Summary
Dieses Verfahren beschreibt Echtzeit Aufnahme von Sauerstoff-Verbrauch und extrazelluläre Übersäuerung Preise in explantierten Maus retinalen Gewebe mit einer extrazellulären Flux-Analyzer.
Abstract
Hohe Schärfe Vision ist ein stark energieverbrauchender Prozess, und die Netzhaut hat mehrere einzigartige Anpassungen um genau solche Anforderungen unter Beibehaltung der Transparenz von der Sehachse entwickelt. Störungen auf dieses empfindliche Gleichgewicht führen blendende Erkrankungen wie diabetische Retinopathie. Daher ist das Verständnis Energie-Stoffwechsel-Veränderungen in der Netzhaut bei Erkrankung zwingend notwendig, um die Entwicklung rationaler Therapien für verschiedene Ursachen von Vison Verlust. Den letzten Aufkommen von handelsüblichen extrazelluläre Flussmittel Analysatoren hat die Untersuchung der Netzhaut Energiestoffwechsel zugänglicher gemacht. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung solch eines Analyzers, Beiträge zur Netzhaut Energieversorgung durch seine zwei Prinzip Arme - Oxidative Phosphorylierung und Glykolyse - messen durch Quantifizierung von Steuersatzänderungen Sauerstoff Verbrauch (OCR) und extrazellulären Versauerung Preise (ECAR) als Stellvertreter für diese Wege. Diese Technik ist ohne weiteres in explantierten Netzhautgewebe, Erleichterung der Bewertung der Antworten auf mehrere pharmakologische Wirkstoffe in einem einzigen Experiment durchgeführt. Metabolische Signaturen in Netzhaut von Tieren fehlt Stab Photorezeptor Signalisierung sind im Vergleich zu Wildtyp Steuerelemente, die mit dieser Methode. Eine große Einschränkung bei dieser Technik ist die mangelnde Fähigkeit zur Unterscheidung zwischen Licht angepasst und angepassten Energieausnutzung, einen wichtigen physiologischen Gesichtspunkt Netzhautgewebe.
Introduction
Die Netzhaut gehört zu den anspruchsvollsten Energie Geweben in das zentrale Nervensystem1. Wie den meisten Geweben generiert es Adenosintriphosphat (ATP) über Glykolyse im Zytosol oder durch Oxidative Phosphorylierung in den Mitochondrien. Der energetische Vorteil Oxidative Phosphorylierung über Glykolyse ATP aus einem Molekül Glucose herzustellen ist klar: 36 Moleküle ATP generiert aus der ehemaligen vs 2 Molekülen ATP aus letzterer erzeugt. Entsprechend, Netzhaut Neuronen hängen in erster Linie mitochondriale Atmung für Energieversorgung und dies spiegelt sich durch ihre hohe Dichte der Mitochondrien2. Allerdings stützt sich die Netzhaut auch auf glykolytischen Maschinen auch wenn Sauerstoff reichlich vorhanden ist. Dieser Prozess der aeroben Glykolyse wurde ursprünglich in Krebszellen durch Otto Warburg3, der einmal darauf hingewiesen, dass die Netzhaut nur Post-mitotische Gewebe in der Lage, diese Form der Stoffwechsel4beschrieben. Seit dieser ersten Beobachtungen sind viele Post-mitotische Gewebe beschrieben worden, um in unterschiedlichem Ausmaß der Glykolyse neben Oxidative Phosphorylierung zu engagieren, um ihre ATP-Anforderungen zu erfüllen.
Phototransduction, recycling, Sehpigment Biosynthese der Photorezeptor Außensegmenten und synaptische Aktivität sind alle anspruchsvollen Energieprozesse in Photorezeptoren, die vorherrschende neuronalen Unterklasse in der Netzhaut. Aber die Notwendigkeit, aktiv Ionen gegen ihre elektrischen und Konzentration Steigungen zu transportieren ist bei weitem die meisten energetisch raubender Prozess in Neuronen1. Photorezeptoren sind eigentümliche Neuronen in dem Sinne, dass sie in Ermangelung der Stimulation (d. h. im Dunkeln), depolarisiert werden während ein Lichtreiz Kanal Schließung und anschließende Hyperpolarisation auslöst. Daher im Dunkeln verbraucht die Netzhaut große Mengen an ATP zur Aufrechterhaltung seiner Depolarisation oder "Dunkelstrom", wie es gewöhnlich genannt wird. Aus Sicht der adaptiven ist eine große Herausforderung bei der Versorgung dieser Unmengen von ATP die Notwendigkeit für Organismen, visuellen Klarheit durch die optische Achse beizubehalten. Die umgekehrte Netzhaut Architektur in modernen Kreaturen gesehen ist die dominante Lösung, da hält es die dichten Kapillarnetzes Versorgung Photorezeptoren vom Weg des Lichts. Aber dieses Wunderwerk der Natur Bioengineering die Netzhaut am Abgrund in Bezug auf die metabolische Reserve. Auch kleine Beleidigungen der Netzhaut können potenziell stören das empfindliche Gleichgewicht der Energie-Angebot und Nachfrage, und visuellen Dysfunktion oder offene Blindheit kann schnell erfolgen.
Angesichts der einzigartigen energetischen Anforderungen der neuronale Netzhaut, gepaart mit seiner engen Beschränkung der Gefäßversorgung, hätte genaue Messung des ATP-Verbrauch in der Netzhaut und seine Veränderungen während der Krankheit tiefgreifende Auswirkungen bei Verständnis und Behandlung von blendende Voraussetzungen wie Retinitis Pigmentosa und diabetische Retinopathie. Traditionell, erfordern diese Messungen kostspielig, speziell angefertigte Geräte mit den meisten Studien aus einer Handvoll von Laboratorien, die ausschließlich mit Messungen der metabolische Aktivität2,5,6, 7,8. Techniken umfassen einzelne Assays für die spezifischen Metaboliten, Tracer-Studien mit Radio-markierten Vorstufen, Sauerstoffverbrauch Aufnahme mit Clark Elektroden und Metabolomic Profilerstellung9.
Mit Fortschritten im Hochdurchsatz-Technologie und eine höhere Verfügbarkeit von kommerziellen Geräten sind Techniken zur Aufzeichnung retinalen Stoffwechsel immer zugänglich und erschwinglich. Die hier beschriebene Methode misst sowohl Oxidative Phosphorylierung und Glykolyse in der Netzhaut mit isolierten Gewebe und einen handelsüblichen extrazelluläre Flussmittel Analyzer9,10,11,12. Dieser Analysator zeichnet separat Sauerstoff-Verbrauch (OCR) und die extrazelluläre Übersäuerung Rate (ECAR), dient als indirekte Indikatoren für die Oxidative Phosphorylierung und Glykolyse, bzw.13. Diese Messungen erfolgt durch eine Sonde eingetaucht in ein Microchamber über das Gewebe von Interesse erstellt. Diese Anpassung der zuvor veröffentlichten Methoden verwendet eine Capture-Platte ursprünglich für Bauchspeicheldrüsenkrebs Langerhans-Inseln um metabolische Aktivität in kleinen, kreisförmigen Abschnitten der Maus Netzhaut aufzuzeichnen. Pharmakologische Mehrfachbelichtungen können geliefert werden, das Gewebe im Laufe einer einzigen Aufnahme, weil das System gut 4 Injektion Ports für jede Probe enthält. Mit diesem System mit getrennter Protokolle für ECAR und OCR-Aufnahmen optimiert, die Reaktionen der Wildtyp Netzhaut sind vergleichbar mit Netzhaut fehlen transducin (Gnat1- / -), eine Ursache für kongenitale stationäre Nachtblindheit in Menschen-14.
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Protocol
Protokolle folgte der Association for Research in Vision und Augenheilkunde-Anweisung für die Nutzung von Tieren und von der Washington University angenommen wurden.
(1) tierische Vorbereitung
- Halten Sie Tiere in Standardgehäuse mit 12 Stunden dunkel bis 12 Stunden Licht-Zyklus. Begin Experimente an standardisierten Zeiten zu vermeiden circadiane Effekte in der Regel am Morgen kurz nach Lichter eingeschaltet sind.
2. Vorbereitung der Lösung
- Bereiten Sie base Medien durch Auflösen von 8,4 mg pulverförmige Medien in bidestilliertem H2O (DdH2O) und pH auf 7,4 mit HCl oder NaOH einstellen, zu einem Endvolumen von 1 L. Filter sterilisieren diese Lösung mit einem 0,22 µm Gewebekultur Filter.
- Fügen Sie 1 M Glukose und 100 mM Natrium Pyruvat zu den Medien zu Endkonzentrationen von 5 mM Glucose zu erreichen und 1 mM Pyruvat.
- Ort eine 50 mL Aliquot der Basis Medien in einem 37 ° C-Wasserbad.
- Quantifizierung der Gewebe am Ende der Flux-Analyse durch Zugabe von Tris-base, 10 mM, Polyethylenglykol Tert-Octylphenyl Äther auf 0,2 % (V/V) und EDTA, 1 mM, alle in DdH2O. mischen, bis alle Komponenten vollständig aufgelöst und passen bereiten Sie Lyse Lösung vor pH bis 8.0.
- Bereiten Sie für das Protokoll mitochondrialer Stress ein 11 µM-Lager von Oligomycin, ein ATP-Synthase-Inhibitor, aufgelöst in base Medien auf eine Endkonzentration von 1 µM im Brunnen. Bereiten Sie einen 11 µM Vorrat an Carbonyl Zyanid - 4-(Trifluoromethoxy) Phenylhydrazone (FCCP), ein abkoppeln Agent in base Medien, eine Endkonzentration von 1 µM im Brunnen Ziel aufgelöst. Bereiten Sie einen Cocktail der Elektronentransport-Kette-Inhibitoren, Rotenon und Antimycin A (RAA) durch Zugabe von Rotenon bis 11 µM und Antimycin A bis 22 µM, aufgelöst in base Medien auf eine Endkonzentration von 1 µM Rotenon und 2 µM Antimycin A in das gut.
- Bereiten Sie für die Glykolyse Protokoll 220 mM Lager in base Medien, um eine Endkonzentration von 20 mM in den Brunnen Ziel gelöster Glukose. Auch bereiten Sie ein 1,1 M Lager 2-Deoxyglucose (2-DG), als kompetitiver Inhibitor von Glukose und glykolytische Antagonist, durch Auflösen in base Medien. Dies wird eine Endkonzentration von 100 mM 2-DG in der gut ausgerichtet sein.
3. Kalibrierung
- Um die Instrumentierung für eine extrazelluläre Flux-Assay zu kalibrieren, fügen Sie 1 mL der Kalibrierlösung in jede Vertiefung der Sensorkassette (insgesamt 24 Vertiefungen) und Inkubation bei 37 ° C in einer CO2-frei Inkubator über Nacht (oder mindestens 8 Stunden).
- Laden Sie Additive für die mitochondriale Stress-Protokoll oder das Protokoll Glykolyse in jeder Injektor Port A bis D, auf der Sensorkassette, bereinigt um Volumenänderungen im Brunnen.
Hinweis: Beispielsweise würde ein typische Assay gehören 45 µL eines Zusatzstoffes in der erste Injektor-Port, 49,5 µL in die zweite, 54,5 µL in der dritten und 60 µL in den letzten gut Anfangslautstärke von 450 µL vorausgesetzt. - Während der ersten mehrere Experimente laden Sie base Medien in Port A zu beurteilen, wie viel Gewebe Bewegung/Artefakt nach einer Port-Injektion erfolgt.
- Lassen Sie die geladenen Sensorplatte bei 37 ° C in einem nicht-CO2 -Inkubator für mindestens 60 min inkubieren.
4. Isolierung von Netzhautgewebe frische Maus
Hinweis: Dieser Schritt ist von der Technik von Dr. Barry Winkler15angepasst.
- Nach der Verabreichung Tiefe Narkose mit einem standard Ketamin/Xylazin-Cocktail, einschläfern Sie Mäuse durch zervikale Dislokation.
- Verwenden Sie ein paar mittlere gebogene Pinzetten, fassen Sie den hinteren Globus auf den Sehnerv und sanft nach vorne Druck auf Proptose des Auges (Abbildung 1A).
- Erstellen Sie mit einer sauberen Rasierklinge einen Limbus, Limbus-Schnitt in die Hornhaut mit einem einzigen, absichtliche Pass der Klinge.
- Mit feinen, Kneifen abgewinkelte McPherson-Stil Zangen den hinteren Globus, die Objektiv und vorderen hyaloid Membranen aus der Hornhaut Schnitt auszudrücken. Entsorgen Sie diese Gewebe.
- Wiederholen Sie das Kneifen Manöver mit der Pinzette die neuronale Netzhaut zum Ausdruck bringen.
- Mit der Zange wie ein Löffel auf die Netzhaut zu heben, anstatt, das Gewebe zu erfassen, die Netzhaut von der Hornhaut Schnitt und direkt in warmen Medien in einer 3-cm-Schüssel oder eine 6-Well-Zellkultur-Cluster-Platte.
- Verwenden Sie zwei Paare von feinen, gewinkelte McPherson-Stil Zange sanft verbleibenden Glaskörpers von der Netzhaut zu sezieren. Dies geschieht am besten durch den Glaskörper an der Peripherie der Netzhaut Cup greifen und ziehen in Richtung Zentrum, mit einer endgültigen Disinsertion des Glaskörpers von der Mitte als Ganzes. Mit der Pinzette, entfernen Sie alle verbleibenden retinalen Pigmentepithels von der Oberfläche der Photorezeptoren der Netzhaut.
- Schneiden Sie eine P1000 Pipettieren Spitze mit einer Rasierklinge zum Erstellen einer ~ 4 mm Öffnung um unnötige Trauma auf die empfindliche Netzhaut-Gewebe während der Übertragung Manöver zu verhindern.
- Übertragen Sie die isolierten Netzhautgewebe in frische Medien mit einer geschnittenen P1000 Pipettieren Spitze.
- Schneiden Sie 1 mm Schläge der Netzhaut um den Sehnerv mit einem 1 mm-Biopsie Punsch mit einem Kolben ausgestattet, um das Gewebe zu verdrängen, für den Fall, dass sie in die Bohrung (Abbildung 1 b) erhoben wird. Legen Sie die Netzhaut Schläge beiseite in sauberen Medien auf einem Block 37 ° C gehalten oder Heizkissen.
5. Test-Protokoll
- Übertragen Sie einzelne Schläge auf einer 24-Well Inselchen Erfassung Mikrotestplatte mit einer geschnittenen P1000 Spitze, Absaugen von 450 µL der Medien zusammen mit dem Gewebe.
- Verwenden Sie fein, gerade Pinzette sanft Schläge in die Mitte der Mikrotestplatte manipulieren. Halten Sie die Schläge in die gleiche Richtung (z.B. Ganglion Zelle Seite nach oben) ausgerichtet.
- Ruhen Sie die Capture-Platte auf ein Heizkissen oder Heizung Block auf 37 ° C eingestellt, da diese Schritte für die restlichen Proben wiederholt werden.
Hinweis: Für jedes Experiment beiseite 3-4 leere Brunnen mit 450 µL base Medien als negative Kontrollen dienen. Testen Sie in den verbleibenden 20-21-Brunnen jede biologische replizieren in dreifacher Ausfertigung. Daher wird jede 24-Well-Platte für die Aufnahme von 6-7 verschiedene Tiere oder Behandlungsbedingungen erlauben.
- Ruhen Sie die Capture-Platte auf ein Heizkissen oder Heizung Block auf 37 ° C eingestellt, da diese Schritte für die restlichen Proben wiederholt werden.
- Vermeidung von Luftblasen, sanft Position die Insel Mesh-Einsätze in jeder gut mit Pinzette zu erfassen und die Einsätze zu sichern, mit einem metallischen Kolben oder mit geschnittenen P1000 Pipettieren Spitze (Abb. 1 C).
Hinweis: Vermeiden Sie übermäßige Gewebe Bewegung während dieses Schrittes, retinale Lochposition in der Mitte der Probe Microchamber beizubehalten. Luftblasen verfälschen stark OCR Lesungen. Obwohl die Microchamber ausreichende Tiefe, typische Maus Netzhaut (Abbildung 1) unterzubringen ist, verursachen gelegentlich Bearbeitung-Fehler in der Mesh-Einsätze Gewebe zu übermäßig beim Bildschirm einfügen komprimiert werden. In diesem Fall einfach notieren Sie das zerkleinerte Gewebe und letzten Endes schließen Sie dieser Probe aus. - Inkubieren Sie die Gewebe-Platte in einem 37 ° C CO2-frei Inkubator für mindestens 60 min..
- Programm den extrazellulären Flux-Analyzer mit Mix, warten, Maßnahme, und wiederholen Sie Befehle. Als Beispiel, ein typisches Experiment mit Netzhautgewebe kann Folgendes beinhalten: Mischen Sie 2 Minuten, warten Sie 2 Minuten und 5 Minuten zu messen. Wiederholen Sie das Experiment mit diesen drei zwischen Schritten 5-8 Mal (Zyklen) für eine Aufnahme der Grundlinie und nach Injektion von jeder Verbindung getestet während des Laufs.
- Drücken Sie die Programm-START-Taste auf der extrazellulären Flux-Analyzer und folgen Sie den Anweisungen auf dem Bildschirm, um die Sensor-Steckmodul für Kalibrierung einfügen.
- Am Ende der Kalibrierung befolgen Sie die Anweisungen auf dem Bildschirm, um die Platte mit der Netzhaut Proben die Kalibrator Platte ersetzen.
- Lassen Sie das Programm ausführen, wie programmiert. Am Ende des Laufs befolgen Sie die Anweisungen auf dem Bildschirm, um die Gewebe-Platte auswerfen. Zeigen Sie die Ergebnisse des Laufes und speichern Sie die Datei zu.
- Entfernen Sie mit einem gebogenen 20 Gauge-Nadel und Pinzette alle Mesh-Einsätze aus dem Brunnen, den Netzhaut Stempel hinterlassen.
- Vorsichtig aspirieren Sie die Medien aus dem Gewebe und waschen Sie das Gewebe zweimal mit 0,5 mL kalte Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Aspirieren Sie die PBS, nach dem Waschen.
- Jeder Brunnen und Pipettieren rauf und runter, um Gewebe zu homogenisieren fügen Sie 100 µL der Lyse Puffer hinzu.
- Quantitate basierend auf insgesamt doppelsträngige DNA (DsDNA) oder Gesamtproteingehalt Eingangspegel.
Hinweis: Folgendes basiert auf einem handelsüblichen DsDNA-Assay. - Lysierten Proben 1:1 durch Zugabe von 100 µL Tris-EDTA (TE)-Puffer verdünnen und 100 µL der verdünnten Probe auf einer 96-well-Platte übertragen.
- Fügen Sie 100 µL der Detektionspuffer in jede Vertiefung. Nach dem Mischen für 2-5 Minuten, quantitate Fluoreszenz nach Anregung bei 480 nm und Emission bei 520 nm, im Vergleich zu einer standard-Kurve.
- Die rohen extrazelluläre Flux-Tracing auf DNA-Gehalt in den Brunnen zu normalisieren.
Hinweis: In der hier vorgestellten Ergebnisse sind Proben auf 50 ng DsDNA - eine typische Menge in einen 1 mm retinalen Schlag normalisiert. Daher kann Absolute Werte, die hier vorgestellten Studien, die Darstellung von Daten "Pro Retina Punch" verglichen werden. Normalisieren Sie Kurven mit einem internen Standard, wie die Basislinie laufen bei einer Glukosekonzentration von 5 mM.
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Representative Results
Netzhaut Explantaten von 8 Wochen alten Wildtyp (WT) Mäusen wurden mit den beschriebenen Techniken (zusammengefasst in Abbildung 1), im Vergleich zu Alter und Hintergrund abgestimmt transducin null Mäuse (Gnat1- / -). Weil Gnat1- / - Tiere die Maschinerie, in der Nähe fehlt zyklische Nukleotid gated Ionenkanäle in Reaktion auf Lichtreize, ihre Rute Photorezeptoren bleiben auch in leichten14depolarisiert. Die anschließende musst beibehalten, dass Kalium Ausfluss eine große Nachfrage der ATP, wodurch bioenergetische Belastung schaffen würde. Um festzustellen, ob solche Verschiebungen im Energiebedarf Oxidative Phosphorylierung oder glykolytischen Flussmittel erhöhen würde, wurden Gewebe von Wildtyp-Mäusen und Gnat1- / - Mäusen verglichen mit der extrazellulären Flux-Analyzer. Zu Studienbeginn in Anwesenheit von Glucose 5 mM und 1 mM Pyruvat haben retinalen Gewebe aus Wildtyp Tiere ähnliche Preise von sauren Ausfluss im Vergleich zu Gnat1- / - Mutanten. Ähnliche Muster sind nach Zugabe von 20 mM Glukose und die glykolytischen Inhibitor 2-DG (Abbildung 2A) gesehen. Diese Daten können auch mathematisch umgewandelt werden, um gebrochene Änderungen gegenüber dem Ausgangswert (Abb. 2 b), ein Format darstellen, die zum besseren Vergleich zwischen verschiedenen experimentellen Interventionen ermöglichen kann.
Absolute OCR zu Studienbeginn entspricht zwischen WT und mutierten Netzhautgewebe (Abb. 3A). Die Zugabe von 20 mM Glukose erhöht die mitochondriale Atmung, aber keine Änderung wird zwischen den Gruppen in Bezug auf absolute Quantifizierung oder in Bezug auf die Veränderung vom Ausgangswert (Abb. 3 b) beobachtet. Die Zugabe von 1mM FCCP (abkoppeln Vermittler) maximale mitochondriale Atemfrequenz zeigen deutlich erhöht OCR über dem Niveau gesehen mit hoher Glucose in WT oder Gnat1- / - Gewebe sich nicht. Jedoch fallen die Signale von beiden Mäusen drastisch nach der Zugabe von RAA cocktail.
Im Idealfall laufen extrazelluläre Flussmittel Experimente in Anwesenheit von ATP-Synthase-Inhibitor Oligomycin Hilfe bei der Identifizierung von Quellen der Proton Leck, auftreten, wenn die Bewegung durch den Elektronentransport-Kette nicht mit ATP Produktion16verbunden ist. In retinalen Explantaten von 8 Wochen alten C57BL/6J Mäusen senkt Oligomycin Behandlung robust OCR, als erwartet (Abbildung 4). Aber spätere Zugabe von FCCP, maximale OCR finden nur nominell erhöht die OCR auf etwa 60 % der Grundlinie, konsequent mit einer früheren Studie11.
Der XF24-Analyzer verwendet Tauchpumpe Sonden, die eine feste Dichtung in das Gewebe gesund, erstellen eine transiente Mikroumgebung zur Messung von Sauerstoff und saure Flussmittel zu machen. Positionierung von Netzhautgewebe in der well-Platte (in Bezug auf die Sensoren) könnte potenziell beeinflussen OCR Aufnahmen und führen zu unerwünschten Confounder, und einige Mitarbeiter haben uns ausgesprochen Platzierung Netzhautgewebe direkt unterhalb der Sauerstoff-Sensor mit der Photorezeptor Außensegmenten der Sensor11ausgerichtet. Um die Auswirkungen von Netzhautgewebe Position auf OCR Messungen zu testen, Gewebe von jungen Mäusen C57BL/6J (8 Wochen alt) wurden analysiert, in zwei Ausrichtungen: retinalen Ganglienzellen nach unten auf die Platte (d. h. Photorezeptoren platziert aufrecht am nächsten zum Sensor ) oder nach oben in Richtung des Sensors. Keine Unterschiede im relativen OCR als Reaktion auf FCCP oder RAA beobachtet wurden, zeigt entsprechende Empfindlichkeit für maximale und minimale mitochondriale Atemfrequenz in beiden Ausrichtung (Abb. 5A). Darüber hinaus entsprachen auch absolute OCR Messungen zwischen retinalen Gewebe entweder Ausrichtung (Abb. 5 b).
Abbildung 1 : Isolierung der Netzhaut Explant und Setup in den extrazellulären Flussmittel Analysator. A. Isolation des neuronale Netzhaut in Situ durch Anwendung Antriebskraft auf Globus mit der Pinzette, Einritzen der Hornhaut und Netzhaut nach abwerfen, Objektiv und vorderen hyaloid Membranen entfernen. B. Vorbereitung des Gewebes für Flux Aufnahme mit retinalen Punsch Schöpfung, Platzierung von einzelnen Schlägen in Insel Gefangennahme Mikrotestplatte und Verwendung von einem Mesh-Einsatz um Gewebe Bewegung mit Microchambers zu minimieren (skalieren Balken = 1 mm). C. eine schematische, abgeleitet vom Hersteller bereitgestellten Daten, zeigt den Umriss der Verfahren und zeigen, dass die Höhe der Microchamber die murine Netzhaut Platz ausreicht. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Mitochondriale Spannungsanalyse mit explantierten Netzhaut von 8 Wochen alten Tiere. A. Kurven mit Standard-Fehler der Messung (SEM), normiert auf DNA-Gehalt des Gewebes, aus einem Experiment optimiert für Sauerstoff-Verbrauch-Aufnahmen, transducin Ko Tiere (Gnat1- / -) im Vergleich zu durchschnittlich Wildtyp-Steuerelemente. B. dasselbe Experiment mit Daten transformiert, so dass Ausgangsmessungen aufgezeichnet als Referenz festgelegt sind. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Analyse der glykolytischen Rate mit isolierten Netzhaut von 8 - Wochen alten Tieren. A. Durchschnitt, DNA Inhalt normalisiert, Umzeichnungen aus einem Experiment optimiert für saure Efflux Aufnahmen transducin Ko Tiere (Gnat1- / -), Wildtyp-Steuerelemente zu vergleichen. B. Daten aus dem gleichen experiment normalisierte, Ausgangsmessungen aufgezeichnet haben. Spuren zeigen Mittelwert ± SEM Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Irreversible Wirkungen von Oligomycin auf Netzhaut Atemfrequenz. In akut bereit retinalen Explantaten von 8 Wochen alten C57BL/6J Mäuse reduziert Oligomycin Behandlung die maximale OCR induziert durch nachträgliche Zugabe von FCCP. Spuren zeigen Mittelwert ± SEM Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5 : Auswirkungen der Gewebe Positionierung auf OCR Messung. Retinalen Gewebe von 8 Wochen alten C57BL/6J Mäuse wurden in Brunnen mit Ganglienzellen mit Blick in Richtung des Sensors (Ganglion Zellen nach oben) oder Weg vom Sensor (Ganglion Zellen nach unten) gestellt. Zwischen Gruppen, ähnlich wie extrazelluläre Flussmittel, die Aufnahmen in Bezug auf (A) Atemvolumen relativ zur Grundlinie oder (B) in Bezug auf absolute Quantifizierung beobachtet werden. Spuren zeigen Mittelwert ± SEM Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
OCR und ECAR werden ohne weiteres in explantierten Netzhautgewebe mit einem Bioanalyzer mit den beschriebenen Techniken gemessen. Diese Methode weicht von denen anderer Gruppen in mehreren kritischen Schritten. Retinalen Gewebe sind durch einen großen Hornhaut Schnitt isoliert ohne enucleating der ganzen Welt, wie ursprünglich von Winkler15beschrieben. Diese Methode der Netzhaut Isolierung ermöglicht eine schnelle Übertragung von lebenden Auge in die Gewebe-Capture-Platte (oft innerhalb von 5 Minuten). Gewebe werden bei 37 ° C während des Prozesses gehalten, die bewahrt Zellatmung besser als wenn sie auf Eis platziert sind. Medien mit minimalen Zusatzstoffen dienen zur ersten Messungen keine Pufferung Agenten z. B. HEPES oder Natriumbicarbonat, Serum oder überschüssige Makronährstoffe weglassen, da dies eine zuverlässige Messungen der basalen Energiestoffwechsel ermöglicht und nicht hemmen Bewertung der ECAR. Netzhaut Schläge erfasst am besten in einer 24-Well-Format und nicht im 96-Brunnen, Trauma, das Gewebe zu minimieren. Netzhautgewebe ist platziert in der Mitte des Brunnens, innerhalb der Gewebe Microchamber und sicherte sich mit einem Mesh-Einsatz. Dies ermöglicht eine genaue Erfassung der ECAR und OCR, und verhindert übermäßige Gewebe Bewegung während des Laufs und eliminiert die Notwendigkeit für andere Reagenzien wie Gewebekleber. Eine Fahrzeug-Injektion während des Laufs wird empfohlen, vor allem wenn Aufnahme Experimente zum ersten Mal einrichten, da dies ein Gefühl von wie gut das Gewebe innerhalb der Capture-Platte gesichert ist. OCR-Aufnahmen, die mit dieser Technik sind unabhängig von retinalen Orientierung innerhalb der gut, aber die Ausrichtung muss zwischen Proben innerhalb Experimente konsistent gehalten werden. Alle Messungen sind erst nach retinalen Stoffwechsel Steady-State nach Injektion von Testverbindungen erreicht hat.
Dieses Protokoll beschreibt Normalisierung der Daten zum gesamten DNA-Gehalt als Proxy für die Anzahl von Zellen. Diese Technik ist vorteilhaft, weil es Änderungen an angetrieben durch Variation in Netzhautdicke, Punsch Größe oder Unterschiede in der Zellularität zwischen genetisch unterschiedliche Proben Zellzahl ausmachen werden. Gesamt Protein-basierten Normalisierung ist auch eine zuverlässige Methode und hat den Vorteil der Unterschiede in der mitochondrialen Gesamtmasse zwischen Netzhaut Proben zu minimieren. Jedoch kann Normalisierung basierend auf Proteingehalt im gesamten Gewebe durch Veränderungen in der extrazellulären Matrix zwischen Proben verwechselt werden. Normalisierung der Flux-Aufnahmen auf die Grundlinie ist wie dargestellt in die repräsentativen Ergebnisse vorteilhaft, weil es minimiert die Variabilität in der Netzhaut Stempel Größe zwischen Wiederholungen und erlaubt auf einfache Interpretation der Veränderungen durch pharmakologische Interventionen Weise. Berichterstattung über die Rohwerte kann jedoch zum besseren Vergleich zwischen verschiedenen Experimenten und für Experimente mit unterschiedlichen Flussmittel Aufnahmemethoden durchgeführt.
Ergebnisse mit diesen Techniken sind vergleichbar mit denen an anderer Stelle berichtet. Wenn Oligomycin - ATP-Synthase Inhibitor - in der Regel verwendet, um Proton Leck innerhalb von Geweben oder Zellen von Interesse zu messen, hat diese Verbindung unerwünschte Auswirkungen auf den Stoffwechsel der Netzhaut. In den Experimenten berichtet hier eine 60 % Rückgang der maximalen Retinal, OCR, hervorgerufen durch FCCP nach Exposition gegenüber Oligomycin (Abbildung 4), fast identisch mit einer früheren Studie11beobachtet wird. Eine mögliche Erklärung für dieses Ergebnis ist irreversible Schäden oder Änderung an retinalen Mitochondrien durch Hemmung der ATP-Synthase. Darüber hinaus Kooragayala und Kollegen berichteten zuerst11, Retinal sind Mitochondrien wahrscheinlich am in der Nähe von maximale Preise im basalen Bedingungen seit Elektronentransport-Kette abkoppeln Vermittler, FCCP, nur mit zunehmender OCR um etwa 15 % (Abbildung 3 , Abbildung 5).
Extrazelluläre Flussmittel Aufnahmen in explantierten retinalen Gewebes zeigen eine große Reserve glykolytische Kapazität, da die Zugabe von 20 mM Glukose einen zweifachen Anstieg der ECAR (Abbildung 2 entlockt). Da Oligomycin, in der Regel verwendet, um maximale glykolytische Kapazität messen in Netzhautgewebe (Abbildung 4) schädliche Auswirkungen hat, kann die Verwendung von hohen Glukose Ergänzung für die Aufnahme als bessere Proxy abzuschätzen glykolytischen Reserve in der Netzhaut dienen. Eine wichtige Einschränkung, die verhindern, dass der ECAR als reine Proxy für glykolytischen Tarif ist, dass CO2 befreit von der Zitronensäure-Zyklus kann eine bedeutende Quelle von Säure im kultivierten Gewebe17. Überschüssige Pyruvat erhöht ECAR nicht über dem Niveau von hervorgerufen durch hohe Glukose und glykolytische Flussmittel entfällt fast in retinalen Explantaten mit überschüssigen molaren Verhältnis von 2-DG (Abbildung 2). Da ATP dient, Membranpotential vom Depolarisation Ereignisse in der angepassten Netzhaut auftreten zu regenerieren, sollen Tiere fehlen transducin verbrauchen mehr Energie als WT-Pendants. Allerdings wurden in Explantaten, Unterschiede in der Netzhaut Energiestoffwechsel zwischen Gnat1- /- und Steuerelemente nicht in die hier beschriebenen Experimente (Abbildung 2 und 3) gesehen. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit denen, die mit einem benutzerdefinierten Perfusions-Apparat zu OCR in Gnat1- / - Tiere18messen. Insbesondere der benutzerdefinierten Apparat von Du verwendet und Kollegen für die Messung von OCR Licht angepasst und dunklen angepasste Bedingungen erlaubt. Auf diese Weise wird eine kleine, aber bedeutende Verringerung OCR nach Belichtung in Wildtyp Netzhaut, aber nicht in Gnat1- / - Netzhaut18erkannt. Dies zeigt eine große Einschränkung der aktuellen Technik bei der Messung der ECAR und OCR in explantierten Netzhaut - der extrazellulären Flux-Analyzer verwendet hier stützt sich auf sichtbare leichte Erregung des Fluorophore eingebettet in seinen Sauerstoff und pH Sensoren, Beseitigung der Möglichkeit der Durchführung von Messungen in angepassten Geweben. Solche Messungen sind äußerst relevant für visuelle Physiologie und benötigen weiterhin die Verwendung von älteren Techniken, die ausschließlich für die Untersuchung der Netzhaut Stoffwechsel.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir danken Dr. Alexander Kolesnikov und Dr. Vladimir Kefalov für die Bereitstellung von Gnat1/ -Mäuse, für hilfreiches Feedback und Beratung, und das Manuskript zu lesen.
Diese Arbeit wurde unterstützt von NIH EY025269 (RR), der Diabetes Research Center an der Washington University - NIH DK020579 (JRM und RR), ein Career Development Award von der Forschung zu verhindern, dass Blindheit (RR), der Horncrest Stiftung (RR), ein Career Development Award von JDRF ( JRM), NIH DK101392 (CFS), DK020579 (CFS), DK056341 (CFS) und DK114233 (JRM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Seahorse XF24 Extracellular Flux Analyzer | Agilent, Santa Clara, CA | ||
| Seahorse XF24 Islet Capture FluxPak (includes: Islet Capture Microplate, Sensor Cartridge and Calibrant Solution) | Agilent, Santa Clara, CA | 101174-100 | Includes islet capture microplate, sensor cartridge and calibrant solution |
| RPMI 1640 Media (Powdered medium) | Millipore-Sigma | R1383 | RPMI 1640 Media with L-Glutamine and without glucose or sodium bicarbonate |
| D-Glucose | Millipore-Sigma | G8270 | 1M D-Glucose filtered, for media preparation |
| Sodium pyruvate | Corning | 25000CI | 100 mM sodium pyruvate |
| Antimycin-A | Millipore-Sigma | A8674 | Mitochondrial stress protocol component |
| FCCP | Millipore-Sigma | C2920 | Mitochondrial stress protocol component |
| Rotenone | Millipore-Sigma | R8875 | Mitochondrial stress protocol component |
| 2-deoxyglucose | Millipore-Sigma | D6134 | Glycolysis protocol component |
| 1 mm skin biopsy punches with plunger | Integra-Miltex | 33-31AA-P/25 | Explanting retinal tissue tool |
| Dumont Mini-Forceps Straight | Fine Science Tools | 11200-10 | Explanting retinal tissue tool |
| Dumont Medical #5/45 Forceps- Angled 45 degrees | Fine Science Tools | 11253-25 | Explanting retinal tissue tool |
| Dumont #7 Forceps - Curved | Fine Science Tools | 11271-30 | Explanting retinal tissue tool |
| Quant-iT Picogreen dsDNA Assay Kit | Fisher Scientific | P7589 | Loading normalization assay |
| Trizma base (Tris base) | Millipore-Sigma | T6066 | Component of lysis buffer |
| Triton X-100 (polyethylene glycol tert-octylphenyl ether) | Millipore-Sigma | X100 | Component of lysis buffer |
| 0.5M EDTA pH 8.0 | Ambion | AM9262 | Component of lysis buffer |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratories | Strain 000664 | Animals |
| Gnat1-/- and background-matched Gnat1+/+ | Vladimir Kefalov, PhD; Washington University School of Medicine | Animals |
References
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