Summary
Deze techniek wordt beschreven real-time opname van zuurstofverbruik en extracellulaire verzuring tarieven in het netvlies weefsel transplanteren muis met behulp van een extracellulaire flux-analyzer.
Abstract
Hoge gezichtsscherpte visie is een zwaar energieverbruikende proces, en het netvlies heeft verscheidene unieke aanpassingen precies om dergelijke eisen met behoud van de transparantie van de visuele as ontwikkeld. Verstoringen op dit delicate evenwicht veroorzaken verblindende ziekten, zoals diabetische retinopathie. Het begrip van energie metabolisme veranderingen in het netvlies tijdens ziekte is dus noodzakelijk om de ontwikkeling van rationele therapieën voor verschillende oorzaken van vison verlies. De recente komst van verkrijgbare extracellulaire flux analyzers heeft de studie van retinale energiemetabolisme toegankelijker gemaakt. Dit protocol beschrijft het gebruik van dergelijke een analysator voor het meten van bijdragen aan het netvlies energievoorziening door haar twee beginsel wapens - oxidatieve fosforylatie en glycolyse - door het kwantificeren van de veranderingen in het zuurstof verbruik (OCR) en extracellulaire verzuring tarieven (ECAR) als proxy's voor deze trajecten. Deze techniek wordt gemakkelijk uitgevoerd in transplanteren retinale weefsel, vergemakkelijking van de beoordeling van reacties op meerdere farmacologische agenten in een enkele experiment. Metabole handtekeningen in het netvlies van de dieren ontbreekt staaf fotoreceptor signalering worden vergeleken met wild-type besturingselementen met behulp van deze methode. Een belangrijke beperking bij deze techniek is het gebrek aan vermogen om te discrimineren tussen licht aangepast en dark-adapted energie gebruik, een belangrijke fysiologische overweging in netvlies weefsel.
Introduction
Het netvlies is een van de meest energie-eisen weefsels in het centrale zenuwstelsel1. Zoals de meeste weefsels genereert het adenosine trifosfaat (ATP) via glycolyse in het cytosol of via oxidatieve fosforylatie in de mitochondriën. De energieke voordeel van oxidatieve fosforylatie over glycolyse te produceren van ATP van één molecuul glucose is duidelijk: 36 moleculen van ATP gegenereerd op basis van de voormalige vs. 2 moleculen van ATP gegenereerd op basis van de laatste. Dienovereenkomstig, retinale neuronen is voornamelijk afhankelijk van mitochondriale ademhaling voor energievoorziening en dit komt tot uiting door hun hoge dichtheid van mitochondriën2. Nog, het netvlies ook sterk afhankelijk van glycolytic machines zelfs wanneer zuurstof overvloedig is. Dit proces van aërobe glycolyse werd oorspronkelijk in kankercellen beschreven door Otto Warburg3, die eens merkte op dat het netvlies het alleen na mitotische weefsel staat van deze vorm van metabolisme4. Sinds deze eerste opmerkingen, zijn veel post mitotische weefsels beschreven om deel te nemen in verschillende graden van glycolyse naast oxidatieve fosforylatie om hun ATP-eisen te voldoen.
Phototransduction, visuele pigment recycling, biosynthese van fotoreceptor buitenste segmenten, en synaptische activiteit zijn alle energie veeleisende processen in de researchdieren, de overheersende neuronale subklasse in het netvlies. Maar de noodzaak om actief transport van ionen tegen hun elektrische gevaren en concentratie verlopen is veruit het meest energiek tijdrovend proces in neuronen1. Researchdieren zijn eigenaardige neuronen in de zin dat ze zijn depolarized bij gebrek aan stimulatie (dat wil zeggen, in het donker), overwegende dat een lichte stimulans kanaal sluiting en latere hyperpolarisatie activeert. Daarom, in het donker verbruikt het netvlies grote hoeveelheden van ATP of te handhaven de depolarisatie "donkere huidig" zoals het gewoonlijk genoemd wordt. Vanuit een adaptieve oogpunt is een belangrijke uitdaging bij het verstrekken van deze enorme hoeveelheden van ATP de noodzaak van organismen om visuele helderheid door de optische as. De omgekeerde retinale architectuur gezien in moderne wezens is de dominante oplossing, zoals het houdt de dichte capillaire netwerk leveren researchdieren uit de buurt van het pad van licht. Maar dit wonder van natuurlijke bioengineering plaatst het netvlies in een afgrond in termen van metabole reserve. Zelfs kleine beledigingen aan netvlies kunnen potentieel verstoren het delicate evenwicht van de energievoorziening te eisen, en visuele disfunctie of openhartige blindheid kan ontstaan snel.
Gezien de unieke energetische eisen van het neurale netvlies, in combinatie met haar strakke beperking vasculaire voorzieningszekerheid, zou kunnen nauwkeurige meting van ATP verbruik in het netvlies en de veranderingen tijdens ziekte verstrekkende gevolgen in begrijpen en behandelen hebben verblindende aandoeningen zoals retinitis pigmentosa en diabetische retinopathie. Traditioneel, vereisen deze metingen dure, douane-ontworpen apparatuur met de meeste studies die voortkomen uit een handvol laboratoria geheel gewijd aan de metingen van de metabole activiteit2,5,6, 7,8. Technieken omvatten individuele tests voor specifieke metabolieten, tracer studies met radio-geëtiketteerden precursoren, zuurstofverbruik opname via Clark elektroden, en profilering van de9metabolomic.
Met high-throughput technologische vooruitgang en toegenomen beschikbaarheid van commerciële apparaten zijn technieken voor record retinale stofwisseling steeds toegankelijk en betaalbaar. De hier beschreven methode meet beide oxidatieve fosforylatie en transplanteren glycolyse bij het gebruik van het netvlies weefsel en een verkrijgbare extracellulaire flux analyzer9,10,11,12. Deze analyzer registreert afzonderlijk zuurstof verbruik rente (OCR) en de extracellulaire verzuring (ECAR), fungeren als indirecte indicatoren van oxidatieve fosforylatie en glycolyse, respectievelijk13. Deze metingen zijn gedaan door een sonde onderdompelen in een microchamber gemaakt over het weefsel van belang. Deze aanpassing van eerder gepubliceerde methoden gebruikt een plaat van de vangst oorspronkelijk ontworpen voor alvleesklier eilandjes van Langerhans voor het vastleggen van de metabole activiteit in kleine, cirkelvormige secties van muis netvlies. Meerdere farmacologische belichtingen kunnen worden afgeleverd bij het weefsel in de loop van een enkele opname, omdat het systeem 4 injectie-poorten voor elk monster goed bevat. Met behulp van dit systeem met afzonderlijke protocollen geoptimaliseerd voor ECAR- en OCR-opnamen, de reacties van het netvlies van de wild-type kunnen worden vergeleken met netvlies ontbreekt transducine (Gnat1- / -), een oorzaak van aangeboren stationaire nacht blindheid in mensen14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protocollen gevolgd van de Association for Research in visie en oogheelkunde-instructie voor het gebruik van dieren en zijn goedgekeurd door de Universiteit van Washington.
1. dierlijke voorbereiding
- Dieren houden in standaard behuizing met een 12 uur donker aan 12 uur licht cyclus. Begin experimenten op gestandaardiseerd keer circadiane-effecten te vermijden, meestal in de ochtend kort na de lichten zijn ingeschakeld.
2. oplossing voorbereiding
- Base media voor te bereiden door het oplossen van 8.4 mg poeder media in tweemaal gedestilleerd H2O (ddH2van O) en breng aan 7.4 met HCl of NaOH pH, tot een eindvolume van 1 L. Filter steriliseren deze oplossing met een 0,22 µm weefselkweek filter.
- Voeg 1 M glucose en 100 mM natrium pyruvaat naar de media om de eindconcentraties van 5 mM glucose en pyruvaat van 1 mM.
- Plaats een hoeveelheid van 50 mL van de base media in een waterbad 37 ° C.
- Lysis van de oplossing, voorbereiden op weefsel kwantificatie aan het einde van de flux-analyse, door toevoeging van tris basis aan 10 mM, polyethyleenglycol tert-octylphenyl ether tot 0,2% (v/v) en EDTA tot 1 mM, alle in ddH2O. Mix totdat alle onderdelen volledig ontbonden en aanpassen pH ten slotte op 8.0.
- Voorbereiden voor het protocol mitochondriale stress een 11 µM voorraad van oligomycin, een inhibitor van ATP-Synthase, opgelost in base media te richten een eindconcentratie van 1 µM in de put. Bereiden van een voorraad 11 µM carbonyl cyanide - 4-(trifluormethoxy) phenylhydrazone (FCCP), een ontkoppelingseiwit agent, opgelost in base media te richten een eindconcentratie van 1 µM in de put. Bereiden van een cocktail van het elektronentransport keten remmers, rotenon en antimycin A (RAA) door toevoeging van rotenon 11 µM en antimycin A naar 22 µM, opgelost in base media te richten een eindconcentratie van 1 µM rotenon en 2 µM antimycin A in het goed.
- Voor het protocol glycolyse bereiden een 220 mM voorraad van glucose opgelost in base media, te richten op een eindconcentratie van 20 mM in de put. Bereiden ook een 1.1 M voorraad van 2-deoxyglucose (2-DG), een concurrerende inhibitor van glucose en glycolytic antagonist, door het oplossen van het in base media. Dit zal richten op een eindconcentratie van 100 mM 2-DG in de put.
3. kalibreren van het instrument
- Als u wilt kalibreren de instrumentatie voor een extracellulaire flux assay, voeg 1 mL kalibratie-oplossing aan elk putje van de sensor-patroon (24 wells totaal) en Incubeer bij 37 ° C in een CO-2-gratis incubator overnachting (of ten minste 8 uur).
- Additieven voor het mitochondriaal stress-protocol of de glycolyse protocol in elke injector poort, A t/m D, op de sensor patroon, gecorrigeerd voor de veranderingen van het volume in de put te laden.
Opmerking: Als voorbeeld, zou een typisch assay 45 µL van een toevoegingsmiddel in de eerste haven van de injector, 49,5 µL in de tweede, 54.5 µL in de derde, en 60 µL in de laatste, uitgaande van een aanvankelijke goed volume van 450 µL omvatten. - Tijdens de eerste verschillende experimenten, door base media te laden op poort A om te meten hoeveel weefsel verkeer/artefact treedt op na de injectie van een poort.
- Laat de plaat geladen sensor te incuberen bij 37 ° C in een niet-CO2 -incubator voor ten minste 60 min.
4. isolatie van verse muis retinale weefsel
Opmerking: Deze stap is aangepast van de techniek van Dr. Barry Winkler15.
- Na beheren diepe verdoving met euthanaseren een standaard ketamine/xylazine cocktail, muizen door cervicale dislocatie.
- Gebruik een paar kleine en middelgrote gebogen pincet voorzichtig toepassing voorwaartse druk uit op proptose het oog (figuur 1A) te begrijpen van de posterieure globe op de oogzenuw.
- Met een schone scheermesje, door een limbus aan limbus incisie te maken door het hoornvlies met behulp van een enkele, doelbewuste pass van het blad.
- Met behulp van boete, knijpen schuine McPherson-stijl Tang, de posterieure globe wil de lens en de voorste hyaloid membranen uit het hoornvlies incisie. Gooi deze weefsels.
- Herhaal de knijpen manoeuvreren met een tang om uit te drukken de neurale netvlies.
- Met behulp van de verlostang als een lepel om te heffen van het netvlies, in plaats van te begrijpen van het weefsel, breng het netvlies uit de buurt van de cornea incisie en direct in de warme media in een 3 cm schotel of een 6-well weefselkweek cluster plaat plaatsen.
- Twee paren van fijne, schuine McPherson-stijl Tang gebruiken om te ontleden zachtjes overige glasvocht van het netvlies. Dit gebeurt best door grijpen het glasvocht aan de rand van de retinale cup en trekken naar het centrum, met een definitieve disinsertion van het glasvocht lichaam van het centrum als geheel. Met behulp van de verlostang, Verwijder eventuele resterende retinale pigment epitheel van de fotoreceptor oppervlak van het netvlies.
- Snijd een P1000 Pipetteer tip met een scheermesje maken een ~ 4 mm opening om te voorkomen dat onnodige trauma aan het kwetsbare netvlies weefsel tijdens overdracht manoeuvres.
- Breng het geïsoleerde retinale weefsel in verse media met behulp van een gesneden P1000 Pipetteer tip.
- Snijd 1 mm stoten van netvlies rond de oogzenuw met een 1 mm biopsie punch uitgerust met een zuiger te verjagen van het weefsel in het geval het wordt ingediend in de boring (figuur 1B). Het netvlies stoten opzij in schone media op een blok 37 ° C bewaard of verwarming pad instellen
5. assay Protocol
- Individuele stoten overbrengen in een 24-well islet vangen microplate met behulp van een gesneden P1000 tip, zuigen 450 µL van media samen met het weefsel.
- Gebruik prima, rechte pincet om te stoten in het midden van de microplate zachtjes te manipuleren. Houd stoten georiënteerd in dezelfde richting (bijvoorbeeld, ganglion cel kant naar boven).
- Rusten de plaat vastleggen op een verwarming pad of verwarming blok ingesteld op 37 ° C als volgt worden herhaald voor de overige monsters.
Opmerking: Voor elk experiment, gereserveerd 3-4 lege putjes met 450 µL van base media om te dienen als negatieve controles. In de resterende test 20-21 wells, elke biologische repliceren in drievoud. Elke plaat 24-well staat dan ook toe voor opname van 6-7 verschillende dieren of behandeling voorwaarden.
- Rusten de plaat vastleggen op een verwarming pad of verwarming blok ingesteld op 37 ° C als volgt worden herhaald voor de overige monsters.
- Vermijden van luchtbellen, zachtjes positie het rotseilandje vastleggen van mesh inzetstukken in elk goed gebruik van pincet en beveiligen van de inserts met een metalen zuiger of met een gesneden P1000 Pipetteer tip (Figuur 1 C).
Opmerking: Vermijd buitensporige weefsel beweging tijdens deze stap om het standpunt van de retinale punch in het midden van het monster microchamber. Luchtbellen verstoren ernstig OCR lezingen. Hoewel de microchamber voldoende diepte aan typische muis netvlies (Figuur 1 c) heeft kunnen af en toe verspaning-gebreken in de mesh inzetstukken weefsels worden overdreven gecomprimeerd tijdens het inbrengen van het scherm veroorzaken. Als dit gebeurt, gewoon Maak een notitie van de geplette weefsel en uitsluiten dat monster van de definitieve analyse. - Incubeer de weefsel plaat in een 37 ° C CO2-gratis incubator voor ten minste 60 min.
- Program van de extracellulaire flux-analyzer met behulp van de Mix, wachten, maatregel, en herhaalt u opdrachten. Als voorbeeld, een typisch experiment met weefsel van het netvlies kan omvatten het volgende: Meng 2 minuten, wacht 2 minuten en 5 minuten meten. Herhaal het experiment met deze drie tussen stappen 5 - 8 keer (cycli) voor een opname basislijn, en na injectie van elke stof wordt getest tijdens de run.
- Druk op de knop programma START op de extracellulaire flux analyzer en volg de instructies op het scherm om het invoegen van de sensor cartridge voor kalibratie.
- Volg de instructies op het scherm ter vervanging van de kalibrant plaat met de plaat met de retinale monsters aan het eind van de kalibratie.
- Het programma laat werken, zoals geprogrammeerd. Volg de instructies op het scherm om het uitwerpen van de plaat weefsel aan het einde van de termijn. De resultaten van de run bekijken en opslaan van het gegevensbestand.
- Met een gebogen 20 gauge naald en pincet, verwijder alle mesh inzetstukken uit de putten, de retinale punch achterlatend.
- Zorgvuldig gecombineerd van de media van het weefsel en spoel het weefsel tweemaal met 0,5 mL koude-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). De PBS gecombineerd na het wassen.
- 100 µL van lysis buffer aan elk goed en Pipetteer omhoog en omlaag te homogeniseren weefsel toevoegen.
- Kwantificeren van de sterkte van de ingevoerde, op basis van totale double-stranded DNA (dsDNA) of totale eiwitgehalte.
Opmerking: De volgende is gebaseerd op een commercieel beschikbare dsDNA assay. - Lysed monsters 1:1 verdunnen door toevoeging van 100 µL van Tris-EDTA (TE) buffer en breng 100 µL van het verdunde monster naar een 96 goed plaat.
- Voeg 100 µL van detectie buffer in elk putje. Na het mengen voor 2-5 minuten, kwantificeren fluorescentie na excitatie bij 480 nm en emissie bij 520 nm, vergelijken met een standaard curve.
- Normaliseren van het ruwe extracellulaire flux traceren naar DNA inhoud binnen de put.
Opmerking: In de resultaten die hier gepresenteerd, zijn monsters genormaliseerd naar 50 ng dsDNA - een typisch bedrag in een retinale punch van 1 mm. Daarom kan absolute waarden hier gepresenteerd worden vergeleken met studies presentatie van gegevens "per retinale punch". Normaliseren schetsen naar een interne standaard, zoals de basislijn uitgevoerd bij een concentratie van de glucose van 5 mM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van de beschreven technieken (samengevat in Figuur 1), werden retinale explantaten van 8 weken oude wild type (WT) muizen vergeleken met leeftijd - en achtergrond-matched transducine null muizen (Gnat1- / -). Omdat Gnat1- / - dieren ontbreken de machines te sluiten cyclische-nucleotide gated ionenkanalen in reactie op lichte stimuli, hun rod researchdieren blijven depolarized zelfs in lichte14. De daaropvolgende moeten handhaven kalium efflux zou leiden tot een grote vraag van ATP, resulterend in de bio-energetische belasting. Om te bepalen als dergelijke verschuivingen in de vraag naar energie oxidatieve fosforylatie of glycolytic flux zou toenemen, werden weefsels uit wild type muizen en Gnat1- / - muizen vergeleken met de extracellulaire flux-analyzer. Op basislijn, in aanwezigheid van 5 mM glucose en pyruvaat 1 mM, hebben retinale weefsels van wild-type dieren soortgelijke tarieven van zure efflux ten opzichte van Gnat1- / - mutanten. Vergelijkbare patronen worden gezien na toevoeging van glucose van 20 mM en de glycolytic remmer 2-DG (figuur 2A). Deze gegevens kunnen ook wiskundig te vertegenwoordigen fractionele wijzigingen vanaf basislijn (figuur 2B), een indeling die voor betere vergelijking tussen verschillende experimentele interventies zorgen kan worden omgezet.
Absolute OCR op basislijn is gelijkwaardig tussen WT en mutant retinale weefsel (figuur 3A). De toevoeging van 20 mM glucose verhoogt mitochondriale ademhaling, maar geen verandering wordt geconstateerd tussen groepen in termen van absolute kwantificering of in termen van verandering van baseline (figuur 3B). De toevoeging van 1mM FCCP (een ontkoppelingseiwit agent) om aan te tonen van maximale mitochondriale respiratoire tarieven verhoogt niet aanzienlijk OCR boven het niveau gezien met hoge glucose in WT of Gnat1- / - weefsels. Echter, de signalen van beide muizen drastisch dalen na toevoeging van RAA cocktail.
In het ideale geval extracellulaire flux experimenten uitgevoerd in het bijzijn van de ATP synthase remmer oligomycin steun bij het identificeren van bronnen van proton lek, optreedt bij beweging door het elektronentransport keten niet gekoppeld aan de ATP productie16 is. In het netvlies explantaten van 8 weken oude C57BL/6J muizen verlaagt de oligomycin behandeling krachtig OCR, als verwachte (Figuur 4). Maar latere toevoeging van FCCP, om te vinden van maximale OCR, slechts nominaal verhoogt de OCR ongeveer 60% van de basislijn, consistent met een voorafgaande studie11.
De XF24-analyzer gebruikt Onderdompelbare sondes waardoor een strakke verbinding binnen het weefsel goed, maken een voorbijgaande communicatie voor meting van zuurstof en zure flux. Positionering van de retinale weefsel in de goed plaat (ten opzichte van de sensoren) kon potentieel beïnvloeden OCR opnamen, en leiden tot ongewenste verstoringen, en sommige reserachers hebben gepleit voor het plaatsen van de retinale weefsel direct onder de zuurstofsensor met de fotoreceptor buitenste segmenten gericht op de sensor11. Om te testen de effecten van de retinale weefsel positie op OCR metingen, weefsels van jonge C57BL/6J muizen (8 weken oud) werden geanalyseerd in twee richtingen: netvlies ganglion cellen naar beneden op het bord (dat wil zeggen, researchdieren dichtst rechtop geplaatst op sensor ) of naar boven naar de sensor. Geen verschillen in relatieve OCR in reactie op FCCP of RAA werden waargenomen, die gelijkwaardig gevoeligheid voor maximale en minimale mitochondriale respiratoire tarieven in beide richting (figuur 5A) aangeeft. Daarnaast, waren absolute OCR metingen ook gelijkwaardig tussen retinale weefsel in beide oriëntatie (figuur 5B).
Figuur 1 : Isolatie van retinale explant en setup in de extracellulaire flux analyzer. A. isolatie van de neurale netvlies in situ door voortstuwende kracht toe te passen op wereldbol met een tang, gebeuren van het hoornvlies en netvlies verwijderen na het teruggooien van de lens en de voorste hyaloid membranen. B. opstelling van weefsel voor flux opnemen met retinal punch creatie, plaatsing van individuele stoten in islet vangen microplate, en het gebruik van een mesh invoegen om te minimaliseren van weefsel verkeer met microchambers (schaal bars = 1 mm). C. een schematische, afgeleid van fabrikant geleverde gegevens, toont het overzicht van de procedure en aantonen dat de hoogte van de microchamber volstaat voor het lymfkliertest netvlies. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Mitochondriale spanningsanalyse met behulp van transplanteren netvlies van 8 weken oude dieren. A. gemiddeld schetsen met de standaardfout van meting (SEM), genormaliseerd naar DNA inhoud van het weefsel, uit een experiment geoptimaliseerd voor zuurstof verbruik opnamen, te vergelijken met transducine knock-out dieren (Gnat1- / -) wild type besturingselementen. B. hetzelfde experiment met gegevens omgezet zodat basislijnregistratie zijn ingesteld als referentie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Analyse van het glycolytic tarief gebruik transplanteren netvlies van 8 - weken oude dieren. A. Averaged, DNA inhoud-genormaliseerd, schetsen van een experiment geoptimaliseerd voor zure efflux opnamen transducine knock-out dieren (Gnat1- / -) wild type besturingselementen vergelijken. B. gegevens uit hetzelfde experiment genormaliseerd naar basislijnregistratie. Traces weergeven als gemiddelde ± SEM. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Onherstelbare effecten van oligomycin op de tarieven van de retinale respiratoire. In terdege voorbereid retinale explantaten van 8 weken oude C57BL/6J muizen vermindert oligomycin behandeling de maximale OCR geïnduceerd door latere toevoeging van FCCP. Traces weergeven als gemiddelde ± SEM. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 : Effecten van weefsel positionering op OCR meting. Netvlies weefsels van 8 weken oude C57BL/6J muizen werden in putten geplaatst met peesknoopcellen tegenover naar de sensor (Ganglion cellen Up) of uit de buurt van de sensor (Ganglion cellen naar beneden). Tussen groepen, vergelijkbare extracellulaire flux opnamen worden waargenomen in termen van de respiratoire capaciteit (A) ten opzichte van de basislijnplanning of (B) in termen van absolute kwantificering. Traces weergeven als gemiddelde ± SEM. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
OCR en ECAR worden gemakkelijk gemeten in transplanteren retinale weefsel met behulp van een bioanalyzer met behulp van de beschreven technieken. Deze methode vertrekt van die van andere groepen in verschillende kritische stappen. Netvlies weefsels zijn geïsoleerd door middel van een grote cornea incision zonder enucleating van de hele wereld, zoals oorspronkelijk beschreven door Winkler15. Deze methode van retinale isolatie zorgt voor een snelle overdracht van het oog van de levende in de weefsels vangen plaat (vaak binnen 5 minuten). Weefsels worden bewaard bij 37 ° C gedurende het hele proces, waarin het cellulaire ademhaling behouden dan wanneer ze worden geplaatst op het ijs. Media met minimale additieven worden gebruikt voor eerste metingen, weglaten van elke buffer agenten zoals HEPES natriumbicarbonaat, serum en/of overtollige macronutriënten, aangezien dit voor meer betrouwbare metingen van basale stofwisseling zorgt en doet niet remmen beoordeling van ECAR. Netvlies stoten worden best opgenomen in een 24-well-formaat, in plaats van in 96-wells, tot een minimum beperken van trauma aan het weefsel. Retinale weefsel wordt geplaatst in het midden van de put, binnen de microchamber weefsel, en beveiligd met een mesh invoegen. Doen dus zorgt voor nauwkeurige registratie van ECAR en OCR, terwijl het voorkomen van buitensporige weefsel beweging tijdens de run, en elimineert de noodzaak voor andere reagentia zoals weefsel lijmen. De injectie van een voertuig tijdens de run wordt aanbevolen, vooral bij het opzetten van opname experimenten voor de eerste keer, aangezien dit voor een gevoel zorgt van hoe goed het weefsel binnen de capture-plaat is beveiligd. OCR-opnamen met behulp van deze techniek zijn onafhankelijk van de richting van de retinale binnen de put, maar de oriëntatie consistente tussen monsters binnen experimenten moet worden bewaard. Alle metingen verricht slechts nadat retinale metabolisme steady-state na injectie van test verbindingen is bereikt.
Dit protocol beschrijft normalisatie van gegevens aan DNA totaalgehalte, als een proxy voor mobiele nummer. Deze techniek is voordelig, omdat het zal goed zijn voor wijzigingen aan celaantal gedreven door variatie in netvlies dikte, grootte van de stoot of verschillen in buiten tussen genetisch ongelijke monsters. Totaal eiwit gebaseerde normalisatie is ook een betrouwbare methode en heeft het voordeel van het minimaliseren van de verschillen in de totale mitochondriale massa tussen de retinale monsters. Normalisering op basis van het gehalte aan andere melkeiwitten in hele weefsel kan echter worden verward door veranderingen in de extracellulaire matrix tussen de monsters. Normalisering van flux opnames op de basislijn, is zoals aangegeven in de representatieve resultaten, gunstig omdat het gemakkelijk interpretatie van veranderingen als gevolg van farmacologische interventies toestaat en minimaliseert de variabiliteit in de grootte van de retinale punch tussen wordt gerepliceerd. Rapportage van ruwe waarden staat echter voor betere vergelijking tussen verschillende experimenten en voor experimenten uitgevoerd met behulp van verschillende flux opname methoden.
Resultaten met behulp van deze technieken zijn vergelijkbaar met die elders gemeld. Al oligomycin - een ATP synthase remmer - meestal gebruikt wordt voor het meten van proton lek binnen weefsels of cellen van belang, heeft deze compound ongewenst effecten op netvlies metabolisme. In de experimenten hier gemeld, is een 60% afname van maximale retinal OCR ontlokte door FCCP wordt waargenomen na blootstelling aan oligomycin (Figuur 4), vrijwel identiek zijn aan een eerdere studie11. Een mogelijke verklaring voor deze bevinding is onomkeerbare schade of wijziging van retinale mitochondriën door ATP-synthase remming. Bovendien, zoals Kooragayala en collega's eerst gemeld11, retinale mitochondriën waarschijnlijk operating zijn bij in de buurt van maximale tarieven onder basale omstandigheden sinds een elektronentransport keten ontkoppelingseiwit agent, FCCP, verhoogt alleen OCR met ongeveer 15% (Figuur 3 , Figuur 5).
Extracellulaire flux opnames in het transplanteren retinale weefsel tonen een grote reserve glycolytic capaciteit, aangezien de toevoeging van 20 mM glucose een twee-voudige toename in ECAR (Figuur 2 lokt). Omdat oligomycin, meestal gebruikt voor het meten van maximale glycolytic capaciteit, heeft schadelijke effecten in de retinale weefsel (Figuur 4), kan het gebruik van hoge glucose toevoeging aan de opname dienen als beter proxy te meten glycolytic reserve in het netvlies. Een belangrijk voorbehoud voorkoming van het gebruik van ECAR als een zuivere proxy voor glycolytic tarief is dat CO2 bevrijd door de citroenzuurcyclus kan een belangrijke bron van zuur in gekweekte weefsel17. Overtollige pyruvaat ECAR niet boven de ontlokte door hoge glucose niveaus toeneemt, en glycolytic flux is bijna geëlimineerd in netvlies explantaten met behulp van overtollige molaire ratio's van 2-DG (Figuur 2). Aangezien ATP wordt gebruikt voor het regenereren van de membraanpotentiaal optreedt van depolarisatie gebeurtenissen in het dark-adapted netvlies, dieren ontbreekt transducine moeten verbruiken meer energie dan WT tegenhangers. Echter in explantaten, werden verschillen in netvlies energiemetabolisme Gnat1- /- en controles niet gezien in de experimenten die hier beschreven (Figuur 2 en 3). Deze resultaten stroken met die welke verkregen met behulp van een aangepaste perfusie-apparaat voor het meten van OCR in Gnat1- / - dieren-18. Met name de aangepaste apparatuur gebruikt door Du en collega's toegestaan voor meting van OCR omstandigheden aangepast licht en donker aangepast. Door dit te doen, is een kleine, maar significante afname van de OCR na blootstelling aan licht in wild-type netvlies, maar niet in Gnat1- / - netvlies18gedetecteerd. Dit illustreert een belangrijke beperking van de huidige techniek bij het meten van ECAR en OCR in transplanteren netvlies - de extracellulaire flux analyzer hier gebruikt is afhankelijk van zichtbaar licht excitatie van fluorophores ingebed in haar zuurstof- en pH-sensoren, afschaffing van de mogelijkheid tot het uitvoeren van metingen in dark-adapted weefsels. Dergelijke metingen zijn zeer relevant voor visuele fysiologie en zal nog steeds nodig voor het gebruik van oudere technieken, exclusief ontworpen voor de studie van retinale metabolisme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Dr. Alexander Kolesnikov en Dr. Vladimir Kefalov voor het verstrekken van Gnat1- / -muizen, voor nuttige feedback en advies en voor het lezen van het manuscript.
Dit werk werd gesteund door NIH EY025269 (RR), het onderzoekscentrum van de Diabetes aan de Washington University - NIH DK020579 (JRM en RR), een carrière ontwikkeling Award van onderzoek te voorkomen blindheid (RR), de Horncrest Foundation (RR), een carrière ontwikkeling Award van JDRF () JRM), NIH DK101392 (CFS), DK020579 (CFS), DK056341 (CFS) en DK114233 (JRM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Seahorse XF24 Extracellular Flux Analyzer | Agilent, Santa Clara, CA | ||
| Seahorse XF24 Islet Capture FluxPak (includes: Islet Capture Microplate, Sensor Cartridge and Calibrant Solution) | Agilent, Santa Clara, CA | 101174-100 | Includes islet capture microplate, sensor cartridge and calibrant solution |
| RPMI 1640 Media (Powdered medium) | Millipore-Sigma | R1383 | RPMI 1640 Media with L-Glutamine and without glucose or sodium bicarbonate |
| D-Glucose | Millipore-Sigma | G8270 | 1M D-Glucose filtered, for media preparation |
| Sodium pyruvate | Corning | 25000CI | 100 mM sodium pyruvate |
| Antimycin-A | Millipore-Sigma | A8674 | Mitochondrial stress protocol component |
| FCCP | Millipore-Sigma | C2920 | Mitochondrial stress protocol component |
| Rotenone | Millipore-Sigma | R8875 | Mitochondrial stress protocol component |
| 2-deoxyglucose | Millipore-Sigma | D6134 | Glycolysis protocol component |
| 1 mm skin biopsy punches with plunger | Integra-Miltex | 33-31AA-P/25 | Explanting retinal tissue tool |
| Dumont Mini-Forceps Straight | Fine Science Tools | 11200-10 | Explanting retinal tissue tool |
| Dumont Medical #5/45 Forceps- Angled 45 degrees | Fine Science Tools | 11253-25 | Explanting retinal tissue tool |
| Dumont #7 Forceps - Curved | Fine Science Tools | 11271-30 | Explanting retinal tissue tool |
| Quant-iT Picogreen dsDNA Assay Kit | Fisher Scientific | P7589 | Loading normalization assay |
| Trizma base (Tris base) | Millipore-Sigma | T6066 | Component of lysis buffer |
| Triton X-100 (polyethylene glycol tert-octylphenyl ether) | Millipore-Sigma | X100 | Component of lysis buffer |
| 0.5M EDTA pH 8.0 | Ambion | AM9262 | Component of lysis buffer |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratories | Strain 000664 | Animals |
| Gnat1-/- and background-matched Gnat1+/+ | Vladimir Kefalov, PhD; Washington University School of Medicine | Animals |
References
- Wong-Riley, M. T. Energy metabolism of the visual system. Eye and brain. 2, 99-116 (2010).
- Ames, A. 3rd, Li, Y. Y., Heher, E. C., Kimble, C. R. Energy metabolism of rabbit retina as related to function: high cost of Na+ transport. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 12 (3), 840-853 (1992).
- Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123 (3191), 309-314 (1956).
- Wubben, T. J., et al. Photoreceptor metabolic reprogramming provides survival advantage in acute stress while causing chronic degeneration. Scientific reports. 7 (1), 17863 (2017).
- Du, J., Linton, J. D., Hurley, J. B. Probing Metabolism in the Intact Retina Using Stable Isotope Tracers. Methods in enzymology. 561, 149-170 (2015).
- Felder, A. E., Wanek, J., Tan, M. R., Blair, N. P., Shahidi, M. A Method for Combined Retinal Vascular and Tissue Oxygen Tension Imaging. Scientific reports. 7 (1), 10622 (2017).
- Hurley, J. B., Lindsay, K. J., Du, J. Glucose, lactate, and shuttling of metabolites in vertebrate retinas. Journal of neuroscience research. 93 (7), 1079-1092 (2015).
- Winkler, B. S. Glycolytic and oxidative metabolism in relation to retinal function. The Journal of general physiology. 77 (6), 667-692 (1981).
- Pelletier, M., Billingham, L. K., Ramaswamy, M., Siegel, R. M. Extracellular flux analysis to monitor glycolytic rates and mitochondrial oxygen consumption. Methods in enzymology. 542, 125-149 (2014).
- Joyal, J. S., et al. Retinal lipid and glucose metabolism dictates angiogenesis through the lipid sensor Ffar1. Nature medicine. 22 (4), 439-445 (2016).
- Kooragayala, K., et al. Quantification of Oxygen Consumption in Retina Ex Vivo Demonstrates Limited Reserve Capacity of Photoreceptor Mitochondria. Investigative ophthalmology & visual science. 56 (13), 8428-8436 (2015).
- Pearsall, E. A., et al. PPARalpha is essential for retinal lipid metabolism and neuronal survival. BMC biology. 15 (1), 113 (2017).
- Nicholls, D. G., et al. Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. Journal of visualized experiments. (46), (2010).
- Lobanova, E. S., et al. Transducin translocation in rods is triggered by saturation of the GTPase-activating complex. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 27 (5), 1151-1160 (2007).
- Winkler, B. S. The electroretinogram of the isolated rat retina. Vision research. 12 (6), 1183-1198 (1972).
- Jastroch, M., Divakaruni, A. S., Mookerjee, S., Treberg, J. R., Brand, M. D. Mitochondrial proton and electron leaks. Essays in biochemistry. 47, 53-67 (2010).
- Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data. Methods in enzymology. 547, 309-354 (2014).
- Du, J., et al. Phototransduction Influences Metabolic Flux and Nucleotide Metabolism in Mouse Retina. The Journal of biological chemistry. 291 (9), 4698-4710 (2016).
