Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Измерение энергии метаболизма в описаны ткани сетчатки, с помощью анализа внеклеточного Flux

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58626

Summary

Этот метод описывает записи в реальном времени потребления кислорода и внеклеточной подкисления ставок описаны мыши сетчатки тканей с использованием анализатора внеклеточного потока.

Abstract

Высокая острота зрения представляет собой процесс сильно потребления энергии, и сетчатки разработал несколько уникальных адаптации точно выполнять такие требования при сохранении прозрачности зрительной оси. Возмущений в этот деликатный баланс вызывают ослепительный болезней, таких как диабетическая ретинопатия. Таким образом понимание энергии метаболизма изменения в сетчатке во время болезни необходимо для разработки рациональной терапии для различных причин утраты vison. Недавнее появление коммерчески доступных внеклеточного потока анализаторы сделал исследование сетчатки энергии метаболизма более доступными. Этот протокол описывает использование такого анализатора измерить вклад сетчатки энергоснабжение через два принципа оружие - окислительного фосфорилирования и гликолиза - путем количественной оценки изменений в уровнях потребления кислорода (OCR) и внеклеточной показатели подкисления (ECAR) как прокси для этих путей. Этот метод легко выполняется в описаны ткани сетчатки, облегчения оценки ответов на несколько фармакологических агентов в одном эксперименте. Метаболические подписей в сетчатки от животных, не хватает стержень фоторецепторных сигнализации по сравнению с одичал тип элементов управления, с помощью этого метода. Одним из основных ограничений в этой технике является отсутствие способности различать использования света адаптированных и dark-adapted энергии, важным физиологическим в ткани сетчатки.

Introduction

Сетчатка является одним самых требовательных энергии тканей в центральной нервной системе1. Как и большинство тканей он генерирует аденозинтрифосфатом (АТФ) через гликолиз в цитозоль или через окислительного фосфорилирования в митохондриях. Энергичный преимущество Оксидативное фосфорилирование гликолиз производить АТФ из одной молекулы глюкозы ясна: 36 молекулы АТФ генерируется из бывших против 2 молекулы АТФ, созданный из последнего. Соответственно нейроны сетчатки главным образом зависят от митохондриальное дыхание для поставок энергии и это отражено в их высокой плотности митохондрий2. Тем не менее сетчатки также полагается на гликолитических машин даже тогда, когда кислород обильные. Этот процесс аэробного гликолиза первоначально был описан в раковых клетках Отто Варбург3, который однажды отметил, что только после митотическая ткани, способную метаболизма4сетчатки. После этих первоначальных наблюдениях участвовать в той или иной степени гликолиза в дополнение к окислительное фосфорилирование к их требованиям СПС были описаны многие пост митотическая тканей.

Phototransduction, визуальные пигмент рециркуляции, биосинтез наружной сегментов фоторецепторных и синаптической активности являются все энергии требовательных процессов в фоторецепторных клеток, преобладающим нейрональных подкласс в сетчатке. Но на сегодняшний день наиболее энергетически длительный процесс в нейроны1является необходимость активно транспорт ионов против их электрические и градиенты концентрации. Фоторецепторы являются своеобразным нейронов в том смысле, что они являются деполяризованный в отсутствие стимуляции (т.е., в темноте), тогда как легкие стимул вызывает закрытие канала и последующих гиперполяризации. Таким образом в темноте, сетчатки потребляет большое количество АТФ для поддержания ее деполяризации или «Темновой ток», как это обычно называют. С точки зрения адаптации одной из основных проблем в обеспечении этих огромное количество АТФ является необходимость организмов поддерживать четкость через оптической оси. Перевернутый сетчатки архитектура, видели в современном существ является доминирующим решение, как он держит плотной капиллярной сети, поставку фоторецепторы от пути света. Но это чудо природных биоинженерии сетчатки на краю пропасти с точки зрения метаболических резерва. Даже небольшие оскорбления к сетчатке потенциально может нарушить хрупкий баланс поставок энергии для спроса, и визуальный дисфункции или откровенный слепота может наступить быстро.

Учитывая уникальный энергичный требования нейронных сетчатки, в сочетании с ее жесткие ограничения кровоснабжения, точное измерение потребления АТП в сетчатке и его изменения во время болезни может иметь серьезные последствия в понимании и лечении ослепительный условия, такие как пигментный ретинит и диабетической ретинопатии. Традиционно эти измерения требуют дорогостоящей, специально оборудования с большинства исследований, выходящих из несколько лабораторий, полностью посвященный измерений метаболической активности2,5,6, 7,8. Методы включают в себя отдельные анализы для конкретных метаболитов, трассирующими исследования с использованием радио меченых прекурсоров, потребление кислорода, запись с помощью электродов Кларк и Метаболомные профилирования9.

С достижениями в технологии высокой пропускной способности и повышение доступности коммерческих устройств методы для записи обмена веществ сетчатки являются более доступными и дешевыми. Метод, описанный здесь меры как окислительного фосфорилирования и гликолиза в сетчатке с помощью описаны ткани и коммерчески доступные внеклеточного потока анализатор9,10,11,12. Этот анализатор отдельно записи скорости потребления кислорода (OCR) и уровень внеклеточного подкисления (ECAR), выступающей в качестве косвенных показателей окислительного фосфорилирования и гликолиз, соответственно13. Эти измерения выполняются зонд submersed в пределах microchamber, поверх ткани интерес. Эта адаптация ранее опубликованных методов использует захвата плита, первоначально разработанный для островков Лангерганса поджелудочной железы для записи метаболической активности в небольших, циркуляр разделы мыши сетчатки. Несколько фармакологического воздействия может быть доставлен ткани в течение одной записи, потому что система содержит 4 инъекции портов для каждого образца хорошо. С помощью этой системы с отдельными протоколами, оптимизированный для записи ECAR и OCR, ответы сетчатки одичал типа можно сравнить с сетчатки не хватает transducin (Gnat1- / -), причиной врожденной стационарных ночной слепоты в люди14.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Протоколы ассоциации исследований в видении и офтальмологии заявление для использования животных и были одобрены Университет Вашингтона.

1. животных подготовка

  1. Держите животных в стандартный корпус с 12 часов темного света цикл 12 часов. Начало экспериментов на стандартизированных раз чтобы избежать суточного эффекты, обычно утром вскоре после того, как огни включены.

2. решение подготовка

  1. Подготовить базовый СМИ, растворяя 8,4 мг порошка СМИ в дистиллированной двойной H2O (ddH2O) и скорректировать рН 7,4 с HCl или NaOH, окончательный объемом 1 л фильтр стерилизовать это решение с 0,22 мкм фильтром культуры ткани.
    1. Добавьте 1 M глюкозы и пируват натрия 100 мм для средств массовой информации для достижения окончательного концентрации глюкозы 5 мм и 1 мм пируват.
    2. Место 50 мл Алиготе базы СМИ в ванну воды 37 ° C.
  2. Подготовиться количественный ткани в конце анализа потока, лизис решение, добавляя tris база 10 мм, полиэтиленгликоль трет octylphenyl эфира до 0,2% (v/v) и ЭДТА до 1 мм, все в ddH2O. смесь до тех пор, пока все компоненты полностью распущены и настроить pH 8.0.
  3. Для митохондриального стресс протокола Подготовьте 11 мкм запас oligomycin, АТФ-синтазы ингибитор, растворяют в базовых СМИ целевой конечной концентрации 1 мкм в колодец. Подготовка 11 мкм запас карбонильных цианид - 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP), агент расцеплять, растворенного в базы СМИ целевой конечной концентрации 1 мкм в колодец. Приготовить коктейль ингибиторы цепи переноса электронов, ротенон и antimycin (САР), добавив ротенон 11 мкм и antimycin A до 22 мкм, растворяют в базовых СМИ целевой конечной концентрации 1 мкм ротенон и 2 мкм antimycin A в хорошо.
  4. Для протокола гликолиза Подготовьте 220 мм запас глюкозы растворяют в базовых средств массовой информации, целевой конечной концентрации 20 мм в колодец. Также Подготовьте запас 1.1 M 2-deoxyglucose (2-ГД), конкурентный ингибитор глюкозы и гликолитических антагонист, растворяют в базовых средств массовой информации. Это будет целевой конечной концентрации 100 мм 2-DG в колодец.

3. инструмент калибровки

  1. Для калибровки приборов для assay внеклеточного потока, добавить 1 мл раствора калибровки в каждой скважине датчик картриджа (всего 24 скважин) и инкубировать при 37 ° C, CO2-бесплатная ночевка инкубатора (или по крайней мере 8 h).
  2. Загрузить добавки для митохондриальных стресс протокол или протокол гликолиза в каждый порт инжектор, A-D, на датчик картриджа, регулируя объем изменений в колодец.
    Примечание: Например типичный пробирного будет включать 45 мкл добавка в первый порт инжектор, 49,5 мкл в второй, 54,5 мкл в третьей и 60 мкл в последний, если первоначальный хорошо объем 450 мкл.
  3. В течение первых нескольких экспериментов Загрузите базы СМИ в порт A оценить, сколько ткани движения/артефакт происходит после инъекции порт.
  4. Разрешить пластину загруженного датчик для инкубации при 37 ° C в не CO2 инкубатора для по крайней мере 60 мин.

4. изоляция свежие мыши ткани сетчатки

Примечание: Этот шаг приспособлен от методики доктора Барри Уинклер15.

  1. После управляющей глубокого наркоза с использованием стандартного коктейль, Ксилазина кетамин усыпить мышей от шейки матки дислокации.
  2. Использование пара средних Изогнутый пинцет понять задняя глобус на зрительный нерв и осторожно применять прямого давления на proptose глаз (рис. 1A).
    1. С чистым лезвием создайте разрез в лимба лимба роговицы с помощью единого, преднамеренное перевал лезвия.
    2. С помощью тонкой, угловой Макферсон стиль щипцы, щепотка задняя глобус выразить объектива и передней Гиалоидная мембраны из роговицы разрез. Отказаться от этих тканей.
    3. Повторите щипать маневр с щипцами выразить нейронных сетчатки.
    4. С помощью щипцов как ложки поднять сетчатки, вместо того, чтобы понять ткани, передача сетчатки от разреза роговицы и место непосредственно в теплой СМИ в 3 см блюдо или тарелку кластера 6-ну тканевые культуры.
  3. Используйте две пары щипцов Макферсон стиль штраф, угловая аккуратно вскрыть оставшиеся стекловидного тела от сетчатки. Лучше всего это делается путем цепляния стекловидного тела на периферии сетчатки Кубка и потянув в сторону центра, с окончательной disinsertion стекловидного тела из центра в целом. С помощью щипцов, удалите любые остаточные пигментный эпителий сетчатки от поверхности фоторецептора сетчатки.
    1. Отрежьте кончик накапайте P1000 с лезвием бритвы, чтобы открыть ~ 4 мм для предотвращения чрезмерного травмы для деликатных тканей сетчатки во время передачи учений.
    2. Перенос изолированных ткани сетчатки в свежие носителя с помощью кончика пипетки отрезока P1000.
    3. Вырежьте 1 мм пробойники сетчатки вокруг зрительного нерва с биопсией 1 мм удар, оборудованных с плунжером выбить ткани в случае, если он застревает в отверстие (рис. 1B). Установите сетчатки пуансонов сторону в чистых сред на блоке 37 ° C или грелку.

5. Протокол assay

  1. Передача отдельных ударов Гонав захват 24-ну островок, используя кончик отрезока P1000, аспирационных 450 мкл СМИ наряду с ткани.
  2. Нормально, используйте прямые щипцами осторожно управлять ударов в центр микроплиты. Держите удары, ориентированы в одном направлении (например, стороны ячейки ганглия вверх).
    1. Отдых захвата плиты на грелку или нагрева блока набор до 37 ° C, как эти шаги повторяются для оставшихся образцов.
      Примечание: Для каждого эксперимента отложите пустой 3-4 скважин с 450 мкл базовых средств массовой информации в качестве негативных элементов. В оставшиеся 20-21 скважин, проверить каждый Биопрепарат реплицировать в трех экземплярах. Таким образом каждая пластина 24-ну позволит для записи с 6-7 разных животных или условий лечения.
  3. Избегая пузырьки воздуха, нежно позиции островок захвата сетки вставок в каждый хорошо с помощью щипцов и зафиксируйте вставки с металлический Плунжер, или вырезать наконечник пипетки P1000 (рис. 1 C).
    Примечание: Избегайте излишней ткани движения во время этого шага для поддержания позиции сетчатки удар в центре образца microchamber. Пузырьки воздуха сильно исказить OCR чтений. Хотя microchamber не имеет адекватной глубины для размещения обычно мышь сетчатки (рис. 1 c), иногда обработки дефекты в сетку вставками может вызвать ткани становятся слишком сжаты во время вставки экрана. Если это произойдет, просто запишите измельченные ткани и исключить этот образец из окончательного анализа.
  4. Инкубировать ткани пластины в 37 ° C CO2-бесплатные инкубатор для по крайней мере 60 мин.
  5. Программа анализатор внеклеточного потока с использованием смеси, подождите, мера и повторять команды. Например, типичный эксперимент с ткани сетчатки могут включать в себя следующее: смешать 2 минуты, подождите 2 минуты, и измерить 5 минут. Повторить эксперимент с этих трех шагов между 5 - 8 раз (циклов) для базовой записи и после инъекции каждого комплекса проходит проверку во время выполнения.
  6. Нажмите кнопку Пуск программы на анализаторе внеклеточного потока и следуйте инструкциям на экране, чтобы вставить картридж датчик для калибровки.
  7. В конце калибровки следуйте инструкциям на экране, чтобы заменить пластину calibrant пластину, содержащие образцы сетчатки.
  8. Разрешите запуск программы, как запланировано. По завершении выполнения следуйте инструкциям на экране, чтобы извлечь пластину ткани. Просмотрите результаты выполнения и хранить файл данных.
  9. Изогнутой иглой 20 калибра и щипцы удалите все сетки вставки из скважин, оставив позади сетчатки удар.
  10. Тщательно аспирационная СМИ из ткани и стирать ткани дважды с 0,5 мл холодного фосфат амортизированное saline (PBS). Аспирационная PBS после стирки.
  11. Добавьте 100 мкл буфера lysis каждой скважины и пипетки вверх и вниз для гомогенизации ткани.
  12. Quantitate входные уровни, основанные на общей двуцепочечной ДНК (dsDNA) или содержание общего белка.
    Примечание: Следующие основан на коммерчески доступных dsDNA assay.
  13. Разбавить лизированных образцы 1:1, добавив 100 мкл буфера Tris-ЭДТА (TE) и передачи 100 мкл разбавленного образца 96 пластины хорошо.
    1. Добавьте 100 мкл буфера обнаружения в каждой скважине. После перемешивания в течение 2-5 минут, quantitate флуоресценции после возбуждения на 480 Нм и выбросов на 520 Нм, сравнивая с калибровочной кривой.
    2. Нормализовать сырье внеклеточного потока трассировки для содержания ДНК в колодец.
      Примечание: В результаты, представленные здесь образцы, нормализуется до 50 нг dsDNA - типичный сумма в 1 мм сетчатки удар. Поэтому абсолютные значения, представленные здесь можно сравнить с исследований, представления данных «за сетчатки удар». Нормализовать Прориси внутреннего стандарта, как базовый при концентрации глюкозы 5 мм.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

С помощью описанных методов (кратко на рис. 1), сетчатки эксплантов от 8 недели старый дикого типа (WT) мышах были по сравнению с соответствием возраста и фон transducin null мышей (Gnat1- / -). Потому что Gnat1- / - животные не хватает техники закрыть циклических нуклеотидов закрытого ионных каналов в ответ на раздражители, света, их род фоторецепторов остаются деполяризованный даже в свет14. Последующих нужно поддерживать калия измеряем создаст большой спрос АТФ, что приводит к нагрузку биоэнергетический. Чтобы определить, если такие сдвиги в энергетических потребностей будет увеличение окислительного фосфорилирования или гликолитических потока, тканей от мышей дикого типа и Gnat1- / - мышей были сопоставлены с помощью анализатора внеклеточного потока. В начале исследования, присутствии глюкозы 5 мм и 1 мм пируват сетчатки тканей от дикого типа животных имеют аналогичные показатели кислоты измеряем, по сравнению с Gnat1- / - мутантов. Аналогичные тенденции наблюдаются после добавления 20 мм глюкозы и гликолитических ингибитор 2-DG (рис. 2A). Эти данные также могут быть математически преобразованы для представления дробных изменения от базовой линии (рис. 2B), формат, который может позволить для лучшего сравнения между различными экспериментальных мероприятий.

Абсолютная OCR в базовых эквивалент между WT и мутантов ткани сетчатки (рис. 3A). Добавление глюкозы 20 мм увеличивает митохондриальное дыхание, но никаких изменений не наблюдается между группами с точки зрения абсолютной количественной или с точки зрения изменения от базовой линии (рисунок 3B). Добавление 1 мм FCCP (расцеплять агент) проявить максимальную митохондриальной дыхания ставки не значительно увеличить OCR выше уровня, видели с высоким глюкозы в WT или Gnat1- / - тканях. Однако сигналы от обеих мышей резко падение после добавления Раа коктейль.

В идеале внеклеточного потока эксперименты запустить присутствии АТФ синтазы ингибитор oligomycin помощь в выявлении источников утечки Протон, происходящих когда движение через цепь переноса электронов не связан с СПС производства16. В сетчатки эксплантов от 8 week-old мышей C57BL/6J oligomycin лечения надежно понижает OCR, как ожидается (рис. 4). Но последующее добавление FCCP, чтобы найти максимальную OCR, только номинально увеличивает OCR около 60% от базового, в соответствии с предварительного исследования11.

XF24 анализатор использует погружные датчики, обеспечивающие плотное прилегание в ткани хорошо, создание переходных микроокружение для измерения кислорода и кислоты поток. Позиционирование ткани сетчатки в хорошо пластины (в связи с датчиками), потенциально могут влиять OCR записи и привести к нежелательных вмешивающиеся факторы, и некоторые reserachers выступали за размещение ткани сетчатки непосредственно под Датчик кислорода с фоторецептор внешние сегменты ориентированную датчик11. Чтобы проверить последствия позиции ткани сетчатки на измерениях, OCR, тканей из молодых мышей C57BL/6J (8 недель) были проанализированы в двух направлениях: клетки сетчатки ганглия, вниз на пластину (то есть, фоторецепторов размещены вертикально ближе к датчику ) или вверх к датчика. Без различия в относительной OCR в ответ на FCCP или САР были замечены, указывающее эквивалент чувствительности для максимального и минимального митохондриальной дыхания ставки в любой ориентации (Рисунок 5A). Кроме того абсолютные измерения OCR также были эквивалентны между сетчатки тканей в любой ориентации (Рисунок 5B).

Figure 1
Рисунок 1 : Изоляция сетчатки экспланта и установки в анализаторе внеклеточного потока. A. изоляция нейронных сетчатки в situ , применяя пропульсивной силы на глобусе с щипцами, промо роговицы и удаление сетчатки после отбрасывания объектива и передней Гиалоидная мембраны. B. подготовка ткани для потока записи с сетчатки удар создание, размещение отдельных ударов в Иле захвата микроплиты и использование сетчатая вставка к минимуму движение ткани с microchambers (масштаб баров = 1 мм). C. схема, производный от производителя предоставленные данные, показывая наброски процедуры и демонстрируя, что высота microchamber является достаточным для покрытия мышиных сетчатки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. 

Figure 2
Рисунок 2 : Митохондриальной стресс анализ с использованием описаны сетчатки от 8 недели старый животных. A. среднем Прориси с стандартная ошибка измерения (SEM), нормализуется содержание ДНК ткани, из эксперимента, оптимизированный для записи потребления кислорода, сравнивая transducin нокаут животных (Gnat1- / -) дикого типа элементов управления. B. же эксперимент с данными преобразованы таким образом, что базовые записи задаются в качестве ссылки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 : Анализ гликолитических показатель использования описаны сетчатки от 8 - неделя старый животных. A. средняя, контент нормированный, ДНК Прориси из эксперимента, оптимизированный для кислоты измеряем записей, сравнивая transducin нокаут животных (Gnat1- / -) дикого типа элементов управления. B. данные из той же эксперимент нормализованных базовых записей. Следы показывают среднее ± SEM. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4 : Необратимые последствия oligomycin сетчатки дыхания ставки. В прекрасно подготовленных сетчатки эксплантов от 8 week-old мышей C57BL/6J oligomycin лечение снижает максимальный OCR, вызванных последующего добавления FCCP. Следы показывают среднее ± SEM. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5 : Эффекты ткани позиционирования на измерение OCR. Сетчатки тканей из 8 week-old мышей C57BL/6J были помещены в скважинах с клеток ганглия, стоящих на датчик (ганглия клетки вверх) или от датчика (ганглия клетки вниз). Между группами, аналогичные внеклеточного потока, который записи наблюдаются дыхательная способности (A) относительно базового или (B) с точки зрения абсолютной количественной оценки. Следы показывают среднее ± SEM. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

OCR и ECAR легко измеряются в описаны ткани сетчатки, с помощью bioanalyzer, с помощью описанных методов. Этот метод отличается от других групп в нескольких важных шагов. Сетчатки тканей изолированы через большой разрез роговицы без enucleating всему миру, как первоначально описанных Карлом Уинклер15. Этот метод сетчатки изоляции позволяет для быстрой передачи от жизни глаз в пластину захвата ткани (часто в течение 5 минут). Тканей хранятся при 37 ° C на протяжении всего процесса, который сохраняет клеточное дыхание лучше, чем когда они размещены на льду. СМИ с минимальными добавки используются для первоначальных измерений, минуя любые буферизации агенты, например HEPES, бикарбонат натрия, сыворотки или избыток макроэлементы, как это позволяет для более надежного измерения базальной энергии метаболизма и не препятствовать Оценка ECAR. Лучше всего сетчатки пробойники записываются в формате 24-хорошо, а не в 96-колодцы, чтобы свести к минимуму травмы на ткани. Ткани сетчатки помещается в центре скважины, в пределах microchamber ткани и обеспечены сетчатая вставка. Это позволяет для точной записи ECAR и OCR, предотвращая чрезмерное ткани движения во время выполнения и устраняет необходимость для других реагентов, таких как ткани клеи. Транспортное средство инъекции во время запуска рекомендуется, особенно при настройке записи экспериментов для в первый раз, как это даст ощущение как хорошо обеспеченных ткани в пластину захвата. OCR записей с помощью этой техники являются независимыми от сетчатки ориентации в колодец, но ориентация должна оставаться последовательной среди образцов в рамках экспериментов. Все измерения проводятся только после обмена веществ сетчатки достигла устойчивого состояния после инъекции испытания соединений.

Этот протокол описывает нормализации данных в общее содержание ДНК, как прокси для количества клеток. Такая техника выгодно, потому что она будет учитывать изменения количества клеток, движимый изменения сетчатки толщина, размер штампа или различия в клеточности между генетически разнородными образцами. Общая нормализации на основе белков также надежный метод и имеет то преимущество, свести к минимуму различия в общей митохондриальной массы между сетчатки образцов. Однако нормализации на основе содержания белка в цельной ткани может быть confounded изменения внеклеточного матрикса между выборками. Нормализация потока записей базовой линии, как показано в результатах представительных, выгодно потому, что она минимизирует вариабельность в сетчатки удар размер между реплицирует и позволяет легко интерпретации изменений вследствие фармакологического вмешательства. Однако отчетности о необработанных значений позволяет для лучшего сравнения между различных экспериментов и эксперименты, проведенные с использованием методов записи различных потока.

Результаты с помощью этих методов сопоставимы с показателями других сообщили. Хотя oligomycin - ингибитор АТФ-синтазы - обычно используется для измерения утечки протона в ткани или клетки интереса, это соединение имеет неблагоприятные последствия для обмена веществ сетчатки. В ходе экспериментов здесь 60% снижение максимальной сетчатки, OCR, вызвало FCCP наблюдается после воздействия oligomycin (рис. 4), почти идентична предыдущей исследование11. Потенциальным объяснение для этого вывода является необратимые повреждения или изменения сетчатки митохондрий ингибитированием АТФ-синтазы. Кроме того как Kooragayala и коллеги впервые сообщил11, сетчатки, митохондрии, вероятно, работает на вблизи максимальной цены в базальных условиях с агентом расцеплять цепи переноса электронов, FCCP, только увеличивает OCR около 15% (рис. 3 , Рис. 5).

Внеклеточные потока записи в описаны сетчатки тканях демонстрируют большой гликолитических резерв, с добавлением глюкозы 20 мм вызывает два раза, увеличение ECAR (рис. 2). Потому что oligomycin, обычно используется для определения максимального гликолитических потенциала, имеет пагубные последствия в ткани сетчатки (рис. 4), использование высоких глюкозы дополнение к записи может служить прокси лучше оценить гликолитических резерва в сетчатке. Важный нюанс, предотвращение использования ECAR как чисто прокси для гликолитических ставка является что CO2 освобожденных от цикла лимонной кислоты может быть значительным источником кислоты в культурной ткани17. Избыток пируват не увеличивает ECAR выше уровней, с высокой глюкозы, и гликолитических потока почти ликвидирована в сетчатки эксплантов с использованием избыточное молярной соотношения 2-DG (рис. 2). Так как АТФ используется для регенерации мембранного потенциала, происходящих от деполяризации события в dark-adapted сетчатки, животных, не хватает transducin , как ожидается, затратить больше энергии чем WT. Однако в эксплантов, различий в метаболизме сетчатки энергии между Gnat1- / - и элементы управления не были замечены в эксперименты, описанные здесь (рис. 2 и 3). Эти результаты согласуются с результатами, полученными с помощью пользовательских перфузии аппарат для измерения OCR для животных Gnat1- / - 18. Примечательно пользовательские аппарат используется Du и коллеги допускается для измерения OCR адаптированы свет и темные адаптированных условиях. Поступая таким образом, небольшое, но заметное снижение OCR после воздействия света обнаруживается в сетчатки одичал типа, но не в Gnat1- / - сетчатки18. Это иллюстрирует основные ограничения текущей методики измерения ECAR и OCR в описаны сетчатки - внеклеточные потока анализатор, используемый здесь опирается на видимый свет возбуждения флуорофоров, внедренный в его датчики кислорода и рН, устраняя возможность выполнения измерений в dark-adapted тканях. Такие измерения весьма актуальны для визуального физиологии и будет по-прежнему требуют использования старых методов, предназначенные исключительно для исследования обмена веществ сетчатки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Мы благодарим д-р Александр Колесников и д-р Владимир Kefalov за предоставление Gnat1- / -мышей, за полезные отзывы и советы и для чтения рукопись.

Эта работа была поддержана, низ EY025269 (ОР), исследовательский центр университета Вашингтона - низ DK020579 диабет (JRM и RR), премии развития карьеры от исследований по предотвращению слепоты (ОР), Фонд Horncrest (ОР), премии развития карьеры с JDRF ( JRM), низ DK101392 (CFS), DK020579 (CFS), DK056341 (CFS) и DK114233 (JRM).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Seahorse XF24 Extracellular Flux Analyzer Agilent, Santa Clara, CA
Seahorse XF24 Islet Capture FluxPak (includes: Islet Capture Microplate, Sensor Cartridge and Calibrant Solution) Agilent, Santa Clara, CA 101174-100 Includes islet capture microplate, sensor cartridge and calibrant solution
RPMI 1640 Media (Powdered medium) Millipore-Sigma R1383 RPMI 1640 Media with L-Glutamine and without glucose or sodium bicarbonate
D-Glucose Millipore-Sigma G8270 1M D-Glucose filtered, for media preparation
Sodium pyruvate Corning 25000CI 100 mM sodium pyruvate
Antimycin-A Millipore-Sigma A8674 Mitochondrial stress protocol component
FCCP Millipore-Sigma C2920 Mitochondrial stress protocol component
Rotenone Millipore-Sigma R8875 Mitochondrial stress protocol component
2-deoxyglucose Millipore-Sigma D6134 Glycolysis protocol component
1 mm skin biopsy punches with plunger Integra-Miltex 33-31AA-P/25 Explanting retinal tissue tool
Dumont Mini-Forceps Straight Fine Science Tools 11200-10 Explanting retinal tissue tool
Dumont Medical #5/45 Forceps- Angled 45 degrees Fine Science Tools 11253-25 Explanting retinal tissue tool
Dumont #7 Forceps - Curved Fine Science Tools 11271-30 Explanting retinal tissue tool
Quant-iT Picogreen dsDNA Assay Kit Fisher Scientific P7589 Loading normalization assay
Trizma base (Tris base) Millipore-Sigma T6066 Component of lysis buffer
Triton X-100 (polyethylene glycol tert-octylphenyl ether) Millipore-Sigma X100 Component of lysis buffer
0.5M EDTA pH 8.0 Ambion AM9262 Component of lysis buffer
C57BL/6J mice  Jackson Laboratories  Strain 000664 Animals
Gnat1-/- and background-matched Gnat1+/+  Vladimir Kefalov, PhD; Washington University School of Medicine Animals

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wong-Riley, M. T. Energy metabolism of the visual system. Eye and brain. 2, 99-116 (2010).
  2. Ames, A. 3rd, Li, Y. Y., Heher, E. C., Kimble, C. R. Energy metabolism of rabbit retina as related to function: high cost of Na+ transport. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 12 (3), 840-853 (1992).
  3. Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123 (3191), 309-314 (1956).
  4. Wubben, T. J., et al. Photoreceptor metabolic reprogramming provides survival advantage in acute stress while causing chronic degeneration. Scientific reports. 7 (1), 17863 (2017).
  5. Du, J., Linton, J. D., Hurley, J. B. Probing Metabolism in the Intact Retina Using Stable Isotope Tracers. Methods in enzymology. 561, 149-170 (2015).
  6. Felder, A. E., Wanek, J., Tan, M. R., Blair, N. P., Shahidi, M. A Method for Combined Retinal Vascular and Tissue Oxygen Tension Imaging. Scientific reports. 7 (1), 10622 (2017).
  7. Hurley, J. B., Lindsay, K. J., Du, J. Glucose, lactate, and shuttling of metabolites in vertebrate retinas. Journal of neuroscience research. 93 (7), 1079-1092 (2015).
  8. Winkler, B. S. Glycolytic and oxidative metabolism in relation to retinal function. The Journal of general physiology. 77 (6), 667-692 (1981).
  9. Pelletier, M., Billingham, L. K., Ramaswamy, M., Siegel, R. M. Extracellular flux analysis to monitor glycolytic rates and mitochondrial oxygen consumption. Methods in enzymology. 542, 125-149 (2014).
  10. Joyal, J. S., et al. Retinal lipid and glucose metabolism dictates angiogenesis through the lipid sensor Ffar1. Nature medicine. 22 (4), 439-445 (2016).
  11. Kooragayala, K., et al. Quantification of Oxygen Consumption in Retina Ex Vivo Demonstrates Limited Reserve Capacity of Photoreceptor Mitochondria. Investigative ophthalmology & visual science. 56 (13), 8428-8436 (2015).
  12. Pearsall, E. A., et al. PPARalpha is essential for retinal lipid metabolism and neuronal survival. BMC biology. 15 (1), 113 (2017).
  13. Nicholls, D. G., et al. Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. Journal of visualized experiments. (46), (2010).
  14. Lobanova, E. S., et al. Transducin translocation in rods is triggered by saturation of the GTPase-activating complex. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 27 (5), 1151-1160 (2007).
  15. Winkler, B. S. The electroretinogram of the isolated rat retina. Vision research. 12 (6), 1183-1198 (1972).
  16. Jastroch, M., Divakaruni, A. S., Mookerjee, S., Treberg, J. R., Brand, M. D. Mitochondrial proton and electron leaks. Essays in biochemistry. 47, 53-67 (2010).
  17. Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data. Methods in enzymology. 547, 309-354 (2014).
  18. Du, J., et al. Phototransduction Influences Metabolic Flux and Nucleotide Metabolism in Mouse Retina. The Journal of biological chemistry. 291 (9), 4698-4710 (2016).

Tags

Биология выпуск 143 сетчатки скорость потребления кислорода внеклеточная подкисления ставка окислительного фосфорилирования гликолиза митохондрии метаболизм
Измерение энергии метаболизма в описаны ткани сетчатки, с помощью анализа внеклеточного Flux
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Millman, J. R., Doggett, T.,More

Millman, J. R., Doggett, T., Thebeau, C., Zhang, S., Semenkovich, C. F., Rajagopal, R. Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis. J. Vis. Exp. (143), e58626, doi:10.3791/58626 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter