Summary
Cette technique décrit enregistrement en temps réel de la consommation d’oxygène et le taux d’acidification extracellulaire dans les tissus rétiniens explantés souris à l’aide d’un analyseur de flux extracellulaire.
Abstract
Vision de l’acuité élevée est un processus fortement consommateurs d’énergie, et la rétine a développé plusieurs adaptations uniques pour répondre précisément à ces exigences tout en conservant la transparence de l’axe visuel. Perturbations à cet équilibre délicat causent des maladies aveuglantes, telles que la rétinopathie diabétique. Par conséquent, la compréhension des changements de métabolisme énergétique de la rétine au cours de la maladie est impérative pour le développement de thérapies rationnelles pour diverses causes de perte de vison. L’avènement récent des analyseurs de flux extracellulaire disponible dans le commerce a fait l’étude du métabolisme énergétique rétinien plus accessible. Ce protocole décrit l’utilisation d’un tel analyseur pour mesurer la contribution à l’approvisionnement énergétique rétinien par l’intermédiaire de ses bras deux principe - la phosphorylation oxydative et la glycolyse - en quantifiant les changements dans les taux de consommation d’oxygène (OCR) et extracellulaire taux d’acidification (ECAR) comme proxy pour ces voies. Cette technique est facilement réalisée dans le tissu rétinien explanté, facilitant l’évaluation des réponses à plusieurs agents pharmacologiques dans une expérience simple. Métaboliques signatures dans la rétine des animaux dépourvus de signalisation de photorécepteur tige sont comparés aux contrôles de type sauvage à l’aide de cette méthode. Une limitation majeure de cette technique est le manque de capacité d’établir une distinction entre l’utilisation de l’énergie lumière adaptés et adapté à l’obscurité, un facteur physiologique important dans le tissu rétinien.
Introduction
La rétine est parmi les plus énergivores tissus dans le système nerveux central1. Comme la plupart des tissus, il génère l’adénosine triphosphate (ATP) via la glycolyse dans le cytosol ou via la phosphorylation oxydative dans les mitochondries. L’avantage énergétique de la phosphorylation oxydative au cours de la glycolyse pour produire de l’ATP d’une molécule de glucose est clair : 36 molécules d’ATP générées par l’ancien vs 2 molécules d’ATP générée à partir de ce dernier. En conséquence, les neurones rétiniens dépendent principalement de la respiration mitochondriale pour l’approvisionnement en énergie et cela se reflète par leur forte densité des mitochondries,2. Pourtant, la rétine aussi repose largement sur machines glycolytique même lorsque l’oxygène est abondante. Ce processus de glycolyse aérobie a été initialement décrite dans les cellules cancéreuses par Otto Warburg3, qui une fois a noté que la rétine est le seul post-mitotique tissu capable de cette forme de métabolisme4. Depuis ces premières observations, plusieurs tissus post-mitotiques ont été décrites pour se livrer à des degrés divers de la glycolyse en plus de la phosphorylation oxydative à répondre à leurs demandes d’ATP.
Phototransduction, pigment visuel recyclage, biosynthèse des segments externes des photorécepteurs et l’activité synaptique sont tous les processus exigeants de l’énergie dans les photorécepteurs, la sous-classe neuronale prédominante dans la rétine. Mais la nécessité de transporter activement des ions contre leur électriques et des gradients de concentration est de loin le plus énergiquement de votre processus en neurones1. Photorécepteurs sont des neurones particulières en ce sens qu’ils sont dépolarisés en l’absence de stimulation (c'est-à-dire, dans l’obscurité), alors qu’un stimulus lumineux déclenche la fermeture du chenal et l’Hyperpolarisation ultérieure. Par conséquent, dans l’obscurité, la rétine consomme de grandes quantités d’ATP pour maintenir sa dépolarisation ou « courant d’obscurité » comme on l’appelle communément. D’un point de vue adaptatif, un défi majeur dans la fourniture de ces énormes quantités d’ATP est la nécessité pour les organismes à maintenir une clarté visuelle par le biais de l’axe optique. L’architecture rétinienne inversé vu dans créatures modernes est la solution dominante, car il maintient le réseau capillaire dense fournissant des photorécepteurs de la voie de la lumière. Mais cette merveille du génie biologique naturel met la rétine à bord d’un précipice en termes de réserve métabolique. Même les petites insultes à la rétine peuvent potentiellement perturber l’équilibre délicat de l’approvisionnement énergétique de la demande, et la dysfonction visuelle ou cécité franche peut s’ensuivre rapidement.
Étant donné l’unique avec les besoins énergétiques de la rétine neuronale, couplée à sa restriction serrée d’approvisionnement vasculaire, une mesure précise de la consommation d’ATP dans la rétine et ses changements au cours de la maladie pourrait avoir de profondes implications dans la compréhension et le traitement aveuglante d’affections comme la rétinite pigmentaire et la rétinopathie diabétique. Traditionnellement, ces mesures nécessitent des équipements coûteux, conçus avec la plupart des études qui sortent d’une poignée de laboratoires entièrement dédié aux mesures de l’activité métabolique2,5,6, 7,8. Les techniques comprennent des essais individuels pour les métabolites spécifiques, études par traceurs utilisant les précurseurs marqués radio, consommation d’oxygène d’enregistrement à l’aide d’électrodes de Clark et métabolomique profilage9.
Grâce aux progrès des technologies de haut débit et une disponibilité accrue des appareils commerciaux, techniques au métabolisme rétinien record sont toujours plus accessible et abordable. La méthode décrite ici permet de mesurer tant la phosphorylation oxydative et la glycolyse dans l’utilisation de la rétine explantées tissus et un flux extracellulaire disponible dans le commerce analyseur9,10,11,12. Cet analyseur enregistre séparément les taux de consommation d’oxygène (OCR) et le taux d’acidification extracellulaire (ECAR), servant d’indicateurs indirects de la phosphorylation oxydative et de la glycolyse, respectivement13. Ces mesures sont effectuées par une sonde immergée dans un microchamber créé sur le tissu d’intérêt. Cette adaptation de méthodes publiées antérieurement utilise une plaque de capture initialement conçue pour le pancréas, îlots de Langerhans pour enregistrer l’activité métabolique en petites sections circulaires de rétine de souris. Des expositions pharmacologiques multiples peuvent être livrées au tissu au cours d’un enregistrement unique, car le système contient 4 ports d’injection pour chaque échantillon bien. Grâce à ce système avec des protocoles distincts optimisés pour les enregistrements ECAR et OCR, les réponses des rétines sauvage peuvent être comparés aux rétines manque tbl1xr1 (Gnat1- / -), des causes de cécité nocturne stationnaire congénitale en les humains14.
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Protocol
Protocoles de suivi de l’Association pour la recherche en Vision et ophtalmologie énoncé sur l’utilisation des animaux et ont été approuvés par l’Université de Washington.
1. la préparation animaux
- Garder animaux dans le logement standard avec un 12 heures sombres au cycle de lumière de 12 heures. Begin expériences à normalisés afin d’éviter les effets circadiennes, généralement le matin, peu après les lumières sont allumées.
2. préparation de la solution
- Préparer la base médias en dissolvant 8,4 mg de poudre médias bidistillée H2O (ddH2O) et ajuster le pH à 7,4 avec HCl ou NaOH, pour un volume final de 1 L. filtre stériliser cette solution avec un filtre de vitroplants de 0,22 µm.
- Ajouter 1 M de glucose et de pyruvate de sodium 100 mM aux médias pour atteindre la concentration finale de 5 mM de glucose et de pyruvate de 1 mM.
- Place une portion de 50 mL de base médias dans un bain-marie à 37 ° C.
- Préparer la solution de lyse, pour le dosage de tissus à la fin de l’analyse de flux, en ajoutant tris base à 10 mM, éther de polyéthylèneglycol tert-octylphényle à 0,2 % (v/v) et EDTA 1 mm, tous en FD2Mix O. jusqu'à ce que tous les composants complètement dissous et ajuster pH 8.0.
- Pour le protocole de stress mitochondrial, préparation d’un stock de 11 µM de l’oligomycine, un inhibiteur de l’ATP Synthase, dissous dans la base médias pour cibler une concentration finale de 1 µM dans le puits. Préparation d’un stock de 11 µM de cyanure de carbonyle - 4-(trifluorométhoxy) phénylhydrazone (FCCP), un agent découplant, dissous dans la base médias pour cibler une concentration finale de 1 µM dans le puits. Préparer un cocktail des inhibiteurs de la chaîne de transport d’électrons, la roténone et l’antimycine A (RAA) en ajoutant la roténone à 11 µM et l’antimycine A à 22 µM, dissous dans la base médias pour cibler une concentration finale de roténone 1 µM et 2 µM antimycine A dans le bien.
- Pour le protocole de la glycolyse, préparation d’un stock de 220 mM de glucose dissous dans les médias de base, de cibler une concentration finale de 20 mM dans le puits. Aussi, préparer un stock de 1,1 M de 2-désoxyglucose (2-DG), un inhibiteur compétitif de la glucose et antagoniste de la glycolyse, en dissolvant dans les médias de base. Cela s’adressera à une concentration finale de 100 mM 2-DG dans le puits.
3. instrument Calibration
- Pour calibrer les instruments pour une analyse de flux extracellulaire, ajouter 1 mL de solution d’étalonnage pour chaque puits de la cartouche de capteur (total de 24 puits) et incuber à 37 ° C dans un CO2-libre incubateur pendant la nuit (ou au moins 8 h).
- Charger des additifs pour le stress mitochondrial ou le protocole de la glycolyse dans chaque port de l’injecteur, A à D, de la cartouche de sonde, ajustement pour les changements de volume dans le puits.
Remarque : À titre d’exemple, un essai typique comprend 45 µL d’un additif dans le premier port de l’injecteur, 49,5 µL dans le second, 54,5 µL dans la troisième et 60 µL dans le dernier, en supposant un volume bien initial de 450 µL. - Pendant les premières expériences de plusieurs, charger base médias dans port A de mesurer combien le tissu mouvement/artefact se produit après une injection de port.
- Laissez la plaque de capteur chargé à incuber à 37 ° C dans une étuve à non-CO2 pendant au moins 60 min.
4. isolement des frais souris tissu rétinien
Remarque : Cette étape est une adaptation de la technique du Dr Barry Winkler15.
- Après avoir fait une anesthésie profonde à l’aide d’un cocktail de kétamine/xylazine standard, euthanasier souris par dislocation cervicale.
- Utilisez une paire de pinces courbes moyennes pour saisir le monde postérieur au nerf optique et exercez une légère pression vers l’avant à proptose l’oeil (Figure 1 a).
- Avec une lame de rasoir propre, créer une incision de limbe à Limbe à travers la cornée à l’aide d’un pass unique et délibéré de la lame.
- À l’aide de très bien, angle pince McPherson-style, pincer le globe postérieur pour exprimer l’objectif et les membranes hyaloïde antérieures hors de l’incision cornéenne. Jetez ces tissus.
- Répétez la manœuvre pincement avec une pince pour exprimer la rétine neurale.
- À l’aide de la pince comme une cuillère pour soulever la rétine, plutôt que de saisir le tissu, transférer la rétine loin de l’incision cornéenne et déposez directement dans les médias chauds dans un plat de 3 cm ou une plaque de cluster 6 puits culture de tissus.
- Utiliser deux paires de pinces de type McPherson fine, inclinée à disséquer doucement restant vitré de la rétine. C’est mieux fait en saisissant le corps vitré à la périphérie de la rétine coupe et en tirant vers le centre, avec un disinsertion final du corps vitré du centre dans son ensemble. À l’aide de la pince, retirez tout épithélium pigmentaire rétinien résiduel de la surface des photorécepteurs de la rétine.
- Couper un embout P1000 avec une lame de rasoir pour créer une ouverture d’environ 4 mm afin d’éviter un traumatisme abusif le tissu rétinien délicat lors des manoeuvres de transfert.
- Transvaser le tissu rétinien isolé dans les supports neufs en utilisant un embout de pipette P1000 coupé.
- Couper les poinçons de 1 mm de la rétine autour du nerf optique avec une biopsie de 1 mm punch équipé d’un piston pour déloger le tissu dans le cas où il se loge dans le trou (Figure 1 b). Définissez les poinçons rétiniennes côté dans les médias propres détenus dans un bloc de 37 ° C ou coussin chauffant.
5. protocole
- Transfert individuels poinçons à une îlot de 24 puits capture microplaque utilisant un embout P1000 coupé, aspirer 450 µL de médias ainsi que le tissu.
- Utiliser correctement, pinces droites pour manipuler doucement les coups de poing au centre de la microplaque. Garder les poinçons orientées dans le même sens (p. ex., ganglion cell côté vers le haut).
- Reposer la plaque de capture sur un coussin chauffant ou chauffage bloc réglé à 37 ° C que ces étapes sont répétées pour les échantillons restants.
Remarque : Pour chaque expérience, mis de côté 3-4 puits vides avec 450 µL de base médias pour servir de témoins négatifs. Dans les autres puits de 20-21, tester chaque réplicat biologique en trois exemplaires. Par conséquent, chaque plaque 24 puits permettra pour l’enregistrement de 6-7 différents animaux ou des conditions de traitement.
- Reposer la plaque de capture sur un coussin chauffant ou chauffage bloc réglé à 37 ° C que ces étapes sont répétées pour les échantillons restants.
- En évitant les bulles d’air, position doucement l’îlot prendre des inserts en mesh dans chaque puits à l’aide de pinces et de sécuriser les inserts avec une tige métallique ou avec un embout P1000 coupe (Figure 1 C).
Remarque : Éviter la circulation excessive des tissus au cours de cette étape de maintenir la position de punch rétinienne au sein du centre de l’échantillon microchamber. Bulles d’air gravement faussent la lecture OCR. Bien que le microchamber a une profondeur suffisante pour accueillir la rétine de souris typique (Figure 1), parfois d’usinage-défauts dans les inserts en mesh peuvent causer les tissus deviennent trop compressée lors de l’insertion de l’écran. Si cela se produit, simplement prendre note des tissus broyés et exclure que l’échantillon de l’analyse finale. - Incuber la plaque de tissu dans un 37 ° C CO2-incubateur libre pendant au moins 60 min.
- L’analyseur de flux extracellulaire à l’aide de Mix, attendre, mesure du programme et répétez les commandes. À titre d’exemple, une expérience typique avec tissu rétinien peut inclure ce qui suit : mélanger 2 minutes, attendre 2 minutes et mesurer 5 minutes. Répétez l’expérience avec ces trois étapes entre 5 - 8 fois (cycles) pour un enregistrement de base et après l’injection de chaque composé testé pendant la course.
- Appuyez sur le bouton de démarrage de programme sur l’analyseur de flux extracellulaire et suivez les instructions à l’écran pour insérer la cartouche de sonde pour l’étalonnage.
- À la fin de l’étalonnage, suivez les instructions à l’écran pour remplacer la plaque calibrant avec la plaque contenant les échantillons rétiniennes.
- Autoriser le programme à exécuter, comme programmé. À la fin de la course, suivez les instructions à l’écran pour éjecter la plaque de tissu. Afficher les résultats de la course et stocker le fichier de données.
- Avec une aiguille de calibre 20 tordue et forceps, supprimer tous les inserts en mesh provenant des puits, abandonnant le poinçon rétiniens.
- Aspirer les médias du tissu avec précaution et laver le tissu deux fois avec 0,5 mL de froide solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Aspirer le PBS après le lavage.
- Ajouter 100 µL de tampon de lyse dans chaque puits et la pipette up et down pour homogénéiser les tissus.
- Quantifier les niveaux d’entrée basés sur l’ADN double brin (dsDNA) total ou de la teneur totale en protéines.
Remarque : Ce qui suit est basé sur un test ADN double brin disponibles dans le commerce. - Diluer les échantillons lysés 1:1 en ajoutant 100 µL de tampon Tris-EDTA (TE) et transférer 100 µL de l’échantillon dilué dans une plaque 96 puits.
- Ajouter 100 µL de tampon de détection dans chaque puits. Après le mélange pendant 2-5 minutes, quantifier la fluorescence après excitation à 480 nm et d’émission à 520 nm, en comparant à une courbe d’étalonnage.
- Normaliser le traçage de flux extracellulaire brutes à la teneur en ADN dans le puits.
Remarque : Dans les résultats présentés ici, les échantillons sont normalisées à 50 ng dsDNA - une quantité typique dans un coup de poing rétinienne de 1 mm. Par conséquent, les valeurs absolues présentées ici peut être comparés à études présentant des données « par punch rétinienne ». Normaliser les tracés d’un étalon interne, telles que la ligne de base run à une concentration de glucose de 5 mM.
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Representative Results
En utilisant les techniques décrites (résumées dans la Figure 1), les explants rétiniennes de 8 semaines sauvage (WT) souris ont été comparés aux appariés selon l’âge et le fond de tbl1xr1 souris null (Gnat1- / -). Parce que Gnat1- / - les animaux n’ont pas les machines à fermer canaux ioniques en réponse à des stimuli lumineux sensibles au nucléotide cyclique, les photorécepteurs de la tige restent dépolarisées même en lumière14. Le besoin de maintenir efflux de potassium créerait une grande demande d’ATP, résultant en une souche bioénergétique. Pour déterminer si ces changements dans la demande d’énergie augmenterait la phosphorylation oxydative ou flux glycolytique, tissus de souris de type sauvage et des Gnat1- / - souris ont été comparés à l’aide de l’analyseur de flux extracellulaire. Au départ, en présence de 5 mM de glucose et de la pyruvate de 1 mM, les tissus rétiniens d’animaux sauvage donner les mêmes taux d’efflux acide par rapport à des Gnat1- / - mutants. Des tendances similaires apparaissent après l’addition de 20 mM de glucose et de l’inhibiteur de la glycolyse 2-DG (Figure 2 a). Ces données peuvent également être mathématiquement transformées afin de représenter les modifications fractionnaires de base (Figure 2 b), un format qui peut permettre meilleure comparaison entre les différentes interventions expérimentales.
OCR absolue au départ équivaut entre WT et mutant tissu rétinien (Figure 3 a). L’addition de glucose 20 mM augmente la respiration mitochondriale, mais aucun changement n’est observé entre les groupes en termes de quantification absolue ou en termes de changement de ligne de base (Figure 3 b). L’addition de 1mM FCCP (un agent découplant) afin de démontrer les taux maximaux de respiratoires mitochondriales n’augmente pas significativement OCR au-dessus du niveau de Sîn à forte concentration de glucose dans les tissus de- / - WT ou Gnat1. Cependant, des signaux provenant de deux souris chute drastiquement après l’addition du RAA cocktail.
Idéalement, les expériences de flux extracellulaire exécutent en présence de l’ATP synthase inhibiteur oligomycine permettant d’identifier des sources de fuite de protons, qui se produisent lorsque le mouvement par le biais de la chaîne de transport d’électrons n’est pas associé avec ATP production16. Des explants de rétine de souris de C57BL/6J 8 semaines, traitement oligomycine abaisse robuste OCR, comme prévu (Figure 4). Mais addition subséquente du FCCP, trouver maximale OCR, supposément augmente l’OCR à environ 60 % du niveau de référence, conformément à une étude préalable11.
L’analyseur XF24 utilise des sondes submersibles qui faire un joint étanche à l’intérieur du puits de tissus, créant un micro-environnement transitoire pour mesure d’oxygène et de flux acide. Positionnement du tissu rétinien dans la plaque bien (en ce qui concerne les capteurs) pourrait potentiellement influencer les enregistrements de l’OCR et conduisent à des facteurs de confusion non désirés, et certains chercheurs ont préconisé de placer le tissu rétinien directement sous la sonde d’oxygène avec la segments externes des photorécepteurs orientés vers le capteur11. Pour tester les effets de tissu rétinien position sur les mesures de l’OCR, tissus de souris C57BL/6J jeunes (âgés de 8 semaines) ont été analysés dans deux orientations : cellules ganglionnaires rétiniennes orienté vers le bas sur la plaque (photorécepteursc'est-à-dire des placé debout le plus près possible à capteur ) ou vers le haut vers le capteur. Aucune différence relative OCR en réponse à FCCP ou RAA ont été observées, ce qui indique une sensibilité équivalente pour des taux respiratoires mitochondriales maximales et minimales soit l’orientation (Figure 5 a). En outre, les mesures absolues de OCR étaient également équivalents entre les tissus rétiniens soit l’orientation (Figure 5 b).
Figure 1 : Isolement des explants rétinienne et d’installation dans l’analyseur de flux extracellulaire. A. isolement de la rétine neurale in situ en appliquant la force propulsive globe avec une pince, incision de la cornée et enlever la rétine après avoir jeté la lentille et membranes hyaloïde antérieures. B. préparation du tissu pour le flux d’enregistrement avec création de poinçon rétinienne, placement des poinçons individuels en îlot capture microplaque et utilisation d’un insert mesh pour minimiser le mouvement du tissu avec microchambers (échelle bars = 1 mm). C. une représentation schématique, dérivé des données fournies par le fabricant, montrant le plan de la procédure et démontrant que la hauteur de la microchamber est suffisante pour accueillir la rétine murine. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Analyse des contraintes mitochondriale à l’aide de rétine explanté de 8 semaines animaux. A. tracés avec écart-type de mesure (SEM), normalisés au contenu en ADN des tissus, à une expérience optimisée pour les enregistrements de la consommation d’oxygène, comparant tbl1xr1 animaux knock-out (Gnat1- / -) à la moyenne contrôles de type sauvage. B. même de l’expérience avec les données transformées telles que des enregistrements de référence sont définis comme référence. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Analyse de l’utilisation de taux de glycolyse explantées rétine des animaux 8 - semaine vieux. A. moyenne, ADN contenu normalisé, tracés à partir d’une expérience optimisée pour les enregistrements de l’efflux acide comparant tbl1xr1 animaux knock-out (Gnat1- / -) pour les contrôles de type sauvage. B. données de la même experiment normalisée aux enregistrements de la base. Des traces montrent moyenne ± SEM. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Des effets irréversibles de l’oligomycine sur les taux respiratoires rétiniennes. Des explants de rétinienne aiguë préparés chez des souris de C57BL/6J 8 semaines, l’oligomycine traitement réduit l’OCR maximale induite par l’addition subséquente de FCCP. Des traces montrent moyenne ± SEM. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Effets du tissu positionnement sur mesure OCR. Les tissus rétiniens de 8 souris C57BL/6J de week-old ont été placés dans les puits avec les cellules ganglionnaires face vers le capteur (cellules ganglionnaires Up) ou éloigner le capteur (cellules ganglionnaires Down). Entre les groupes, les flux extracellulaire semblable enregistrements sont observées en termes de capacité respiratoire (A) par rapport à la ligne de base ou (B) en termes de quantification absolue. Des traces montrent moyenne ± SEM. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
OCR et ECAR sont facilement mesurable en tissu rétinien explanté, à l’aide d’un bioanalyzer en utilisant les techniques décrites. Cette méthode diffère de celles des autres groupes en plusieurs étapes cruciales. Les tissus rétiniens sont isolées à travers une large incision cornéenne sans enucleating du globe, qui avaient été initialement décrit par Winkler,15. Cette méthode d’isolement rétinienne permet un transfert rapid de le œil de la vie dans la plaque de capture de tissu (souvent dans les 5 minutes). Les tissus sont maintenus à 37 ° C tout au long du processus, ce qui préserve la respiration cellulaire mieux que quand ils sont placés sur la glace. Médias avec additifs minimales sont utilisés pour les mesures initiales, l’omission de tout agent tampon HEPES ou bicarbonate de sodium, sérum ou excès macronutriments, comme ceci permet des mesures plus fiables du métabolisme énergétique basale et n’inhibe pas évaluation d’ECAR. Poinçons rétiniennes sont mieux enregistrées dans un format de 24 puits, plutôt qu’à 96 puits, afin de minimiser le traumatisme des tissus. Tissu rétinien est placé au centre du puits, au sein de la microchamber des tissus et sécurisé avec un insert mesh. Cela permet pour un enregistrement précis de ECAR et OCR, tout en empêchant le mouvement de l’excès de tissu pendant la course et élimine le besoin d’autres réactifs tels que les colles tissulaires. Une injection de véhicule pendant la course est recommandée, surtout lorsque la mise en place des expériences d’enregistrement pour la première fois, car cela donnera une idée de la façon dont le tissu est fixé dans la plaque de capture. Enregistrements d’OCR à l’aide de cette technique sont indépendantes de l’orientation rétinienne dans le puits, mais l’orientation doit être cohérente entre les échantillons dans les expériences. Toutes les mesures sont effectuées uniquement après que métabolisme rétinien a atteint l’état d’équilibre après une injection de composés d’essai.
Ce protocole décrit la normalisation des données pour la teneur en ADN total, comme un proxy pour le nombre de cellules. Une telle technique est avantageuse car elle représentera pour faire modifier le nombre de cellules conduit par variation épaisseur rétinienne, poinçon taille ou différences cellularité entre échantillons antigénique différentes. Normalisation de base de protéine totale est également une méthode fiable et a l’avantage de minimiser les différences de masse mitochondriale totale entre les échantillons rétiniennes. Cependant, normalisation basée sur la teneur en protéines dans le tissu entier peut être confondue par des changements dans la matrice extracellulaire entre les échantillons. Normalisation des enregistrements de flux au niveau de référence, comme le montre les résultats représentatifs, est avantageuse car elle minimise la variabilité punch rétinienne de taille entre les répétitions et permet facilement l’interprétation des changements dus aux interventions pharmacologiques. Cependant, rapports de valeurs brutes permet meilleure comparaison entre les différentes expériences et expériences réalisées à l’aide de méthodes d’enregistrement des flux différents.
Résultats à l’aide de ces techniques sont comparables à celles observées ailleurs. Bien que l’oligomycine - ATP synthase inhibiteur - est généralement utilisée pour mesurer la fuite de protons au sein de tissus ou de cellules d’intérêt, ce composé a des effets négatifs sur le métabolisme rétinien. Dans les expériences rapportées ici, un 60 % diminution maximale rétinienne OCR par FCCP est observé après exposition à l’oligomycine (Figure 4), presque identique à une précédente étude11. Une explication possible pour cette conclusion est des dommages irréversibles ou modification aux mitochondries rétiniennes par inhibition de ATP synthase. En outre, comme Kooragayala et ses collègues d’abord signalé11, rétinal mitochondries sont susceptibles d’exploitation à près dans des conditions basales, les taux maximaux depuis un agent découplante de chaîne de transport d’électrons, FCCP, ne fait qu’accroître OCR d’environ 15 % (Figure 3 , Figure 5).
Enregistrements de flux extracellulaire dans les tissus rétiniens explantés montrent une capacité glycolytique grande réserve, puisque l’addition de glucose 20 mM provoque une augmentation double ECAR (Figure 2). Parce que l’oligomycine, habituellement utilisé pour évaluer la capacité glycolytique, a des effets délétères en tissu rétinien (Figure 4), l’utilisation de la plus forte concentration de glucose à l’enregistrement peut servir de proxy mieux mesurer glycolytique réserve dans la rétine. Une mise en garde importante empêchant l’utilisation de ECAR comme proxy pur pour taux de glycolyse, c’est que de CO2 , libérés par le cycle de Krebs peut être une source importante d’acide dans les tissus cultivés17. Pyruvate excès n’augmente pas l’ECAR au-dessus des niveaux induites par l’hyperglycémie et flux glycolytique est presque éliminée des explants rétinienne à l’aide des rapports molaires excédentaires de 2-DG (Figure 2). Puisque l’ATP sert à régénérer le potentiel qui se produisent des événements de dépolarisation dans la rétine adapté à l’obscurité de la membrane, animaux manquant tbl1xr1 devraient dépenser plus d’énergie que leurs homologues WT. Toutefois, des explants, différences dans le métabolisme énergétique rétinien Gnat1- / - et les contrôles ont été pas vu dans les expériences décrites ici (Figure 2 et 3). Ces résultats concordent avec ceux obtenus en utilisant un appareil de perfusion personnalisé pour mesurer l’OCR en Gnat1- / - animaux18. Notamment, l’appareil de mesure utilisé par Du et collègues a permis pour la mesure des OCR dans des conditions adaptées adapté à la lumière et sombres. Ce faisant, une petite mais significative diminution OCR après exposition à la lumière est détectée dans la rétine de type sauvage, mais pas dans Gnat1- / - rétines18. Cet exemple illustre une limitation majeure de la technique actuelle dans la mesure ECAR et OCR dans la rétine explantés - l’analyseur de flux extracellulaire utilisé ici se fonde sur une excitation lumineuse visible des fluorophores incorporés dans ses capteurs d’oxygène et du pH, éliminant les possibilité d’effectuer des mesures dans les tissus adapté à l’obscurité. Ces mesures sont très pertinents à la physiologie visuelle et exigent toujours l’utilisation d’anciennes techniques exclusivement destiné à l’étude du métabolisme rétinien.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions le Dr Alexander Kolesnikov et Dr Vladimir Kefalov pour fournir des Gnat1- / -souris, de conseil et d’informations utiles et pour la lecture du manuscrit.
Ce travail a été soutenu par NIH EY025269 (RR), le centre de recherche du diabète à l’Université de Washington - NIH DK020579 (JRM et RR), un Career Development Award de la recherche pour prévenir la cécité (RR), la Fondation Horncrest (RR), une bourse de développement de carrière du (de la FRDJ JRM), NIH DK101392 (CFS), DK020579 (CFS), DK056341 (CFS) et DK114233 (JRM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Seahorse XF24 Extracellular Flux Analyzer | Agilent, Santa Clara, CA | ||
| Seahorse XF24 Islet Capture FluxPak (includes: Islet Capture Microplate, Sensor Cartridge and Calibrant Solution) | Agilent, Santa Clara, CA | 101174-100 | Includes islet capture microplate, sensor cartridge and calibrant solution |
| RPMI 1640 Media (Powdered medium) | Millipore-Sigma | R1383 | RPMI 1640 Media with L-Glutamine and without glucose or sodium bicarbonate |
| D-Glucose | Millipore-Sigma | G8270 | 1M D-Glucose filtered, for media preparation |
| Sodium pyruvate | Corning | 25000CI | 100 mM sodium pyruvate |
| Antimycin-A | Millipore-Sigma | A8674 | Mitochondrial stress protocol component |
| FCCP | Millipore-Sigma | C2920 | Mitochondrial stress protocol component |
| Rotenone | Millipore-Sigma | R8875 | Mitochondrial stress protocol component |
| 2-deoxyglucose | Millipore-Sigma | D6134 | Glycolysis protocol component |
| 1 mm skin biopsy punches with plunger | Integra-Miltex | 33-31AA-P/25 | Explanting retinal tissue tool |
| Dumont Mini-Forceps Straight | Fine Science Tools | 11200-10 | Explanting retinal tissue tool |
| Dumont Medical #5/45 Forceps- Angled 45 degrees | Fine Science Tools | 11253-25 | Explanting retinal tissue tool |
| Dumont #7 Forceps - Curved | Fine Science Tools | 11271-30 | Explanting retinal tissue tool |
| Quant-iT Picogreen dsDNA Assay Kit | Fisher Scientific | P7589 | Loading normalization assay |
| Trizma base (Tris base) | Millipore-Sigma | T6066 | Component of lysis buffer |
| Triton X-100 (polyethylene glycol tert-octylphenyl ether) | Millipore-Sigma | X100 | Component of lysis buffer |
| 0.5M EDTA pH 8.0 | Ambion | AM9262 | Component of lysis buffer |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratories | Strain 000664 | Animals |
| Gnat1-/- and background-matched Gnat1+/+ | Vladimir Kefalov, PhD; Washington University School of Medicine | Animals |
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