoreceptorer, neuronal underklasse, der er fremherskende i nethinden. Men behovet for at aktivt transport af ioner mod deres elektriske og koncentration gradienter er langt den mest energisk tidskrævende proces i neuroner1. Fotoreceptorer er ejendommelig neuroner i den forstand, at de er depolariseret i mangel af stimulation (dvs. i mørke), der henviser til, at lys stimulerer udløser kanal lukning og efterfølgende hyperpolarisering. Derfor, i mørke, nethinden forbruger store mængder af ATP til at opretholde sin depolarisering eller "mørke strøm" som det kaldes almindeligvis. Fra en adaptive synspunkt er en stor udfordring i at levere disse enorme mængder af ATP behovet for organismer at fastholde visuel klarhed gennem den optiske akse. Den omvendte retinal arkitektur set i moderne skabninger er den dominerende løsning, da det holder tæt kapillær netværket leverer fotoreceptorer væk fra stien af lys. Men dette vidunder af naturlige bioteknologi placerer nethinden i en afgrund i form af metaboliske reserve. Selv små fornærmelser til nethinden kan potentielt forstyrre den fine balance af energiforsyning til efterspørgslen, og visuelle dysfunktion eller frank blindhed kan opstå hurtigt.
Givet de unikke energisk krav af neurale nethinden, kombineret med sin stramme begrænsning af vaskulær forsyning, kunne nøjagtig måling af ATP forbrug i nethinden og dens ændringer under sygdom have dybtgående konsekvenser i forståelse og behandling af blændende sygdomme som retinitis pigmentosa og diabetisk retinopati. Traditionelt har kræver disse målinger dyre, specialdesignet udstyr med de fleste undersøgelser fra en håndfuld af laboratorier udelukkende dedikeret til målinger af metaboliske aktivitet2,5,6, 7,8. Teknikker omfatter individuelle assays til specifikke metabolitter, tracer undersøgelser ved hjælp af radio-mærket prækursorer, iltforbrug optagelse ved hjælp af Clark elektroder og metabolomic profilering9.
Med teknologiske udvikling høj overførselshastighed og øget tilgængelighed af kommercielle enheder er teknikker til at optage retinal stofskifte mere og mere tilgængelige og økonomisk overkommelige. Metoden beskrevet her måler både oxidativ fosforylering og glykolyse i nethinden ved hjælp af eksplanterede væv og et kommercielt tilgængelige ekstracellulære flux analyzer9,10,11,12. Denne analyzer registrerer særskilt ilt forbrug (OCR) og den ekstracellulære forsuring sats (ECAR), der tjener som indirekte indikatorer for oxidativ fosforylering og glykolyse, henholdsvis13. Disse målinger er udført af en sonde nedsænket i en microchamber, lavet over væv af interesse. Denne tilpasning af tidligere udgivne metoder bruger en fange plade oprindeligt designet til pancreas Holme af Langerhanske optage metaboliske aktivitet i små, cirkulære dele af musen nethinden. Flere farmakologiske eksponeringer kan leveres til væv i løbet af en enkelt registrering, fordi systemet indeholder 4 injektion porte for hver prøve godt. Ved hjælp af dette system med adskilte protokoller optimeret til ECAR og OCR optagelser, svarene fra vildtype nethinder kan sammenlignes med nethinder mangler transducin (Gnat1- / -), en årsag til medfødt stationær natteblindhed i mennesker14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokoller fulgt foreningen for forskning i Vision og oftalmologi erklæring om brug af dyr og blev godkendt af Washington University.
1. animalsk forberedelse
- Holde dyr i standard boliger med en 12 timers mørke til 12 timers lys cyklus. Begynd forsøg på standardiseret gange for at undgå døgnrytmen effekter, typisk morgenen kort efter lysene er tændt.
2. løsning forberedelse
- Forberede base medier ved at opløse 8,4 mg pulveriserede medier i dobbeltdestilleret H2O (ddH2O) og justere pH til 7.4 med enten HCl eller NaOH, til en endelige mængden af 1 L. Filter sterilisere denne løsning med et 0,22 µm vævskultur filter.
- Tilføj 1 M glukose og 100 mM natrium pyruvat til medierne for at opnå endelige koncentrationer af 5 mM glukose og 1 mM pyruvat.
- Sted en 50 mL prøve af base medierne i et 37 ° C vandbad.
- Forberede væv kvantitering i slutningen af flux analyse, lysis løsning, ved at tilføje tris base til 10 mM, polyethylenglycol tert-octylphenyl ether til 0,2% (v/v) og EDTA til 1 mM, alle i ddH2O. Mix indtil alle komponenter helt opløst og justere pH 8,0.
- Forberede en 11 µM bestand af oligomycinets, en ATP syntase hæmmer, opløst i base medier til at målrette en endelig koncentration på 1 µM i brønden mitokondrie stress-protokollen. Forberede en 11 µM bestand af carbonyl cyanid - 4-(trifluormethoxy) phenylhydrazone (FCCP), en frakobling agent, opløst i base medier til at målrette en endelig koncentration på 1 µM i brønden. Forberede en cocktail af elektron transport kæde hæmmere, rotenon og antimycin A (RAA) ved at tilføje rotenon 11 µM og antimycin A til 22 µM, opløst i base medier til at målrette en endelig koncentration på 1 µM rotenon og 2 µM antimycin A i den godt.
- Forberede en 220 mM bestand af glucose opløses i base medier, til at målrette en endelig koncentration på 20 mM i brønden glykolyse-protokollen. Også forberede en 1,1 M bestand af 2-deoxyglucose (2-DG), en kompetitiv inhibitor af glucose og glycolytic antagonist, ved at opløse det i base medier. Dette vil være rettet mod en endelig koncentration på 100 mM 2-GD i brønden.
3. instrument kalibrering
- For at kalibrere apparaturet til en ekstracellulær flux assay, tilsættes 1 mL af kalibreringsopløsningen til hver brønd af sensor patron (24 brønde i alt) og der inkuberes ved 37 ° C i en CO2-gratis kuvøse natten over (eller mindst 8 h).
- Indlæse additiver til den mitokondrielle stress eller glykolyse protokollen i hver injektor port, A til D, på sensor patron, justere volumen ændringer i brønden.
Bemærk: Som et eksempel, ville en typisk assay omfatter 45 µL af et tilsætningsstof i første injektor porten, 49.5 µL ind i anden, 54,5 µL til den tredje, og 60 µL til sidst, antager en indledende godt volumen af 450 µL. - Under de første adskillige forsøg, skal du indlæse base medier i port A at måle, hvor meget væv bevægelse/artefakt opstår efter en port injektion.
- Tillad indlæst sensor plade til inkuberes ved 37 ° C i en ikke-CO2 inkubator for mindst 60 min.
4. isolering af friske mus retinale væv
Bemærk: Dette trin er tilpasset fra en teknik, Dr. Barry Winkler15.
- Efter administration af dyb anæstesi ved hjælp af en standard ketamin/xylazin cocktail, aflive mus af cervikal dislokation.
- Bruge et par mellemstore buet pincet til at forstå den posteriore kloden på synsnerven og forsigtigt anvende fremadrettet pres på proptose i øjet (figur 1A).
- Med en ren barberblad, skal du oprette en limbus til limbus snit på tværs af hornhinden ved hjælp af en enkelt, bevidst pass af bladet.
- Bruger fine, knivspids vinklet McPherson-stil pincet, posterior kloden at udtrykke linse og forreste hyaloid membraner af cornea snit. Kassér disse væv.
- Gentag den klemme manøvre med pincet til at udtrykke de neurale nethinden.
- Bruge pincet som en ske til at løfte nethinden, snarere end at forstå væv, overføre nethinden fra cornea snit og placere direkte i varm medier i en 3-cm parabol eller en 6-godt vævskultur klynge plade.
- Bruge to par af fine, vinklet McPherson-stil tang til at forsigtigt dissekere resterende glasagtige fra nethinden. Dette gøres bedst ved at fatte glasagtige i periferien af den retinale cup og trække mod centrum, med en sidste disinsertion af den glasagtige kroppen fra center som helhed. Brug af pincet, fjerne enhver resterende retinale pigment epitel fra fotoreceptor overfladen af nethinden.
- Skære en P1000 afpipetteres tip med et barberblad til at oprette en ~ 4 mm åbning for at forhindre unødig traumer til den sarte retinale væv under overførsel manøvrer.
- Overføre den isolerede retinale væv i friske medier ved hjælp af en cut P1000 afpipetteres tip.
- Skær 1 mm slag af nethinden omkring synsnerven med en 1 mm biopsi punch udstyret med en stemplet til at løsne væv i tilfælde det bliver indgivet i boringen (figur 1B). Angiv de retinale slag til side i ren media holdt på en 37 ° C blok eller varme pad.
5. assay protokol
- Overføre enkelte slag til en 24-godt islet capture mikrotiterplade ved hjælp af en cut P1000 tip, sugning 450 µL af medier sammen med væv.
- Bruge fint, lige tang til at forsigtigt manipulere slag ind i midten af mikrotiterplade. Holde slag orienteret i den samme retning (fx, ganglion celle side opad).
- Hvile capture plade på en varmepude eller varme blok sæt til 37 ° C, som disse trin gentages for de resterende prøver.
Bemærk: Til hvert eksperiment, der er afsat 3-4 blanke brønde med 450 µL af base medier til at tjene som negative kontroller. I de resterende 20-21 brønde, test hver biologiske replikeres i tre eksemplarer. Derfor vil tillade hver 24-godt plade til optagelse fra 6-7 forskellige dyr eller behandling betingelser.
- Hvile capture plade på en varmepude eller varme blok sæt til 37 ° C, som disse trin gentages for de resterende prøver.
- Undgå luftbobler, forsigtigt holdning Holmen optage mesh skær til hver brønd med pincet og sikre skærene med en metal stemplet eller med et cut P1000 afpipetteres tip (figur 1 C).
Bemærk: Undgå overdreven væv bevægelse under dette trin for at bevare retinal punch position inden for center for eksempel microchamber. Luftbobler fordreje alvorligt OCR aflæsninger. Selv om microchamber har tilstrækkelig dybde til at rumme typisk mus nethinden (figur 1 c), kan lejlighedsvis bearbejdning-defekter i trådnet skærene forårsage væv til at blive alt for komprimeret under skærmen indsættelse. Hvis dette sker, simpelthen gøre en note af knust væv og udelukke at prøve i den endelige analyse. - Inkuber væv pladen i et 37 ° C CO2-gratis kuvøse for mindst 60 min.
- Programmere den ekstracellulære flux analyzer bruger Mix, vent, foranstaltning, og Gentag kommandoer. Som et eksempel, en typisk eksperiment med retinale væv kan omfatte følgende: Bland 2 minutter, vent 2 minutter og måle 5 minutter. Gentag forsøget med disse tre trin mellem 5 - 8 gange (cykler) for en baseline optagelse, og efter injektion af hvert stof testes under flugt.
- Tryk på knappen START på ekstracellulære flux analyzer og følg vejledningen på skærmen for at indsætte sensor patronen til kalibrering.
- Følg vejledningen på skærmen for at erstatte kalibratoren plade med pladen som indeholder retinal prøverne for enden af kalibreringen.
- Tillad, at programmet til at køre, som programmeret. Ved afslutningen af flugt, Følg vejledningen på skærmen for at skubbe væv plade. Se resultaterne af Kør og gemme datafilen.
- Med en bøjet 20 gauge kanyle og pincet, skal du fjerne alle mesh skær fra brønde, efterlod den retinale punch.
- Omhyggeligt Aspirér medier fra vævet og vaske væv to gange med 0,5 mL koldt fosfatbufferet saltopløsning (PBS). Opsug PBS efter vask.
- Tilføje 100 µL af lysisbuffer til hver brønd og afpipetteres op og ned for at homogenisere væv.
- Kvantificere input niveauer baseret på samlede dobbelt-strenget DNA (dsDNA) eller samlede proteinindhold.
Bemærk: Det følgende er baseret på et kommercielt tilgængelige dsDNA assay. - Fortynd mængden prøver 1:1 ved at tilføje 100 µL af Tris-EDTA (TE) bufferen og overføre 100 µL af de fortyndede prøve til en 96 godt plade.
- Tilføj 100 µL af påvisning buffer i hver brønd. Efter blanding for 2-5 minutter, kvantificere fluorescens efter excitation på 480 nm og emission ved 520 nm, at sammenligne med en standardkurve.
- Normalisere rå ekstracellulære flux sporing til DNA indhold i brønden.
Bemærk: I resultaterne præsenteres her, er prøver normaliseret til 50 ng dsDNA - en typisk beløb i en 1 mm retinal punch. Absolutte værdier præsenteret her kan derfor sammenlignes med undersøgelser præsenteres data "pr. retinal punch". Normalisere tracings til en intern standard, som baseline køre ved en glukose koncentration på 5 mM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Brug de beskrevne teknikker (sammenfattet i figur 1), retinal explants fra 8 uger gamle vildtype (WT) mus var i forhold til alder og baggrund matchede transducin null mus (Gnat1- / -). Fordi Gnat1- / - dyr mangler maskiner at lukke cyklisk-nukleotid gated Ionkanaler som reaktion på lys stimuli, deres rod fotoreceptorer forblive depolarized selv i lys14. Den efterfølgende nødvendigt at bevare kalium efflux ville skabe store ATP efterspørgsel, hvilket resulterer i bioenergetic stamme. For at bestemme, hvis sådanne skift i energiefterspørgsel vil øge oxidativ fosforylering eller glycolytic flux, blev væv fra vildtype mus og Gnat1- / - mus sammenlignet ved hjælp af ekstracellulære flux analyzer. Ved baseline, 5 mM glukose og 1 mM pyruvat, har retinal væv fra wild-type dyr samme rente af syre efflux sammenlignet med Gnat1- / - mutanter. Lignende mønstre er set efter tilsætning af 20 mM glukose og glycolytic hæmmer 2-GD (figur 2A). Disse data kan også blive matematisk omdannet til at repræsentere fraktioneret ændringer fra baseline (figur 2B), et format, som kan give mulighed for bedre sammenligning mellem forskellige eksperimentelle interventioner.
Absolut OCR på baseline er tilsvarende mellem WT og mutant retinale væv (figur 3A). Tilsætning af 20 mM glukose øger mitokondrie respiration, men ingen ændring er observeret mellem grupper med hensyn til absolutte kvantificering eller ændring fra baseline (figur 3B). Tilsætning af 1mM FCCP (en frakobling agent) at demonstrere maksimal mitokondrie respiratorisk satser øger ikke væsentligt OCR over niveauet set med høje glukose i WT eller Gnat1- / - væv. Men, signaler fra begge mus drastisk falde efter tilsætning af RAA cocktail.
Ideelt set køre ekstracellulære flux eksperimenter i overværelse af ATP syntase hæmmer oligomycinets støtte til at identificere kilder til proton lækage, forekommer når bevægelse gennem elektron transportkæde ikke er knyttet til ATP produktion16. I retinal explants fra 8 uger gamle C57BL/6J mus sænker oligomycinets behandling håndfast OCR, som forventede (figur 4). Men efterfølgende tilsætning af FCCP, at finde maksimal OCR, øger kun nominelt OCR til omkring 60% af baseline, i overensstemmelse med en forudgående undersøgelse11.
XF24 analyzer bruger dykkede sonder, der gør en tæt forsegling i væv nå, at skabe en forbigående mikromiljø til måling af ilt og syre flux. Positionering af retinale væv i godt pladen (i forhold til sensorerne) kan potentielt påvirke OCR optagelser, og føre til uønskede konfoundere, og nogle reserachers har opfordret til markedsføring retinale væv direkte nedenunder lambda-sonden med den fotoreceptor ydre segmenter orienteret mod sensoren11. For at teste effekten af retinale væv holdning til OCR målinger, væv fra unge C57BL/6J mus (8 uger gammel) blev analyseret i to retninger: retinal ganglion celler nedad på pladen (dvs., fotoreceptorer placeres oprejst tættest til sensor ) eller opad mod sensoren. Ingen forskelle i relativ OCR som reaktion på FCCP eller RAA blev observeret, med angivelse af tilsvarende følsomhed for maksimal og minimal mitokondrie respiratorisk satser i enten orientering (figur 5A). Derudover var absolutte OCR målingerne også tilsvarende mellem retinale væv i enten orientering (figur 5B).
Figur 1 : Isolering af retinale eksplantat og opsætning i den ekstracellulære flux analyzer. A. Isolation af neurale nethinden i situ af anvende fremdrivningseffektiviteten kraft på kloden med pincet, incising hornhinden og fjerne nethinden efter kassering linse og forreste hyaloid membraner. B. forberedelse af væv til flux optagelse med retinal punch skabelse, placering af enkelte slag i Holmen capture mikrotiterplade og brug af en mesh indsætte at minimere væv bevægelse med microchambers (skala barer = 1 mm). C. en skematisk, stammer fra producenten-forudsat data, viser proceduren dispositionen og demonstrerer, at højden af microchamber er tilstrækkelig til at rumme murine nethinden. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Mitokondrie stress analyse ved hjælp af eksplanterede nethinden fra 8 uger gamle dyr. A. gennemsnit tracings med standard fejl af måling (SEM), normaliseres til DNA indhold af væv, fra et eksperiment, der er optimeret til ilt forbrug optagelser, sammenligne transducin knockout dyr (Gnat1- / -) vildtype kontrol. B. samme eksperiment med data omdannet, baseline optagelser angives som reference. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Analyse af glykolytiske sats ved hjælp af eksplanterede nethinden fra 8 - uger gamle dyr. A. Averaged, DNA-indhold-normaliseret, tracings fra et eksperiment, der er optimeret til syre efflux optagelser sammenligne transducin knockout dyr (Gnat1- / -) vilde type kontrol. B. Data fra det samme eksperiment normaliseret til baseline optagelser. Spor viser gennemsnit ± SEM. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Irreversible virkninger af oligomycinets på retinal respiratorisk satser. I akut rede retinale explants fra 8 uger gamle C57BL/6J mus reducerer oligomycinets behandling den maksimal OCR induceret ved senere tilsætning af FCCP. Spor viser gennemsnit ± SEM. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Virkningerne af væv positionering på OCR måling. Retinal væv fra 8 uger gamle C57BL/6J mus blev placeret i brønde med ganglion celler vender mod sensor (Ganglion celler op) eller fra sensor (Ganglion celler ned). Mellem grupper, lignende ekstracellulære flux optagelser er observeret i form af (A) respiratorisk kapacitet i forhold til grundlinjen eller (B) med hensyn til absolutte kvantificering. Spor viser gennemsnit ± SEM. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
OCR og ECAR måles let i eksplanterede retinale væv ved hjælp af en bioanalyzer ved hjælp af de teknikker, der beskrives. Denne metode afviger fra de andre grupper i flere kritiske trin. Retinal væv er isolerede gennem en stor hornhinde indsnit uden enucleating globe, som oprindeligt beskrevet af Winkler15. Denne metode af retinale isolation giver mulighed for en hurtig overførsel fra levende øje i væv capture pladen (ofte inden for 5 minutter). Væv holdes ved 37 ° C i hele den proces, som bevarer cellulær respiration bedre end når de er lagt på is. Medier med minimal tilsætningsstoffer bruges til indledende målinger, udelade nogen bufferkapacitet agenter såsom HEPES eller natriumbikarbonat, serum eller overskydende makronæringsstoffer, da dette giver mulighed for mere pålidelige målinger af basal energimetabolisme og hæmmer ikke vurdering af ECAR. Retinal slag optages bedst i en 24-godt format og ikke i 96-brønde, at minimere traumer til væv. Retinal væv er placeret i midten af brønden i microchamber væv og sikret med en mesh indsætte. Doing så giver mulighed for nøjagtig registrering af ECAR og OCR, samtidig forhindre overdreven væv bevægelse i tiden, og eliminerer behovet for andre reagenser som væv klæbemidler. Et køretøj indsprøjtning under flugt anbefales, især når du konfigurerer optagelse eksperimenter for første gang, da dette vil give en fornemmelse af hvor godt væv er sikret inden for capture plade. OCR optagelser ved hjælp af denne teknik er uafhængige af retinale orientering i brønden, men orientering skal holdes konsekvent blandt prøver inden for eksperimenter. Alle målinger er taget kun efter retinal metabolisme har nået stabil tilstand efter injektion af test forbindelser.
Denne protokol beskriver normalisering af data til samlede DNA-indhold, som en proxy for celle nummer. En sådan teknik er fordelagtig, fordi det vil tage hensyn til ændringer i celle nummer drevet af variation i retinal tykkelse, punch størrelse eller forskelle i lymfevaev mellem genetisk forskellige prøver. Total protein-baserede normalisering er også en pålidelig metode, og har fordelen at minimere forskellene i mitokondrie totalvægt mellem retinal prøver. Dog kan normalisering baseret på proteinindhold i hele væv blive forvirret af ændringer i ekstracellulær matrix mellem prøver. Normalisering af flux optagelser til grundlinjen, er som vist i de repræsentative resultater, fordelagtigt fordi det minimerer variabilitet i retinal punch størrelse mellem replikater og nemt giver mulighed for fortolkning af ændringer som følge af farmakologiske interventioner. Dog rapportering af rå værdier giver mulighed for bedre sammenligning mellem forskellige forsøg og eksperimenter udført ved hjælp af forskellige flux optagelse metoder.
Resultater ved hjælp af disse teknikker kan sammenlignes med dem, der indberettes andetsteds. Selvom oligomycinets - en ATP syntase hæmmer - bruges typisk til at måle proton lækage i væv eller celler af interesse, har dette stof uheldige virkninger for retinal stofskifte. I forsøgene rapporteret her, en 60% fald i maksimal retinal OCR fremkaldes ved FCCP er observeret efter udsættelse for oligomycinets (figur 4), næsten identisk med en tidligere studie11. En potentiel forklaring på denne konstatering er uoprettelige skader eller ændring af retinale mitokondrier af ATP syntase hæmning. Desuden som Kooragayala og kolleger først rapporteret11, retinal mitokondrier er sandsynligvis opererer på nær maksimal priser i basal betingelser siden en elektron transport kæde frakobling agent, øger FCCP, kun OCR med ca 15% (figur 3 , Figur 5).
Ekstracellulære flux optagelser i eksplanterede retinale væv vise en stor reserven glykolytiske kapacitet, da tilsætningen af 20 mM glukose fremkalder en to-fold stigning i ECAR (figur 2). Fordi oligomycinets, normalt bruges til at måle maksimal glycolytic kapacitet, har skadelige virkninger i retinal væv (figur 4), kan anvendelse af høje glukose tilføjelse til optagelsen tjene som bedre proxy til at måle glycolytic reserve i nethinden. En vigtig advarsel forebyggelse af brug af ECAR som en ren proxy for glycolytic sats er, at CO2 befriet af citronsyrecyklus kan være en betydelig kilde til syre i kulturperler væv17. Overskydende pyruvat øger ikke ECAR over de niveauer, der fremkaldes ved høje glukose, og glycolytic flux er næsten elimineret i retinal explants ved hjælp af overskydende molære forhold 2-GD (figur 2). Da ATP bruges til at regenerere membran potentiale forekommende fra depolarisering begivenheder i dark-adapted nethinden, forventes dyr mangler transducin at forbruge mere energi end WT modstykker. Dog i explants, blev forskelle i retinal energimetabolisme mellem Gnat1- /- og kontrol ikke set i eksperimenter beskrevet her (figur 2 og 3). Disse resultater stemmer overens med dem, der opnås ved hjælp af en brugerdefineret perfusion apparat til at måle OCR i Gnat1- / - dyr18. Navnlig, brugerdefinerede apparatet bruges af Du og kolleger tilladt for måling af OCR under lys-tilpasset og mørke tilpasset betingelser. Dermed er et lille, men signifikant fald i OCR efter lys eksponering opdaget i wild-type nethinder, men ikke i Gnat1- / - nethinder18. Dette illustrerer en stor begrænsning af den nuværende teknik i måling af ECAR og OCR i eksplanterede nethinder - den ekstracellulære flux analyzer bruges her er afhængig af synligt lys excitation af fluorophores indlejret i dets ilt og pH sensorer, at fjerne den mulighed for at udføre målinger i dark-adapted væv. Sådanne målinger er særdeles relevante for visuel fysiologi og vil stadig brug for ældre teknikker designet udelukkende for studiet af retinale stofskifte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi takke Dr. Alexander Kolesnikov og Dr. Vladimir Kefalov for at give Gnat1- / -mus, for nyttige feedback og rådgivning, og læsning af manuskript.
Dette arbejde blev støttet af NIH EY025269 (RR), Diabetes Research Center ved Washington University - NIH DK020579 (JRM og RR), en karriere udvikling Award fra forskning til at forebygge blindhed (RR), Horncrest Foundation (RR), en karriere udvikling Award fra JDRF ( JRM), NIH DK101392 (CFS), DK020579 (CFS), DK056341 (CFS) og DK114233 (JRM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Seahorse XF24 Extracellular Flux Analyzer | Agilent, Santa Clara, CA | ||
| Seahorse XF24 Islet Capture FluxPak (includes: Islet Capture Microplate, Sensor Cartridge and Calibrant Solution) | Agilent, Santa Clara, CA | 101174-100 | Includes islet capture microplate, sensor cartridge and calibrant solution |
| RPMI 1640 Media (Powdered medium) | Millipore-Sigma | R1383 | RPMI 1640 Media with L-Glutamine and without glucose or sodium bicarbonate |
| D-Glucose | Millipore-Sigma | G8270 | 1M D-Glucose filtered, for media preparation |
| Sodium pyruvate | Corning | 25000CI | 100 mM sodium pyruvate |
| Antimycin-A | Millipore-Sigma | A8674 | Mitochondrial stress protocol component |
| FCCP | Millipore-Sigma | C2920 | Mitochondrial stress protocol component |
| Rotenone | Millipore-Sigma | R8875 | Mitochondrial stress protocol component |
| 2-deoxyglucose | Millipore-Sigma | D6134 | Glycolysis protocol component |
| 1 mm skin biopsy punches with plunger | Integra-Miltex | 33-31AA-P/25 | Explanting retinal tissue tool |
| Dumont Mini-Forceps Straight | Fine Science Tools | 11200-10 | Explanting retinal tissue tool |
| Dumont Medical #5/45 Forceps- Angled 45 degrees | Fine Science Tools | 11253-25 | Explanting retinal tissue tool |
| Dumont #7 Forceps - Curved | Fine Science Tools | 11271-30 | Explanting retinal tissue tool |
| Quant-iT Picogreen dsDNA Assay Kit | Fisher Scientific | P7589 | Loading normalization assay |
| Trizma base (Tris base) | Millipore-Sigma | T6066 | Component of lysis buffer |
| Triton X-100 (polyethylene glycol tert-octylphenyl ether) | Millipore-Sigma | X100 | Component of lysis buffer |
| 0.5M EDTA pH 8.0 | Ambion | AM9262 | Component of lysis buffer |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratories | Strain 000664 | Animals |
| Gnat1-/- and background-matched Gnat1+/+ | Vladimir Kefalov, PhD; Washington University School of Medicine | Animals |
References
- Wong-Riley, M. T. Energy metabolism of the visual system. Eye and brain. 2, 99-116 (2010).
- Ames, A. 3rd, Li, Y. Y., Heher, E. C., Kimble, C. R. Energy metabolism of rabbit retina as related to function: high cost of Na+ transport. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 12 (3), 840-853 (1992).
- Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123 (3191), 309-314 (1956).
- Wubben, T. J., et al. Photoreceptor metabolic reprogramming provides survival advantage in acute stress while causing chronic degeneration. Scientific reports. 7 (1), 17863 (2017).
- Du, J., Linton, J. D., Hurley, J. B. Probing Metabolism in the Intact Retina Using Stable Isotope Tracers. Methods in enzymology. 561, 149-170 (2015).
- Felder, A. E., Wanek, J., Tan, M. R., Blair, N. P., Shahidi, M. A Method for Combined Retinal Vascular and Tissue Oxygen Tension Imaging. Scientific reports. 7 (1), 10622 (2017).
- Hurley, J. B., Lindsay, K. J., Du, J. Glucose, lactate, and shuttling of metabolites in vertebrate retinas. Journal of neuroscience research. 93 (7), 1079-1092 (2015).
- Winkler, B. S. Glycolytic and oxidative metabolism in relation to retinal function. The Journal of general physiology. 77 (6), 667-692 (1981).
- Pelletier, M., Billingham, L. K., Ramaswamy, M., Siegel, R. M. Extracellular flux analysis to monitor glycolytic rates and mitochondrial oxygen consumption. Methods in enzymology. 542, 125-149 (2014).
- Joyal, J. S., et al. Retinal lipid and glucose metabolism dictates angiogenesis through the lipid sensor Ffar1. Nature medicine. 22 (4), 439-445 (2016).
- Kooragayala, K., et al. Quantification of Oxygen Consumption in Retina Ex Vivo Demonstrates Limited Reserve Capacity of Photoreceptor Mitochondria. Investigative ophthalmology & visual science. 56 (13), 8428-8436 (2015).
- Pearsall, E. A., et al. PPARalpha is essential for retinal lipid metabolism and neuronal survival. BMC biology. 15 (1), 113 (2017).
- Nicholls, D. G., et al. Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. Journal of visualized experiments. (46), (2010).
- Lobanova, E. S., et al. Transducin translocation in rods is triggered by saturation of the GTPase-activating complex. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 27 (5), 1151-1160 (2007).
- Winkler, B. S. The electroretinogram of the isolated rat retina. Vision research. 12 (6), 1183-1198 (1972).
- Jastroch, M., Divakaruni, A. S., Mookerjee, S., Treberg, J. R., Brand, M. D. Mitochondrial proton and electron leaks. Essays in biochemistry. 47, 53-67 (2010).
- Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data. Methods in enzymology. 547, 309-354 (2014).
- Du, J., et al. Phototransduction Influences Metabolic Flux and Nucleotide Metabolism in Mouse Retina. The Journal of biological chemistry. 291 (9), 4698-4710 (2016).
