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Biology

Extracellular फ्लक्स विश्लेषण का उपयोग Explanted रेटिना ऊतक में ऊर्जा चयापचय का मापन

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58626
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 3, 1, 3
1Division of Metabolism, Endocrinology and Lipid Research, Department of Medicine, Washington University School of Medicine, 2Department of Biomedical Engineering, Washington University in Saint Louis, 3Department of Ophthalmology and Visual Science, Washington University School of Medicine

Summary

इस तकनीक का वर्णन वास्तविक समय ऑक्सीजन की खपत और एक extracellular फ्लक्स विश्लेषक का उपयोग explanted माउस रेटिना ऊतकों में extracellular अंलीकरण दरों की रिकॉर्डिंग ।

Abstract

उच्च तीक्ष्णता दृष्टि एक भारी ऊर्जा लेने वाली प्रक्रिया है, और रेटिना कई अद्वितीय रूपांतरों के लिए ठीक ऐसी मांगों को पूरा करते हुए दृश्य धुरी की पारदर्शिता बनाए रखने विकसित की है । इस नाजुक संतुलन के लिए Perturbations, जैसे मधुमेह रेटिनोपैथी के रूप में अंधा कर रही बीमारियों । इसलिए, रोग के दौरान रेटिना में ऊर्जा चयापचय परिवर्तन की समझ vison हानि के विभिन्न कारणों के लिए तर्कसंगत चिकित्सा के विकास के लिए आवश्यक है. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध extracellular फ्लक्स विश्लेषक के हाल के आगमन रेटिना ऊर्जा चयापचय का अध्ययन अधिक सुलभ बना दिया है । इस प्रोटोकॉल का वर्णन इस तरह के एक विश्लेषक के उपयोग के लिए अपने दो सिद्धांत हथियारों के माध्यम से रेटिना ऊर्जा की आपूर्ति के लिए योगदान उपाय-ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण और glycolysis-ऑक्सीजन की खपत दर (ओसीआर) और extracellular में परिवर्तन को बढ़ाता है अंलीकरण दरों (ीकार) के रूप में इन रास्ते के लिए परदे के बाहर । इस तकनीक को आसानी से explanted रेटिना ऊतक में किया जाता है, एक ही प्रयोग में कई औषधीय एजेंटों के लिए प्रतिक्रियाओं का आकलन की सुविधा । जानवरों से रेटिना में चयापचय हस्ताक्षर की कमी रॉड photoreceptor संकेतन जंगली प्रकार इस पद्धति का उपयोग कर नियंत्रण की तुलना में कर रहे हैं. इस तकनीक में एक प्रमुख सीमा के बीच भेदभाव करने की क्षमता की कमी है प्रकाश अनुकूलित और अंधेरे अनुकूलित ऊर्जा उपयोग, रेटिना ऊतक में एक महत्वपूर्ण शारीरिक विचार ।

Introduction

रेटिना केंद्रीय तंत्रिका तंत्र1में सबसे अधिक ऊर्जा की मांग ऊतकों के बीच है । सबसे ऊतकों की तरह, यह cytosol में glycolysis के माध्यम से या ऑक्सीडेटिव में फास्फारिलीकरण mitochondria के माध्यम से adenosine ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) उत्पंन करता है । glycolysis से अधिक ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण के ऊर्जावान लाभ ग्लूकोज का एक अणु से एटीपी का उत्पादन करने के लिए स्पष्ट है: एटीपी के ३६ अणुओं पूर्व बनाम 2 के बाद से उत्पंन के अणुओं से उत्पंन । तदनुसार, रेटिना ंयूरॉंस मुख्य रूप से ऊर्जा की आपूर्ति के लिए mitochondrial श्वसन पर निर्भर है और यह उनके2mitochondria के उच्च घनत्व से परिलक्षित होता है । हालांकि, रेटिना भी ऑक्सीजन प्रचुर मात्रा में है जब भी glycolytic मशीनरी पर भारी निर्भर करता है । एरोबिक glycolysis की यह प्रक्रिया मूल ओटो Warburg द्वारा कैंसर की कोशिकाओं में वर्णित किया गया था3, जो एक बार ध्यान दिया है कि रेटिना केवल पोस्ट mitotic चयापचय4के इस रूप में सक्षम ऊतक था । उन प्रारंभिक टिप्पणियों के बाद से, कई पोस्ट mitotic ऊतकों को ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण के अलावा glycolysis की डिग्री अलग में संलग्न करने के लिए अपने एटीपी मांगों को पूरा करने के लिए वर्णित किया गया है ।

Phototransduction, दृश्य वर्णक रीसाइक्लिंग, photoreceptor बाहरी क्षेत्रों का संश्लेषण, और synaptic गतिविधि photoreceptors में सभी ऊर्जा की मांग प्रक्रियाओं, रेटिना में प्रमुख ंयूरॉन उपवर्ग हैं । लेकिन सक्रिय रूप से उनके बिजली और एकाग्रता ढाल के खिलाफ आयनों परिवहन की जरूरत है द्वारा अब तक सबसे अधिक ऊर्जावान लेने वाली प्रक्रिया ंयूरॉंस में1। Photoreceptors अर्थ में अजीब ंयूरॉंस रहे है कि वे उत्तेजना के अभाव में विनाशक है (यानी, अंधेरे में), जबकि एक प्रकाश उत्तेजना चैनल बंद करने और बाद में hyperpolarization से चलाता है । इसलिए, अंधेरे में, रेटिना एटीपी की बड़ी मात्रा में अपने ध्रुवीकरण या "डार्क वर्तमान" के रूप में इसे आमतौर पर कहा जाता है बनाए रखने के लिए भस्म हो जाती है । एक अनुकूली दृष्टिकोण से, एटीपी के इन विशाल मात्रा की आपूर्ति में एक प्रमुख चुनौती जीवों के लिए की जरूरत है ऑप्टिकल धुरी के माध्यम से दृश्य स्पष्टता बनाए रखने के लिए है । यह घने केशिका नेटवर्क प्रकाश के पथ से दूर photoreceptors की आपूर्ति रहता है के रूप में, आधुनिक प्राणियों में देखा उल्टे रेटिना वास्तुकला प्रमुख समाधान है । लेकिन प्राकृतिक इंजीनियरिंग के इस चमत्कार चयापचय आरक्षित के मामले में एक करारा में रेटिना स्थानों । रेटिना के लिए भी छोटे अपमान संभावित मांग करने के लिए ऊर्जा की आपूर्ति के नाजुक संतुलन को बाधित कर सकते हैं, और दृश्य रोग या फ्रैंक अंधापन जल्दी से पीछा करना पड़ सकता है ।

तंत्रिका रेटिना की अनूठी ऊर्जावान मांगों को देखते हुए, संवहनी आपूर्ति के अपने तंग प्रतिबंध के साथ युग्मित, रेटिना में एटीपी खपत की सटीक माप और रोग के दौरान अपने परिवर्तन समझ और इलाज में गहरा प्रभाव हो सकता है कंकरीट की स्थितियां जैसे रेटनाइटिस pigmentosa और डायबिटिक रेटिनोपैथी । परंपरागत रूप से, इन माप महंगा, कस्टम-सबसे प्रयोगशालाओं की एक मुट्ठी भर से उभरती हुई अध्ययन के साथ उपकरण तैयार पूरी तरह से चयापचय गतिविधि की माप के लिए समर्पित2,5,6, 7,8. तकनीक विशिष्ट चयापचयों के लिए व्यक्तिगत परख शामिल हैं, अनुरेखक रेडियो का उपयोग अध्ययन-लेबल वाले पुरोगामी, ऑक्सीजन की खपत क्लार्क इलेक्ट्रोड का उपयोग रिकॉर्डिंग, और metabolomic9profiling.

उच्च प्रवाह प्रौद्योगिकी और वाणिज्यिक उपकरणों की वृद्धि की उपलब्धता में प्रगति के साथ, रेटिना चयापचय रिकॉर्ड करने के लिए तकनीक तेजी से सुलभ और सस्ती कर रहे हैं. विधि यहां वर्णित दोनों ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण और glycolysis रेटिना में explanted ऊतक और एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध extracellular फ्लक्स विश्लेषक9,10,11,12का उपयोग करने के उपाय । इस विश्लेषक अलग ऑक्सीजन खपत दर (ओसीआर) और extracellular अंलीकरण दर (ीकार), ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण और glycolysis, क्रमशः13के अप्रत्यक्ष संकेतकों के रूप में सेवारत रिकॉर्ड । ये माप एक microchamber के भीतर एक जांच submersed द्वारा किया जाता है ब्याज की ऊतक पर बनाया । पहले से प्रकाशित तरीकों का यह अनुकूलन एक कब्जा प्लेट मूलतः आइलेट्स के अग्नाशय के टाप के लिए डिजाइन करने के लिए छोटे, माउस रेटिना के परिपत्र वर्गों में चयापचय गतिविधि रिकॉर्ड का उपयोग करता है । कई औषधीय जोखिम ऊतक के लिए एक एकल रिकॉर्डिंग के दौरान वितरित किया जा सकता है क्योंकि प्रणाली में प्रत्येक नमूने के लिए अच्छी तरह से 4 इंजेक्शन बंदरगाहों शामिल हैं । ीकार और ओसीआर रिकॉर्डिंग के लिए अनुकूलित अलग प्रोटोकॉल के साथ इस प्रणाली का उपयोग करना, जंगली प्रकार के रेटिना की प्रतिक्रियाओं transducin कमी रेटिना की तुलना में किया जा सकता है (Gnat1-/-), जन्मजात स्थिर रात अंधापन का एक कारण मनुष्य१४.

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Protocol

प्रोटोकॉल दृष्टि और पशुओं के उपयोग के लिए नेत्र विज्ञान वक्तव्य में अनुसंधान के लिए संघ का पीछा किया और वॉशिंगटन विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित थे ।

1. पशु तैयारी

  1. मानक आवास में 12 घंटे के अंधेरे के साथ पशुओं को 12 घंटे प्रकाश चक्र में रखें । circadian प्रभाव से बचने के लिए मानकीकृत समय में प्रयोग शुरू, आम तौर पर रोशनी चालू होने के बाद शीघ्र ही सुबह में.

2. समाधान तैयारी

  1. डबल-आसुत एच2ओ (ddH2हे) में पाउडर मीडिया के ८.४ मिलीग्राम भंग करके बेस मीडिया तैयार करें और 1 एल के एक अंतिम मात्रा के लिए या तो एचसीएल या NaOH के साथ पीएच समायोजित ७.४, एक ०.२२ µm ऊतक संस्कृति फिल्टर के साथ इस समाधान निष्फल ।
    1. 5 मिमी ग्लूकोज और 1 मिमी पाइरूवेट के अंतिम सांद्रता प्राप्त करने के लिए मीडिया के लिए 1 एम ग्लूकोज और १०० मिमी सोडियम पाइरूवेट जोड़ें ।
    2. एक ३७ डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में बेस मीडिया के ५० मिलीलीटर aliquot रखें ।
  2. तैयार lysis समाधान, प्रवाह विश्लेषण के अंत में ऊतक quantitation के लिए, 10 मिमी tris आधार जोड़कर, पॉलीथीन ग्लाइकोल tert-octylphenyl ईथर के लिए ०.२% (वी/वी), और EDTA को 1 मिमी, सभी ddH में2ओ. मिश्रण तक सभी घटकों को पूरी तरह से भंग और समायोजित ८.० के लिए पीएच ।
  3. mitochondrial तनाव प्रोटोकॉल के लिए, oligomycin, एक एटीपी सिंथेस अवरोध करनेवाला, बेस मीडिया में भंग के एक 11 µ एम शेयर तैयार करने के लिए अच्छी तरह से 1 µ मीटर की एक अंतिम एकाग्रता लक्ष्य । एक 11 carbonyl साइनाइड के µ एम शेयर तैयार-4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP), एक uncouplन एजेंट, बेस मीडिया में भंग करने के लिए अच्छी तरह से 1 µ मीटर की एक अंतिम एकाग्रता लक्ष्य । इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला अवरोधकों का एक कॉकटेल तैयार करें, रोटेनोन और antimycin एक (RAA) रोटेनोन जोड़कर 11 µ एम और antimycin एक करने के लिए 22 µ एम, बेस मीडिया में भंग 1 µ एम रोटेनोन और 2 µ एम antimycin के एक अंतिम एकाग्रता लक्ष्य को अच्छी तरह से ।
  4. glycolysis प्रोटोकॉल के लिए, बेस मीडिया में भंग ग्लूकोज की एक २२० मिमी शेयर तैयार, अच्छी तरह से 20 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता लक्ष्य. इसके अलावा 2-deoxyglucose (2-डीजी), ग्लूकोज और glycolytic विरोधी के एक प्रतियोगी अवरोधक, यह आधार मीडिया में भंग करके के १.१ मीटर शेयर तैयार करते हैं । यह अच्छी तरह से १०० मिमी 2-डीजी के एक अंतिम एकाग्रता लक्ष्य होगा ।

3. साधन अंशांकन

  1. एक extracellular फ्लक्स परख के लिए उपकरण जांचना, सेंसर कारतूस के प्रत्येक अच्छी तरह से अंशांकन समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ने (24 कुओं कुल) और एक सह2में ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन-मुफ्त मशीन रात भर (या कम 8 घंटे) ।
  2. mitochondrial तनाव प्रोटोकॉल या प्रत्येक इंजेक्टर बंदरगाह, एक के माध्यम से डी में glycolysis प्रोटोकॉल के लिए additives लोड, सेंसर कारतूस पर, अच्छी तरह से मात्रा में परिवर्तन के लिए समायोजन ।
    नोट: एक उदाहरण के रूप में, एक ठेठ परख एक additive के ४५ µ एल में शामिल होगा पहले इंजेक्टर बंदरगाह, ४९.५ µ एल में दूसरे, ५४.५ µ एल में तीसरे, और ६० µ l में पिछले, संभालने के एक प्रारंभिक अच्छी मात्रा में ४५० µ l
  3. पहले कई प्रयोगों के दौरान, पोर्ट में लोड बेस मीडिया एक बंदरगाह इंजेक्शन के बाद कितना ऊतक आंदोलन/
  4. एक गैर में ३७ ° c में मशीन के लिए भरी हुई सेंसर प्लेट की अनुमति दें-CO2 मशीन में कम से ६० मिनट के लिए ।

4. ताजा माउस रेटिना ऊतक के अलगाव

नोट: यह कदम डॉ बैरी विंकलर15की तकनीक से अनुकूलित है ।

  1. गहरी संज्ञाहरण के प्रशासन के बाद एक मानक ketamine/xylazine कॉकटेल का उपयोग कर, euthanize चूहों ग्रीवा विस्थापन द्वारा ।
  2. मध्यम आकार घुमावदार संदंश की एक जोड़ी का प्रयोग करने के लिए ऑप्टिक तंत्रिका पर पीछे ग्लोब समझ और धीरे आगे लागू करने के लिए आंख proptose (1a आंकड़ा) दबाव ।
    1. एक साफ उस्तरा ब्लेड के साथ, एक limbus बनाने के लिए कॉर्निया भर में limbus चीरा एक एकल, ब्लेड के जानबूझकर पारित का उपयोग कर ।
    2. ठीक का उपयोग करना, angled McPherson शैली संदंश, पीछे ग्लोब चुटकी लेंस और corneal चीरा से बाहर पूर्वकाल hyaloid झिल्ली व्यक्त करते हैं । इन ऊतकों को त्यागें ।
    3. तंत्रिका रेटिना को व्यक्त करने के लिए संदंश के साथ चुटकी पैंतरेबाज़ी दोहराएँ.
    4. एक चंमच की तरह संदंश का उपयोग करने के लिए रेटिना उठा, बजाय ऊतक समझ के लिए, corneal चीरा से दूर रेटिना हस्तांतरण और एक 3 सेमी डिश या एक 6 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति क्लस्टर प्लेट में गर्म मीडिया में सीधे जगह ।
  3. का प्रयोग करें दो जोड़े ठीक, angled McPherson शैली संदंश को धीरे काटना शेष अवलेह से रेटिना । यह सबसे अच्छा रेटिना कप की परिधि में अवलेह लोभी द्वारा किया जाता है और केंद्र की ओर खींच, एक पूरे के रूप में केंद्र से अवलेह शरीर के एक अंतिम विनिवेश के साथ. संदंश का उपयोग करना, रेटिना की photoreceptor सतह से किसी भी अवशिष्ट रेटिना वर्णक उपकला को हटा दें.
    1. एक उस्तरा ब्लेड के साथ एक P1000 प्लास्टिक टिप में कटौती के लिए एक ~ 4 स्थानांतरण युद्धाभ्यास के दौरान नाजुक रेटिना ऊतक को अनुचित आघात को रोकने के लिए खोलने मिमी बनाने के लिए ।
    2. एक कट P1000 प्लास्टिक टिप का उपयोग कर ताजा मीडिया में अलग रेटिना ऊतक स्थानांतरण.
    3. कट 1 मिमी एक 1 मिमी बायोप्सी के साथ ऑप्टिक तंत्रिका के आसपास रेटिना के घूंसे घूंसे एक गोताख़ोर के साथ सुसज्जित करने के मामले में यह बोर (आंकड़ा 1b) में दर्ज हो जाता है । एक ३७ डिग्री सेल्सियस ब्लॉक या हीटिंग पैड पर रखा साफ मीडिया में एक तरफ रेटिना घूंसे सेट.

5. परख प्रोटोकॉल

  1. एक 24-अच्छी तरह से टाप कैप्चर microplate का उपयोग कर एक कट P1000 टिप, aspirating ४५० µ एल के साथ मीडिया के ऊतक के साथ व्यक्तिगत घूंसे स्थानांतरण ।
  2. ठीक का प्रयोग करें, सीधे संदंश धीरे microplate के केंद्र में घूंसे हेरफेर करने के लिए । एक ही दिशा (जैसे, नाड़ीग्रंथि सेल साइड ऊपर की ओर) में घूंसे केंद्रित रखें ।
    1. एक हीटिंग पैड पर कब्जा थाली आराम या ३७ ° c के लिए सेट हीटिंग ब्लॉक के रूप में इन चरणों शेष नमूनों के लिए दोहराया जाता है ।
      नोट: प्रत्येक प्रयोग के लिए, आधार मीडिया के ४५० µ एल के साथ अलग 3-4 खाली कुओं सेट करने के लिए नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा करते हैं । शेष 20-21 कुओं में, प्रत्येक परीक्षण जीवविज्ञान दोहराने में तपसिल । इसलिए, प्रत्येक 24 अच्छी तरह से प्लेट 6-7 विभिन्न जानवरों या उपचार की स्थिति से रिकॉर्डिंग के लिए अनुमति देगा ।
  3. हवा के बुलबुले से बचना, धीरे से प्रत्येक अच्छी तरह से संदंश का उपयोग कर में टाप कैप्चर मेष आवेषण की स्थिति और एक धातु गोताख़ोर, या एक कट P1000 प्लास्टिक टिप (चित्रा 1C) के साथ आवेषण सुरक्षित ।
    नोट: नमूना microchamber के केंद्र के भीतर रेटिना पंच स्थिति बनाए रखने के लिए इस कदम के दौरान अत्यधिक ऊतक आंदोलन से बचें । एयर बुलबुले गंभीर रूप से ओसीआर रीडिंग को विकृत । हालांकि microchamber पर्याप्त गहराई ठेठ माउस रेटिना को समायोजित करने के लिए है (चित्रा 1C), कभी कभार मशीनिंग-जाल आवेषण में दोषों के कारण ऊतकों को पीढ़ी स्क्रीन प्रविष्टि के दौरान संकुचित हो सकता है । यदि ऐसा होता है, बस कुचल ऊतक के एक नोट बनाने के लिए और अंतिम विश्लेषण से उस नमूने को बाहर ।
  4. एक ३७ डिग्री सेल्सियस सह2में ऊतक थाली-मुक्त मशीन कम से ६० मिनट के लिए मशीन ।
  5. कार्यक्रम extracellular फ्लक्स मिश्रण, रुको, उपाय, और दोहराने आज्ञाओं का उपयोग कर विश्लेषक । एक उदाहरण के रूप में, रेटिना ऊतक के साथ एक ठेठ प्रयोग में निम्नलिखित शामिल हो सकते हैं: 2 मिनट, 2 मिनट रुको, और 5 मिनट उपाय. एक आधारभूत रिकॉर्डिंग के लिए 5-8 बार (चक्र) के बीच इन तीन चरणों के साथ प्रयोग को दोहराएँ, और चलाने के दौरान परीक्षण किया जा रहा प्रत्येक यौगिक के इंजेक्शन के बाद.
  6. extracellular फ्लक्स विश्लेषक पर कार्यक्रम प्रारंभ बटन दबाएँ और अंशांकन के लिए सेंसर कारतूस डालने के लिए स्क्रीन पर निर्देशों का पालन करें.
  7. अंशांकन के अंत में, रेटिना के नमूनों वाली प्लेट के साथ calibrant प्लेट को प्रतिस्थापित करने के लिए स्क्रीन पर दिए गए निर्देशों का पालन करें ।
  8. प्रोग्राम को चलाने के लिए अनुमति दें, के रूप में क्रमादेशित । चलाने के पूरा होने पर, टिशू प्लेट बाहर निकालने के लिए स्क्रीन पर निर्देशों का पालन करें । चलाएं के परिणाम देखें और डेटा फ़ाइल संग्रहीत करें ।
  9. एक तुला 20 गेज सुई और संदंश के साथ, कुओं से सभी जाल आवेषण निकालें, पीछे रेटिना पंच छोड़ने.
  10. ध्यान से ऊतक से मीडिया महाप्राण और दो बार ठंडा फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) के ०.५ मिलीलीटर के साथ ऊतक धोने । पंजाबियों को धोने के बाद महाप्राण ।
  11. एक अच्छी तरह से lysis बफर के १०० µ एल जोड़ें और ऊपर और homogenize ऊतक के लिए नीचे प्लास्टिक ।
  12. कुल दोहरे-असहाय डीएनए (dsDNA) या कुल प्रोटीन सामग्री के आधार पर Quantitate इनपुट स्तर ।
    नोट: निंनलिखित एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध dsDNA परख पर आधारित है ।
  13. पतला लीजड ड नमूने 1:1 के १०० µ l जोड़कर Tris-EDTA (TE) बफर और एक ९६ अच्छी तरह से प्लेट करने के लिए पतला नमूना के १०० µ एल स्थानांतरण.
    1. एक अच्छी तरह से खोज बफर के १०० µ एल जोड़ें । 2-5 मिनट के लिए मिश्रण के बाद, quantitate ४८० एनएम और उत्सर्जन ५२० एनएम पर उत्तेजना के बाद प्रतिदीप्ति, एक मानक वक्र की तुलना ।
    2. सामांय extracellular फ्लक्स के भीतर डीएनए सामग्री के लिए अनुरेखण अच्छी तरह से ।
      नोट: यहां प्रस्तुत परिणामों में, नमूनों ५० एनजी dsDNA-एक ठेठ राशि में एक 1 mm रेटिना पंच के लिए सामान्यीकृत हैं । इसलिए, निरपेक्ष मान यहाँ प्रस्तुत अध्ययन डेटा "प्रति रेटिना पंच" पेश करने के लिए तुलना की जा सकती है । एक आंतरिक मानक के लिए tracings को सामान्य, जैसे 5 मिमी ग्लूकोज एकाग्रता पर चलाने के आधार रेखा ।

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Representative Results

वर्णित तकनीकों का उपयोग करना ( चित्रा 1में संक्षेप), 8 सप्ताह से रेटिना explants-पुराने जंगली प्रकार (WT) चूहों की तुलना में थे उम्र-और पृष्ठभूमि मिलान transducin नल चूहों (Gnat1-/ क्योंकि Gnat1-/ जानवरों की कमी के लिए मशीनरी चक्रीय-न्यूक्लियोटाइड gated आयन चैनलों को बंद करने के लिए प्रकाश उत्तेजनाओं के जवाब में, उनकी रॉड photoreceptors भी प्रकाश14में ध्रुवीकरण रहते हैं । बाद में पोटेशियम समाप्ति बनाए रखने की जरूरत है एक बड़े एटीपी मांग पैदा होता है, जो ऊर्जावान तनाव में जिसके परिणामस्वरूप । यदि ऊर्जा की मांग में इस तरह की पाली ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण या glycolytic फ्लक्स, जंगली प्रकार चूहों और Gnat1-/- चूहों से ऊतकों में वृद्धि होगी निर्धारित करने के लिए extracellular फ्लक्स विश्लेषक का उपयोग तुलना में थे । बेसलाइन पर, 5 मिमी ग्लूकोज और 1 मिमी पाइरूवेट की उपस्थिति में, जंगली प्रकार के जानवरों से रेटिना के ऊतकों Gnat1-/ म्यूटेंट की तुलना में एसिड समाप्ति की इसी तरह की दर है । इसी तरह के पैटर्न 20 मिमी ग्लूकोज और glycolytic अवरोधक 2-डीजी (चित्रा 2a) के अलावा के बाद देखा जाता है । इन आंकड़ों को भी गणितीय आधारभूत (चित्रा बी), एक प्रारूप है जो विभिंन प्रायोगिक उपायों के बीच बेहतर तुलना के लिए अनुमति दे सकता है से भिंन परिवर्तन का प्रतिनिधित्व बदल सकता है ।

आधारभूत पर निरपेक्ष ओसीआर WT और उत्परिवर्ती रेटिना ऊतक (3 ए आंकड़ा) के बीच बराबर है । 20 मिमी ग्लूकोज के अलावा mitochondrial श्वसन बढ़ जाती है, लेकिन कोई परिवर्तन निरपेक्ष ठहराव के संदर्भ में समूहों के बीच या आधारभूत (चित्र बी) से परिवर्तन के संदर्भ में मनाया जाता है. 1mM FCCP (एक uncouplन एजेंट) के अलावा अधिक से अधिक mitochondrial श्वसन दर प्रदर्शित करने के लिए काफी WT या Gnat1में उच्च ग्लूकोज के साथ देखा स्तर के ऊपर ओसीआर वृद्धि नहीं करता है-/ हालांकि, दोनों चूहों से संकेत काफी RAA कॉकटेल के अलावा के बाद ड्रॉप ।

आदर्श रूप में, extracellular फ्लक्स प्रयोगों प्रोटॉन रिसाव के स्रोतों की पहचान में एटीपी सिंथेस अवरोधक oligomycin सहायता की उपस्थिति में चलाने के लिए, होने वाली जब इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला के माध्यम से आंदोलन एटीपी उत्पादन16के साथ संबद्ध नहीं है. 8 सप्ताह पुराने C57BL/6J चूहों से रेटिना explants में, oligomycin उपचार मजबूती से ओसीआर कम करती है, के रूप में की उंमीद (4 चित्रा) । लेकिन FCCP के बाद इसके अलावा, अधिक से अधिक ओसीआर खोजने के लिए, केवल नाममात्र आधारभूत के बारे में ६०% करने के लिए ओसीआर बढ़ जाती है, एक पूर्व अध्ययन11के अनुरूप ।

XF24 विश्लेषक पनडुब्बी जांच का उपयोग करता है कि ऊतक के भीतर एक तंग सील करना अच्छी तरह से, ऑक्सीजन और एसिड प्रवाह की माप के लिए एक क्षणिक microenvironment बनाने । अच्छी तरह से प्लेट में रेटिना ऊतक की स्थिति (सेंसर के संबंध में) संभवतः ओसीआर रिकॉर्डिंग को प्रभावित कर सकता है, और अवांछित संस्थापकों के लिए नेतृत्व, और कुछ reserachers के साथ ऑक्सीजन संवेदक के नीचे रेटिना ऊतक सीधे रखने की वकालत की है photoreceptor बाहरी खंडों संवेदक11की ओर उंमुख । C57BL/6J चूहों (8 सप्ताह पुराना) से ओसीआर माप, ऊतकों पर रेटिना ऊतक की स्थिति के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए दो झुकाव में विश्लेषण किया गया: रेटिना नाड़ीग्रंथि कोशिकाओं पर नीचे का सामना करना पड़ (यानी, photoreceptors रखा ऊपर के ऊपर ऊपर सेंसर ) या सेंसर की ओर का सामना करना पड़. FCCP या RAA के जवाब में सापेक्ष ओसीआर में कोई अंतर नहीं देखा गया, या तो अभिविंयास (आंकड़ा 5) में अधिक से अधिक और ंयूनतम mitochondrial श्वसन दर के लिए बराबर संवेदनशीलता का संकेत है । इसके अलावा, निरपेक्ष ओसीआर मापन भी या तो अभिविंयास (चित्रा 5B) में रेटिना के ऊतकों के बीच समकक्ष थे ।

Figure 1
चित्रा 1 : extracellular फ्लक्स विश्लेषक में रेटिना explant और सेटअप का अलगाव । A. संदंश के साथ ग्लोब पर आवेगी बल लागू करके सीटू में तंत्रिका रेटिना का अलगाव, कॉर्निया incising, और लेंस और पूर्वकाल hyaloid झिल्ली को खारिज करने के बाद रेटिना को हटाने । B. प्रवाह के लिए ऊतक की तैयारी रेटिना पंच निर्माण के साथ रिकॉर्डिंग, टाप कैप्चर microplate में व्यक्तिगत घूंसे की नियुक्ति, और microchambers के साथ ऊतक आंदोलन को कम करने के लिए एक जाल डालने का उपयोग (स्केल बार्स = 1 मिमी). C. एक योजनाबद्ध, निर्माता-प्रदान डेटा से व्युत्पंन, प्रक्रिया रूपरेखा दिखाने और microchamber की ऊंचाई का प्रदर्शन murine रेटिना को समायोजित करने के लिए पर्याप्त है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । 

Figure 2
चित्रा 2 : Mitochondrial तनाव 8 सप्ताह पुराने जानवरों से explanted रेटिना का उपयोग कर विश्लेषण । माप की मानक त्रुटि (SEM) के साथ एक औसत अनुरेखण, ऊतक के डीएनए सामग्री के लिए सामान्यीकृत, एक प्रयोग ऑक्सीजन की खपत रिकॉर्डिंग के लिए अनुकूलित से, transducin पीटा जानवरों की तुलना (Gnat1-/ जंगली प्रकार नियंत्रण । B. डेटा के साथ एक ही प्रयोग परिवर्तित ऐसी है कि आधारभूत रिकॉर्डिंग संदर्भ के रूप में सेट कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : 8 सप्ताह पुराने जानवरों से explanted रेटिना का उपयोग कर glycolytic दर का विश्लेषण । A. औसत, डीएनए सामग्री-सामान्यीकृत, एक प्रयोग से अनुरेखण एसिड समाप्ति रिकॉर्डिंग के लिए अनुकूलित transducin नॉकआउट जानवरों की तुलना (Gnat1-/-) जंगली प्रकार के नियंत्रण के लिए । B. एक ही प्रयोग से डेटा आधारभूत रिकॉर्डिंग के लिए सामान्यीकृत । निशान शो मतलब ± SEM इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें कृपया ।

Figure 4
चित्र 4 : रेटिना श्वसन दर पर oligomycin के अपरिवर्तनीय प्रभाव. 8 सप्ताह पुराने C57BL/6J चूहों से तीव्र रूप से तैयार रेटिना explants में oligomycin उपचार FCCP के बाद के अलावा द्वारा प्रेरित अधिक से अधिक ओसीआर कम कर देता है । निशान शो मतलब ± SEM इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें कृपया ।

Figure 5
चित्रा 5 : ओसीआर माप पर ऊतक स्थिति के प्रभाव । 8 सप्ताह पुराने C57BL/6J चूहों से रेटिना के ऊतकों को नाड़ीग्रंथि कोशिकाओं संवेदक (नाड़ीग्रंथि कोशिकाओं ऊपर) की ओर या सेंसर (नाड़ीग्रंथि कोशिकाओं को नीचे) से दूर का सामना करना पड़ के साथ कुओं में रखा गया था । समूहों के बीच, समान extracellular फ्लक्स रिकॉर्डिंग (क) आधारभूत के सापेक्ष श्वसन क्षमता के संदर्भ में या (ख) निरपेक्ष ठहराव के संदर्भ में मनाया जाता है. निशान शो मतलब ± SEM इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें कृपया ।

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Discussion

ओसीआर और ीकार आसानी से explanted रेटिना में मापा जाता है तकनीक का उपयोग कर एक प्रतिविश्लेषक का उपयोग कर । इस विधि के कई महत्वपूर्ण चरणों में अंय समूहों के उन से प्रस्थान । रेटिना के ऊतकों ग्लोब enucleating बिना एक बड़े corneal चीरा के माध्यम से अलग कर रहे हैं, मूल रूप से विंकलर15द्वारा वर्णित के रूप में. रेटिना अलगाव की इस विधि ऊतक पर कब्जा थाली में रहने वाले आंख से एक तेजी से हस्तांतरण के लिए अनुमति देता है (अक्सर 5 मिनट के भीतर). ऊतकों ३७ डिग्री सेल्सियस पर प्रक्रिया में रखा जाता है, जो सेलुलर संवेदनाएं बरकरार रखता है जब वे बर्फ पर रखा जाता है की तुलना में बेहतर है । न्यूनतम additives के साथ मीडिया प्रारंभिक माप के लिए उपयोग किया जाता है, इस तरह के HEPES या सोडियम बिकारबोनिट, सीरम, या अतिरिक्त macronutrients के रूप में किसी भी बफ़रिंग एजेंटों को छोड़, के रूप में यह बेसल ऊर्जा चयापचय के अधिक विश्वसनीय माप के लिए अनुमति देता है और बाधित नहीं करता है ीकार का आंकलन । रेटिना घूंसे सबसे अच्छा एक 24 अच्छी तरह से प्रारूप में दर्ज कर रहे हैं, बजाय ९६-कुओं में, ऊतक को आघात को कम करने के लिए. रेटिना ऊतक अच्छी तरह के केंद्र में रखा गया है, ऊतक microchamber के भीतर, और एक जाल डालने के साथ सुरक्षित. ऐसा करने से ीकार और ओसीआर के सटीक रिकॉर्डिंग के लिए अनुमति देता है, जबकि चलाने के दौरान अत्यधिक ऊतक आंदोलन को रोकने, और ऊतक चिपकने वाले के रूप में अन्य रिएजेंट के लिए की जरूरत को समाप्त. चलाने के दौरान एक वाहन इंजेक्शन की सिफारिश की है, खासकर जब पहली बार के लिए रिकॉर्डिंग प्रयोगों की स्थापना, के रूप में यह कितनी अच्छी तरह ऊतक कैप्चर प्लेट के भीतर सुरक्षित है की भावना प्रदान करेगा । इस तकनीक का उपयोग ओसीआर रिकॉर्डिंग अच्छी तरह से के भीतर रेटिना अभिविन्यास के स्वतंत्र हैं, लेकिन अभिविन्यास प्रयोगों के भीतर नमूनों के बीच लगातार रखा जाना चाहिए. सभी माप के बाद ही लिया जाता है रेटिना चयापचय स्थिर स्थिति परीक्षण यौगिकों के बाद इंजेक्शन तक पहुँच गया है.

यह प्रोटोकॉल, कक्ष संख्या के लिए प्रॉक्सी के रूप में कुल डीएनए सामग्री के डेटा के सामान्यीकरण का वर्णन करता है. इस तरह के एक तकनीक लाभप्रद है क्योंकि यह सेल रेटिना मोटाई में भिंनता, पंच आकार, या आनुवंशिक रूप से भिंन नमूनों के बीच सेलुलर में अंतर से प्रेरित संख्या में परिवर्तन के लिए खाते में होगा । कुल प्रोटीन आधारित सामान्यीकरण भी एक विश्वसनीय तरीका है, और रेटिना नमूनों के बीच कुल mitochondrial मास में अंतर को कम करने का लाभ है. हालांकि, पूरे ऊतक में प्रोटीन सामग्री पर आधारित सामान्यता नमूनों के बीच extracellular मैट्रिक्स में परिवर्तन द्वारा पाया जा सकता है. आधार रेखा के लिए फ्लक्स रिकॉर्डिंग का सामान्य, प्रतिनिधि परिणामों में दिखाया गया है, क्योंकि यह प्रतिकृति के बीच रेटिना पंच आकार में परिवर्तनशीलता को कम करता है और आसानी से औषधीय हस्तक्षेप के कारण परिवर्तन की व्याख्या की अनुमति देता है लाभप्रद है । हालांकि, कच्चे मूल्यों की रिपोर्टिंग विभिन्न प्रयोगों के बीच बेहतर तुलना के लिए और विभिन्न प्रवाह रिकॉर्डिंग तरीकों का उपयोग किया प्रयोगों के लिए अनुमति देता है.

इन तकनीकों का उपयोग कर परिणाम कहीं और सूचना उन लोगों के लिए तुलनीय हैं । हालांकि oligomycin-एक एटीपी सिंथेस अवरोध करनेवाला-आम तौर पर ऊतकों या ब्याज की कोशिकाओं के भीतर प्रोटॉन रिसाव को मापने के लिए प्रयोग किया जाता है, इस परिसर रेटिना चयापचय पर प्रभाव की अप्रिय है । प्रयोगों में यहां की रिपोर्ट, अधिक से अधिक रेटिना FCCP द्वारा बटोरा ओसीआर में ६०% कमी oligomycin के लिए जोखिम के बाद मनाया जाता है (चित्रा 4), लगभग एक पिछले अध्ययन करने के लिए समान11. इस खोज के लिए एक संभावित विवरण अपरिवर्तनीय क्षति या एटीपी सिंथेस निषेध द्वारा रेटिना mitochondria के लिए संशोधन है । इसके अलावा, के रूप में Kooragayala और सहकर्मियों पहले11की सूचना, रेटिना mitochondria की संभावना एक इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला uncouplन एजेंट, FCCP के बाद से बेसल शर्तों में निकट अधिकतम दरों पर काम कर रहे हैं, केवल के बारे में 15% द्वारा ओसीआर बढ़ता है (चित्रा 3 , चित्रा 5).

explanted रेटिना के ऊतकों में Extracellular फ्लक्स रिकॉर्डिंग एक बड़े आरक्षित glycolytic क्षमता का प्रदर्शन, 20 मिमी ग्लूकोज के अलावा ीकार (चित्रा 2) में एक दो गुना वृद्धि बटोरने के बाद से. क्योंकि oligomycin, आमतौर पर अधिक से अधिक glycolytic क्षमता गेज करने के लिए प्रयोग किया जाता है, रेटिना ऊतक में बचके प्रभाव है (चित्रा 4), रिकॉर्डिंग के लिए उच्च ग्लूकोज के उपयोग के रूप में बेहतर प्रॉक्सी रेटिना में glycolytic रिजर्व गेज करने के लिए सेवा कर सकते हैं. एक महत्वपूर्ण glycolytic दर के लिए एक शुद्ध प्रॉक्सी के रूप में ीकार के उपयोग को रोकने चेतावनी है कि2 सह साइट्रिक एसिड चक्र द्वारा मुक्त किया गया है एक महत्वपूर्ण स्रोत एसिड की संस्कृति में ऊतक17हो सकता है । अतिरिक्त पाइरूवेट उच्च ग्लूकोज द्वारा बटोरा स्तरों के ऊपर ीकार वृद्धि नहीं करता है, और glycolytic फ्लक्स लगभग 2-डीजी (चित्रा 2) के अतिरिक्त दाढ़ अनुपात का उपयोग कर रेटिना explants में समाप्त हो गया है. के बाद से एटीपी झिल्ली अंधेरे में ध्रुवीकरण की घटनाओं से उत्पंन होने वाली क्षमता को पुनर्जीवित करने के लिए प्रयोग किया जाता है-अनुकूलित रेटिना, transducin कमी पशुओं को WT समकक्षों से अधिक ऊर्जा व्यय की उंमीद कर रहे हैं । हालांकि, explants में, Gnat1-/- और नियंत्रण के बीच रेटिना ऊर्जा चयापचय में अंतर यहाँ वर्णित प्रयोगों में नहीं देखा गया (चित्रा 2 और 3). इन परिणामों के एक कस्टम छिड़काव तंत्र का उपयोग करने के लिए Gnat1में ओसीआर उपाय प्राप्त उन लोगों के साथसंगत कर रहे है/ विशेष रूप से, कस्टम ड्यू और सहकर्मियों द्वारा प्रयुक्त उपकरण के तहत ओसीआर की माप के लिए अनुमति दी प्रकाश-अनुकूलित और अंधेरे अनुकूलित शर्तों । ऐसा करके, प्रकाश जोखिम के बाद ओसीआर में एक छोटी लेकिन महत्वपूर्ण कमी जंगली प्रकार के रेटिना में पता चला है, लेकिन Gnat1में नहीं-/ यह explanted रेटिना में ीकार और ओसीआर को मापने में वर्तमान तकनीक का एक प्रमुख सीमा दिखाता है-यहां इस्तेमाल किया extracellular फ्लक्स विश्लेषक अपनी ऑक्सीजन और पीएच सेंसर में एंबेडेड fluorophores के दृश्य प्रकाश उत्तेजना पर निर्भर करता है, को नष्ट करने अंधेरे अनुकूलित ऊतकों में माप प्रदर्शन की संभावना । इस तरह के माप अत्यधिक दृश्य शरीर क्रिया विज्ञान के लिए प्रासंगिक हैं और अभी भी रेटिना चयापचय के अध्ययन के लिए विशेष रूप से डिजाइन पुराने तकनीकों के उपयोग की आवश्यकता होगी.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम डॉ अलेक्जेंडर Kolesnikov और डॉ व्लादिमीर Kefalov Gnat1 प्रदान करने के लिए धंयवाद-/चूहों, उपयोगी प्रतिक्रिया और सलाह के लिए, और पांडुलिपि पढ़ने के लिए ।

यह काम NIH EY025269 (आरआर), वाशिंगटन विश्वविद्यालय में मधुमेह अनुसंधान केंद्र द्वारा समर्थित किया गया था-NIH DK020579 (JRM और आरआर), अंधापन को रोकने के लिए अनुसंधान से एक कैरियर विकास पुरस्कार (आरआर), Horncrest फाउंडेशन (आरआर), JDRF से एक कैरियर विकास पुरस्कार ( JRM), NIH DK101392 (सीएफएस), DK020579 (सीएफएस), DK056341 (सीएफएस), और DK114233 (JRM) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Seahorse XF24 Extracellular Flux Analyzer Agilent, Santa Clara, CA
Seahorse XF24 Islet Capture FluxPak (includes: Islet Capture Microplate, Sensor Cartridge and Calibrant Solution) Agilent, Santa Clara, CA 101174-100 Includes islet capture microplate, sensor cartridge and calibrant solution
RPMI 1640 Media (Powdered medium) Millipore-Sigma R1383 RPMI 1640 Media with L-Glutamine and without glucose or sodium bicarbonate
D-Glucose Millipore-Sigma G8270 1M D-Glucose filtered, for media preparation
Sodium pyruvate Corning 25000CI 100 mM sodium pyruvate
Antimycin-A Millipore-Sigma A8674 Mitochondrial stress protocol component
FCCP Millipore-Sigma C2920 Mitochondrial stress protocol component
Rotenone Millipore-Sigma R8875 Mitochondrial stress protocol component
2-deoxyglucose Millipore-Sigma D6134 Glycolysis protocol component
1 mm skin biopsy punches with plunger Integra-Miltex 33-31AA-P/25 Explanting retinal tissue tool
Dumont Mini-Forceps Straight Fine Science Tools 11200-10 Explanting retinal tissue tool
Dumont Medical #5/45 Forceps- Angled 45 degrees Fine Science Tools 11253-25 Explanting retinal tissue tool
Dumont #7 Forceps - Curved Fine Science Tools 11271-30 Explanting retinal tissue tool
Quant-iT Picogreen dsDNA Assay Kit Fisher Scientific P7589 Loading normalization assay
Trizma base (Tris base) Millipore-Sigma T6066 Component of lysis buffer
Triton X-100 (polyethylene glycol tert-octylphenyl ether) Millipore-Sigma X100 Component of lysis buffer
0.5M EDTA pH 8.0 Ambion AM9262 Component of lysis buffer
C57BL/6J mice  Jackson Laboratories  Strain 000664 Animals
Gnat1-/- and background-matched Gnat1+/+  Vladimir Kefalov, PhD; Washington University School of Medicine Animals

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References

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जीव विज्ञान अंक १४३ रेटिना ऑक्सीजन उपभोग दर extracellular अंलीकरण दर ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण glycolysis mitochondria चयापचय
Extracellular फ्लक्स विश्लेषण का उपयोग Explanted रेटिना ऊतक में ऊर्जा चयापचय का मापन
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Millman, J. R., Doggett, T.,… More

Millman, J. R., Doggett, T., Thebeau, C., Zhang, S., Semenkovich, C. F., Rajagopal, R. Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis. J. Vis. Exp. (143), e58626, doi:10.3791/58626 (2019).

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